[go: up one dir, main page]

CN114250266A - 一种转座酶活性测定方法 - Google Patents

一种转座酶活性测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114250266A
CN114250266A CN202111561717.XA CN202111561717A CN114250266A CN 114250266 A CN114250266 A CN 114250266A CN 202111561717 A CN202111561717 A CN 202111561717A CN 114250266 A CN114250266 A CN 114250266A
Authority
CN
China
Prior art keywords
transposase
sequence
substrate
activity
recognition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111561717.XA
Other languages
English (en)
Inventor
瞿志鹏
江明扬
唐秋雨
易文洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111561717.XA priority Critical patent/CN114250266A/zh
Publication of CN114250266A publication Critical patent/CN114250266A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种转座酶活性测定方法，尤其是Tn5转座酶活性测定方法，包括：将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应，将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。本发明的方法可以对转座酶的活性进行较为精确的测定，从而评价转座酶的活性，并且本发明的方法所需的测活时间短。

Description

一种转座酶活性测定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种转座酶活性测定方法。
背景技术
目前高通量测序技术的建库过程，根据打断方式的不同可以分为两种方法，分别为物理法和酶法，物理法包括雾化和超声打断DNA，酶法包括DNA片段化酶(Fragmentase)、DNA剪切酶(Shearase)和转座酶(Tn5 Transposase)等，除转座酶外，其他的所有建库方法都包含打断DNA，修复DNA片段和DNA片段加接头几个步骤。使用转座酶建库时，超高活性Tn5转座酶能够对DNA分子进行非特异性的随机切割，仅一步就可以完成打断DNA和DNA片段加接头的过程，使建库反应在2个小时内完成。与传统的机械法片段化DNA相比较，Tn5转座酶处理样品的通量更大、流程更为简便、更节约时间。另外传统的超声机械打断仪价格昂贵，Tn5转座酶处理样本更节约成本。因此可替代传统的超声机械法，应用于高通量测序中的DNA文库构建。
根据Tn5转座酶法进行DNA片段化，将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应这一特点，建库技术得到了很大的进步，进一步拓展了NGS的适用范围，同时在分子诊断、表观遗传领域也衍生出许多新技术，产生更加广泛、更加多元化的应用。例如：长片段读取、单细胞微量建库、ATAC-seq、CUT&Tag等。
目前，针对转座酶的测活方法，已有一些文献和专利报道。例如一些报道中，酶活定量测定方法通过转位反应/转化实验，采用阳性菌斑计数的方法测定。使用转座酶和报告基因构建成转座复合体，同时将报告基因导入质粒中，将构建的含有报告基因的质粒转化进入到大肠杆菌细胞中，通过检测细菌(或显色细菌)在抗性平板上的菌斑数量来间接检测转座酶的活性。通过阳性菌斑计数的方法测定转座酶活性，该方法涉及的大肠杆菌转化实验本身的稳定性和重复性较差，转化的效率与感受态细胞的稳定性和效价密切相关，同时转化产生的菌落往往无法精确计数，因此该方法更适合于定性分析而不适合定量分析转座酶的活性；并且实验涉及到细菌培养，整体测活反应时间较长。
CN108265101A公开了一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法，使用一种易于检测的Tn5转座酶底物，当Tn5转座酶和测活底物混合后，Tn5转座酶识别测活底物序列中的末端序列，进而催化转座反应，将底物DNA切断，释放带有标记的DNA片段。未反应的底物可以通过能够识别底物标记的介质，经过介质吸附和介质移除的方式去除。通过检测被释放的DNA片段的含量，同标准数据比对，来计算出Tn5转座酶的酶活。
目前针对转座酶活性测定和功能评价之间，缺乏统一的标准和科学的方法，使得Tn5转座酶的生产中，不同批次间酶活测定和比较难以控制。本发明目的在于提供一种稳定、快速测定转座酶活性的方法，能够检测并控制转座酶生产批次间差异，表征转座酶的稳定性，助力更加高标准、高质量的单细胞/分子级的产品开发。
发明内容
本发明提供了一种转座酶活性测定方法，所述方法包括：
(1)将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应；
(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
在一些实施方案中，所述测定方法还包含构建含有转座酶识别序列的底物的步骤。
本发明还提供了一种转座酶活性检测试剂盒，试剂盒包含：含有转座酶识别序列的底物、检测引物。
在一些实施方案中，所述转座酶可选自Tn5、MuA、IS5、IS91或哈氏弧菌转座酶，或其活性突变体。
在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶。
在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶，转座酶识别序列可选自Tn5转座酶序列的内端(inside end，IE)、外端(outside end，OE)和嵌合端(mosaic end，ME)序列，即IE、OE或ME序列。
在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物中含有不限数量的识别序列，例如可以是1～100个，优选含有2个。
在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X-识别序列1-Y-识别序列2-Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列或不存在，并且X、Y、Z至少一个是随机核酸序列，识别序列1或2为转座酶识别序列。
在一些实施方案中，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X-识别序列1-Y-识别序列2-Z，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2为转座酶识别序列。
在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶，所述的含有转座酶识别序列的底物结构是X-识别序列1-Y-识别序列2-Z，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2选自IE、OE或ME序列。在一些实施方案中，所述的转座酶识别序列1和2是相同的。在一些实施方案中，所述的转座酶识别序列1和2均为ME序列。
本发明还提供了一种Tn5转座酶活性测定方法，所述方法包括：
(1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应；
(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
在一些实施方案中，所述的含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X-ME-Y-ME-Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列。在一些实施方案中，所述的含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X-ME-Y-ME-Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列，且X、Y、Z互不相同。
在一些实施方案中，所述的X的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选300～400bp。在一些实施方案中，所述的Y的序列长度选自50～5000bp，优选100～1000bp，更优选200～800bp。在一些实施方案中，所述的Z的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选100～200bp。
在一些实施方案中，所述Tn5转座酶活性测定方法，包括：
(1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应，所述底物结构是：A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列；
(2)将上述打断后的产物，分别以F1/R1、F2/R2为引物，进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
在一些实施方案中，所述Tn5转座酶活性测定方法，还包括构建含有Tn5转座酶识别序列ME的底物的步骤。
在一些实施方案中，所述构建含有Tn5转座酶识别序列ME的底物：A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列，包括合成上游底物A序列-ME序列(19bp)、下游底物ME序列(19bp)-B序列、插入式底物ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)，并利用上游底物、下游底物、插入式底物合成完整底物A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列。
在一些实施方案中，所述合成上游底物A序列-ME序列(19bp)，包括以小鼠基因组为模板，以F3/R4为引物，进行扩增，合成上游底物，对底物进行纯化。
在一些实施方案中，所述合成下游底物ME序列(19bp)-B序列，包括以293T细胞基因组为模板，以F4/R3为引物，进行扩增，合成下游底物，对底物进行纯化。
在一些实施方案中，所述合成插入式底物ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)，包括以小鼠基因组为模板，以F-513/R-513为引物，进行扩增，合成插入式底物，对底物进行纯化。
在一些实施方案中，所述合成完整底物A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列，包括以(上游底物1ng+插入式底物1ng+下游底物1ng)为模板，以F3/R3为引物，进行重叠延伸PCR，合成完整底物，对底物进行纯化。
在一些实施方案中，所述构建含有Tn5转座酶识别序列ME的底物，还包括检测并纯化完整底物。
在一些实施方案中，所述试剂盒中，含有转座酶识别序列的底物结构是A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列，检测引物是F1/R1、F2/R2。
术语定义：
转座酶，指野生型或者突变型具有转座功能的酶。
随机核酸序列，是指不限定来源、不限定核酸排序的随机的已知序列。
酶活：一定条件下，例如37℃条件下1小时，完全切割1μg含有转座酶识别序列的底物所需的转座酶量定义为1个活性单位(U)。底物一般指的是含有转座酶识别序列的DNA片段。完全切割指的是与转座酶反应后的产物进行设定的PCR循环，例如40个循环后检测不到(意味着含有转座酶识别序列的底物基本全部被切割，剩余的微量未被切割的底物在经历40个循环后仍然没有达到设定值。切割的效果可以通过公式进行计算：切割率＝1-2^(-ΔCt)，表示发生切割的片段占总片段的百分比)，将这种情况下对应的转座酶量视为1个活性单位(U)。
A序列(SEQ ID NO:1)：
5’-Gttctcctactcagccagtggcacagcctgaggcctggggcagcggctggcagctccacgctcctctgcattgccgagtccagaagccccgcatggatcatctgaacctgatgttttgtttctcggatgcgctggggaggaaccttgccagcctccaggaccaggggaggatgtttctactgtgggcagcagcctacctcccagccaggtcaggaggaaaactatcctggggtttttcttaatttatttcatccagtttgagaccacacatgtggcctcagtgcccagaacaattagattcatgtagaaaactattaaggactgacgcgaccatgtgca-3’
B序列(SEQ ID NO:2)：
5’-gctgagagctgtagtgtttaccgaaggctttgtctttgggaatgtcaggatataggtacttcagagggttttcaggaatgttttcagccataataactttgtagtctcgcaggatgtcagcgaatggcagagcagacaaccggcctttatt-3’
C序列(SEQ ID NO:3)：
5’-attgttaccaactgggacgacatggagaagatctggcaccacaccttctacaatgagctgcgtgtggcccctgaggagcaccctgtgctgctcaccgaggcccccctgaaccctaaggccaaccgtgaaaagatgacccaggtcagtatcccgggtaacccttctctttggccagcttctcagccacgccctttctcaattgtctttcttctgccgttctcccataggactcccttctatgagctgagtctcccttggatctttgcagtttctgctctttcccagacgaggtctttttttctctcaattgcctttctgactaggtgtttaaaccctacagtgctgtgggtttaggtactaacaatggctcgtgtgacaaagctaatgaggctggtgataagtggccttggagtgtgtattgagtagatgcacagtaggtctaagtggagcccctgtcctgagactcccagcacactgaacttagctgtgttcttgcactccttgcatgtctca-3’
ME序列(SEQ ID NO:4)：5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’
IE序列(SEQ ID NO:5)：5’-CTGTCTCTTGATCAAGATCT-3’
OE序列(SEQ ID NO:6)：5’-CTGACTCTTATACACAAGT-3’
F1(SEQ ID NO:7)：5’-TATTAAGGACTGACGCGACCATGTG-3’
R1(SEQ ID NO:8)：5’-CTCGGTGAGCAGCACAGGGTGCT-3’
F2(SEQ ID NO:9)：5’-CTAAGTGGAGCCCCTGTCCTGAGA-3’
R2(SEQ ID NO:10)：5’-CATTCCTGAAAACCCTCTGAAGTACC-3’
F3(SEQ ID NO:11)：5’-GTTCTCCTACTCAGCCAGTGGCAC-3’
R4(SEQ ID NO:12)：
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGTGCACATGGTCGCGTCAGTCC-3’
F4(SEQ ID NO:13)：
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGGCTGAGAGCTGTAGTGTTTACCGA-3’
R3(SEQ ID NO:14)：5’-AATAAAGGCCGGTTGTCTGCT-3’
F-513(SEQ ID NO:15)：
5’-CTGTCTCTTATACACATCTATTGTTACCAACTGGGACGACATGGAGA-3’
R-513(SEQ ID NO:16)：
5’-CTGTCTCTTATACACATCTTGAGACATGCAAGGAGTGCAA-3’
有益效果
1.通过将转座酶的活性转化为qPCR的Ct值，可以对转座酶的活性进行较为精确的测定，评价转座酶的活性；
2.测活的时间短。
附图说明
附图1：完整底物结构图
附图2：经过37℃处理0min/30min/2h的Tn5转座酶活性测试结果
具体实施方式
实施例1：含有转座酶识别序列的底物构建
1.合成上游底物
上游底物结构：A序列-ME序列(19bp)
以C57BL/6小鼠基因组为模板，以F3/R4为引物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P515试剂，合成上游底物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号DC301试剂盒对上游底物进行胶回收。
F3：5’-GTTCTCCTACTCAGCCAGTGGCAC-3’
R4：5’-AGATGTGTATAAGAGACAGTGCACATGGTCGCGTCAGTCC-3’
2.合成下游底物
下游底物结构：ME序列(19bp)-B序列
以293T细胞基因组为模板，以F4/R3为引物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P515试剂，合成下游底物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号DC301试剂盒对下游底物进行胶回收。
F4：5’-AGATGTGTATAAGAGACAGGCTGAGAGCTGTAGTGTTTACCGA-3’
R3：5’-AATAAAGGCCGGTTGTCTGCT-3’
3.合成插入式底物
插入式底物结构：ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)
以C57BL/6小鼠基因组为模板，以F-513/R-513为引物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P515试剂，合成插入式底物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号DC301试剂盒对插入式底物进行胶回收。
F-513：5’-CTGTCTCTTATACACATCTATTGTTACCAACTGGGACGACATGGAGA-3’
R-513：5’-CTGTCTCTTATACACATCTTGAGACATGCAAGGAGTGCAA-3’
4.合成完整底物
完整底物结构：A序列-ME序列(19bp)-C序列-ME序列(19bp)-B序列，结构示意图见附图1。
以(上游底物1ng+插入式底物1ng+下游底物1ng)为模板，以F3/R3为引物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P515试剂进行重叠延伸PCR，合成完整底物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号DC301试剂盒对完整底物进行胶回收。
5.检测并纯化完整底物
(1)取上述完整底物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒(货号C601)进行克隆。
(2)使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司Fast-T1化学感受态细胞(货号C505)将上述克隆转化后涂氨苄抗性平板，过夜培养后，随机挑选10个克隆进行一代测序。
(3)选择测序结果序列比对完全正确的单克隆，以F3/R3为引物，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号P515试剂进行扩增，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号DC301试剂盒对产物进行胶回收获得单一的底物。
完整底物序列即为SEQ ID NO:17。
实施例2：转座酶活性测试
分别测试经过37℃处理0min/30min/2h的转座酶活性。
1.转座酶与实施例1最终得到的完整底物结合，体系如下：
试剂 体积
转座酶(500ng/μl) 1μl
完整底物50ng/μl 1μl
CouplingBuffer 18μl
总体积 20μl
转座酶和Coupling Buffer来自南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号S601。
同样取一份实施例1最终得到的完整底物50ng，作为对照，体系如下：
试剂 体积
转座酶(500ng/μl) 0μl
完整底物50ng/μl 1μl
CouplingBuffer 19μl
总体积 20μl
2.进行打断反应，30℃60min。
3.取打断产物，使用灭菌水稀释500倍，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司货号Q712，分别以上游检测引物和下游检测引物进行qPCR检测，体系如下：
加入组份 体积
2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl
F 0.4μl
R 0.4μl
RNase-free ddH<sub>2</sub>O 8.2μl
稀释后的打断产物 1μl
总体积 20μl
反应程序如下：
Figure BDA0003420663520000081
上游qPCR检测引物(F1/R1)：
F1：5’-TATTAAGGACTGACGCGACCATGTG-3’
R1：5’-CTCGGTGAGCAGCACAGGGTGCT-3’
下游qPCR检测引物(F2/R2)：
F2：5’-CTAAGTGGAGCCCCTGTCCTGAGA-3’
R2：5’-CATTCCTGAAAACCCTCTGAAGTACC-3’
4.数据处理：计算△Ct＝Ct(加Tn5转座酶)-Ct(不加酶-仅底物)
实验结果：Tn5转座酶活性测试结果见附图2。
本发明通过将△Ct与转座酶的活性建立联系，提供了一种转座酶活性的测定方法。本领域技术人员能够理解，可以通过建立标准曲线或者标准值的方式，将待测转座酶的△Ct与标准进行比较，从而得到待测转座酶的活性。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司
<120> 一种转座酶活性测定方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttctcctac tcagccagtg gcacagcctg aggcctgggg cagcggctgg cagctccacg 60
ctcctctgca ttgccgagtc cagaagcccc gcatggatca tctgaacctg atgttttgtt 120
tctcggatgc gctggggagg aaccttgcca gcctccagga ccaggggagg atgtttctac 180
tgtgggcagc agcctacctc ccagccaggt caggaggaaa actatcctgg ggtttttctt 240
aatttatttc atccagtttg agaccacaca tgtggcctca gtgcccagaa caattagatt 300
catgtagaaa actattaagg actgacgcga ccatgtgca 339
<210> 2
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgagagct gtagtgttta ccgaaggctt tgtctttggg aatgtcagga tataggtact 60
tcagagggtt ttcaggaatg ttttcagcca taataacttt gtagtctcgc aggatgtcag 120
cgaatggcag agcagacaac cggcctttat t 151
<210> 3
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attgttacca actgggacga catggagaag atctggcacc acaccttcta caatgagctg 60
cgtgtggccc ctgaggagca ccctgtgctg ctcaccgagg cccccctgaa ccctaaggcc 120
aaccgtgaaa agatgaccca ggtcagtatc ccgggtaacc cttctctttg gccagcttct 180
cagccacgcc ctttctcaat tgtctttctt ctgccgttct cccataggac tcccttctat 240
gagctgagtc tcccttggat ctttgcagtt tctgctcttt cccagacgag gtcttttttt 300
ctctcaattg cctttctgac taggtgttta aaccctacag tgctgtgggt ttaggtacta 360
acaatggctc gtgtgacaaa gctaatgagg ctggtgataa gtggccttgg agtgtgtatt 420
gagtagatgc acagtaggtc taagtggagc ccctgtcctg agactcccag cacactgaac 480
ttagctgtgt tcttgcactc cttgcatgtc tca 513
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agatgtgtat aagagacag 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtctcttg atcaagatct 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgactctta tacacaagt 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tattaaggac tgacgcgacc atgtg 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcggtgagc agcacagggt gct 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctaagtggag cccctgtcct gaga 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cattcctgaa aaccctctga agtacc 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttctcctac tcagccagtg gcac 24
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agatgtgtat aagagacagt gcacatggtc gcgtcagtcc 40
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agatgtgtat aagagacagg ctgagagctg tagtgtttac cga 43
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aataaaggcc ggttgtctgc t 21
<210> 15
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgtctctta tacacatcta ttgttaccaa ctgggacgac atggaga 47
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgtctctta tacacatctt gagacatgca aggagtgcaa 40
<210> 17
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttctcctac tcagccagtg gcacagcctg aggcctgggg cagcggctgg cagctccacg 60
ctcctctgca ttgccgagtc cagaagcccc gcatggatca tctgaacctg atgttttgtt 120
tctcggatgc gctggggagg aaccttgcca gcctccagga ccaggggagg atgtttctac 180
tgtgggcagc agcctacctc ccagccaggt caggaggaaa actatcctgg ggtttttctt 240
aatttatttc atccagtttg agaccacaca tgtggcctca gtgcccagaa caattagatt 300
catgtagaaa actattaagg actgacgcga ccatgtgcac tgtctcttat acacatctat 360
tgttaccaac tgggacgaca tggagaagat ctggcaccac accttctaca atgagctgcg 420
tgtggcccct gaggagcacc ctgtgctgct caccgaggcc cccctgaacc ctaaggccaa 480
ccgtgaaaag atgacccagg tcagtatccc gggtaaccct tctctttggc cagcttctca 540
gccacgccct ttctcaattg tctttcttct gccgttctcc cataggactc ccttctatga 600
gctgagtctc ccttggatct ttgcagtttc tgctctttcc cagacgaggt ctttttttct 660
ctcaattgcc tttctgacta ggtgtttaaa ccctacagtg ctgtgggttt aggtactaac 720
aatggctcgt gtgacaaagc taatgaggct ggtgataagt ggccttggag tgtgtattga 780
gtagatgcac agtaggtcta agtggagccc ctgtcctgag actcccagca cactgaactt 840
agctgtgttc ttgcactcct tgcatgtctc aagatgtgta taagagacag gctgagagct 900
gtagtgttta ccgaaggctt tgtctttggg aatgtcagga tataggtact tcagagggtt 960
ttcaggaatg ttttcagcca taataacttt gtagtctcgc aggatgtcag cgaatggcag 1020
agcagacaac cggcctttat t 1041

Claims (11)

1.一种转座酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应；
(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述转座酶选自Tn5、MuA、IS5、IS91或哈氏弧菌转座酶，或其活性突变体，优选Tn5转座酶或其活性突变体。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述的转座酶是Tn5转座酶，转座酶识别序列可选自IE、OE、ME序列。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述含有转座酶识别序列的底物结构是X-识别序列1-Y-识别序列2-Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列或不存在，并且X、Y、Z至少一个是随机核酸序列，识别序列1或2为转座酶识别序列。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其中X、Y、Z均选自随机核酸序列且各不相同，识别序列1或2选自IE、OE或ME序列，优选ME序列。
6.一种Tn5转座酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应；
(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其中，含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结构是X-ME-Y-ME-Z，其中X、Y、Z选自随机核酸序列。
8.根据权利要求5或7任一项所述的测定方法，其中，所述的X的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选300～400bp；所述的Y的序列长度选自50～5000bp，优选100～1000bp，更优选200～800bp；所述的Z的序列长度选自50～1000bp，优选100～500bp，更优选100～200bp。
9.一种Tn5转座酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将Tn5转座酶与含有Tn5转座酶识别序列ME的底物结合，进行打断反应，所述底物结构是A序列-ME序列-C序列-ME序列-B序列；
(2)将上述打断后的产物，分别以F1/R1、F2/R2为引物，进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。
10.一种转座酶活性检测试剂盒，其特征在于，包含：含有转座酶识别序列的底物、检测引物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，含有转座酶识别序列的底物是A序列-ME序列-C序列-ME序列-B序列，检测引物是F1/R1、F2/R2。
CN202111561717.XA 2021-12-20 2021-12-20 一种转座酶活性测定方法 Pending CN114250266A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111561717.XA CN114250266A (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种转座酶活性测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111561717.XA CN114250266A (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种转座酶活性测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114250266A true CN114250266A (zh) 2022-03-29

Family

ID=80793112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111561717.XA Pending CN114250266A (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种转座酶活性测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114250266A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591993A (zh) * 2022-05-10 2022-06-07 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法
CN116732132A (zh) * 2023-04-21 2023-09-12 百力格生物科技(上海)股份有限公司 Tn5转座酶活性测定的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060035245A1 (en) * 2004-04-20 2006-02-16 Ason Brandon L Modulators of enzymatic nucleic acid elements mobilization
CN105705515A (zh) * 2013-11-07 2016-06-22 安捷伦科技有限公司 多种用于dna操作的转座酶适体
CN108265101A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 天津强微特生物科技有限公司 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060035245A1 (en) * 2004-04-20 2006-02-16 Ason Brandon L Modulators of enzymatic nucleic acid elements mobilization
CN105705515A (zh) * 2013-11-07 2016-06-22 安捷伦科技有限公司 多种用于dna操作的转座酶适体
CN108265101A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 天津强微特生物科技有限公司 一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GREGORY PETERSON等: "Tn5 Transposase Active Site Mutations Suggest Position of Donor Backbone DNA in Synaptic Complex", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591993A (zh) * 2022-05-10 2022-06-07 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法
CN114591993B (zh) * 2022-05-10 2022-08-12 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法
CN116732132A (zh) * 2023-04-21 2023-09-12 百力格生物科技(上海)股份有限公司 Tn5转座酶活性测定的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7405485B2 (ja) 部位特異的核酸を用いた核酸濃縮と続いての捕捉方法
EP2963709B1 (en) Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
JP7460539B2 (ja) 核酸を結合、修飾、および切断する物質の基質選択性および部位のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの高感度アッセイ
WO2023288222A1 (en) Modified adapters for enzymatic dna deamination and methods of use thereof for epigenetic sequencing of free and immobilized dna
CN115181783A (zh) 胞嘧啶修饰的免亚硫酸氢盐的碱基分辨率鉴定
CN107075512B (zh) 一种接头元件和使用其构建测序文库的方法
CN110117574B (zh) 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒
CN114250266A (zh) 一种转座酶活性测定方法
CN111549025B (zh) 链置换引物和细胞转录组文库构建方法
CN113207299A (zh) 用于管理下一代测序中的低样本输入的归一化对照
JP2023506631A (ja) 共有結合で閉端された核酸分子末端を使用したｎｇｓライブラリー調製
CN118562933A (zh) 低深度全基因组测序和靶向测序相结合的建库方法
US20250145988A1 (en) Methods of enriching nucleic acids
CN110029149A (zh) 一种鉴定碱基修饰的方法
CN116529430A (zh) Umi分子标签及其应用、接头、接头连接试剂及试剂盒和文库构建方法
CN118727162B (zh) 单细胞4c文库构建方法和检测方法
WO2022242739A1 (zh) 用于检测碱基编辑器编辑位点的方法和试剂盒
WO2025076733A1 (zh) 一种快速进行核酸文库构建的方法
WO2024108145A2 (en) Methods for selective amplification for efficient rearrangement detection
HK40081618A (zh) 胞嘧啶修飾的免亞硫酸氫鹽的碱基分辨率鑒定
CN117757895A (zh) 一种单链dna文库构建试剂盒及其应用
CN112662749A (zh) 一种具有单碱基分辨率的核酸修饰检测方法
CN116804216A (zh) 一种含5hmC单细胞的检测方法
CN118434882A (zh) 一种生成标记的核酸分子群的方法及其试剂盒
CN114411266A (zh) 一种基于启动子构建文库的方法及其文库

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220329