CN114225011A

CN114225011A - 一种用于预防和治疗gsm的复合制剂及其应用

Info

Publication number: CN114225011A
Application number: CN202111669790.9A
Authority: CN
Inventors: 于普光; 李广永; 何瑞; 占学康
Original assignee: Affiliated Hospital of Ningxia Medical University; Ningxia Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Ningxia Medical University; Ningxia Medical University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114225011B

Abstract

本申请提供了一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下主要组分：表皮生长因子，沙棘籽油和甘油。本申请还提供了复合制剂的新用途，即在预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性阴道萎缩、维持性器官状态及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性围绝经期排尿功能异常、尿频、尿急、夜尿增多等排尿障碍及在其产品中的应用和在提高女性围绝经期性激素水平、调节并恢复女性紊乱的月经周期及在其产品中的应用。本申请对于直接利用复合制剂预防和治疗围绝经期泌尿生殖综合征提供了依据。

Description

一种用于预防和治疗GSM的复合制剂及其应用

技术领域

本申请涉及复合制剂制备及用途技术领域，特别涉及一种用于预防和治疗GSM的复合制剂及其应用。

背景技术

围绝经期泌尿生殖综合征(genitourinary syndrome ofmenopause，GSM)是指由于内源性雌激素水平降低引起的外阴阴道萎缩、干涩、性交不适和泌尿系症状，包括尿频、尿急以及尿失禁等。我国目前有1.3亿围绝经期妇女，预计2030年将达2.8亿，研究显示，我国围绝经期女性发生性交痛、阴道干涩的比例为60.5％，尿急、尿失禁的比例为42.5％，合并外阴阴道症状的妇女中，40％存在性生活全程的障碍，24％缺乏性欲，34％性唤起困难，另有19％无法达到性高潮。因此，GSM对生活质量产生严重的负面影响，正确认识GSM并给予针对性的治疗尤为重要。

GSM的主要原因是由性激素水平的降低所引起。随着年龄的增长，卵巢功能逐渐减退，性激素水平减低，泌尿生殖道失去了雌激素的营养作用，进而出现生殖系统、泌尿系统及全身的一系类症状。这些围绝经期妇女的健康管理将会是今后社会重点关注的问题之一，正确认识GSM，并探索其有效防治措施，对改善患者生活质量及预后具有重要意义。目前临床中针对GSM的治疗主要以阴道润滑剂(保湿剂)为代表的非处方药和以雌激素为主的激素类药物为主。润滑剂类药物虽然起效快、作用明显，但只能改善阴道干涩引起的相关症状，治标不治本；而激素类药物主要以外源性雌激素补充治疗为主，对由激素减退引起的外阴泌尿生殖道众多症状有很好的改善作用，但由于激素类药物存在明显的心血管系统并发症和依赖性，未能在临床上广泛使用。因此，对于GSM的治疗，急需研发出普适性、疗效确切、副作用少的药物。

本申请在前期研究中通过筛选和实验验证，寻找出一种可用于改善GSM的新物质——表皮生长因子，以及以表皮生长因子为主要成分、辅以沙棘籽油和多种菌群配方的一种用于治疗GSM的新型复合制剂。迄今为止，尚没有表皮生长因子及该复合制剂对GSM有预防和治疗作用的报道。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种用于预防和治疗GSM的复合制剂及其应用，以解决目前尚未见关于表皮生长因子及由表皮生长因子、沙棘籽油和菌群等制备的复合制剂在GSM中应用的问题。

第一方面，本申请提供了一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下主要组分：表皮生长因子，沙棘籽油和甘油。

可选的，所述复合制剂还包括伯克霍尔德菌、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌中的一种或多种。

第二方面，本申请提供了一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下组分：表皮生长因子20-30％，伯克霍尔德菌1-3％、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌1-3％，沙棘黄酮5-15％，甘油41-72％。

第三方面，本申请提供了一种复合制剂在预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征及在其产品中的应用。

第四方面，本申请提供了一种复合制剂在预防和/或治疗女性阴道萎缩、维持性器官状态及在其产品中的应用。

第五方面，本申请提供了一种复合制剂在预防和/或治疗女性围绝经期排尿功能异常、尿频、尿急、夜尿增多等排尿障碍及在其产品中的应用。

第六方面，本申请提供了一种复合制剂在提高女性围绝经期性激素水平、调节并恢复女性紊乱的月经周期及在其产品中的应用。

可选的，所述产品包括药物和保健品。

可选的，所述药物的剂型包括凝胶、软胶囊、滴丸、乳剂、片剂、洗剂、搽剂、软膏剂或栓剂等。

有以上技术方案可知，本申请提供了一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下主要组分：表皮生长因子，沙棘籽油和甘油。本申请还提供了复合制剂的新用途，即在预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性阴道萎缩、维持性器官状态及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性围绝经期排尿功能异常、尿频、尿急、夜尿增多等排尿障碍及在其产品中的应用和在提高女性围绝经期性激素水平、调节并恢复女性紊乱的月经周期及在其产品中的应用。本申请对于直接利用复合制剂预防和治疗围绝经期泌尿生殖综合征提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同剂量组中小鼠排尿习惯即尿斑的变化示意图；

图2为不同剂量组小鼠动情周期的变化示意图；

图3为本申请提供的实验流程示意图；

图4为本申请提供的技术路线示意图；

图5A为不同组小鼠阴道组织的离体图；

图5B为不同组小鼠阴道的重量的示意图；

图5C为不同组小鼠阴道的阴道指数的示意图；

图5D为不同组小鼠子宫的重量的示意图；

图5E为不同组小鼠阴道的子宫指数的示意图；

图6为不同组小鼠血清中雌激素的含量示意图；

图7为不同组小鼠血清中雄激素的含量示意图；

图8为小鼠四个动情周期的HE染色图；

图9为不同组小鼠动情周期的变化示意图；

图10为不同组小鼠尿斑实验的示意图。

具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

本申请提供了一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下主要组分：表皮生长因子，沙棘籽油和甘油。其中，表皮生长因子，沙棘籽油和甘油为主成分。也可以使用沙棘籽油提取物如沙棘黄酮。进一步，复合制剂还包括辅成分，其中，辅成分包括伯克霍尔德菌、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌中的一种或多种。需要说明的是，复合制剂也可以仅有主成分组成。主成分和辅成分的具体含量可根据实际情况进行设置和调整。

本申请提供了一种中西医结合复合制剂，预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，包括以下重量百分比的物质：表皮生长因子20-30％，伯克霍尔德菌(Burkholderia)1-3％、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)1-3％，沙棘籽油5-15％，甘油41-72％。

复合制剂的制备方法是将上述成分按照比例混合制成凝胶状。并进行以下筛选过程：在筛选过程中，根据各种成分在体内的药代动力学特点，将复合制剂分为低、中、高三个剂量组来确定出最佳的配制比例。其中，低剂量组包括以下重量百分比的物质：表皮生长因子20％，伯克霍尔德菌(Burkholderia)1％、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1％、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)1％，沙棘籽油提取物(沙棘黄酮)5％，甘油72％。

中剂量组包括以下重量百分比的物质：表皮生长因子25％，伯克霍尔德菌(Burkholderia)2％、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)2％、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)2％，沙棘籽油提取物(沙棘黄酮)10％，甘油59％。

高剂量组包括以下重量百分比的物质：表皮生长因子30％，伯克霍尔德菌(Burkholderia)3％、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)3％、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)3％，沙棘籽油提取物(沙棘黄酮)15％，甘油46％。

进一步地，本申请将8周龄的C57小鼠分为5组，即对照组(NCD组)、模型组(GSM组)、低剂量组(LDG组)、中剂量组(MDG组)和高剂量组(HGD组)。通过对每组连续给药48天，同时以预设天数对小鼠进行排尿症状监测(尿斑实验)和动情周期变化的检测。图1为不同剂量组中小鼠排尿的变化示意图，NCD-对照组，GSM-模型组，LDG-低剂量组，MDG-中剂量组，HDG-高剂量组。如图1所示，中等剂量组的小鼠排尿最接近正常小鼠。图2为不同剂量组小鼠动情周期的变化示意图，图中纵坐标代表各个周期的百分比，横坐标代表四个动情周期，Proestrus-动情前期，Estrus-动情期，Metstrus-动情后期，Diestrus-间期，NCD-对照组，GSM-模型组，LDG-低剂量组，MDG-中剂量组，HDG-高剂量组。如图2所示，在动情周期方面，尽管三种剂量的治疗对小鼠动情周期的紊乱都有改善，但中等剂量组的小鼠改善最明显，维持的时间最长。综上所述，本申请提供的一种复合制剂，在排尿和动情周期方面均有所改善。进一步地，可将中等剂量组的各成分剂量作为复合制剂优选的剂量配比。

本申请首次证实以表皮生长因子为主要成分的复合制剂具有完全不同于以往的新功能：(1)可以有效预防和治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征的各种症状；(2)可以预防和治疗因绝经引起的阴道萎缩；(3)可以预防和治疗尿频、尿急等排尿障碍(4)提高性激素水平；(5)调节动情周期，改善动情周期紊乱。本申请对于直接利用复合制剂预防和治疗GSM提供了依据。

本申请公开以表皮生长因子为主要成分的复合制剂的新用途，新用途包括在预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性阴道萎缩、维持性器官状态及在其产品中的应用；在预防和/或治疗女性围绝经期排尿功能异常、尿频、尿急、夜尿增多等排尿障碍及在其产品中的应用和在提高女性围绝经期性激素水平、调节并恢复女性紊乱的月经周期及在其产品中的应用。同时，本申请对于直接利用复合制剂预防和治疗围绝经期泌尿生殖综合征提供了依据。

为了证实复合制剂具有上述新用途，本申请进行了如下实验。

1.技术方案

(1)建立GSM的小鼠模型：

图3为本申请提供的实验流程示意图，参见图3，本申请通过卵巢切除来模拟临床中的GSM小鼠模型。通过双侧卵巢切除，饲养一个月后成功建立GSM小鼠模型，然后通过阴道给药来验证本申请复合制剂的效果。

(2)技术路线

图4为本申请提供的技术路线示意图，参见图4，本申请采用8周龄雌性C57小鼠，分为5组，即对照组(NCD组)、模型组(GSM组)、阳性对照组(PCG组)、表皮生长因子治疗组(EGF组)、复合制剂组(Compound drug preparation，CDP组)。其中，NCD组为单纯的对照组，小鼠只需打开腹腔后随即用丝线缝合。GSM组为女性围绝经期泌尿生殖综合征模型组，即对小鼠进行卵巢切除处理。NCD组和GSM组每天给予相同剂量的甘油通过阴道涂抹给药。PCD组用临床中治疗围绝经期泌尿生殖综合征的雌激素软膏作为阳性对照，给予雌激素软膏0.1g/天(雌激素含量为97.5μg)，通过给药器按确定好的剂量将药物送到小鼠阴道近端1/3处，连续给药28天。EGF组为表皮生长因子治疗组，给予重组人表皮生长因子0.2g/天(含表皮生长因子2550μg)，通过给药器确定好剂量后将药物送到小鼠阴道近端1/3处，连续给药28天。CDP为复合制剂治疗组，给予复合制剂0.5g/天。其中，复合制剂包括以下重量百分比的物质：表皮生长因子25％，伯克霍尔德菌(Burkholderia)2％、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)2％、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)2％，沙棘籽油提取物(沙棘黄铜)10％，甘油59％。需要说明的是，本申请不对复合制剂的成分含量进行具体限定，本实施例采用的是优选方案。可根据实际情况自行对成分含量进行选择，只需在本申请限定的范围内即可。

所有组小鼠在第29天取材，进行以下操作：(1)观察不同治疗组小鼠动情周期的变化；(2)观察不同治疗组小鼠排尿习惯的变化(3)取材后对子宫、阴道进行称重，并计算器官指数；(4)检测血清中雌激素和雄激素的含量。

2.主要技术

参见图4，进行如下测试：

1)建立GSM小鼠模型

用5％水合氯醛10g/0.1ml麻醉小鼠，麻醉完毕后固定于动物手术台上，在耻骨联合上方正中做2cm切口，充分暴露，显露子宫角，沿着两侧子宫角向上追踪到卵巢，结扎卵巢血管后切除卵巢。

2)小鼠阴道、子宫重量称重

取材时找到小鼠子宫和阴道，分离周围多余的脂肪和其他组织，在分析称上进行称重。

3)阴道脱落细胞冲洗液涂片法检测动情周期

用滴管吸取适量生理盐水，每隔4天，在同一时间点冲洗、吸取阴道分泌物于载玻片上，迅速于显微镜下观察细胞形态，判断动情周期。

4)小鼠排尿习惯检测

准备一个与鼠笼大小相仿的塑料笼，底部平整的贴一张540级酸硬滤纸，纸张被切割成合适的尺寸，将每只小鼠被轻轻地从笼子中移出，放入一个实验塑料笼子里，避免老鼠受到惊吓导致提前排尿。(老鼠被允许自由饮水，直到被关进笼子进行检测)。将老鼠笼放置在安静的环境下4小时。当老鼠在笼子里时，房间的灯根据时间可以亮或者熄灭，但房间的门必须关闭，没有任何设备在运行以保证实验环境的安静，直到4小时的测试期结束，才准有人进入。在此期间，小鼠可以吃到常规食物，但不能喝水。将老鼠轻轻取出，放回鼠笼，小心收集滤纸避免损坏，将滤纸晾干，滤纸在照射紫外光下观察以显示尿斑，并以电子方式捕捉滤纸的图像。

5)血清雌激素、雄激素水平检测

取材时心脏取血，将全血以12000r/min离心10min，分离血清，采用ELISA检测试剂盒，各组待测血清加入到反应孔中，每孔100μL，每组分别设4个复孔，37℃孵育90min，弃掉孔内液体，加入100μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60min，弃掉孔内液体，洗涤3次，随后加入100μL酶结合物工作液，37℃孵育30min后弃掉孔内液体，洗涤5次，每孔加入90μL底物溶液，37℃孵育15min，加50μL终止液，450nm波长下检测，按照标准曲线计算各组大鼠血清中T、E2的含量。

3.实验结果

3.1本申请的复合制剂可以提高小鼠阴道和子宫的重量，预防和改善性器官萎缩

外阴阴道萎缩和萎缩性阴道炎已经被认为是围绝经期与雌激素缺乏相对应的外阴、阴道、下泌尿道的主要症状体征改变，阴道萎缩往往会引起阴道干涩和性交痛，而且由于阴道和尿道的萎缩，更容易出现尿频、尿急、尿痛、尿失禁、泌尿道反复感染等。本申请通过不同组的治疗发现，雌激素、表皮生长因子和复合制剂对终末性器官如阴道、子宫等组织多有很好的保护作用，可有效改善阴道和子宫的萎缩，图5A为不同组小鼠阴道组织的离体图，图中NCD-对照组，GSM-模型组，PCD-雌激素治疗组，EGF-表皮生长因子治疗组，CDP-复合制剂组。如图5A所示，与对照组(NCD组)相比，模型组(GSM组)小鼠的阴道发生了明显的萎缩，体积缩小，且触之感觉变硬。经过雌激素、表皮生长因子和复合制剂治疗后，阴道的外观结构都较GSM组有所改善，阴道组织饱满，体积增加，其中复合制剂组(CDP组)改观最显著。进一步对解剖离体的阴道和子宫称重，并计算其器官比，也得到了相同的趋势，如图5B、5C、5D、5E所示，及GSM组的小鼠阴道和子宫的重量显著减轻，经三组不同的药物治疗后两种器官的重量都有所增加，其中以CDP组增加的最为明显。

3.2复合制剂可以提高血清中性激素的水平

引起GSM的主要原因是体内雌激素水平下降使得结缔组织松弛，进而引起内括约肌功能障碍，引起泌尿生殖系统的改变。

图6为不同组小鼠血清中雌激素的含量示意图，图中纵坐标代表含量，单位ng/L。参见图6，本申请通过对各组小鼠血清中性激素水平的检测发现，与NCD组相比，GSM组小鼠血清中的雌激素E2含量明显较少，在分别给予雌激素、表皮生长因子和复合制剂治疗后雌激素的含量有所上升，均接近于正常组，其中复合制剂组(CDP组)对雌激素的增加作用最明显。

图7为不同组小鼠血清中雄激素的含量示意图，图中纵坐标代表含量，单位ng/L。参见图7，本申请通过对各组小鼠血清中性激素水平的检测发现，与NCD组相比，GSM组小鼠血清中的雄激素含量明显减少，在E2组中经过雌激素治疗后雄激素的含量并没有明显增加，说明雌激素对雄激素的产生没有促进作用；相反的，经表皮生长因子治疗的EGF组和复合制剂治疗的CDP组中雄激素的含量明显上升，且CDP组的上升更明显。

3.3复合制剂可以调节小鼠动情周期紊乱，建立正常的动情周期

小鼠的动情周期类似于人的月经周期，是正常性反应的基础。图8为小鼠四个动情周期的HE染色图。其中，A为动情前期，可见成群或单独出现的梭形上皮细胞，白细胞较少；B为动情期，见大量鳞状上皮细胞，形状大而不规则，无核，白细胞消失；C为动情后期，可见多种细胞类型，白细胞，无核的上皮细胞及梭形上皮细胞；D为间期可见大量白细胞，极少量梭形上皮细胞。图9为不同组小鼠动情周期的变化示意图，图中横坐标代表四个动情周期，Proestrus-动情前期，Estrus-动情期，Metstrus-动情后期，Diestrus-间期，纵坐标代表各个周期的百分比，CDP-复合制剂组，Model-动情周期紊乱模型组，NCD-正常对照组。参见图9，为验证该复合制剂对小鼠动情周期的影响，本申请通过注射来曲唑(芳香化酶抑制剂，可以抑制雄激素向雌激素的转化，造成高性激素血症，导致动情周期紊乱)建立动情周期紊乱模型小鼠。通过复合制剂治疗后我们发现：小鼠在造模后出现动情周期紊乱，可见持续较多的动情间期，而动情周期的其他期表现较少，提示无排卵，经复合制剂治疗21天后，其他三个动情期逐渐出现，到治疗后期出现规律的动情周期，表明该复合制剂对小鼠动情周期紊乱有很好的恢复作用。

3.4复合制剂可以改善小鼠阴道的排尿障碍

当女性处于围绝经期时，由于雌激素缺乏容易引起一系列由于膀胱及尿道黏膜萎缩所致症状，如萎缩性膀胱炎、尿道炎、尿道口外翻、肉阜及张力性尿失禁等，出现尿频、尿急、夜尿增多等症状。图10为检测不同组小鼠排尿习惯变化的尿斑实验。正常情况下，小鼠排尿时会选择笼子的四个角进行集中排尿，且尿斑大小适中很有规律，这与小鼠的习性有关；但当发生排尿功能障碍如尿频、尿急、夜尿增多时，小鼠不能控制其排尿，就会在笼子的任意地方排尿，往往呈“滴尿”的形式。如图10所示，正常组小鼠的排尿行为在未受到损害的情况下，尿斑大小适中，且规律的分布于四个角落，但GSM组小鼠就出现了明显的异常，尿斑形态无规则，以小尿斑为主，分布在笼子的各个地方，这表明小鼠出现了排尿功能障碍，未能等走到适合排尿的地方就发生漏尿；经过三个治疗组的治疗后，小鼠的排尿行为又明显改善，小尿斑的占比较少，逐渐趋近于四个角落的排尿，其中复合制剂组改善的最为明显，最接近正常组。这充分说明，该复合制剂能改善小鼠的排尿功能障碍，即显著减轻尿频、尿急、夜尿增多等症状。

由以上实验结果可知：

1.本申请提供的复合制剂能预防和治疗围绝经期性器官的萎缩进程，维持阴道、子宫的年轻化；

2.本申请提供的复合制剂可以提高围绝经期小鼠性激素水平；

3.本申请提供的复合制剂有助于恢复围绝经期小鼠紊乱的动情周期；

4.本申请提供的复合制剂可以改善小鼠的排尿习惯，减轻尿频、尿急、夜尿增多等症状。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，其特征在于，包括以下主要组分：表皮生长因子，沙棘籽油和甘油。

2.根据权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂还包括伯克霍尔德菌、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌中的一种或多种。

3.一种复合制剂，应用于预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征，其特征在于，包括以下组分：表皮生长因子20-30％，伯克霍尔德菌1-3％、植物乳杆菌、费氏丙酸杆菌1-3％，沙棘黄酮5-15％，甘油41-72％。

4.一种复合制剂在预防和/或治疗女性围绝经期泌尿生殖综合征及在其产品中的应用。

5.一种复合制剂在预防和/或治疗女性阴道萎缩、维持性器官状态及在其产品中的应用。

6.一种复合制剂在预防和/或治疗女性围绝经期排尿功能异常、尿频、尿急、夜尿增多等排尿障碍及在其产品中的应用。

7.一种复合制剂在提高女性围绝经期性激素水平、调节并恢复女性紊乱的月经周期及在其产品中的应用。

8.根据权利要求4-7所述任意一项的应用，其特征在于，所述产品包括药物和保健品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括凝胶、软胶囊、滴丸、乳剂、片剂、洗剂、搽剂、软膏剂或栓剂等。