CN114262366B

CN114262366B - 幽门螺杆菌HspA的B细胞表位多肽HP11及其应用

Info

Publication number: CN114262366B
Application number: CN202111608236.XA
Authority: CN
Inventors: 刘纯杰; 张鑫; 王艳春; 桑姝丽; 陶好霞; 关清
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114262366A

Abstract

本发明公开了幽门螺杆菌HspA的B细胞表位多肽HP11及其应用。本发明提供了HspA抗原表位肽，为如下1)或2)：1)为序列1第2‑12位所示的多肽；2)为在1)所示多肽的序列末端添加标签序列。本发明从HspA中鉴定了新的B细胞表位HP11，并检测了这些表位肽在H.pylori自然感染人群中的抗体表达谱，为进一步研究HspA在H.pylori感染免疫诊断与免疫预防中的作用提供了基础。由该表位肽制备的抗体，可以用于检测HspA或H.pylori感染。

Description

幽门螺杆菌HspA的B细胞表位多肽HP11及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种幽门螺杆菌HspA的B细胞表位多肽HP11及其应用。

背景技术

1982年，两位澳大利亚学者Robin Warren和Barry Marshall从人胃组织中分离到了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，并阐明了该菌与胃肠疾病的关系。2005年，诺贝尔生理学或医学奖授予了澳大利亚的这两位科学家，以表彰他们为此做出的贡献。

H.pylori是一种螺旋形、微需氧、革兰氏阴性细菌，定植于人胃中。H.pylori的发现使人们对慢性胃炎、消化性溃疡等疾病在发病学和防治学上的认识发生了颠覆性的变化。目前，H.pylori感染作为慢性胃炎、消化性溃疡的最主要病因己经得到了国际医学界的普遍认可，且已有足够证据表明该菌感染对人类具有致癌力，与胃腺癌和粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生高度相关。1994年，WHO国际癌症研究机构(IARC)和美国NIH相继通过决议，分别宣布：H.pylori为胃炎、胃和十二指肠消化性溃疡的病因，同时也是第一类致癌因子。迄今为止，H.pylori是公认的唯一与癌症发病相关联的病原细菌。

H.pylori感染呈全球分布，全球自然人群的感染率超过50％。在发展中国家，50％-80％以上的成年人感染本菌；在发达国家，H.pylori的感染率也达25％～50％。在我国，据流行病学调查，H.pylori感染率为40％-90％，平均为59％；最低地区是广东，为42％；最高地区是西藏，为90％。我国H.pylori的现症感染率为42-64％，平均55％；最低地区是广东，为42％；最高地区是陕西，为64％。我国儿童H.pylori感染率为25-59％，平均40％，并以平均每年0.5％-1％的速度递增。

H.pylori一经获得，如果不经治疗便会在人胃内持续定植与生长数年、数十年乃至一生。100％的感染者会出现无症状性胃炎，大约30％的感染者会发展为慢性胃炎，10-20％的感染者发展为胃和十二指肠消化性溃疡，约1％-2％的感染者发展为胃腺癌及胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤。临床检测表明，慢性胃炎H.pylori的检出率为54％-100％，慢性活动性胃炎H.pylori的检出率为90％以上，胃溃疡H.pylori的检出率为80％以上，十二指肠溃疡H.pylori的检出率为90％以上。H.pylori感染者胃癌发生率是非感染者的6-8倍，H.pylori感染者的年轻胃癌患者发生率是非感染者的20倍。也有研究证实，H.pylori除了可以引起上述疾病外，还涉及到与许多胃肠道外疾病相关，如与口腔、皮肤、血液、心血管及呼吸系统乃至妊娠与儿科疾病发生相关联。

基于人们对H.pylori感染所致疾病在认识上的统一，上述消化道常见与多发疾病采取根除H.pylori治疗的方法已成为共识。目前采用的治疗方法是基于抗生素、质子泵抑制剂和铋化合物的三联或四联组合，疗程持续10-14天。然而，近十年来，随着许多国家对克拉霉素耐药性的迅速增加，世界范围内H.pylori的根除率呈下降趋势。除了越来越多的耐药菌株报道外，治疗费用高、药物依从性差、感染复发率高也是H.pylori感染大规模控制失败的主要原因。因此，研究针对H.pylori的免疫反应和免疫保护机制，对于克服目前治疗方法存在的问题，更有效地检测与评估，乃至预防和治疗H.pylori感染具有积极意义。

H.pylori热休克蛋白A(heat shock protein A，HspA)是一种细菌热休克分子伴侣，是H.pylori感染的关键毒力因子和保护性抗原之一。HspA由118个氨基酸组成，分为两个结构域：A结构域(1-90氨基酸)，与GroES序列具有序列相似性，以及B结构域(91-118氨基酸)，这是H.pylori和Helicobacter acinonuchis独有的，含有8个组氨酸和4个半胱氨酸。HspA参与细胞内镍螯合和运输，维持H.pylori的Ni2⁺稳态。金属镍可影响H.pylori尿素酶和[NiFe]氢化酶的活性和功能，这两种酶是H.pylori在胃内存活和定植的重要毒力因子。HspA在H.pylori的诊断、治疗和预防中起着重要作用。大约40％的H.pylori感染者可以检测到HspA抗体。Bi³⁺不可逆地与HspA结合并干扰其生物学功能，这种作用是铋化合物治疗效果的主要机制。HspA在小鼠模型中对H.pylori具有明显的免疫保护作用。

众所周知，机体通过识别病原菌的表位，产生适应性免疫应答反应，来抵抗外来病原体的入侵与致病。因此，抗原表位的鉴定对于感染性疾病进行免疫诊断、免疫保护机制研究以及疫苗研发具有重要意义。

发明内容

本发明一个目的是提供一种HspA抗原表位肽。

本发明提供的HspA抗原表位肽为如下1)或2)：

1)为序列1第2-12位所示的多肽；

2)为在1)所示多肽的序列末端添加标签序列。

本发明另一个目的是提供一种HspA抗原。

本发明提供的抗原，为将上述HspA抗原表位肽与载体蛋白偶联而成。

上述抗原中，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或者牛血清白蛋白。

上述HspA抗原表位肽或上述HspA抗原在作为免疫原制备抗HspA的抗体中的应用也是本发明保护的范围。

由上述HspA抗原表位肽或上述HspA抗原在作为免疫原制备的抗HspA的抗体也是本发明保护的范围。

上述抗体在如下任一中的应用也是本发明保护的范围：

1)检测或辅助检测HspA；

2)检测或辅助检测H.pylori；

3)制备用于检测或辅助检测HspA的产品；

4)制备用于检测或辅助检测H.pylori感染引发相关疾病的产品中的应用。

上述HspA抗原表位肽或上述的HspA抗原或上述的抗体或以上述的HspA抗原表位肽为活性成分的物质在如下(a)-(d)中任一种的应用也是本发明保护的范围：

(a)制备用于诊断或辅助诊断HspA表达异常相关疾病的产品；

(b)制备用于预防HspA表达异常相关疾病的产品；

(c)制备用于诊断或辅助诊断H.pylori感染引发相关疾病的产品；

(d)制备用于预防H.pylori感染引发相关疾病的产品。

上述预防HspA表达异常相关疾病的产品为疫苗，具体可以为多联多聚表位疫苗制剂。

本发明还有一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述HspA抗原表位肽或上述的HspA抗原或上述的抗体；

所述产品具有如下功能中至少一种：

(a)用于诊断或辅助诊断HspA表达异常相关疾病；

(b)用于预防HspA表达异常相关疾病；

(c)用于诊断或辅助诊断H.pylori感染引发相关疾病；

(d)用于预防H.pylori感染引发相关疾病。

编码上述HspA抗原表位肽的核酸分子也是本发明保护的范围。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞系也是本发明保护的范围。

本发明从HspA中鉴定了新的B细胞表位HP11，并检测了这些表位肽在H.pylori自然感染人群中的抗体表达谱，为进一步研究HspA在H.pylori感染免疫诊断与免疫预防中的作用提供了基础。由该表位肽制备的抗体，可以用于检测HspA或H.pylori感染。

附图说明

图1为HspA抗原免疫优势反应肽段的筛选。(A)来自H.pylori的HspA截短片段及其相对位置。(B)用20只小鼠抗rHspA血清通过ELISA检测到的五个肽段的OD值。

图2为HspA中HP1肽段的抗原表位精细定位。(A)覆盖HP1的重叠合成肽。每个肽段包含11个氨基酸，其中9个氨基酸与相邻的肽段重叠。(B)11种多肽与小鼠抗rHspA血清的ELISA检测结果。

图3为HP11和HP19抗原表位的免疫原性和免疫反应性。(A)抗原表位-KLH小鼠抗血清与合成表位肽的ELISA检测结果。用合成的表位肽HP11和HP19为包被抗原，抗原表位-KLH小鼠抗血清为一抗，PBS免疫小鼠血清为阴性对照。(B)HP11-KLH免疫小鼠抗血清免疫印迹分析。(C)HP19-KLH免疫小鼠抗血清免疫印迹分析。(D)rHspA免疫小鼠抗血清免疫印迹分析。

图4为抗原表位特异性淋巴细胞增殖反应。抗原表位刺激相应的HP11-KLH(A)和HP19-KLH(B)免疫小鼠的脾淋巴细胞发生增殖反应。抗原表位刺激PBS免疫的小鼠脾淋巴细胞作为阴性对照，ConA刺激作为阳性对照。脾淋巴细胞刺激指数(stimulation index,SI)为刺激孔的OD值除以对照孔的OD值。*P<0.05，**P<0.01vs.阴性对照。

图5为抗原表位HP11(A)和HP19(B)在自然感染者中的血清抗体谱。用来自感染H.pylori患者的42例HspA血清阳性样品，通过ELISA检测针对抗原表位HP11和HP19的血清抗体OD值。17例H.pylori抗体阴性血清用作阴性对照。阳性判定标准：OD值>阴性对照血清平均OD值*2.1。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细菌菌株和培养条件：

下述实施例中的H.pyloriSS2000超声破碎物上清液按照如下方法制备：将H.pylori菌株Sydney菌株2000(SS2000)(Thompson LJ,Danon SJ,Wilson JE,etal.Chronic Helicobacter pylori Infection with Sydney Strain 1and a NewlyIdentified Mouse-Adapted Strain(Sydney Strain 2000)in C57BL/6and BALB/cMice.INFECTION AND IMMUNITY,2004,72(8):4668–4679)和NCTC11637(美国ATCC，ATCC43504)在含有7％胎牛血清的H.pylori选择性琼脂平板(Campylobacter Agar Base)上，在37℃、5％O₂、10％CO₂和85％N₂的微需氧条件下培养。培养3天后，刮取菌落并用pH7.0浓度为20mM的预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，然后在4℃下以10,000×g离心10分钟获得菌体沉淀。将H.pylori SS2000沉淀重悬在PBS中，通过冰浴条件下超声破碎(300w,10s,10s,20min)，离心20分钟，收集H.pylori SS2000上清液，即为含有HspA的上清液，用于蛋白免疫印迹(Western blotting，WB)。将H.pylori NCTC11637细菌沉淀，用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取NCTC11637基因组DNA。

下述实施例中H.pylori重组HspA(rHspA)和GST融合肽的构建、表达和纯化方法如下：

HspA的基因序列(序列2)通过PCR从幽门螺杆菌菌株NCTC11637的基因组中直接扩增，并克隆到pGEX-6P-1(+)(GE Healthcare)表达载体中，置于BamHI和NotI或XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞(Cwbio)中，用1mMIPTG诱导表达重组融合蛋白GST-HspA。通过离心收集细胞并将细菌沉淀重悬于PBS中，超声破碎重悬的细胞，离心收集上清液，即含有重组表达的GST-HspA融合蛋白。

重组GST-HspA融合蛋白，通过Price Glutathione Superflow Agarose(Thermo)纯化。然后，用precision protein酶(Beyotime)切除GST标签，并使用GST标签纯化树脂(BeyoGold)去除，根据说明书(GE Healthcare，USA)进行纯化，得到重组蛋白rHspA。

纯化后的重组蛋白rHspA用SDS-PAGE分析，纯化蛋白的浓度用BCA法测定。

GST-HP11和GST-HP19的构建、表达和纯化与GST-HspA融合蛋白相似，仅是将HspA的编码基因序列替换为HP11或HP19多肽对应的编码基因序列，且GST标签并未被移除。

下述实施例中HP1-HP5多肽的合成，覆盖HP1全长的各重叠肽的合成，多肽HP11与HP19同钥孔血蓝蛋白(KLH)的偶联(制备HP11-KLH偶联肽或HP19-KLH偶联肽)，均由GenScript(中国南京)完成。标准固相FMOC方法用于肽合成，通过高压液相色谱法评估纯度>95％，并通过激光解吸质谱法鉴定。将肽以10mg/ml的浓度溶解在DMSO或超纯水中，并在-20℃下分装储存。

下述实施例中ELISA检测方法如下：

用多肽作为抗原进行包被时，先将96孔ELISA板(Costar)在37℃下用150μl2.5％戊二醛预处理1小时，然后用水洗涤四次。表位肽作为包被抗原在0.1mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释并包被ELISA板(30μg/ml，100μl/孔)，在37℃下孵育过夜。HspA做抗原进行包被时，抗原在0.1mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释并包被ELISA板(2μg/ml，100μl/孔)，4℃孵育过夜。用PBST洗板3次。

用封闭缓冲液(含有5％脱脂牛乳的PBST用于小鼠血清，无蛋白封闭液(Thermo)用于人血清)加入ELISA板，200μl/孔，37℃封闭1小时。去除封闭液，每孔加入100μl rHspA免疫血清(1:500)或KLH结合肽免疫血清(1:100)或H.pylori阳性血清(1:100)并在37℃孵育1小时。PBS免疫小鼠或H.pylori感染阴性的健康人血清用作阴性对照。

用PBST洗涤孔3次后，将HRP偶联的兔抗小鼠IgG(1:5,000稀释度，Abcam)或山羊抗人IgG(1:20,000稀释度，Abcam)二抗加入孔中(100μl/孔)，37℃孵育1小时，同上洗涤ELISA板。以100μl/孔加入酶底物溶液3,3,5,5-四甲基苯-联苯(TMB)，反应在室温下进行15分钟。用100μl1MH₂SO₄终止反应，用ELISA酶标仪测量450nm(A450)处的吸光度。所有检测均用复孔进行，检测结果用复孔平均值。

下述实施例中的rHspA抗血清按照如下方法制备:免疫6-8周龄雌性SPF BALB/c小鼠(军事医学研究院实验动物中心，每组20只),初次免疫采用50μg rHspA与完全弗氏佐剂(Sigma)混合的乳剂进行皮下免疫。免后第10天和第20天使用50μg rHspA与不完全弗氏佐剂(Sigma)混合的乳剂加强免疫。在第30天处死小鼠，收集血清样品即为抗rHspA血清。

下述实施例中的统计分析，所有数据均表示为平均值±标准偏差(S.D.)。使用双尾t检验比较平均值，使用GraphPad Prism8.0.2(GraphPad Software)进行分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1、HspA抗原表位肽的鉴定与制备及免疫原性与免疫反应性检测

一、HspA抗原免疫优势反应肽段的筛选

将HspA(氨基酸序列为序列表中序列1)截短为五段，前4个肽段位于HspA的A结构域，每个片段重叠8个氨基酸，从N端到C端依次命名为HP1-HP4；第5个肽段位于B结构域，与HP4重叠2个氨基酸(图1A)。

HP1肽段的氨基酸序列为序列1第2-31位；

HP2肽段的氨基酸序列为序列1第34-53位；

HP3肽段的氨基酸序列为序列1第46-75位；

HP4肽段的氨基酸序列为序列1第68-91位；

HP5肽段的氨基酸序列为序列1第90-118位；

合成上述五段多肽作为抗原，并通过ELISA用20只小鼠抗rHspA血清(HspA抗血清)检测。

结果如图1B所示，表明HP1可与所有抗血清发生反应，免疫反应最强，HP1是HspA抗原免疫优势反应区段。

二、HP1抗原表位的精细定位

为了对HspA中HP1肽段的抗原表位进行精细定位，合成了一组11个氨基酸的重叠多肽，覆盖了HspA的2-31氨基酸，总共获得了11个多肽(图2A)。

HP11多肽的氨基酸序列为序列1第2-12位；

HP12多肽的氨基酸序列为序列1第4-14位；

HP13多肽的氨基酸序列为序列1第6-16位；

HP14多肽的氨基酸序列为序列1第8-18位；

HP15多肽的氨基酸序列为序列1第10-20位；

HP16多肽的氨基酸序列为序列1第12-22位；

HP17多肽的氨基酸序列为序列1第14-24位；

HP18多肽的氨基酸序列为序列1第16-26位；

HP19多肽的氨基酸序列为序列1第18-28位；

HP20多肽的氨基酸序列为序列1第20-30位；

HP21多肽的氨基酸序列为序列1第21-31位；

合成上述多肽，用合成多肽作为包被抗原进行ELISA板包被，采用ELISA方法检测11个多肽与20只小鼠抗rHspA血清(HspA抗血清)的反应性。

结果如图2B所示，可以看出，HP11、HP18、HP19和HP20能够发生较强的免疫反应。其中，三种肽HP18、HP19和HP20的序列相似，且HP19(ENKTSSGIIIP)免疫反应最强，推测HP19可能是HspA的一个抗原表位。此外，HP11(KFQPLGERVLV)的免疫反应与HP20相当，可能是HspA的另一个表位。

三、HP11表位肽和HP19表位肽的免疫原性和免疫反应性检测

在初步确定了HspA中的两个B细胞表位，首先评估了这些表位是否能够诱导小鼠产生免疫反应，具体如下：

1、HP11的KLH偶联肽(HP11-KLH)和HP19的KLH偶联肽(HP19-KLH)

为了增强多肽的免疫原性，在HP11和HP19的C端连接了一个半胱氨酸，然后使用MBS方法将它们偶联到KLH上形成KLH偶联肽。

HP11-KLH偶联肽为将HP11的C端连接了一个半胱氨酸得到的多肽，再将C端连接半胱氨酸的HP11偶联到KLH上，形成HP11-KLH偶联肽(C端连接半胱氨酸的HP11和KLH的投料质量比1:1)。

HP19-KLH偶联肽为将HP19的C端连接了一个半胱氨酸得到的多肽，再将C端连接半胱氨酸的HP19偶联到KLH上，形成HP19-KLH偶联肽(C端连接半胱氨酸的HP11和KLH的投料质量比1:1)。

2、小鼠免疫及样本采集

通过免疫6-8周龄雌性SPF BALB/c小鼠(军事医学研究院实验动物中心，每组10-20只)来评估rHspA和HP11-KLH偶联肽或HP19-KLH偶联肽的免疫原性。

初次免疫采用50μg rHspA或50μg HP11-KLH偶联肽或50μg HP19-KLH偶联肽分别与完全弗氏佐剂(Sigma)混合的乳剂进行皮下免疫。

初免后第10天和第20天，分别使用同初次免疫相同种类和剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma)混合制备的乳剂进行加强免疫。

对照小鼠使用相同的免疫程序用PBS进行免疫。

在第30天处死小鼠，收集血清样品，得到rHspA免疫血清、HP11-KLH偶联肽免疫血清、HP19-KLH偶联肽免疫血清，并通过ELISA和蛋白免疫印迹分析；收集脾组织获得rHspA免疫小鼠脾细胞、HP11-KLH偶联肽免疫小鼠脾细胞、HP19-KLH偶联肽免疫小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖试验。

所有动物均购自维通利华(中国北京)，并在SPF条件下饲养。

3、ELISA检测抗原表位的免疫原性

按照前面所述的方法，以HP11多肽和HP19多肽作为检测抗原进行包被，将上述2采集的小鼠HP11-KLH偶联肽免疫血清(1:100，又称为HP11-KLH抗血清)和HP19-KLH偶联肽免疫血清(1:100，又称为HP11-KLH抗血清)分别作为抗体，用ELISA方法检测KLH偶联肽免疫小鼠获得的所有血清。以PBS免疫小鼠血清作阴性对照。

检测结果如图3A所示，注射HP11-KLH偶联肽和HP19-KLH偶联肽可诱导小鼠产生强烈的免疫反应，2种表位肽特异性抗体(抗血清)滴度均超过1：1000。两个抗原表位均能够同自身与KLH偶联肽免疫小鼠血清发生ELISA阳性反应，均不与另一个抗原表位与KLH偶联肽或PBS免疫小鼠血清产生ELISA阳性反应(图3A)。

4、免疫印迹分析方法检测抗原表位的免疫反应性

用KLH偶联肽免疫的血清与H.pylori SS2000上清液、rHspA和GST融合蛋白进行蛋白免疫印迹分析，具体如下：

按照前面方法制备出H.pylori SS2000超声破碎物上清；

rHspA蛋白的氨基酸序列为序列1的蛋白。

GST融合表达蛋白GST-HP11的氨基酸序列为序列3，其中序列3第1-229位为GST标签，第230-231位为Linker，第232-242位为HP11。

GST融合表达蛋白GST-HP19的氨基酸序列为序列4，其中序列4第1-229位为GST标签，第230-231位为Linker，第232-242位为HP19。

采用rHspA蛋白作阳性对照，GST蛋白做阴性对照。

将H.pylori SS2000超声破碎物上清(SS2000)、rHspA、GST-HP11融合蛋白、GST-HP19融合蛋白和GST在变性条件下通过15％SDS-PAGE分离，转移到转移膜(MerckMillpore)上，然后用封闭缓冲液(溶于PBST的5％脱脂牛奶，pH7.4))37℃封闭1小时，以防止非特异性蛋白结合。将膜与用上述2采集的小鼠HP11-KLH偶联肽免疫血清(1:500稀释)或HP19-KLH偶联肽免疫血清(1:500稀释)在37℃孵育1小时，室温下用PBST洗涤3次。同HRP偶联的兔抗小鼠IgG(1:5,000稀释，Abcam)在37℃作用1小时，使用HRP蛋白免疫印迹分析试剂盒(Easybio，中国)检测。

结果如图3B和3C所示，HP11-KLH免疫血清(HP11-KLH抗血清)和HP19-KLH免疫血清(HP19-KLH抗血清)可以对H.pylori SS2000的天然HspA(SS2000)、大肠杆菌中表达的rHspA及其自身的GST融合蛋白(GST-HP11或GST-HP19)产生免疫印迹反应，但不能与GST发生反应(图3B和3C)。

接着，用rHspA免疫小鼠制备的抗血清，与来自SS2000的天然HspA、rHspA蛋白以及两种GST融合蛋白GST-HP11和GST-HP19进行免疫印迹。结果证实，两种融合蛋白GST-HP11和GST-HP19，同SS2000天然HspA、rHspA蛋白均可以与rHspA抗血清发生免疫印迹反应，而单独GST不与rHspA抗血清发生反应(图3D)。

5、淋巴细胞增殖反应试验

为了进一步了解抗原表位诱导产生的免疫反应，检测了来自抗原表位与KLH偶联肽免疫小鼠脾淋巴细胞的抗原表位刺激特异性淋巴细胞增殖活性。用相应的抗原表位刺激HP11-KLH或HP19-KLH免疫小鼠的脾细胞，同时用相同的抗原表位刺激PBS免疫的小鼠脾细胞作为阴性对照，刀豆蛋白A(ConA，Solarbio，货号：C8110)刺激作为阳性对照。具体如下：

使用注射器塞轻轻挤压上述2制备的HP11-KLH偶联肽免疫小鼠脾组织、HP19-KLH偶联肽免疫小鼠脾细胞脾组织，过细尼龙网以制备单细胞悬液。将细胞接种在96孔细胞培养板中，培养基为含有10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco，美国)，每孔接种4×10⁵个细胞。在不加任何刺激剂(阴性对照)与加10μg/mL表位肽HP11多肽或HP19多肽或0.625μg/mLConA刺激条件下(向细胞中加入对应浓度表位肽或者ConA)，37℃5％CO₂条件下培养72小时。用PBS免疫的小鼠作为阴性对照组(negative control)。在培养的最后四小时内，每孔加入20μl Cell Counting Kit-8(CCK8，Dojindo，日本)溶液，并用SpectraMaxi3x(MolecularDevices，美国)测量A450。脾淋巴细胞刺激指数(SI)为刺激孔的OD值除以对照孔的OD值。

结果如图4所示，ConA能够刺激小鼠脾细胞发生非特异性强烈增值，抗原表位肽刺激相应的抗原表位肽-KLH偶联肽免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性显着高于阴性对照组(P<0.01，图4)。

四、自然感染者抗原表位的抗体检测

用来自H.pylori自然感染者的血清，检测了HspA中鉴定的两个B细胞表位的抗体表达谱。

本研究经解放军总医院第四医学中心伦理委员会批准，并获得患者知情同意。采集住院患者血清，采用H.pylori IgG ELISA试剂盒(IBL)检测是否存在抗H.pylori抗体。实验操作按照试剂盒说明书进行。当临界指数(COI)>1.2时，血清被认为是H.pylori阳性，当临界指数(COI)<0.8时，血清被认为是H.pylori阴性。

选取85例H.pylori阳性血清(命名为P1-P85)用ELISA方法检测HspA抗体和表位抗体，包被抗原分别为rHspA、表位肽HP11和HP19，17例H.pylori抗体阴性血清作为阴性对照。HspA抗体和表位抗体阳性判断限为：OD值>阴性对照血清平均OD值*2.1。

结果如下：85例H.pylori感染患者中ELISA检测42例HspA抗体阳性，阳性率为49.4％。17例H.pylori IgG ELISA试剂盒检测阴性血清(N1-N17)，作为阴性对照。在42例HspA血清阳性患者中，9例检测到针对HP11抗原表位的抗体呈阳性，14例HP19抗原表位的抗体阳性，阳性率分别为21.4％和33.3％。下图为HspA血清阳性患者中两个表位的抗体反应谱(图5)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 幽门螺杆菌HspA的 B细胞表位多肽HP11及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Lys Phe Gln Pro Leu Gly Glu Arg Val Leu Val Glu Arg Leu Glu

1 5 10 15

Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly Ile Ile Ile Pro Asp Asn Ala Lys

20 25 30

Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val Lys Ala Val Ser His Lys Ile Ser

35 40 45

Glu Gly Cys Lys Cys Val Lys Glu Gly Asp Val Ile Ala Phe Gly Lys

50 55 60

Tyr Lys Gly Ala Glu Ile Val Leu Asp Gly Thr Glu Tyr Met Val Leu

65 70 75 80

Glu Leu Glu Asp Ile Leu Gly Ile Val Gly Ser Gly Ser Cys Cys His

85 90 95

Thr Gly Asn His Asp His Lys His Ala Lys Glu His Glu Ala Cys Cys

100 105 110

His Asp His Lys Lys His

115

<210> 2

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgaagtttc aaccattagg agaaagggtc ttagtagaaa gacttgaaga agagaacaaa 60

accagttcag gcattatcat ccctgataac gctaaagaaa agcctttgat gggcgtagtc 120

aaagcggtta gccataaaat cagtgagggt tgcaaatgcg tcaaagaagg cgatgtgatc 180

gcttttggca aatataaagg tgcagaaatc gttttagatg gcaccgaata catggtgcta 240

gaactagaag acattctggg cattgtgggt tcaggctctt gttgtcatac aggtaatcat 300

gatcataagc atgctaaaga gcatgaagct tgctgtcatg atcacaaaaa acactaa 357

<210> 3

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Lys Phe Gln Pro Leu Gly Glu Arg Val

225 230 235 240

Leu Val

<210> 4

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly Ile Ile

225 230 235 240

Ile Pro

Claims

1.HspA抗原表位肽，为序列1第2-12位所示的多肽。

2.HspA抗原，为将权利要求1所述的HspA抗原表位肽与载体蛋白偶联而成；所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白。

3.权利要求1所述的HspA抗原表位肽或权利要求2所述的HspA抗原在作为免疫原制备抗HspA的抗体中的应用。

4.以权利要求1所述的HspA抗原表位肽为活性成分的物质在如下（a）-（d）中任一种的应用：

（a）制备用于诊断或辅助诊断HspA表达异常相关疾病的产品；

（b）制备用于预防HspA表达异常相关疾病的产品；

（c）制备用于诊断或辅助诊断H.pylori感染引发相关疾病的产品；

（d）制备用于预防H.pylori感染引发相关疾病的产品。

5.权利要求1所述的HspA抗原表位肽或权利要求2所述的HspA抗原在制备具有如下至少一种功能产品中的应用；

（a）用于诊断或辅助诊断HspA表达异常相关疾病；

（b）用于预防HspA表达异常相关疾病；

（c）用于诊断或辅助诊断H.pylori感染引发相关疾病；

（d）用于预防H.pylori感染引发相关疾病。

6.编码权利要求1所述HspA抗原表位肽的核酸分子。

7.含有权利要求6所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞系。