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CN114231042B - 一种接枝共聚物及其载药组合体与制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种接枝共聚物及其载药组合体与制备方法。所述共聚物以亲水的海藻酸丙二醇酯作为主链、疏水的聚四氢呋喃作为支链。本发明的接枝共聚物具有亲水性的酰化海藻酸丙二醇酯主链和疏水性的聚四氢呋喃支链，具有良好的自组装能力，能够形成纳米尺度的载药组合体，具有生物相容性、pH敏感性和靶向释药行为，并可显著提高药效。

Description

一种接枝共聚物及其载药组合体与制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种接枝共聚物及其载药组合体与制备方法，具体地，涉及一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物、一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体及其制备方法。
背景技术
药物载体对体内药物安全低毒运送起到重要作用。一些不溶性的药物、可生物降解的药物、生物利用率极低的药物和对生物系统具有高毒性的药物(如抗癌药)通过药物载体进行运送，将药物包覆并安全运送到靶细胞中，保护药物不被吞噬细胞清除或过早降解，调节药物释放，提高药物稳定性，减少药物直接对体内组织或器官的毒性作用，但也可能导致降低抗癌药物的治疗效果。参见：Journal of Drug Delivery Science andTechnology,2008,18:59–68；Journal of Controlled Release,2017,253:97-109。药物载体的大小是细胞摄取的关键因素，只有纳米级的药物载体才适合细胞摄取。对于纳米级聚合物基药物载体，因其增强的通透性和保留效应而增加对癌细胞的杀灭能力。参见：ACSNano,2015,9:8655-8671；Expert opinion on biological therapy,2005,5:1557-1569；Journal of Artificial Organs,2005,8:77-84。体内正常部位和病理部位的生理pH值不同，因此具有pH响应性的药物输送及靶向释药行为具有重要意义。参见：InternationalJournal of Pharmaceutics,2018,535:253–260；Drug Discovery Today,2002,7:569-579。
天然多糖具有生物相容性、生物耐受性、生物可降解性、独特的生物活性，如壳聚糖、海藻酸钠、果胶、葡聚糖、淀粉等是制备用于药物载体优选的材料之一，含有丰富官能团(如羟基、胺基和羧基)的天然多糖在制备药物载体时可以提供简单的颗粒形式和易于调节的载体结构，其低免疫原性和低毒性也为药物载体的开发提供了优势。近年来，基于多糖制备微球、凝胶、胶束、囊泡、脂质体、纤维、乳液等药物载体，具有pH响应、光响应、微波响应、酶响应、磁场响应、超声响应、电场响应或氧化还原响应等行为，实现药物可控释放和药物缓释。参见：Polymers,2021,13:3342；Materials Science and Engineering C,2016,68:964–981；Current Medicinal Chemistry,2012,19:3212-3229；Progress in PolymerScience,2019,99:101164；W Journal of Functional Biomaterials,2019,10:34。但是，由于多糖分子间存在大量氢键限制了其溶解性，常规手段难以实现对疏水药物的包载，需进行疏水化改性，如引入C8、C12、C16等烷烃基团制备两亲性的多糖衍生物用于药物载体。参见：Polymer,2000,41:899-906；International Journal of BiologicalMacromolecules,2013,57:92-98。
海藻酸钠是一种源自海洋的聚阴离子多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性和易凝胶性，在生物医学科学和工程领域有着广泛的应用。海藻酸丙二醇酯是一种由海藻酸钠与环氧丙烷在酸性条件下发生酯化反应制备的亲水性多糖衍生物，酯化度约50～85％。
通过对海藻酸钠进行接枝改性，可以改善其性能。根据支链溶解性的差异，海藻酸钠接枝共聚物主要分为水溶性接枝共聚物和两亲性接枝共聚物。水溶性海藻酸钠接枝共聚物主要包括海藻酸钠-g-聚丙烯酰胺接枝共聚物、海藻酸钠-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝共聚物、海藻酸钠-g-聚乙二醇接枝共聚物，只能通过与药物进行共混、吸附、黏附等手段来包覆药物，难以达到pH响应的可控药物输送和靶向药物控制释放的效果。参见：Journal ofBiomaterials Science,2010,21:1799–1814；Current World Environment Journal,2014,9:109–113；ACS Applied Materials&Interfaces,2017,9:35673-35682；Carbohydrate Polymers,2017,175:337-346。通过在海藻酸盐主链上引入疏水部分(例如，烷基链、疏水聚合物链)合成的两亲性海藻酸钠衍生物，通过自组装形成颗粒、乳液、凝胶等，可以解决上述海藻酸钠的疏水性、机械强度及药物突释等问题。参见：Progress inPolymer Science,2012,37:106-126；Bioprocess and Biosystems Engineering,2010,33:457–463；Progress in Polymer Science,2018,76:151-173。两亲性海藻酸钠接枝共聚物主要包括：通过“grafting from”方法合成的海藻酸钠-g-聚甲基丙烯酸甲酯及通过“grafting onto”方法合成的酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃和酰化海藻酸钠-g-聚异丁烯。对于酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃的两亲性接枝共聚物，其中的支链聚四氢呋喃(PTHF)，或称为聚四甲基醚乙二醇(PTMG)或聚四亚甲基氧化物(PTMO)，具有优异的生物惰性、生物相容性、湿强度、柔韧性、抗菌性和水解稳定性，该共聚物也具有明显的微相分离结构、自组装能力、受限结晶行为和增强的抗蛋白质吸收性能，可包载布洛芬(IBU)形成的载药微球并具有pH响应性释药行为，但只能形成微米级的载药微球。参见：CN 104419008 A；Biomacromolecules,2015,16:2040-2048；Applied Surface Science,2019,483:1027-1036；Carbohydrate Polymers，2019，219：201-209。
至今，尚未见有关涉及海藻酸丙二醇酯为主链的接枝共聚物及其应用的公开报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物及其载药组合体。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，该共聚物以海藻酸丙二醇酯作为主链、聚四氢呋喃作为支链。聚四氢呋喃也称为聚四甲基醚乙二醇或聚四亚甲基氧化物。本发明的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物为两亲性共聚物，其中作为主链的海藻酸丙二醇酯是亲水的，作为支链的聚四氢呋喃是疏水的。
支链聚四氢呋喃接枝的分子量和接枝密度都可以调控，支链的分子量优选在300～6000g/mol之间，更优选在500～4000g/mol之间，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝聚四氢呋喃支链的平均数目，优选2～35根/1000个海藻酸单糖，更优选3～27根/1000个海藻酸单糖。
根据本发明，所述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物是通过四氢呋喃开环聚合得到的聚四氢呋喃活性链与海藻酸丙二醇酯上的羟基发生亲核取代反应来制备。
根据本发明一种具体实施方式，所述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物由包括以下步骤的方法制得：
(1)合成酰化海藻酸丙二醇酯
将海藻酸丙二醇酯置于第一有机溶剂中，低温(优选-10℃～-5℃)下添加第二有机溶剂，缓慢加入癸酰氯，搅拌下反应，再将反应体系在甲醇和/或乙醇中沉析，并用甲醇和/或乙醇反复洗涤多次去除过量的癸酰氯和第一有机溶剂，然后向固体产物中添加第二有机溶剂，将上清液脱除溶剂后，将所得酰化海藻酸丙二醇酯(APGA)固体产物，真空干燥；
(2)合成聚四氢呋喃活性链
在氮气气氛下，将一定量引发剂和共引发剂添加到预先冷却的四氢呋喃或其与第三有机溶剂的混合溶液中，上述体系在搅拌下进行本体聚合或溶液聚合，得到含一定分子量的聚四氢呋喃活性链PTHF+/四氢呋喃的混合溶液或PTHF+/四氢呋喃/第三有机溶剂的混合溶液；
(3)合成酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物
将含有PTHF+活性链的PTHF+/四氢呋喃混合溶液或PTHF+/四氢呋喃/第三有机溶剂的混合溶液与APGA/第四有机溶剂的混合溶液混合，进行反应，然后对反应体系进行纯化分离，得到酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物(APGA-g-PTHF)。
更具体地，步骤(1)中，所述第一有机溶剂优选三乙胺和/或吡啶，所述第二有机溶剂优选二氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷中的至少一种。
更具体地，步骤(2)中，所述引发剂优选烯丙基溴、烯丙基氯、苄基溴和苄基氯中的至少一种，所述共引发剂优选高氯酸银，所述第三有机溶剂优选二氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷中的至少一种，反应温度为-4℃～4℃。
更具体地，步骤(3)中，所述第四有机溶剂优选二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷和四氢呋喃中的至少一种。
根据本发明一种更具体的实施方式，合成方法如下：
(1)合成酰化海藻酸丙二醇酯
将5.0g的海藻酸丙二醇酯置于一定量的三乙胺或吡啶中2h，-10～-5℃下添加50mL二氯甲烷，在2h内缓慢滴加17.8mL癸酰氯，磁搅拌下反应5h后，将反应体系用大量甲醇或乙醇沉淀，反复洗涤多次，去除过量的癸酰氯和三乙胺或吡啶，然后向固体残渣中添加80mL二氯甲烷，保存上清液。脱出溶剂后，将所得固体放在60℃下真空干燥24h，得到酰化海藻酸丙二醇酯(APGA)产物；
(2)合成聚四氢呋喃活性链
在氮气气氛下，将一定量引发剂烯丙基溴和共引发剂高氯酸银添加到预先冷却的四氢呋喃和二氯甲烷的混合溶剂中，上述体系在0℃下搅拌反应4h，得到一定分子量的聚四氢呋喃活性链PTHF+/四氢呋喃/二氯甲烷的混合溶液，所合成的聚四氢呋喃活性链的分子量可通过调控引发剂浓度和/或四氢呋喃聚合转化率进行调节，也可以参照本发明人前期研究成果(Chinese Journal of Polymer Science，2015，33:23-35)和推导公式来预测理论分子量；
(3)合成酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物
将一定体积PTHF+活性链/四氢呋喃/二氯甲烷的混合溶液与APGA/二氯甲烷的混合溶液进一步混合，反应3.5h，然后对反应体系进行纯化，得到酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物(APGA-g-PTHF)。
本发明中，可通过聚四氢呋喃活性链与海藻酸丙二醇酯的比例来调节共聚物的接枝密度，该比例越高，接枝密度越大。
聚四氢呋喃支链的分子量可以根据引发剂浓度或用量以及单体聚合转化率来调控。若需要合成低分子量聚四氢呋喃，则需要高的引发剂浓度；若需要合成高分子量聚四氢呋喃，则需要低的引发剂浓度。优选地，所述引发剂浓度为0.6～25.0mmol/L，所述单体四氢呋喃聚合转化率为4％～40％。
本发明的接枝共聚物具有亲水性的酰化海藻酸丙二醇酯主链和疏水性的聚四氢呋喃支链，具有良好的自组装能力，能够在水/有机溶剂体系中形成大小均匀的纳米球。所述有机溶剂优选二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的至少一种，更优选二氯甲烷或三氯甲烷。
本发明的第二方面提供一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体，包括作为载体的上述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物和药物。
本发明中，术语“载药组合体”是指含有聚合物载体和药物的物质。
所述药物的种类包括但不限于：布洛芬(IBU)、姜黄素(CUR)、紫杉醇(PTX)、阿霉素(DOX)、喜树碱(CPT)等，载药率在1％～52％之间，优选在4％～49％之间。载药率的大小，可以通过加入药物的量来调节，当药物加入量少时，载药率低；当药物加入量多时，载药率高，但在超过一定用量后达到极限值。
本发明的第三方面提供上述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体的制备方法，所述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物通过形成O/W乳液制备该共聚物载药组合体，并形成尺寸分布均匀的载药纳米球。所述纳米球的尺寸优选在250nm以下。
具体步骤如下：
(1)接枝共聚物与药物共溶解
25℃下，将20mg的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物和40mg的药物溶解在10mL二氯甲烷中。
(2)通过水包油(O/W)乳液制备载药组合体
在搅拌下，将上述溶液缓慢滴加到50mL去离子水中，形成均匀稳定的乳化体系，脱除溶剂后，用乙醇清洗药物残留物，以去除未载药物，得到载药组合体，完全干燥后称重并计算载药率。
(3)载药组合体的表征
取一部分载药组合体分散在去离子水中，滴在硅片上，干燥后喷金处理，在扫描电子显微镜下观察载药组合体的形态。
本发明取得的突出效果如下：
(1)酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物具有优异的生物相容性，细胞毒性很低。
(2)酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物在有机溶剂/水中具有优异的自组装能力，可以包载药物形成的纳米尺度的载药组合体(≤250nm)，可用于包载布洛芬(IBU)、姜黄素(CUR)、紫杉醇(PTX)、阿霉素(DOX)、喜树碱(CPT)等多种药物。载药率的大小，可以通过加入药物的量来调节，当药物加入量少时，载药率低；当药物加入量多时，载药率高，但在超过一定用量后达到极限值。对于APGA-g-PTHF/CUR和APGA-g-PTHF/IBU，可以形成尺寸分别为115～153nm(134±19nm)和173～233nm(203±30nm)的纳米球，载药率在1％～50％之间，优选在4％～47％之间。
(3)酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物形成的载药组合体纳米球具有pH敏感性释药行为，对于IBU的释放在pH＝7.4时药物释放速率最快，24h内可达到100％的药物释放，对于CUR的药物释放pH＝5.5下32h之内可达94％的累积释药率。
(4)酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体纳米球具有高效的抗癌效果，并可以显著提高CUR的抗癌效果。纯CUR在相对较高的浓度(200μg/mL)下才能显示出抗癌能力，但由于其极低的生物利用度，对HeLa细胞的杀伤效率较低，仅少量纯CUR进入HeLa细胞(弱绿色荧光)。有意义的是，对于本发明的APGA-g-PTHF/CUR纳米球，当CUR浓度仅为20μg/mL时，其抗癌效果可达到接近于浓度为200μg/mL的纯CUR的抗癌效果，采用Hoechst 33342/PI对HeLa细胞染色实验结果，发现APGA-g-PTHF/CUR纳米球中有大量CUR进入HeLa细胞(强绿色荧光)，从而显著增强抗癌效果。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为实施例1中制得的APGA-g3-PTHF600接枝共聚物的TEM照片。
图2为实施例4制得的APGA-g-PTHF/IBU纳米载药组合体的SEM照片。
图3所示为测试例2中不同pH下APGA-g-PTHF/IBU载药组合体的释药行为。
图4所示为测试例3中APGA-g-PTHF/CUR载药组合体共培养的HeLa细胞的荧光成像。
图5所示为测试例3中APGA-g-PTHF/CUR纳米载药组合体和ASA-g-PTHF/CUR微米载药组合体对HeLa细胞的抗癌效果比较。
图6为对比例2制得的APGA-g-PTHF/CUR纳米载药组合体的SEM照片。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
接枝共聚物的表征：
采用Nicolet 6700型傅里叶红外变换光谱(FTIR)仪测定酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物的化学结构，测定范围为4000～400cm-1；采用Bruker NMR AVANCEIII核磁仪(400MHz)表征酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物的化学结构；采用Hitachi HT-7700透射电子显微镜(TEM)上观察经四氧化钌染色的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物微观形态，加速电压为100kV。
细胞毒性测试：
HeLa细胞在37℃、5％CO2和95％相对湿度的环境下，添加10％的胎牛血清、含1％青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。将3组HeLa细胞分别接种在无菌的96孔板中，每个孔加入100μL完全DMEM培养液，密度为5×103个细胞/孔，培养24h后将培养基替换为含有不同浓度的接枝共聚物样品的新鲜培养基，并将细胞再培养24h，用90μL完全DMEM和10μL CCK-8溶液替换培养基，培养1h后，用酶标仪(Thermo scientific，MULTISCAN MNK3)测量每个孔在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
载药组合体的尺寸测定：
采用JEOL JSM-7500F扫描电子显微镜在5kV的加速电压下观察载药组合体的尺寸。
载药组合体药物释放的表征：
采用Hitachi U-3010紫外-可见光分光光度计测定药物释放的浓度，计算累积释药率。
载药组合体的疗效表征：
采用CCK-8试剂盒对细胞进行处理，利用Thermo Fisher Scientific的MultiscanMK3酶标仪测定CCK-8试剂的吸光度，计算细胞存活率；采用AMG-EVOSf1荧光显微镜观察细胞对CUR的摄取效果。
实施例1
酰化海藻酸丙二醇酯-g3-聚四氢呋喃600 接枝共聚物的制备
25℃下，5.0g PGA置于17.4mL三乙胺中，加入30mL二氯甲烷，并将体系温度调节到-10～-5℃，然后缓慢加入17.8mL癸酰氯，搅拌反应5h后加入500mL的乙醇，多次洗涤，将多余的三乙胺和癸酰氯除去；随后，向剩余固体加入100mL二氯甲烷溶解可溶部分，过滤，得到可溶的上清液，脱出溶剂后，即得到酰化海藻酸丙二醇酯(APGA)。
在0℃和氮气气氛下，将67μL烯丙基溴和200mg高氯酸银加入四氢呋喃(30mL)和二氯甲烷(32mL)的混合液中，引发剂浓度为12.3mmol/L，搅拌下反应4h，得到含有聚四氢呋喃活性链的四氢呋喃/二氯甲烷混合溶液；将0.5g酰化海藻酸丙二醇酯溶解在20mL二氯甲烷中；将上述含有聚四氢呋喃活性链的四氢呋喃/二氯甲烷混合溶液与上述酰化海藻酸丙二醇酯/二氯甲烷溶液进行混合，搅拌反应3.5h，得到的反应体系进行透析纯化，得到APGA-g-PTHF接枝共聚物，其中：支链聚四氢呋喃的数均分子量为600g/mol，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝3根聚四氢呋喃支链。该接枝共聚物记为：APGA-g3-PTHF600。该接枝共聚物的TEM照片见附图1。
实施例2
酰化海藻酸丙二醇酯-g23-聚四氢呋喃3400 接枝共聚物的制备
酰化海藻酸丙二醇酯(APGA)的制备方法同实施例1。
在氮气气氛及0℃下，将6.7μL烯丙基溴和20mg高氯酸银加入30mL THF和32mL二氯甲烷的混合液中，引发剂浓度为1.2mmol/L，聚合反应4h得到含有聚四氢呋喃活性链的四氢呋喃/二氯甲烷混合溶液；将0.5g酰化海藻酸丙二醇酯溶解在20mL二氯甲烷中；将上述聚四氢呋喃活性链溶液与上述酰化海藻酸丙二醇酯的二氯甲烷溶液混合，搅拌反应4h。纯化后处理方法同实施例1，得到APGA-g-PTHF接枝共聚物，其中：支链聚四氢呋喃的数均分子量为3400g/mol，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝23根聚四氢呋喃支链。该接枝共聚物记为：APGA-g23-PTHF3400。
实施例3
酰化海藻酸丙二醇酯-g15-聚四氢呋喃1800接枝共聚物的制备
酰化海藻酸丙二醇酯(APGA)的制备方法同实施例1。
在0℃和氮气气氛下，将20μL烯丙基溴和60mg高氯酸银加入四氢呋喃(30mL)和二氯甲烷(32mL)的混合液中，引发剂浓度为3.7mmol/L，聚合反应4h；将0.5g酰化海藻酸丙二醇酯溶解在20mL二氯甲烷中；将上述含聚四氢呋喃活性链混合溶液与上述酰化海藻酸丙二醇酯/二氯甲烷溶液进行混合，搅拌反应3.5h。纯化分离后处理方法同实施例1，得到APGA-g-PTHF接枝共聚物，其中：支链聚四氢呋喃的数均分子量为1800g/mol，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝15根聚四氢呋喃支链。该接枝共聚物记为：APGA-g15-PTHF1800。
实施例4
酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体纳米球的制备
酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物通过形成O/W乳液制备载药组合体纳米球。具体方法如下：25℃下，将20mg所述接枝共聚物APGA-g15-PTHF1.8k和40mg的药物布洛芬(IBU)或姜黄素(CUR)溶解在10mL二氯甲烷中，搅拌下将上述溶液缓慢加入50mL去离子水中，形成均匀稳定的乳化体系，脱除溶剂后，用乙醇清洗药物残留物，以去除未载药物，取一部分载药组合体放置在硅片上，随后进行扫描电子显微镜观察，如图2所示。扫描电镜结果表明：APGA-g15-PTHF1.8k/IBU药物载体和APGA-g15-PTHF1.8k/CUR药物载体具有尺寸分布较为均匀的纳米球状体，直径分别在173～233nm之间(203±30nm)和115～153nm(134±19nm)之间。酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物对IBU的载药率为45.4％～47.8％，对CUR的载药率为39.5％～48.9％。
测试例1
对于布洛芬(IBU)的释放实验，将20mg的APGA-g15-PTHF1.8k/IBU载药组合体纳米球分散在4mL的PBS溶液中，形成分散液，然后将分散液转移到透析袋中，将透析袋放置于装有200mL的具有不同pH值(1.5、5.5、6.2、7.0、7.4、8.0)PBS缓冲液中，在37℃和搅拌下，每隔0.5～2h取出2mL PBS缓冲液测定264nm处的吸光度，计算累积释药率，测试完毕后立即将取出的2mL PBS缓冲液放回。CUR的释放实验：在pH＝5.5下进行释放，在37℃避光环境搅拌下每隔0.5～2h从烧杯中取出少量2mL的PBS缓冲液测定在430nm处检测CUR的吸光度计算累积释药率。
结果表明：由酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物构建的纳米载药组合体具有明显的pH响应性药物释放行为(如图3所示)，在pH＝7.4时，纳米载药组合体对IBU的释放速率最快，24h内可达到100％的药物释放，并且APGA-g-PTHF/IBU的纳米载药组合体在其他pH值下的累积药物释药率均高于ASA-g-PTHF/IBU微米载药组合体(对比例1和2)，如在pH＝5.5时，APGA-g-PTHF/IBU累积药物释药率为59％，ASA-g-PTHF/IBU累积药物释药率为42％。
在pH＝5.5时，对于包载CUR药物，相比于微米级的ASA-g-PTHF/CUR载药组合体(对比例1和2)，APGA-g-PTHF/CUR纳米载药组合体球的累积释药率在每个时间段都更快，APGA-g-PTHF/CUR纳米载药组合体球的累积释药率达到94％，而相同条件下ASA-g-PTHF/CUR微米载药组合体球的累积释药率仅为47％。
测试例2
采用CCK-8法测定纯姜黄素(CUR)和APGA-g-PTHF/CUR载药组合体纳米球对HeLa细胞的毒性，实验具体操作如下：分别将CUR和APGA-g15-PTHF1.8k/CUR载药组合体纳米球分散于细胞培养液中，保持在细胞培养液中两种条件下的CUR浓度相同，分别为20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL，并选择不加CUR的实验作为参比。将上述含有一定CUR浓度的细胞培养液与HeLa细胞共同培养24h，用酶标仪(Thermo scientific，MULTISCAN MNK3)测量每个孔在450nm处的吸光度，每个样品至少测定3组数据，计算HeLa细胞存活率。
结果表明：含CUR浓度为20μg/mL的APGA-g-PTHF/CUR载药组合体纳米球的抗癌效果接近于浓度为200μg/mL的纯CUR，说明基于酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃的载药组合体可以大幅提高CUR的抗癌效果。
测试例3
采用Hoechst 33342/PI染色试剂对与CUR(200μg/mL)和APGA-g-PTHF/CUR载药组合体纳米球(含有CUR浓度200μg/mL)分别共培养24h的HeLa细胞进行染色，观察HeLa细胞对CUR的摄取行为(如图4所示)。
结果表明：APGA-g-PTHF/CUR载药组合体纳米球处理后的HeLa细胞中，出现明显的绿色荧光(代表药物CUR)HeLa细胞可吸收大量CUR(绿色荧光)，说明APGA-g-PTHF/CUR载药组合体纳米球可以显著提高CUR的生物利用率，促进HeLa细胞对CUR的摄取，导致细胞的死亡(强烈的红色荧光)和细胞凋亡(强烈的蓝色荧光)使得APGA-g15-PTHF1.8k/CUR载药组合体纳米球中CUR的抗癌效果明显(如图5所示)，当其中CUR浓度为20μg/mL的APGA-g15-PTHF1.8k/CUR载药组合体纳米球的抗癌效果接近于浓度为200μg/mL的纯CUR的抗癌效果。
作为比较，经ASA-g15-PTHF2.1k/CUR载药组合体微球(对比例1和2)处理的HeLa细胞显示出微弱的绿色荧光和红色荧光，表明ASA-g15-PTHF2.1k/CUR载药组合体微球难以被细胞吸收，仅少量CUR被HeLa细胞摄取，微米尺度的ASA-g-PTHF/CUR载药组合体的抗癌效果较差，药物CUR的生物利用度较低。
对比例1
酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃接枝共聚物的制备
25℃下，5.0g海藻酸钠置于6.9mL三乙胺中，加入50mL二氯甲烷，并将体系的温度调节到-10～-5℃，然后缓慢滴加16.0mL癸酰氯，搅拌反应5h，加入500mL乙醇。后处理及提纯方法同实施例1。得到酰化海藻酸钠(ASA)。
在0℃和氮气气氛下，将20μL烯丙基溴和60mg高氯酸银加入THF(30mL)和二氯甲烷(32mL)的混合液中，聚合反应4h；将0.5g ASA溶解在20mL二氯甲烷中；将上述含有PTHF活性链的四氢呋喃/二氯甲烷混合溶液与上述酰化海藻酸钠/二氯甲烷溶液混合，搅拌反应3.5h。后处理方法同实施例1，得到ASA-g-PTHF接枝共聚物，其中：支链聚四氢呋喃的数均分子量为2100g/mol，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝15根聚四氢呋喃支链。该接枝共聚物记为：ASA-g15-PTHF2100接枝共聚物。
对比例2
酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体微米球的制备
酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃接枝共聚物通过形成O/W乳液制备载药组合体微米球，具体制备方法如下：25℃下，将20mg的接枝共聚物ASA-g15-PTHF2100和40mg的药物(IBU或CUR)共溶解在10mL二氯甲烷中，在搅拌下将上述溶液滴入50mL去离子水中，制备方法同实施例4。扫描电镜(如图6所示)结果表明：ASA-g15-PTHF2100/IBU载药组合体和ASA-g15-PTHF2100/CUR载药组合体具有尺寸分布均匀的微米球，直径分别为1.11～1.54μm(1326±212nm)和0.85～1.16μm(1006±157nm)。酰化海藻酸钠-g-聚四氢呋喃接枝共聚物对IBU的载药率31.8～45.8％，对CUR的载药率为32.8～46.2％。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (11)

1.一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其特征在于，该共聚物以海藻酸丙二醇酯作为主链、聚四氢呋喃作为支链；
所述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物由包括以下步骤的方法制得：
（1）合成酰化海藻酸丙二醇酯APGA
将海藻酸丙二醇酯置于第一有机溶剂中，低温下添加第二有机溶剂，加入癸酰氯，搅拌下反应，再将反应体系在甲醇和/或乙醇中沉析，并用甲醇和/或乙醇反复洗涤多次去除过量的癸酰氯和第一有机溶剂，然后向固体产物中添加第二有机溶剂，将上清液脱除溶剂后，将所得APGA固体产物，真空干燥；
（2）合成聚四氢呋喃活性链PTHF+
在氮气气氛下，将引发剂和共引发剂添加到预先冷却的四氢呋喃或其与第三有机溶剂的混合溶液中，上述体系在搅拌下进行本体聚合或溶液聚合，得到含聚四氢呋喃活性链PTHF+/四氢呋喃的混合溶液或PTHF+/四氢呋喃/第三有机溶剂的混合溶液；
（3）合成酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物APGA-g-PTHF
将含有PTHF+活性链的PTHF+/四氢呋喃的混合溶液或PTHF+/四氢呋喃/第三有机溶剂的混合溶液与APGA/第四有机溶剂的混合溶液混合，进行反应，然后对反应体系进行纯化分离，得到酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物；
步骤（1）中，所述低温为-10℃ ~ -5℃，所述第一有机溶剂为三乙胺和/或吡啶，所述第二有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷中的至少一种；
步骤（2）中，所述引发剂为烯丙基溴、烯丙基氯、苄基溴和苄基氯中的至少一种，所述第三有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和二氯乙烷中的至少一种，反应温度为-4℃ ~ 4℃；
步骤（3）中，所述第四有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷和四氢呋喃中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其中，支链的分子量在300 ~ 6000 g/mol之间，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝2 ~ 35个聚四氢呋喃支链。
3.根据权利要求2所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其中，支链的分子量在500 ~ 4000 g/mol之间，接枝密度为每1000个海藻酸单糖上接枝3 ~ 27个聚四氢呋喃支链。
4.根据权利要求1所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其中，所述共引发剂为高氯酸银。
5.根据权利要求1所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其中，通过聚四氢呋喃活性链与海藻酸丙二醇酯的比例来调节共聚物的接枝密度。
6.根据权利要求1所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物，其中，所述引发剂浓度为0.6 ~ 25.0 mmol/L。
7.一种酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体，包括权利要求1-6中任意一项所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物药物载体和药物。
8.根据权利要求7所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体，其中，所述药物为布洛芬、姜黄素、紫杉醇、阿霉素或喜树碱，载药率在1 % ~ 52 %之间。
9.根据权利要求8所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体，其中，载药率在4 % ~ 49 %之间。
10.权利要求7-9中任意一项所述的酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物载药组合体的制备方法，所述酰化海藻酸丙二醇酯-g-聚四氢呋喃接枝共聚物通过形成O/W乳液制备该共聚物载药组合体，并形成尺寸分布均匀的载药纳米球。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述纳米球的尺寸在250 nm以下。
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