CN114230689A - 一种分离藻红蛋白的亲和树脂、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亲和树脂及其制备方法，包括如下步骤：(1)称取一定量的胆色素溶解于有机溶剂中，得到浓度为30～50mmol/L的胆色素溶液；(2)按体积比1：0.5～1：1将用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂与胆色素溶液混合，然后加入偶联剂至终浓度为0.1～0.6mol/L，避光振荡混匀12～24h，制得亲和树脂；(3)离心去除上清，以相同有机溶剂清洗亲和树脂，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，保存。制备得到的亲和树脂应用于本发明建立的用其纯化藻红蛋白的柱层析工艺中；分离纯化得到的藻红蛋白纯度均达到4以上，纯度较高。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和海洋产物资源开发利用领域，涉及一类新型的亲和树脂及其制备方法以及利用这类树脂对藻红蛋白进行分离纯化，从粗提液中获得高纯度藻红蛋白的应用，具体涉及一种分离藻红蛋白的亲和树脂、制备方法及其应用。
背景技术
藻红蛋白(phycoerythrin，PE)是海洋红藻(如条斑紫菜、红毛菜、龙须菜等)和部分蓝藻、隐藻在水中捕获和传递光能的色素蛋白。藻红蛋白可以作为天然色素用于食品、化妆品行业，也可以作为荧光探针用于荧光免疫检测、激活细胞分选、流式细胞荧光测定以及单分子检测等多项技术中，在临床诊断、免疫化学及生物工程等研究领域发挥作用；藻红蛋白还具有抗氧化和抗炎活性。藻红蛋白具有很高的开发利用价值，其应用与其纯度(最大吸收峰处的光吸收和280nm光吸收的比值)密切相关。一般认为纯度大于0.7为食品级，大于1.5为化妆品级，大于4.0为分析级。藻红蛋白用于荧光标记物时，需要其纯度达到4以上。
目前藻红蛋白的制备纯化方法主要是从藻类中分离提取天然蛋白，制备工艺包括离子交换、羟磷灰石和凝胶过滤柱层析、疏水作用膨胀床色谱、聚偏氟乙烯膜层析法等，这些工艺普遍存在流程繁冗，重复性不佳，纯度不够高，难以放大等问题，仍需研发新的从藻体中纯化藻红蛋白的工艺。
亲和层析是蛋白质纯化的一种重要方法，具有很高的选择性、分离效果以及较大的载量。亲和层析填料的配基在一定条件下能够特异性识别并结合目标蛋白，之后改变结合条件将目标蛋白从亲和填料中洗脱下来，即可实现目标蛋白的纯化。纯化过程中，往往一次层析即可从混合物获得较高纯度的目的蛋白，并保持较高的活性。亲和层析纯化的关键在于层析填料中配基的选择，具体应用于纯化特定蛋白时，常需要在现有亲和填料的基础上连接特定分子(配基)，构成某一类蛋白亲和纯化的专用亲和填料，即树脂。藻红蛋白的亲和层析纯化方法，目前未见报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种分离藻红蛋白的亲和树脂、制备方法及其应用，制备出亲和树脂并建立用其纯化藻红蛋白的柱层析工艺；层析工艺包括为柱层析准备原料的藻红蛋白粗提液制备的两种方法，亲和层析过程及亲和树脂再生方法，采用该亲和树脂的柱层析工艺能够分离纯化得到高纯度的藻红蛋白。
本发明的技术方案是：
氨基树脂是亲和层析的重要原料，市场上的氨基树脂产品一般是在树脂上共价连接“臂”(arm)，臂是长度不等的烃链(可能带有少量其他基团)，臂末端是关键的氨基，这些氨基在偶联剂的辅助下，可以和带有羧基、醛基等的分子即配基进行反应，最终将这些含羧基的分子共价连接到树脂上。树脂的化学结构多为琼脂糖或聚甲基丙烯酸，连接过程受到氨基树脂、配基、偶联剂的浓度及比例，还有反应溶剂、温度等条件的影响。
本发明中，亲和树脂是为纯化藻红蛋白开发的专用亲和填料，是将胆色素分子中的羧基和氨基树脂的氨基以酰胺键共价连接。藻红蛋白在一定条件下可以结合在亲和树脂上，而藻红蛋白粗提液中的杂蛋白无法和亲和树脂结合，直接被洗下形成穿透峰；改变结合条件后，藻红蛋白能够和亲和树脂分离，从层析柱中洗脱下来，收集藻红蛋白洗脱液，实现藻红蛋白的纯化。
本发明涉及一种亲和树脂的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取一定量的胆色素溶解于有机溶剂中，得到浓度为30～50mmol/L的胆色素溶液；
(2)按体积比1：0.5～1：1将用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂与胆色素溶液混合，然后加入偶联剂至终浓度为0.1～0.6mol/L，避光振荡混匀12～24h，制得亲和树脂；
(3)离心去除上清，以相同有机溶剂清洗亲和树脂，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，保存。
进一步的，所述步骤(1)至(3)中的有机溶剂为乙醇、异丙醇或二甲基亚砜中的任一种；所述胆色素包括胆红素和胆绿素。胆色素水溶性差，只能在乙醇等有机溶剂中形成一定浓度的溶液，因此连接过程在有机溶剂中进行。
进一步的，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)或者N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)偶联剂粉末。
进一步的，所述步骤(3)中的酸性溶液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L pH 4乙酸盐缓冲液，碱性溶液为pH 8的Tris-HCl缓冲液；保存条件为以0.02％～0.05％Proclin 300水溶液避光4℃保存。
本发明还涉及一种采用上述制备方法得到的亲和树脂。该亲和树脂中，氨基树脂的氨基和胆红素或者胆绿素的羧基共价连接，色素分子通过酰胺键结合到氨基树脂上，形成以胆红素或者胆绿素分子作为亲和基团的亲和树脂。
本发明还涉及所述亲和树脂在制备高纯度藻红蛋白的亲和树脂柱层析纯化工艺中的应用。
进一步的，所述亲和树脂柱层析纯化工艺包括以下步骤：
将亲和树脂装柱，得到亲和树脂层析柱，采用结合缓冲液冲洗平衡亲和树脂层析柱；将适量的藻红蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去除杂蛋白，然后加入pH 3～5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；向收集到的洗脱液中加入pH 7～9的调节缓冲液调节pH至中性；测定洗脱液中藻红蛋白的纯度。
进一步的，所述结合缓冲液为20mmol/LpH 5.5磷酸钠缓冲液或20mmol/LpH 8磷酸钠盐缓冲液，结合缓冲液的冲洗流速为2mL/min；所述洗脱缓冲液为20mmol/LpH 4的乙酸盐缓冲液或20mmol/LpH 4柠檬酸盐缓冲液；所述调节缓冲液为0.5mol/LpH 8磷酸钠缓冲液。
进一步的，所述藻红蛋白粗提液的制备方法包括如下步骤：将干净的新鲜红藻藻体用粉碎机打碎，按固液比1:5～1:8(g/mL))加入10～50mMpH 5～8缓冲液，以及1～5％纤维素酶，再用均质机粉碎，4℃静置24～48h，10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存；
或者，所述藻红蛋白粗提液的制备方法包括如下步骤：将干净的新鲜红藻藻体静置阴干，阴干至水分低于10％后，在粉碎机中磨成粉末，将粉末和10～50mM pH 5～8缓冲液按1:5～1:8(g/mL)混合，加入1～5％纤维素酶，4℃静置2～4天；10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种亲和树脂及其制备方法，将氨基树脂和胆色素溶液混合，加入偶联剂进行连接反应，得到亲和树脂；利用该亲和树脂的柱层析纯化工艺来纯化藻红蛋白，能够分离得到高纯度的藻红蛋白，其纯度达到4以上，可用于荧光标记物等。
附图说明
图1为本发明实施例6提供的胆色素亲和层析柱分离藻红蛋白低压层析系统检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
本发明提供了一种亲和树脂的制备方法，具体步骤如下：
称取一定量胆红素或者胆绿素溶于乙醇、异丙醇或者二甲基亚砜等有机溶剂，浓度30～50mmol/L；将用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂和胆色素溶液混合(二者体积比为1：0.5～1：1)，向混合物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)或者N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)偶联剂粉末，终浓度为0.1～0.6mol/L，避光振荡混匀12～24h，胆色素结合到氨基树脂上。离心去除上清，以相同的有机溶剂清洗胆红素树脂，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗。以0.02％Proclin 300溶液保藏胆色素树脂。
用于藻红蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺，包括以下步骤：
以结合缓冲液流过亲和树脂的层析柱，平衡两个以上柱体积；将适量的藻红蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去除杂蛋白，再加入pH3～5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱；根据洗脱液的颜色变红或检测到564nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液；向收集液加入高浓度的pH7～9缓冲液使溶液pH升至中性。计算含藻红蛋白的收集液的564nm和280nm吸光值的比值，确定藻红蛋白的纯度。
上述纯化工艺中涉及的藻红蛋白粗提液，其制备方法之一包括如下步骤：
将干净的新鲜红藻藻体用粉碎机打碎，按固液比1:5～1:8(g/mL))加入10～50mMpH 5～8缓冲液，加入1～5％纤维素酶，再用均质机粉碎，4℃静置24～48h，10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存。
藻红蛋白粗提液的制备方法之二包括如下步骤：
将干净的新鲜红藻藻体置于金属筛网上静置阴干，阴干后(水分低于10％)在粉碎机中磨成粉末，将粉末和10～50mMpH 5～8缓冲液按1:5～1:8(g/mL)混合，加入1～5％纤维素酶，在4℃静置2～4天；10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存。
亲和树脂的再生：
完成收集藻红蛋白洗脱峰后，pH 4缓冲液洗脱至检测基线稳定，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液pH为中性或接近中性，以含1mol/L氯化钠的结合缓冲液冲洗亲和树脂2至3个柱体积，洗去结合的杂蛋白；再以结合缓冲液冲洗2至3个柱体积或冲洗至流出液电导稳定，即可进行下次藻红蛋白粗提液纯化。
如暂不使用，则以纯水冲洗1至2个柱体积，再以0.02％～0.05％Proclin 300冲洗2个柱体积，4℃冷藏。
实施例1亲和树脂的制备
取思拓凡(Cytiva)公司EAH Sepharose 4B氨基琼脂糖5mL(含氨基约35～60μmol)转入15mL离心管中，倾倒或吸取上清，使用10mL分析纯的无水异丙醇洗五次，去除上清；加入现配的3mL 33.3mmol/L胆红素的异丙醇溶液(含胆红素100μmol)，再加入0.6g EDC，不断搅拌，避光，摇床振荡12h。离心除去上清即胆红素溶液，保留新合成的胆红素亲和树脂，再以过量异丙醇洗，以洗去胆红素，再以纯水清洗三次，洗去异丙醇，再以含0.5mol/L NaCl的0.1mol/LpH 4乙酸盐缓冲液和pH 8Tris-HCl缓冲液交替洗三次；水洗胆红素亲和树脂，再以0.02％Proclin 300水溶液避光4℃保存。
实施例2亲和树脂的制备
取思拓凡公司EAH Sepharose 4B氨基琼脂糖5mL(含氨基约35～60μmol)转入15mL离心管中，倾倒或吸取上清，使用10mL分析纯的二甲基亚砜洗五次，去除上清；加入现配的3mL 33.3mmol/L胆绿素的二甲基亚砜溶液(含胆红素100μmol)，再加入0.1g DIC，不断搅拌，避光，摇床振荡24h。离心除去上清即胆绿素溶液，保留新合成的胆绿素亲和树脂，再以过量二甲基亚砜洗，以洗去胆绿素，再以纯水清洗三次，洗去二甲基亚砜，再以含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH 4乙酸盐缓冲液和pH 8Tris-HCl缓冲液交替洗三次。水洗胆绿素亲和树脂，再以0.02％Proclin 300水溶液避光4℃保存。
实施例3藻红蛋白粗提液制备
新鲜条斑紫菜洗干净，除去泥沙，用料理机打碎，称5g放入100ml离心管中，加入10mmol/LpH 6.8磷酸钠缓冲液56mL，加入1％纤维素酶，再用IKAT25 digital ULTRA-TURRAX均质机6000rpm粉碎10min，4℃静置48h，以湘仪H2050R离心机10000rpm低温离心25min，收集上清即获得藻红蛋白粗提液，测藻红蛋白纯度和含量，4℃暂存。
实施例4藻红蛋白粗提液制备
冷冻鲜条斑紫菜冲净后，置于大金属筛网上，避免阳光直射，在通风橱内静置阴干，测水分约7.3％；以高速粉碎机中磨碎阴干紫菜，收集干紫菜粉末冷冻保藏。在100mL塑料离心管中加入64mL 10mmol/LpH 6.8磷酸钠盐缓冲液，再称取8g紫菜粉末加入到缓冲液中，加入5％纤维素酶，混匀后放入冰箱4℃冷藏静置3天。以湘仪H2050R离心机10000rpm低温离心20min，收上清即藻红蛋白粗提液，4℃暂存。
实施例5至7为藻红蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺。
实施例5
取5mL思拓凡公司EAH Sepharose 4B氨基琼脂糖制备的亲和树脂，装入重力流塑料层析柱，先用50mL水冲洗平衡，待液面降至高于亲和树脂0.5cm，加入20mL 20mmol/LpH5.5磷酸钠缓冲液冲洗平衡。再加入10ml 20mmol/LpH 5.5磷酸钠缓冲液，同时加入2ml藻红蛋白粗提液，再加入10ml的20mmol/LpH 5.5磷酸钠缓冲液冲洗平衡。之后加入40ml20mmol/LpH 4的乙酸盐缓冲液洗脱藻红蛋白，当红色溶液流出时用10ml离心管收集，收集后立即加入0.5mL 0.5mol/LpH 8磷酸钠缓冲液调pH至中性。
洗脱液不再呈红色后，以20mL含1mol/LNaCl的20mmol/LpH 5.5磷酸钠缓冲液冲洗亲和树脂，再用80ml的水冲洗，进行下一轮纯化。如暂不使用，以30mL 0.05％的Proclin300冲洗，液面降至高于亲和树脂2cm时封住出口，4℃冰箱保存。
藻红蛋白收集液采用默克公司Amicon Ultra-15离心浓缩管(截留分子量3kDa)浓缩，测得收集液中藻红蛋白纯度为4，达到分析级藻红蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。
实施例6
将15mL亲和树脂装入思拓凡公司的XK16/20空层析柱，将层析柱连接到思拓凡公司的
10S蛋白质快速纯化工艺开拓系统，检测280nm，564nm和620nm三个波长的吸光值。以20mmol/LpH 8磷酸钠盐缓冲液作为结合缓冲液，以2mL/min流速冲洗平衡亲和树脂后，加入预先通过0.22微米滤膜过滤的藻红蛋白粗提液4mL，其中约含0.6mg藻红蛋白，上样流速1mL/min。继续以上述结合缓冲液冲洗亲和树脂，流速为2mL/min，穿透峰中杂蛋白被洗去，冲洗至检测基线稳定。然后以20mmol/LpH 4柠檬酸盐缓冲液洗脱，流速2mL/min，以10mL塑料离心管收集如图1所示的564nm的洗脱峰，收集4管红色洗脱液。测得藻红蛋白纯度为4.6，超过分析级藻红蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。
以20mmol/LpH 4柠檬酸盐缓冲液洗脱至检测基线稳定后，改用结合缓冲液以2mL/min流速冲洗亲和树脂，流出液pH升至中性后，再以含1mol/LNaCl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗脱杂蛋白，洗脱液电导升至55mS/cm后趋于稳定，改用不含NaCl的结合缓冲液冲洗，待电导降至原基线后停止洗脱，准备进行下次藻红蛋白粗提液的纯化。
实施例7
将15mL亲和树脂装入思拓凡公司的XK16/20空层析柱，将层析柱连接到思拓凡公司的
10S蛋白质快速纯化工艺开拓系统，检测280nm，564nm和620nm三个波长的吸光值。以20mmol/LpH 8磷酸钠盐缓冲液作为结合缓冲液，以2mL/min流速冲洗平衡亲和树脂后，加入预先通过0.22微米滤膜过滤的藻红蛋白粗提液6mL，其中约含0.9mg藻红蛋白，上样流速1mL/min。继续以该结合缓冲液冲洗亲和树脂，流速为2mL/min，穿透峰中杂蛋白被洗去，冲洗至检测基线稳定。然后以20mmol/LpH 4柠檬酸盐缓冲液洗脱，流速2mL/min，以10mL塑料离心管收集564nm的洗脱峰，收集3管红色洗脱液。测得藻红蛋白纯度为4，达到分析级藻红蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。
以20mmol/LpH 4柠檬酸盐缓冲液洗脱至检测基线稳定后，改用结合缓冲液以2mL/min流速冲洗亲和树脂，流出液pH升至中性后，再以含1mol/LNaCl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗脱杂蛋白，洗脱液电导升至55mS/cm后趋于稳定，改用不含NaCl的结合缓冲液冲洗，待电导降至原基线后停止洗脱，准备进行下次藻红蛋白粗提液的纯化。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种亲和树脂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取一定量的胆色素溶解于有机溶剂中，得到浓度为30～50mmol/L的胆色素溶液；
(2)按体积比1：0.5～1：1将用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂与胆色素溶液混合，然后加入偶联剂至终浓度为0.1～0.6mol/L，避光振荡混匀12～24h，制得亲和树脂；
(3)离心去除上清，以相同有机溶剂清洗亲和树脂，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)至(3)中的有机溶剂为乙醇、异丙醇或二甲基亚砜中的任一种；所述胆色素包括胆红素和胆绿素。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)或者N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)偶联剂粉末，所述氨基树脂选用EAH Sepharose 4B氨基琼脂糖。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的酸性溶液为含0.5mol/LNaCl的0.1mol/L pH 4乙酸盐缓冲液，碱性溶液为pH 8的Tris-HCl缓冲液；保存条件为以0.02％～0.05％Proclin 300溶液避光4℃保存。
5.权利要求1至4任一项所述制备方法得到的亲和树脂。
6.权利要求5所述亲和树脂在制备高纯度藻红蛋白的亲和树脂柱层析纯化工艺中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述亲和树脂柱层析纯化工艺包括以下步骤：
将亲和树脂装柱，得到亲和树脂层析柱，采用结合缓冲液冲洗平衡亲和树脂层析柱；将适量的藻红蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去除杂蛋白，然后加入pH 3～5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱，收集洗脱液；向收集到的洗脱液中加入pH 7～9的调节缓冲液调节pH至中性；测定洗脱液中藻红蛋白的纯度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述结合缓冲液为20mmol/L pH 5.5磷酸钠缓冲液或20mmol/L pH 8磷酸钠盐缓冲液，结合缓冲液的冲洗流速为2mL/min；所述洗脱缓冲液为20mmol/L pH 4的乙酸盐缓冲液或20mmol/L pH 4柠檬酸盐缓冲液；所述调节缓冲液为0.5mol/L pH 8磷酸钠缓冲液。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述藻红蛋白粗提液的制备方法包括如下步骤：将干净的新鲜红藻藻体用粉碎机打碎，按固液比1:5～1:8(g/mL))加入10～50mMpH 5～8缓冲液，以及1～5％纤维素酶，再用均质机粉碎，4℃静置24～48h，10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存；
或者，所述藻红蛋白粗提液的制备方法包括如下步骤：将干净的新鲜红藻藻体静置阴干，阴干至水分低于10％后，在粉碎机中磨成粉末，将粉末和10～50mM pH 5～8缓冲液按1:5～1:8(g/mL)混合，加入1～5％纤维素酶，4℃静置2～4天；10000rpm低温离心25min，取上清即为藻红蛋白粗提液，4℃暂存。
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