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CN1142197A - 从血液中除去白细胞和病毒灭活药剂的装置和方法 - Google Patents

从血液中除去白细胞和病毒灭活药剂的装置和方法 Download PDF

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CN1142197A
CN1142197A CN95191887.7A CN95191887A CN1142197A CN 1142197 A CN1142197 A CN 1142197A CN 95191887 A CN95191887 A CN 95191887A CN 1142197 A CN1142197 A CN 1142197A
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CN
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filter
blood
ligand
leucocyte
inactivating agents
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CN95191887.7A
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F·卡斯丁诺
A·R·M·阿扎德
E·K·-L·李
Y·富龙
C·M·泽普
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Hemasure Inc
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Abstract

公开了一种从全血或血液组分中除去白细胞和病毒灭活药剂的过滤器(中空纤维膜，平板膜，或深过滤器)。一种深过滤器包括编结织物网片，它经改性固定有病毒灭活药剂的配位体，白细胞配位体，或两者的配位体。一种膜的例子含有类似地改性的聚醚砜膜。此外，还公开了一种从全血或血液组分中同时除去白细胞和病毒灭活药剂的过滤装置。一种装置包括(1)一个室，装有(2)活性炭(3)机械稳定的聚合物材料，聚合物材料可以改性以固定白细胞配位体。还公开了从血液中除去白细胞和病毒灭活药剂的一般方法。

Description

从血液中除去白细胞和病毒灭活药剂的装置和方法
                    本发明的领域
本发明涉及从全血或血液组分中除去白细胞和病毒灭活药剂的深过滤器和膜过滤器，制备所述过滤器和膜的方法，用所述膜和过滤器从全血或血液组分中除去白细胞和病毒灭药剂的方法。
                   本发明的背景技术
血液产品，特别是用来输血的那些产品，是非均匀的，除含有各种具有不同活性的分子组分外，它们含有各种类型的细胞。通常要输血的病人只需要一种组分(例如，输送气体的红细胞)，而存在于血液中的其它产品不仅是不需要的，而且甚至可能是不利的或有害的。从这方面讲，白细胞被认为是输血中不需要的物质，这是因为“一旦被输入，它们可能对它们的宿主进行攻击，并释放内生热源质，与细胞有关的病毒，或甚至引起致命的对宿主的移植疾病(graft-versus-host disease)。”[请参看Klein的“Wolf in Wolfs Clothing：Is It Time to Raisethe Bounty on the Passenger Leukocyte？”Blood 80，1865-1867(1992)]。由于这一原因，必须将白细胞降低到最低的可行的水平。
因此，特别希望有一种从全血或血液组分中快速且有效地除去白细胞和其它碎片的方法。
除了除去白细胞外，还需要除去病毒灭活药剂。近年来，人们特别关心对在血液和血液产品中如肝炎B(HBV)、肝炎C(HCV)、人TLymphotrophic Retrovirus Type 3(HTLV)、人体免疫缺陷病毒(HIV)和Lymphadenopathy Associated病毒(LAV)等病毒的灭活。目前，将血液和血液产品中的这些病毒灭活的方法包括(1)用如甲醛的化学消毒剂处理(参见US专利4,833,165)；(2)用感光剂处理。例如美国专利US5232844描述了酞菁的应用；美国专利US5041078描述了假蓝宝石的应用；美国专利US4,169,204、4,294,822、4,328,239和4,727,027描述了不同furocoumarins(补骨脂灵)和其类似物的应用；Meruelo等人[Pro.Nat Acad.Sci.U.S.，85，5230-5234(1988)]已描述了金丝桃素的应用；Lambrecht[Vox Sang.60，207-213(1991)]等人已描述了吩噻嗪染料(亚甲蓝和甲苯胺蓝)的应用；美国专利US4,915,683描述了部花青染料使病毒灭活的应用。按照这些方法，外源感光剂被添加到血液或血液组分中，用适当波长的光辐照溶液，使病毒灭活。
例如，向要用来输血的血浆中添加亚甲蓝。尽管亚甲蓝具有有效的杀病毒(virucidal)性能，并通常被认为是安全的，然而，它在血浆中是外源组分，可能有长期的还未被完全认识的付作用。其它病毒灭活药剂，如补骨脂类，也会带来类似的危险。
在前述的所有处理中，外源药剂被添加到生物流体中，在大多数情况中，这些外源药剂必须在引入人体之前除去。
本发明提供了一种方法，用于在杀病毒作用完成后除去杀病毒药剂。
欧洲申请239,859描述了一种方法，是目前用来从生物流体中除去脂类可溶性处理药剂的方法。它包括使流体与自然界中存在的油接触，搅拌所得混合物，滗析上层脂相，利用剩余的生物流体。除其机械复杂性外，该方法似乎只能除去脂类可溶性处理药剂。
基于分子量的差别，用凝胶过滤用于从血液组分中除去小分子也是已知的。Horowitz等人[Transfusion，25，p.516-522(1985)]已描述了用Sephadex G-25色谱法从抗嗜血药因子浓缩物中除去三正丁基磷酸酯。然而凝胶色谱法不适于用来从血浆和全血中除去小分子。
PCT申请WO 91/03933讨论了用硅胶、改性硅胶、玻璃微珠和离子交换树脂从血浆中吸附亚甲蓝。对于血浆的常规处理，目前使用的或已提出的方法中没有一种特别有吸引力。
从红细胞浓缩物、血小板浓缩物以及其它血液组分中除去白细胞的介质和装置已为人们所描述。介质是常用的具有控制直径的非织垫，其基本上依赖于细胞的机械截留。
Pall和Gsell(美国专利US4,880,548)公开了一种贫化血小板浓缩物中白细胞含量的装置。该装置引入了改进的多孔纤维介质，通过向纤维表面化学地结合上高密度的羟基，使其临界润湿表面张力提高到了约90dynes/cm。这是通过接枝羟乙基甲基丙烯酸酯来完成的。Pall(美国专利4,925,572)将这一概念延伸到了包括有三个元件的装置中，第三个元件是用来除去白细胞的，通过涂覆如2-羟乙基甲基丙烯酸酯和甲基甲基丙烯酸酯混合物之类的聚合物，或通过用如氧化之类的化学反应改性基质聚合物，被改性到其临界润湿表面张力为53-90 dynes/cm。Nishimura等人(美国专利US4,936,998)利用类似的方法使用聚对苯二甲酸乙酯纤维的过滤器，该纤维的表面是2-羟乙基甲基丙烯酸酯和二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯的共聚物。
Beutler等人[J.Lab.Chem.Med.88，328-333(1976)]描述了一种从全血中除去白细胞的方法，是使血液通过由微晶纤维素和α-纤维素组成的床层。
贫化白细胞的过滤器元件描述在美国专利US5,190,657中。这种深过滤器适用于作为组装下面将要描述的本发明的第二种设备的过滤器装置是的部件，它们提供了添加白细胞和病毒灭活药剂配位体(ligand)的起始点。
日本专利申请02-167071报告了一种用亲合色谱柱分离非人类动物B淋巴细胞的系统，亲合色谱柱具有的各种直径为0.05-5mm的颗粒，且有糖类吸附在其上。当处理的目的是要获得特殊类型的细胞时，这种亲合柱是有用的，但当其目的是纯化血液或血液组分时，它们的应用通常受到限制，这是因为在最终产品中所需要的其它细胞组分(如红细胞)可能被不同程度地阻滞或损害。此外，许多适合于用作色谱介质的基材会引起溶血作用。如果目的是获得淋巴细胞用来作免疫研究，则溶血作用不成问题，如果是要获得用来输血的血液或血液组分，则溶血作用是一个非常重要的问题。
                   本发明的概述
本发明提供了一种快速、安全并非常高效地从血浆或其它血液组分中除去白细胞、病毒灭活药剂，或同时除去二者的过滤器和方法。能除去的典型灭活药剂包括：
★补骨脂灵，补骨脂衍生物，以及相关的化合物；
★金丝桃素，其衍生物，以及相关化合物；
★包括甲醛在内的用于病毒灭活的醛类；和
★各种染料(例如，亚甲蓝，甲苯胺蓝，结晶紫罗兰)以及它们的光降解产物。
本发明能有效地，完整地(即单一步骤地)从血浆中除去白细胞和病毒灭活化合物--因此生产了不含活病毒、杀病毒化合物和白细胞的血液产品。本发明还提供了一种将病毒灭活药剂的配位体和白细胞的配位体固定到市场上可买到的过滤器上方法。本发明的一个特别的优点是其能使血液去污而不必使全血经受可能引起絮凝和红细胞溶血的化学药剂和/或流动条件作用，没有当全血通过色谱柱时所遇到的问题。
在第一方法方面，本发明涉及一种从血液产品中除去白细胞的方法，如使血浆通过一种新的过滤器从血浆中除去白细胞。该新过滤器构成了本发明的第一设备方面，它含有包括机械稳定的聚合物基材的编结的(laid)织物网片，至少一部分聚合物基材具有共价固定在其上的配位体。配位体具有对白细胞表面的亲合力，能直接固定到基材上或能通过一个中间链接头或多重链接头固定到基材上。合适的配位体包括选择蛋白族(selectin family)的糖蛋白和糖类，特别是如肝素的聚糖。如果有链接头的话，可以是如乙二胺的亚烷基二胺残基。
用于除去白细胞的过滤器的具体实例包括能保持形状的编结的(laid)织物网片，网片的厚度为1-8mm，其堆积密度为0.05-0.4g/cm3，所述网片包括：
   (a)许多平均旦数为0.05-0.75、平均长度为3-15mm的联锁织物纤维，所述织物纤
维在所述网片上基本均匀地分布以形成织物纤维的基体，基体在相邻联锁纤维间隙之
间有空间，
   (b)许多表面改性的聚合物材料的纤丝化的颗粒，所述聚合物材料的表面积为每克
5-60平方米，所述纤丝化颗粒大都位于所述基体空间内，所述纤丝化颗粒具有许多与
所述空间的相邻织物纤维联锁的细纤，所以在所述血液的过滤期间纤丝化的颗粒基本
上不会被从所述网片排出。其中，纤丝化颗粒与织物纤维的重量比率在1∶99和40∶60之间；而所述表面改性的聚合物材料是共价连接到白细胞配位体上的血溶惰性聚合物；同时所述织物纤维是血溶惰性的，并且对碱水解是稳定的。
在优选的方案中，表面改性的聚合物材料是纤维素酯，特别优选乙酸纤维素，白细胞的配位体是肝素，链接头是乙二胺。过滤器中的织物纤维是聚烯烃、聚酰胺、聚砜、聚酯、聚乙烯醇和聚(乙烯-乙烯醇)共聚物纤维中的一种或多种；聚烯烃或包覆有聚烯烃的纤维是优选的。
在第二方法方面，本发明涉及一种从血液产品中同时除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的方法，如使血浆通过适合于除去白细胞和杀病毒药剂的过滤器从血浆中除去白细胞和杀病毒药剂。“适合于除去白细胞”是指具有适当的几何结构和表面化学性质，能捕集至少一部分存在的白细胞，并能使其它感兴趣的血液组分通过。包括前段中描述的过滤器。
在第二方法方面(即双重除去白细胞和杀病毒剂)的第一个方案中，通过将杀病毒药剂吸附在活性碳或含有活性碳的介质上，从而实现杀病毒药剂的除去。在这一方案中，使血液或血液组分通过适于除去白细胞和杀病毒药剂的过滤器，从全血或血液组分中同时除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂，所述过滤器包括(1)能截留白细胞的机械稳定的聚合物材料和(2)能除去病毒灭活药剂的活性碳。一部分机械稳定的聚合物材料可以有共价地固定在其上的第一配位体，它具有对白细胞表面的亲合力(即相应于本发明的第一方面的过滤器)。在优选的方法中，血液组分是血浆。在另一优选的特别适合于血浆的方法中，病毒灭活药剂选自由吩噻嗪染料和吩噻嗪染料的光降解产物组成的组。优选地，病毒灭活药剂选自由亚甲蓝、甲苯胺蓝和亚甲蓝、甲苯胺蓝的光降解产物组成的组。能截留白细胞的机械稳定聚合物材料可以包括在编结的(laid)织物网内片。
在第二设备方面，提供了一种能完成第二种方法的第一方案的过滤器装置。该装置包括(1)一个室，它密封(2)含有活性碳的过滤器元件，和(3)至少一个适合于截留白细胞的过滤器元件。适合于截留白细胞的过滤器元件含有编结的(laid)织物网片，该网片可以包括一机械稳定的聚合物材料，聚合物材料上固定有第一配位体，第一配位体具有对白细胞表面的亲合力。第一配位体可以直接固定到聚合物材料上，也可以通过至少一个中间链接头固定到聚合物材料上。如果有的话，优选的配位体是肝素。
在一具体方案中，前述的过滤器元件包括(1)含有活性碳的过滤器元件，优选含有碳/纤维素复合物，和(2)能保持形状的编结的(laid)织物网片，网片的厚度为1-8mm，堆积密度为0.05-0.4g/cm3。所述网片包括：
   (a)许多平均旦数为0.05-0.75，平均长度为3-15mm的联锁织物纤维。所述织物纤
维基本均匀地分布在网片上，以形成织物纤维基体，在联锁的纤维相邻间隙之间有空
间；和
   (b)包括许多纤丝化的聚合物材料颗粒的机械稳定的聚合物材料，其表面积为每克
5-60平方米，所述纤丝化颗粒位于基体的空间内。纤丝化的颗粒有许多细纤，它们与
空间内的相邻织物纤维相互联锁，所以在过滤期间纤丝化颗粒基本上不会从网片排
出。其中，纤丝化颗粒与织物纤维的重量比率在1∶99和40∶60之间，优选的聚合物材料是乙酸纤维素，优选的织物纤维是聚烯烃和聚酯纤维。
在第二方法方面的第二方案中，使杀病毒药剂通过含有机械稳定的基材的过滤器，从而实现杀病毒药剂的除去，所述基材具有适于除去白细胞和病毒灭活药剂的表面化学性质。本发明的第三和第四设备方面涉及实施第二方法方面的第二方案的装置。
在第三设备方面，本发明涉及从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的(非膜)过滤器。通常，为了除去病毒灭活药剂，必须对基材进行改性，以使至少一部分机械稳定的基材具有共价固定的第一配位体，该配位体具有对病毒灭活药剂的亲合力；然而，在某些病毒灭活药剂的情形中，基材本身可能具有对特殊杀病毒药剂的亲合力以实现吸附，不必添加病毒灭活药剂的特殊配位体。基材可以另外包括共价固定的对白细胞表面有亲合力的第二配位体。
在第三设备方面，过滤器含有编结的织物网片，网片包括一机械稳定的聚合物基材。至少一部分聚合物基材具有共价固定在其上的第一配位体，该配位体具有对病毒灭活药剂的亲合力。在一个方案中，第一配位体是直接固定到聚合物基材上的；在另一方案中，第一配位体是通过至少一个中间链接头固定到聚合物基材上的。
第一配位体可以是一个肼的端基，病毒RNA或DNA的仿制品，特别是聚胸苷(polythymidine)，糖类，或病毒蛋白的仿制品。
聚合物基材还可以具有共价地固定到其上的第二配位体，它具有对白细胞的亲合力。第二配位体可以是选择蛋白族中的糖蛋白，或糖类，特别是包括葡糖醛酸残基的磺基聚糖，如肝素。正如前面所述，配位体可以直接固定到聚合物基材上，或配位体通过至少一个中间链接头固定到聚合物基材上。中间链接头可以是亚烷基二胺的残基，在这种情况下，当有中间链接头时，链接头可以通过键合到配位体的羧基上的胺来固定到配位体上。
优选的过滤器是正如上面年描述的适于该方法的过滤器。它包括能保持形状的编结织物网片，所述网片的厚度为1-8mm，堆积密度为0.05-0.4g/cm3。该网片包括：
    (a)许多平均旦数为0.05-0.75，平均长度为3-15mm的联锁织物纤维，所述织物纤
维基本均匀地分布在网片上，以形成织物纤维基体，在联锁的纤维相邻间隙之间有空
间；和
    (b)许多纤丝化的表面改性了的聚合物材料颗粒，其表面积为每克5-60平方米，
基本上位于所述基体的空间内。纤丝化的颗粒有许多细纤，它们与空间内的相邻织物
纤维相互联锁，所以在所述血液的过滤期间纤丝化颗粒基本上不会从网片排出。其中，纤丝化颗粒与织物纤维的重量比率在1∶99和40∶60之间；而所述表面改性的聚合物材料是共价连接到许多病毒灭活药剂配位体和许多白细胞配位体上的血溶惰性聚合物；且其中所述织物纤维是血溶惰性的。在各方案中，表面改性的聚合物材料是乙酸纤维素，而织物纤维是聚烯烃、聚酰胺、聚砜、聚酯、聚乙烯醇和聚(乙烯-乙烯醇)共聚物纤维中的一种或多种；聚烯烃纤维是优选的。
在第四设备方面，本发明涉及适合于完成本发明第二方法方面的第二方案，即适合于从血液组分或全血中除去白细胞和病毒灭活药剂的中空纤维或平板膜。该膜包括：
    (a)作为主要疏水聚合物组分的聚醚砜(PES)，所述PES具有可官能化的酚链端；
   (b)固定在许多所述酚链端上的第一链接头基团，所述第一链接头基团是从由选自
由乙二醇二环氧甘油醚、1，4-丁二醇二环氧甘油醚和表氯醇组成的组中的环氧乙烷
所衍生的；和
   (c)固定有许多所述第一链接头基团的表面改性的聚合物材料，而所述表面改性的
聚合物材料是共价连接到许多病毒灭活药剂配位体和许多白细胞配位体上的血溶惰性
聚合物，优选表面改性的聚合物材料是通过第二链接头基团共价地固定在配位体上的
羟烷基纤维素或聚乙烯亚胺。优选的配位体包括肝素和聚胸苷。
在第三方法方面，本发明涉及一种生产白细胞和/或病毒灭活药剂过滤器的方法，这种过滤器适合于用在第一方法或第二方法的第二方案中。生产过滤器的方法两种情况基本类似，仅在最后一个步骤中有所不同，该步骤是固定白细胞或病毒灭活药剂或二者的适当配位体。制造方法(即本发明的第三方法方面)包括：
   (a)提供一种能保持形状的网片，该网片包括：
      (1)许多抗碱降解的纤维，和
      (2)许多乙酸纤维素纤维；
   (b)用碱的水溶液处理所述网片，使一部分乙酸纤维素酯水解成相应的游离羟基；
   (c)活化所述游离的羟基以生成氨活性基团；
   (d)使所述氨活性基团与二胺或二肼反应；和
   (e)使所得到的胺或肼与病毒灭活药剂、白细胞或二者的配位体的活化的衍生物反
应。当病毒灭活药剂是甲醛或其它醛时，最后一个步骤(e)可以省略，最后的肼可经用来螯合醛。
第三方法方面的具体实例需要：
   (a)提供能保持形状的编结织物网片，所述网片的厚度为1-8mm，堆积密度为
0.05-0.4g/cm3。该网片包括：
       (1)许多平均旦数为0.05-0.75，平均长度为3-15mm的联锁聚烯烃纤维，所
述聚烯烃纤维基本均匀地分布在网片上，以形成织物纤维基体，在联锁的纤维相邻间
隙之间有空间；和
       (2)包括许多纤丝化的乙酸纤维素颗粒，其表面积为每克5-60平方米，基
本位于所述基体的空间内，所述纤丝化的颗粒有许多细纤，它们与所述空间内的相
邻聚烯烃纤维相互联锁，所以在血液过滤期间纤丝化颗粒基本上不会从网片排出；纤
丝化颗粒与聚烯烃纤维的重量比率为1∶99-40∶60；和
   (b)用碱的水溶液处理所述网片，使一部分乙酸纤维素酯水解成相应的游离羟基；
   (c)活化所述游离的羟基以生成氨活性基团；
   (d)使所述氨活性基团与二胺或二肼反应；和
   (e)使所得到的胺或肼与聚胸苷或肝素的活化衍生物或这两者的组合同时或顺
序进行反应。该网片用1N的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液在20-40℃下处理8-312小时。为提供对聚合物材料的所需改进，可以改变参数，如氢氧化钠溶液的浓度、碱的性质(例如氢氧化钾)、温度和时间。
游离羟基可以通过与选自由溴化氰、羰基二咪唑、二乙烯基砜、吖内酯、碘酰氯、双环氧化合物、二卤化物、卤环氧化物、2，4，6-三氯-S-三嗪、2-氟-1-甲基吡啶鎓盐、二磺酰氯、高碘酸(盐)、二酰基氯、二异氰酸和卤代乙酸组成的组中的活化剂反应，再与N-羟基琥珀酸亚胺和碳化二亚胺反应来活化。
在优选的方法中，氨活性基团与己二酸二肼(adipic dihydrazide)反应生成许多N-单取代的肼。
                    附图简述
图1是按本发明第一设备方面的过滤器的透视图，其构型在放入过滤器载体中是有用的。
图2是沿图1的过滤器一部分中I-I线的横截面的局部示意图。
图3是按本发明的第一设备方面的过滤器的示意图，显示了固定了的适于白细胞表面特性的配位体。
图4是按本发明的第三设备方面的过滤器的示意图，还显示了固定了的病毒灭活药剂的配位体。
图5是按照本发明第二设备方面的过滤器装置的横截面的示意图。
              包括优选方案在内的详细描述
在一个适合于第一设备方面的方案中，本发明提供了一种同时除去白细胞和横截面大于约8μm的任何其它碎片或组分的过滤器，在另一方案中，提供了一种主要用来除去白细胞的中空纤维或平板膜，当然，如果适当地设计膜和设备，它也可用来进行基于颗粒大小的机械过滤。通过适当的改性，膜也可以用于除去白细胞和一部分存在有白细胞的水溶液。
过滤器是美国专利US5,190,657中描述的过滤器的改进型。为了清晰的原故，在下面的描述中使用该专利中的构型。简单地说，过滤器由能保持形状的编结织物网片过滤材料组成。如图1所示，网片被切成园形形成过滤器，适合于放入圆柱形的过滤器载体中。
网片的厚度至少为1毫米，优选至少2毫米，可厚至约8毫米。编结的网片的密度在约0.05-0.4g/cm3。
如图2所示，该图高度示意地描述了图1的过滤器的截面部分，过滤材料包括许多基体织物纤维5，织物纤维的平均旦数为约0.05-0.75。至少60％，优选70％，进一步优选80-85％的纤维的旦数在上述范围内，其长度为12,000-180,000m/g。
如图2所示，织物纤维在整个网片上基本均匀地分布以形成织物纤维的基体。在联锁纤维的相邻间隙6之间，基体有空间7。在这些空间内，有许多纤丝化的高表面积的颗粒10。纤丝化的颗粒位于空间7内，也沿基体织物纤维5及其中间分布。
一部分基体织物纤维5可以有壳层和芯，其旦数和长度与上面描述的一样。壳层是熔融温度低的聚合物，而其芯是熔融温度高的聚合物。熔融温度低的聚合物通常包括熔融温度低于约190℃的聚合物。当过滤材料中至少一部分基体织物纤维是壳层/芯结构的时，过滤材料的网片要经受如软化聚合物壳层的温度的作用，使一些织物纤维键合在一起。通常，5-35％的基体织物纤维是壳层/芯结构的。
基体织物纤维通常是合成聚合物纤维，如聚烯烃或有聚烯烃壳层的纤维、聚酰胺、聚砜、聚酯、聚乙烯醇和聚(乙烯-乙烯醇)共聚物纤维。聚烯烃纤维非常能抵抗碱水解，因此是优选的。当过滤器是用来从红细胞中分离白细胞的时，织物纤维和细纤两者的重要特征是它们与血液应当是可混合的，特别地，它们不能引起明显的溶血。在临床上，游离红血蛋白的增加超过10％则认为溶血为明显的。
如果使用了有壳层的纤维，则这种纤维具有上面提及的织物纤维材料芯和任何熔融温度低的聚合物壳层。如聚乙烯和聚丙烯的烯烃聚合物是优选的，因为它们提供了熔点相对低的壳层，容易软化壳层并提供必要的附着力。此外，它们能抗碱水解。壳层通常是芯直径的5-30％。
纤丝化颗粒是聚酯纤维材料、丙烯酸纤维材料、尼龙纤维材料、聚烯烃纤维材料或纤维素纤维材料。经常使用乙酸纤维素，这是因为这种材料能产生大量的细纤，并且本身具有疏水性质。
在下面的实施例中使用的过滤器是从Lydall Inc.(Manchester，CT)购得的，由聚丙烯纤维和乙酸纤维素“fibrets”组成。通常，任何包括乙酸纤维素组分和能保持形状的抗碱水解网片的过滤器都适合于按本发明第三方法方面进行改进。
Lydall聚丙烯/乙酸纤维素过滤垫(厚1.9mm，型号825B)的改性可以通过将直径为90mm的盘浸渍在碱性水溶液中来进行，浸渍时间可长可短。所述垫在过滤器上用水彻底洗涤直至接近中性，然后在30-40℃的空气中干燥。这样水解使乙酸纤维素转化成了含有游离羟基的纤维素。如果水解不充分，所得到的可用来进行后续反应的羟基的数量非常少，因此在所得的过滤器的白细胞容量就低，反之，彻底的水解能导致纤维素基材的降解。在一具体实施例中，网片用氢氧化钠的水溶液进行水解。本领域内的技术人员知道不同的温度、氢氧化钠浓度、和处理时间会影响基材的水解和降解程度。通常，氢氧化钠浓度高于0.1N低于5N，温度低于60℃，处理时间为约8小时至13天这样的处理条件能得到适当的水解，而不会导致基材的过度降解。对于这种特定的垫，发现用1N的氢氧化钠在室温下处理8-312小时能提供基材的适当的水解和可接受的降解。可以预料，如氢氧化钾、氢氧化锂等其它碱也能起类似的作用。
“水解垫”，即有游离OH官能团的纤维素，能用广泛已知的方法来活化。请参看Immobilized Affinity Ligand Techniques(Greg T.Hermanson，A.Krisna Mallia，and Paul K.SmithAcademic Press，Inc.，San Diego CA，(1992)，p.51-132)和Affinity Chromatography，A practicalApproach，(P.D.G.Dean，W.S Johnson and F.A.Middle，p.31-59，IRL Press Ltd.Eynsham，OxfordOX81JJ，England(1987))和美国专利US3,389,142，这些文献在这里引入作为参考。两种优选的方法包括溴化氰活化和高碘酸(盐)化。
溴化氰与纤维素连二醇反应生成亚氨基碳酸酯和/或氰酸酯中间体。这些对亲核反应是高度活化的，能接着与含有伯胺的链接头(linkers)或配位体反应。反应的结果是配位体链接头通过一个氨基甲酸酯共价地固定到纤维素上。活化反应按Axen[Nature 214，1302-1304(1967)]等人和Cuatrecasas等人[Proc.Nat.Acad.Sic.US61,636-643(1968)]的描述或作少量的变动来进行。
高碘酸(盐)活化涉及高碘酸诱导的连二醇氧化裂解成醛，该醛对链接头或配位体中的伯胺是有类似的活性的。通常用氰基氢硼化钠或类似的还原剂进行一还原步骤使可能水解的不稳定席夫碱转化成烷基胺。这些反应对本领域内的技术人员来说是熟知的。
在配位体含有由于与白细胞表面相互作用而不需要反应剂易于接近的伯胺基的情况下，在原理上，它可以按前面所描述的直接固定到活化的纤维素上。然而，在大多数情况下，要采用含有氨基的链接头以在纤维素和配位体之间提供桥梁。
当要制备本发明第四设备方面的膜而不是深过滤器时，如第一到第三设备方面一样，通常使用多层的链接头。在这种情况下，“表面改性的聚合物材料”可以包括一层具有能改造基体表面性质和/或复接(multiplying)可能的附着点的官能团的聚合物。例如，可以向聚砜膜基材施加一层羟乙基纤维素(HEC)，白细胞的配位体可以经缩水甘油醚和亚烷基二胺固定到HEC上。尽管在这一实施例中，HEC通常被称之为基材聚砜的涂层聚合物，为了本发明的目的，所有的这种层(HEC，缩水甘油醚和亚烷基二胺)都可以认为是将配位体共价地固定到基材上去的“链接头”。
对于使用至少一种链接头有几个原因：(1)配位体可能没有用于直接固定到所需基材上去的官能团，(例如，肝素固定到乙酸纤维素上)；(2)为提供稳定的共价键的化学反应在链接头上可以更容易地进行；和(3)希望提供具有某种程度的迁移性(mobility)的配位体，使之能更好地接近其目标分子(白细胞)上的键合点；在这一方面，链接头在配位体和相对刚性的聚合物(纤维素)骨架之间起一种系链的作用。在下面的大部分实施例中，亚乙基二胺在纤维素基体和糖类配位体之间用作链接头，但是，任何亚烷基二胺(如六亚甲基二胺)都可以用在这种情况中，其它的链接头可以用于其它的化学反应。一般说来，只要所需的共价地固定的化学反应不损害配位体和白细胞之间的键合，其一端能固定到基材上，而另一端能固定到配位体上的任何双官能团分子都能在本发明中起作用。
在这里选择键合被认为是一种分子(通常被称为受体)对另一种(通常被称为配位体)分子的特征识别，这种识别是通过第二种分子上的决定点的结构或极性来进行的。亲合力足够强的两种分子之间发生选择键合。键合亲合力通常用缔合物和离解物的平衡浓度的亲合常数(Ka来表示，即Ka＝[R-L]/[R][L]，其中[R]、[L]和[R-L]分别为受体(R)、配位体(L)和受体-配位体复合物(R-L)的平衡浓度。
受体和配位体分子的特征键合作用通常包括可逆非共价缔合。
已知白细胞经白细胞上的唾液酸化(sialylated)，岩藻糖基化(fucosylated)乳糖残基与内皮细胞上的细胞受体之间的相互作用专门键合到内皮细胞和血小板上。在某些情况下细胞受体是E-选择蛋白族的糖蛋白。(在较老的文献中，这些糖蛋白经常被称为内皮白细胞的粘附分子或ELAMs。)在另一些情况下，键合出现在sialy残基(在白细胞表面能找到)与其它糖蛋白如周围淋巴节归巢受体(也被黍为鼠Mel14抗原和Leu8抗原)和P-选择蛋白(粒状膜蛋白140，GMP-140，也被称为“PADGEM”)之间。
“选择蛋白”这一词是指所有种类的受体，包括ELAM-1(E-选择蛋白)和GMP-140(P-选择蛋白)，因为它们有与外源凝集素(lectin)相似的区域和粘附功能的选择性。另一种选择蛋白的成员是MEL-14抗原，以及其人体类似物LAM-1，都是淋巴细胞的细胞表面受体。
选择蛋白受体的结构和功能，已通过各个上述受体的克隆化和全长度DNA编码表达式进行了说明。选择蛋白的细胞外的部分可以根据前面描述过的蛋白质的同系性分为三节段。与N端接的区域(约120个氨基酸)与C-型哺乳动物的外源凝集素蛋白族有关。因为选择蛋白受体包括类似于外源凝集素的区域，分子的特异性可能是以蛋白质-糖类的相互作用为基础的。有证据显示Lewis X抗原的唾液酸化、岩藻糖基化的N-乙酰基乳糖胺单元，称之为SLX，是由选择蛋白受体的外源凝集素区域识别的基团。特别地，证据显示这些基团的识别是由E-选择蛋白和P-选择蛋白两者来完成的。因此，E-选择蛋白、P-选择蛋白或它们各自的与N端接的片段作为配位体特别有吸引力，尽管它们所需的费用还不能推荐它们在工业上实现。
目前，在工业上较大的兴趣是使用肝素和类似的磺化聚葡糖醛酸去选择键合白细胞。其效果似乎类似于前面描述的相互作用，但据推测是由白细胞的不同表面特征所媒介的。这种键合现象首先是用相差显微镜观察到的，我们发现白细胞粘附到涂有肝素(用于研究，但不涉及白细胞的除去)的HyperDTM微珠(Sepracor，Inc.Marlborough，MA)上。进一步的研究表明对照的HyperDTM微珠和对照的琼脂糖微珠不会键合白细胞。商品肝素-琼脂糖微珠也不健合白细胞。这证明是一项重要的发现，可以相信是由于事实上在工业过程中，将肝素固定到琼脂糖上的化学反应会干扰键合。(参看下面)，因此，从本领域的固定的肝素的结果来看，发现肝素可以用于键合白细胞是特别令人意想不到的。
在使用带有羧酸基团的肝素、软骨素磺酸盐和类似的聚糖的情况下，羧酸可以被活化用于与链接头或基材中的亲核体反应。通常，亲核体基团是伯胺，而活化使用本领域内已知的任何能形成胺键的方法。我们发现EEDQ和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)是特别有用的。肝素的己糖基与高碘酸(盐)的氧化作用，如上面描述的纤维素一样，会形成不会键合到白细胞上的共轭物。
应用于制造用于除去白细胞的过滤器的前述的化学反应也可以应用于制造中空纤维或平板膜，它们是本发明的第四设备方面的实施例。在这种情况下，中空纤维膜按已公开的PCT申请90/04609中的方法制备。所得的中空纤维膜再按上述方法处理以固定配位体。
本发明的第二方法和设备方面涉及病毒灭活药剂的除去，特别关注的是其中的吩噻嗪染料。吩噻嗪染料是一种键合到核酸上的光化学药剂。在适合的活化条件下，如用长波紫外线辐射，吩噻嗪染料交联到病毒中的DNA和RNA的链上，因此不能伸展和复制。它们也与膜结构进行反应并从分子氧诱导产生杀病毒的氧原子。吩嗪染料的这些特征形成了病毒灭活和某些光化学疗法的基础。[请参看PCT申请WO91/03933]。然而，为保证与病毒进行彻底的相互作用要使用稍微过量的吩噻嗪染料，血浆中残留物对输血的病人来说是危险的。例如，亚甲蓝被认为具有一定程度的致突变性和其它的付作用，可能与常规输血的长期的暴光有关。所以，在病毒灭活处理后，需要从血浆中除去未反应的吩噻嗪染料和它们的代谢和光降解产物。
在所有的灭活处理中，都向生物流体中添加外源药剂。在大多数情况下，在生物流体被施用于人体之前，必须从其中除去外源药剂。本发明需要在适当大小的截留白细胞和灭活药剂的过滤器中倾注生物流体。在一些方案中，通过使用基体来设计过滤器以加强白细胞的除去，所述基体的表面用糖类为基础的配位体处理过。
在用吩噻嗪作病毒灭活药剂的情况下，每一血浆的给体单元都单独注入精确测定量的染料，并在血袋中充分混合。然后，整个血袋用来自发光二极管的萤光或窄波段的红光辐射指定的时间。这一做法不同于把血浆集中起来的分批处理，即不同于结合许多单个给体单元获得大量的血浆。从规模处理的观点来看，这种集中是较方便的，但是有如下的缺点：一个被感染的血浆单元，即一个带病原体的单元，可能污染整池的血浆。给体单元的单个处理避免了这一危险；这种做法也特别适于接下来的病毒灭活药剂的除去，用专用的、一次性的过滤装置得到高质量的、可单个识别的血浆单元。
过滤器大小可以按要除去亚甲蓝的血浆的处理量来设计。优选地，例如，将装置设计成能基本上完全除去用来处理单个血浆单元的病毒灭活药剂--这是一种非常希望的由亚甲蓝技术提供的实用的做法。
在本发明中，要使已经用亚甲蓝进行了病毒灭活的血浆与在所流经的装置中含有活性碳的过滤介质接触。活性碳可以用粉末、颗粒、纤维或织物(纺的、织的、或无纺布)的分散的吸附层的形式。此外，可以在过滤基体中引入碳纤维作为一种组分。另一种介质可以是含有活性碳作为它的一种活性组分的多孔固体。还有一介质可以是复合结构，含有一种或多种形式的活性碳以及其它的非碳结构元件，以提供具有特殊吸附能力、渗透性和机械性能的过滤介质。在所有的情况中，亚甲蓝的吸附主要发生在活性碳的表面。
在过滤装置的流路中，活性碳介质首先是能除去可能存在的脂类和固体杂质的深过滤器。此外，活性碳介质本身可构成给脂类和固体赋予截留性能。另一种过滤器可以放置在活性碳介质的下游以截留可以从任何过滤部件上释放出来的碎片和颗粒。
可以在活性碳表面施以亲水涂层。该涂层具有如下的一种或多种作用：1＞密封和包含碳材料，以减少细颗粒释放到过滤后的血浆中；2＞通过在与血浆的直接接触过程中提供生物相容表面，减少活性碳与血浆组分的不必要的相互作用；和/或3＞通过尺寸的排斥作用(sizeexclusion)，减少或防止显著大于亚甲蓝的物质的吸附，即与更大分子比较，相对地不妨碍亚甲蓝和光解产物的渗透。被排斥的物质的“截断”分子量可以通过改变密封层的组合物来控制。这是一种利用活性碳降低血浆中所需的蛋白质组分的键合，如絮凝因子，的方法。类似考虑应用于除吩噻嗪染料外的病毒灭活药剂的除去上。
血浆样品，特别是那些作为单一给体单元所采集的血浆样品具有各种各样的性质，非常容易引人注意的是存在乳糜微粒。乳糜微粒包括各种各样的不同大小的脂类和一定程度的附聚作用。因为脂类优先吸附染料，所以充满乳糜微粒的血浆单元更易被亚甲蓝染色，相应地对使用者也更有害。此外，这些单元对过滤器也更具挑战性，这是因为它们易于阻塞过滤介质的孔隙。
为降低阻塞作用，保证血浆的单一给体单元的过滤能在合理的时间内完成，需要过滤器有足够的前沿面积。从要将必要量的吸附介质组装成最隹纵横比这一观点来看，这会影响过滤器装置的设计，所述纵横比，即前沿面积与体积的比率。过滤器介质可以成型为片层，或中空纤维或圆柱体其中血浆可以直接流过它们的环形壁。
活性碳介质提供了高容量吸附剂的优点，从而使小型过滤器装置具有小的阻滞体积，使得血浆产品具有高的回收率。用特定级别的活性碳和/或应用表面涂层，可以创造选择吸附，以除去或截留待处理的血浆中的不同目标组分。
为使在长期治疗中与重复输血有关的危险最小，要在病毒灭活步骤后谨慎地尽可能多地除去亚甲蓝和其光反应付产物(例如，天青B，天青C)，优选达到低于可检测的水平(即0.02μg亚甲蓝/mL血浆)。适合于这一用途的介质的例子是碳复合介质，其中活性碳颗粒均匀分布嵌入纤维素纤维基体中。
添加到血浆中的大量亚甲蓝会与乳糜微粒或内源脂类缔合。从血浆中有效地清除染料需要同时清除这些脂类组分。此外，有效的脂类除去使得以前不能使用的过度脂血的(lipemic)血浆单元能用来输血。用亲脂性(即疏水)材料制成的纤维多孔基体适于除去血浆中的脂类。由于除去是通过吸附和尺寸排斥机理来完成的，优选的介质包括表面积与体积比率相对大的、形态适于深过滤的(例如，在经过滤器厚度的流动方向上有效孔径降低)、具有防止过量的非特定蛋白质吸附的良好生物共容性的那些。
通过在过滤器基体上的非特性吸附可以贫化各种絮凝因子。其结果是不同的。例如，因子VIII的损失就不及因子V的可比的损失明显，这是因为前者可以商业上可购得的血浆组分的制剂来补足，而后者则不能。理想的过滤器装置应当使血浆中絮凝因子的含量在过滤前后的变化最小。实际上，因为这些因子在人体中超量存在，而且通常输入的血浆量只是循环系统中血浆总量的一少部分，所以，絮凝因子的适度除去是可以容忍的。
用于输血的贫血小板血浆中的白细胞含量通常为每ml约106。对输血来说，减少3个数量级到每ml103通常认为是适当的。在用亚甲蓝处理后，使用本发明的装置和方法，可以实现白细胞的贫化，同时还能除去亚甲蓝。在用亚甲蓝处理后的白细胞的贫化能使得血浆和白细胞带有的病毒同时灭活。研究表明，对于这两个目的，亚甲蓝的浓度为0.1μM是合适的。
有迹象表明，通过与碳颗粒接触血小板可以被活化。这一问题可通过两种途径有效地解决：按前面所讨论的方式在碳表面涂上生物相容性更好的材料，或通过在合适的深过滤介质上吸附从血浆中一起除去血小板。
本发明第二设备方面的过滤器包括：(1)机械稳定的聚合物材料，它具有适于除去白细胞的表面化学性质，和(2)用于除去病毒灭活药剂的活性碳或含有活性碳的介质。
适于用在本发明的第二设备方面使用的贫化白细胞的介质包括含有机械稳定的聚合物材料的编结织物纤维。在改进的介质中，正如前述的本发明的第一方面一样，一部分聚合物材料可以优选地固定到第一配位体上，第一配位体具有对白细表面的亲合力。一种方案是将第一配位体直接固定到聚合物材料上，另一种方案是通过至少一个中间链接头将第一配位体固定到聚合物材料上。
第一配位体可以是选择蛋白族中的糖蛋白或糖类，特别是含有葡糖醛酸基团的磺基聚糖，如肝素。中间链接头可以是亚烷基二胺基团，在这种情况下，当其存在一个时，链接头可以通过键合到配位体的羧基上的胺固定到配位体上。
其它已知的或以后发现的配位体也希望起同样的作用。对白细胞配位体的重要要求是对白细胞表面具有高亲合能力，并且在某些远离键合区域的部位上是可官能化的取代基，由此配位体可以共价地键合到聚合物材料上。
在操作中，怀疑被病毒污染的单个的血浆单元(或必要时，处理体积大一些的血浆)通过向血浆中添加有效浓度的能使病毒灭活的吩噻嗪染料进行处理。然后，将血浆单元辐射足够长的时间，使杀病毒化合物将“游离的”(即血浆带有的)和与细胞缔合的病毒灭活。
接下来涉及本发明的方法的装置，还含有至少是显著量的杀病毒药剂的处理过的血浆通过本发明的白细胞/杀病毒药剂过滤器，生产基本上不含活病毒、能携带病毒的白细胞以及杀病毒化合物本身的残留物的血浆产品。
能除去白细胞的过滤器在本领域中是已知的。例如，Lydall Inc.生产一种适于贫化白细胞的过滤器，Asahi Chemical生产另一种过滤器。在下面将公开一种通过固定肝素和能增强白细胞截留能力的其它配位体而活化的更有效的过滤器。
图2以一种高度理想化的形式描述了在本发明的过滤器中可使用的过滤元件的一个实例。过滤器包括聚合物材料14，其上共价地键合了许多与白细胞表面特征相适应的配位体15。在使用中，由于机械作用(大小)以及配位体15上的键合点和白细胞表面的键合点之间的特殊相互作用，白细胞11被截留在过滤基体内。
用在以下实施例中的过滤器元件是从Lydall Inc.[Hamptonville，NC]购得的，含有聚丙烯纤维和纤丝化的乙酸纤维素“fibrets.”通常，任何含有乙酸纤维素组分和能保持形状的抗碱水解网片的过滤器都能在本发明的第四方法方面起作用，用来制备表面改性的过滤器。对于本发明的第二方法和设备方面，改进白细胞贫化过滤器是所希望的，但不是必要的。
下面要描述的作为第二设备方面的优选方案的具体过滤器装置具有能从血浆中除去乳糜微粒、大颗粒、细菌和内毒素的附加特征。该装置的各种特征的组合效果是重大的：(a)除去了＞95％的亚甲蓝和其光解产物，消除了与亚甲蓝的毒性以及血浆外观有关的顾虑；(b)除去了＞99.9％的白细胞，改进了病毒灭活性能，减少了与白细胞缔合的细菌(例如，耶尔森属histolytica)，减少了与白细胞有关的免疫效果；(c)由于除去了乳糜微粒和脂类，改进了血浆的外观，不必在床边另设大颗粒的过滤器，避免了不得不抛弃高脂血血浆单元；(d)由于除去了细菌，减少了脓毒；和(e)由于除去了内毒素，减少或消除了发热反应。所有这些优点还伴随着低成本，血浆体积损失小于5％，处理能以单一的给体单元为基础来完成，因此避免了与集中处理有关的害处。
本发明第二方法方面的第二方案需要在适当大小的白细胞贫化过滤器中灌注全血或血液组分(或一种方法或单一血单元规模)，过滤器的表面被做成具有对病毒灭活药剂的吸附截留亲合力。这一“白细胞贫化/杀病毒药剂截留”过滤器的表面化学性质可能本来就适于吸附特殊的感兴趣的杀病毒药剂，或其表面可以通过固定特殊的配位体或其它合适的截留化学性质，被活化用于杀病毒药剂的截留，以从病毒灭活预处理过的红细胞和血小板浓缩物中除去有潜在毒性的病毒灭活药剂，如补骨脂素和醛类。
在操作中，怀疑被病毒污染的单一的血单元(或处理体积稍大一些的血浆)可以通过向血液中添加有效浓度的病毒灭活化合物来处理。要提供足够长的时间以使杀病毒化合物将“游离”(即血浆所携带的)和与细胞缔合的病毒灭活。从这一点看，可以进行，也可以不进行细胞洗涤步骤。
接下来涉及本发明的方法和装置，仍然含有至少显著量的病毒灭活药剂的处理过的全血，通过本发明的白细胞/杀病毒药剂过滤器，生产基本不含活病毒、能携带病毒的白细胞和杀病毒化合物本身的残留物的红细胞产物。
从其最宽的意义上看，本发明第二方法方面并不限于用作基材的白细胞过滤器的形态和化学性质，也不限于要除去的杀病毒化合物的特殊性质，表面化学性质和/或能固定它的配位体，或向白细胞贫化过滤器中引入配位体的方法。
即使没有在过滤器上固定能够键合目标杀病毒化合物的特殊配位体，某些白细胞过滤器的表面化学性质也可以有效地除去存在的杀病毒化合物的大多数组分。在这一情况下，这些白细胞过滤器的固有表面化学性质能吸附和截留某些种类的杀病毒化合物。它们在除去白细胞和杀病毒化合物的一体化过程中的应用都包括在本发明的方法内。
补骨脂素是一种键合到核酸上的光化学品。在适当的活化条件下，如长波紫外辐射，补骨脂素交联到病毒的DNA和RNA链上，因此不能伸开和复制。补骨脂素的这些特征形成了病毒灭活和某些光化学疗法的基础。[参看Anderson和Voorhees的Ann.Rev.PharmacolToxicol.20，235-57(1980)]。最近，补骨脂素已成功地用于血液中携带的病毒的灭活。然而，为保证使病毒完全灭活所用的稍微过量的补骨脂素和其在血液中的残留物对要输血的病人存在某种危险--例如，眼睛的并发症，高光敏性，和在某情况下致癌。所以必需在病毒灭活处理之后，并在输血之前，除去未反应的补骨脂素和补骨脂素的衍生物。键合到核酸上的那部分补骨脂素不再具有活性，因此不必除去。
补骨脂素和DNA的相互作用的机理已作过广泛的研究和评述。在补骨脂素和双螺旋DNA的两个碱基对之间形成初步的相互作用复合体。接着暴露于UV-A辐射，然后在补骨脂素的呋喃骈香豆精结构与核酸的一种或两种碱基之间引起光共轭(分别形成单或二官能团加合物)。嘧啶碱基，特别是胸腺嘧啶在这些反应中被认为是参与者。接下来，单官能团加合物可以吸收光子并与DNA附加链上第二碱基反应形成共价交联。[参看Anderson和Voorhees的op.cit.第240页]。
可以考虑几种从血液中除去残留的补骨脂素衍生物的途径。可以制得对独特的补骨脂素衍生物有特性亲合力的抗体。然后可以将抗体固定到基材上(以固体的形式或作为高分子量可溶聚合物)，以提供键合相应补骨脂素衍生物的识别点。再从血液中分离基材也除去了补骨脂素。这种方法的优点是具有高度的选择性。然而，其缺点是其复杂性、昂贵性和与为每一种感兴趣的补骨脂素衍生物而培养独特抗体有关的不确定性。
包含在本发明中的优选方法是使用一种固体基材，该基材的表面被设计成模拟病毒提供的键合点。通过寡核酸，特别是那些含有嘧啶碱基的，如多胸苷，存在于(populate)基材之上，基于它在病毒灭活中所经历的同样的机理，补骨脂素可能被络合(甚至可能被光反应)。
在使用中，带病毒的血液首先用选择的补骨脂素衍生物处理，保持足够长的时间以进行病毒的灭活，然后与官能化的固体基材接触。这时只有留在血液中的未键合的补骨脂素被截留到基材上。接着可以应用第二UV-A辐射在将过滤器基体中的补骨脂素与嘧啶残留物之间的2＋2环加成(cycloaddition)活化。
可以应用各种方法来使配位体位于基材表面上。一种方法是用亲水共聚物涂布到基材上，然后在共聚物上嫁接带配位体的侧链。用作嫁接宿主的亲水共聚物的选择可以根据生物共容性、无附加活性、和接受下续与配位体基团反应的能力来确定。嫁接具有这样的优点，即配位点可以远离聚合物的表面，减少了补骨脂素的清除期间内的位阻。
在配位体是如多(胸苷)的多核苷酸时，未磷酸化的与3′端接的核糖残基可以用溴化氰或高碘酸盐活化，这一点正如前面所描述的纤维素一样。优选的方法是下面描述的用于ATP活化的高碘酸氧化，这是从Lamed等人的[Biochim.Biophys.Acta 304，231-235(1973)]中得出的，该文献在这里引入用作参考。活化的配位体然后与链接头上的胺官能团反应，正如这里所述的活化的纤维素或活化的ATP与链接头的反应一样。
在要使用病毒蛋白的低聚肽类似物作为配位体时，N-保护的低聚肽的与C端接的羧酸基可以用碳化二亚胺活化并与端接胺的链接头偶合，正如下面要描述的与肝素的反应一样。如果必要的话，与N-端接的保护可以用本领域已知的方法来分开。
其它嵌入(intercalating)病毒灭活药剂也可以使用同样的方法从血液或血液组分中固定。不嵌入的光灭活药剂也能使用类似的方法来截留：象下面要描述的糖类和核酸一样，一种模拟灭活药剂键合到病毒表面蛋白的结构或类似目标的结构可以共价地固定到白细胞过滤器基材上。对延伸到其它配位体所必需的化学性质是本领域内的技术人员所理解的。
下面的实施例包括一些实验，其中白细胞的配位体固定到胺改性的支撑在硅基体(HyperDTM微粒)上的甲基丙酰胺凝胶上。这样做是因为用微粒的键合实验比在完成的过滤器装置或膜上做实验更快更便宜。白细胞和微粒之间的键合结果能预见在过滤器上的结果。
已知的或以后发现的其它配位体也希望起同样的作用。对白细胞配位体的重要要求是对白细胞表面具有高亲合能力，并且在某些远离键合区域的部位上是可官能化的取代基，由此配位体可以共价地键合到基材上。对病毒灭活药剂配位体的重要要求是对病毒灭活药剂有高亲合能力，并且在某些远离键合区域的部位上是可官能化的取代基，由此配位体可以共价地键合到基材上。
当要生产既有白细胞配位体又有病毒灭活配位体的过滤器时，适当的活化配位体，当它们化学地相容时，可以作为混合物添加到基材中。因此，用高碘酸活化的肝素和用高碘酸活化的多(胸苷)混合物可以以要求的最终配位体比率添加。当两种配位体不化学地相容时，或一种可能对另一种产生位阻时，它们可以依次地添加到基材中，本领域内的技术人员能容易地确定其顺序和比例。本发明的两个方法方面的改性基体的制备
A、制备有肝素共价固定的过滤器
通过在室温下将直径为90mm的盘浸渍在1N的氢氧化钠溶液44小时，聚丙烯/乙酸纤维素过滤器垫(1.9mm厚，825B型，Lydall Westex，P.O.Box 109，Hamptoville，NC 27020)被改性。所述垫在过滤器上用水充分洗涤，直到洗涤水成中性，然后，在30℃下在空气中干燥。
1.溴化氰活化
    在1N氢氧化钠中至少水解8小时的垫作为起始材料。使用一标准程序，保持每克过
滤器垫2克CNBr的比率(4g CNBr/90mm盘直径)。过滤器垫放在500ml的Nalgene塑料
过滤器夹(holder)中，为改进流动速率，移去其底部的多孔膜。通过重复过滤用CNBr
处理过滤器垫。然后，用CNBr活化的垫与在0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.5)中的饱和的
乙二胺溶液(约90g/L)反应，反应在4℃下过夜进行。正如Lamed等人在
[Biochim.Biophys.Acta 304，231-235(1973)]中所描述的处理琼脂糖微粒一样。处理过的垫
进一步按下面所描述的处理。
2.氧化方法
    将十个90mm的垫与1升0.5M的偏高碘酸钠在室温下在Nalgene塑料过滤器中反应3
小时，其底部的膜被移去了。垫用水充分洗涤，然后在7.5的PH值下与1M的乙二胺
(Aldrich Chemical Co.Milwaukee，WT)反应16小时。用每一升二胺溶液处理10个垫。
在16小时的最后，向该溶液中添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)使氰基硼
氢化钠的浓度为0.1M，反应进行4小时。最后，垫用水充分洗涤(以除去过量的乙二胺
和氰基硼氢化钠)并在30℃下干燥过夜。
将1.68g肝素(Kabi Pharmacia，Sodium Salt，Cat No.H0178)溶于75.6ml去离子水中。将504mgEEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，Aldrich Chemical Co.)溶解在56.8g 95％的乙醇中。然后，肝素和EEDQ溶液在室温下混合30分钟。通过浸泡和使溶液连续通过在Nalgene过滤器夹上的过滤器，使之与七90mm个胺化垫反应6小时。垫用1升95％的乙醇洗涤除去过量的EEDQ，再用水洗涤除去过量的肝素。垫用600ml 2M的含有22.5ml乙酸酐的乙酸钠复盖1小时。最后，垫用大量的去离子水洗涤并在30℃下干燥72小时。垫在下面将要描述的用来除去白细胞的装置中进行实验。相同的方法可以用来固定任何含有羧基的配位体，该羧基不参与其与连接的相互作用。
A1.共价地固定有肝素的过滤器(方形垫)的制备
Lydall聚丙烯/乙酸纤维素过滤器垫(等级号825，批号3478，卷号2-1-05)被切成27个34.3cm长的条。然后，在室温下，每9条各自在有四升1N氢氧化钠的不同容器中分别浸渍8，16，44小时。在浸渍期后，移出过滤器垫，并放到含有聚丙烯过滤器网(neting)的方形容器的顶上。方形容器被设计成能容纳几层过滤器垫，有一排气或抽真空的出口和洗涤溶液的入口，从而使得过滤器能充分地洗涤。过滤器用去离子水充分洗涤以除去过滤器中截留的过量的氢氧化钠，过滤器被抽吸干，直到洗涤水成中性。再将在方形容器上的过滤器浸渍在3.6升0.29M的高碘酸钠中，溶液循环通过过滤器4小时，再用去离子水充分洗涤除去过量的高碘酸盐。通过与水混合，并用浓HCl调节PH值，制备1M的乙二胺(Aldrich Chemicals)溶液3.6升，PH值为7.5。溶液与氧化过的过滤器反应16小时。在16小时后向乙二胺溶液中添加2.38g氰基硼氢化钠(Sigma)固体，用Nalgene 0.2μm的过滤器过滤除去颗粒，并进一步循环反应6小时。然后，过滤器用去离子水充分洗涤除去截留在过滤器中的任何过量的反应剂，在30℃下干燥过夜。
将34.2g肝素(Kabi Pharmacia，钠盐，Cat.No.H0178)溶解在1.538升去离子水中，10.3gEEDQ(2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉，Aldrich Chemical Co.)溶解在1465ml 95％的乙醇中。肝素和EEDQ溶液在室温下混合30分钟，并用它浸渍放在方形容器中的干燥的乙二胺过滤器30分钟。肝素溶液循环穿过过滤器3.5小时，再另外浸渍20个小时。用2升95％的乙醇洗涤过滤器以除去过量的EEDQ，用2升50/50的乙醇水，最后用大量的水洗涤除去未反应的肝素。过滤器表面上的未反应的亲核基团用含有112.5ml乙酸酐的2M乙酸钠复盖1小时。最后用大量的去离子水洗涤过滤器，并在30℃下干燥。用冲模冲切过滤器垫用于白细胞除去装置中进行测试。还通过与含有白细胞的血浆混合测试垫碎片，并测定白细胞在单个纤维上的键合。
A2.制备共价地固定有ATP的过滤器
聚丙烯/乙酸纤维素过滤器垫按A中所描述的进行改性。
1.溴化氰(CNBr)活化
    未水解的垫和已在1N氢氧化钠中水解8小时的垫作为起始材料。应用如A1中所描述
的标准程序。用CNBr活化的垫和己二酸酰肼(adipic dihydrazide)(约90g/L)在0.1M
碳酸钠缓冲溶液(PH为9.5)中的饱和溶液反应，反应在4℃下过夜和进行，与Lamed等
人所描述的用于琼脂糖微粒一样。用酰肼处理过的垫可以进一步按下面所描述的处
理，或就此用来除去醛类病毒灭活药剂。
2.氧化方法
    将十个90mm的垫与1升0.5M的偏高碘酸钠在室温下在Nalgene塑料过滤器中反应3
小时，其底部的膜被移去了。垫用水充分洗涤，然后在7.4的PH值下与2％的己二酰肼
(Aldrich Chemical Co.Milwaukee，WI)反应4小时。用每一升酰肼溶液处理约10个垫。
在4小时后，向溶液中添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)固体(0.1mol)，
反应过夜。最后，垫用水在Nalgene过滤器上充分洗涤。
    将5.5g(0.01M)ATP在室温下溶解于1升去离子水中，用10N氢氧化钠溶液将PH
值调节到4.5。单独用一烧杯将3.2g(0.015M)偏高碘酸钠溶解在500ml水中，并将PH
值调节到4.5。小心遮盖高碘酸钠溶液使之最小地暴露于光。在黑暗中将两个烧杯内的
内容物很好地混合并保持3小时。所得的氧化的ATP溶液添加到12个己二酰肼处理过的
过滤器垫上，垫在室温下静置过夜。然后，3.14g(0.05M，Sigma)固体氰基硼氢化钠
添加到1升ATP溶液中，并与垫再反应4小时。最后，垫用水充分洗涤，除去过量的ATP
和氰基硼氢化钠。
该方法可用于键连任何的配位体，其中可产生醛而不破坏配位体-连接物(ligate)的相互作用。
B.制备具有共价地固定的肝素的中空纤维
将按共同待审申请07/956432第87所描述的方法制备的聚醚砜中空纤维(36束，每束含有90根外径为1500微米，内径为1000微米的中空纤维)放在有单束纤维入口的容器中，用20升乙腈洗涤16小时。该容器有一个排放口和一个用于将液体循环至容器顶部的泵，此外，如果必要的话，还有一加热溶液的在线加热器和一个用于混合的储蓄器。然后，从容器中排干乙腈，并用20升去离子水用10分钟洗涤纤维两次。
纤维与27升去离子水、3升乙二醇二环氧甘油醚(EGDGE，Aldrich ChemicalCo.，Milwaukee，WI)和240克50％氢氧化钠溶液组成的溶液反应。使该溶液循环通过容器中的纤维3小时，从容器内排干溶液，并用20升去离子水用10分钟洗涤纤维两次。
纤维与27升去离子水、2kg30％的聚亚乙基亚胺溶液(PEI)(Epomin P-1000，AcetoCorpotation，Lake Success，NY)和1440克50％氢氧化钠溶液组成的溶液反应。使溶液循环通过容器中的纤维5分钟，同时设定在线加热器，使得当溶液循环时，容器内溶液的温度达到75℃。使溶液循环通过容器中的纤维3小时，从容器内排干溶液，并用20升去离子水用10分钟洗涤纤维两次。将水排干，向容器中添加30升新鲜去离子水并循环16小时。将水排干，并用27升去离子水代替。
将240克预混合的固体磷酸缓冲盐(Sigma Chemical Co.，ST.Louis，MO)添加到储蓄器中，混合5分钟使PH值达到7.4。将三升戊二醛溶液(25％，Aldrich Chemical Co.)添加到储蓄器中，混合5分钟。溶液循环穿过容器中的纤维4小时，从中排出该溶液，按前面描述的方法用去离子水漂洗4次。必要的话，可以重复该过程向纤维上进行第二次PEI涂敷。
排干水，添加16升1M乙二胺并循环16小时，所述乙二胺用HCl将PH值调节到7.5。在16小时最后，向储蓄器中添加100g固体氰基硼氢化钠，并且在室温下溶液循环穿过纤维5小时。排干内容物，按前面描述的方法用去离子水漂洗4次，在37℃下干燥16小时。纤维在室温下储存直到使用。它们可以进一步处理或就此用来除去醛类病毒灭活药剂。
九十根用胺处理过的中空纤维(长40cm，外径1.5mm，内径1mm，干重约10g)切成10cm长，插入1升的Nalgene塑料烧瓶。向烧瓶中引入1升EEDQ活化的肝素并混合过夜。从纤维中排干溶液，并用乙醇，乙醇或水，然后用水充分洗涤纤维，再在空气中干燥。
B1.制备共价地固定有ATP的中空纤维
    将按共同待审申请07/956432第87页所描述的方法制备的聚醚砜中空纤维(36束，
每束含有90根外径为1500微米，内径为1000微米的中空纤维)放在有单束纤维入口的
容器中，用20升乙腈洗涤16小时。该容器有一个排放口和一个用于将液体循环至容器
顶部的泵，此外，如果必要的话，还有一加热溶液的在线加热器和一个用于混合的储
蓄器。然后，从容器中排干乙腈，并用20升去离子水用10分钟洗涤纤维两次。然后，
纤维与27升去离子水、3升乙二醇二环氧甘油醚(EGDGE，Aldrich Chemical
Co.，Milwaukee，WI)和240克50％氢氧化钠溶液组成的溶液反应。使溶液循环通过容器
中的纤维3小时，从容器内排干溶液，并用20升去离子水用10分钟洗涤纤维两次。纤维
与27升去离子水、2kg 30％的聚亚乙基亚胺溶液(PEI)(Epomin P-1000，Aceto
Corporation，Lake Success，NY)和1440克50％氢氧化钠溶液组成的溶液反应。使溶液循
环通过容器中的纤维5分钟，同时设定在线加热器，使得当溶液循环时，容器内溶液的
温度达到75℃。使溶液循环通过容器中的纤维3小时，从容器内排干溶液，并用20升去
离子水用10分钟洗涤纤维两次。将水排干，向容器中添加30升新鲜去离子水并循环16
小时。将水排干，并用27升去离子水代替。将240克预混合的固体磷酸缓冲盐(Sigma
Chemical Co.，ST.Louis，MO)添加到储蓄器中，混合5分钟使PH值达到7.4。将三升戊二
醛溶液(25％，Aldrich Chemical Co.)添加到储蓄器中，混合5分钟。溶液循环穿过容
器中的纤维4小时，从中排干溶液，按前面描述的方法用去离子水漂洗4次。用由27升
去离子水和2kgPEI溶液组成的溶液混合5分钟，对纤维进行第二次涂敷。内容物在室温
下循环2小时，排出内容物。用20升去离子水洗涤纤维4次，最后的那次洗涤循环16小
时。排干水，并用27升去离子水代替。将240克预混合的固体磷酸缓冲盐(Sigma Chemical
Co.，ST.Louis，MO)添加到储蓄器中，混合5分钟使PH值达到7.4。将三升戊二醛溶液(25
％，Aldrich Chemical Co.)添加到储蓄器中，混合5分钟。溶液循环穿过容器中的纤维4
小时，从中排干溶液，按前面描述的方法用去离子水漂洗4次。
    将水排干，向储蓄器中添加30升去离子水。向储蓄器中添加600g己二酰肼(Aceto
Corporation)和100g氰基硼氢化钠(Aldrich Chemical Co.)，混合5分钟。用5％的氢氧
化钠和按1∶10稀释的盐酸将溶液的PH值调节到7.0。在室温下溶液循环穿过纤维5小时。
排干内容物，按前面描述的方法用去离子水洗涤4次，在37℃下干燥16小时。纤维在室
温下储存直到使用。它们可以进一步处理或就此用来除去醛类病毒灭活药剂。
    九十根用酰肼处理过的中空纤维(长40cm，外径1.5mm，内径1mm，干重约10g)
切成10cm长，插入1升的Nalgene塑料烧瓶。向烧瓶中引入1升PH值为4.5的氧化过的
ATP，并混合过夜。氧化的ATP溶液的PH值调节到7.4，向烧瓶中添加3.14g(0.05M)
氰基硼氢化钠固体，再混合4小时。从纤维中排干溶液，并用水充分洗涤纤维，再在空
气中干燥。
C.带有糖类的微珠的制备
对于检测大量的白细胞键合的基材和化学性质，过滤器垫的改性是低效的。因此要测试的键合到白细胞上的一些糖类配位体联接到胺化过的HyperDTM微珠(Sepracor，Inc.，marlborough，MA)上，每毫升用EEDQ化学品处理的微珠含有36meq的氨基。HyperDTM微珠是多孔氧化硅微珠，在其孔中具有由交联胺化甲基丙烯酰胺衍生物组成的凝胶，正如美国专利US5268097中所描述的一样，该文献在这里引入作为参考。
在室温下，配位体(20到21mg)在1小时内溶解在0.9ml水中。EEDQ(102mg)溶解在11.17g95％的乙醇中。微珠被悬浮在15ml离心试管中的50/50乙醇/水中。相同体积的配位体溶液和EEDQ溶液在室温下混合30分钟，然后添加到1ml的微珠上，并强烈混合几分钟。然后试管放到混合器中，在室温下反应过夜18小时，用50/50乙醇/水洗涤三次，用去离子水洗涤四次，最后用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。微珠在4℃保存，直至使用。
D.使用不同化学物质和微珠固定糖类
使用不同化学物质将糖类固定到不同种类的微珠上。微珠、化学物质和所固定的配位体将在下面描述。起始氨基玻璃微珠按如下方法制备：在80℃下，将玻璃微珠(50g，50-100微米，Polysciences，Inc.，Warrington，PA)浸渍在含有200ml 5％(v/v)的硝酸的500mml的玻璃烧杯中2小时。微珠用400ml去离子水洗涤五次，滗析出过量的水。盛有玻璃珠的烧杯转移到烘箱中，烘箱设置在170℃，干燥过夜。将由混合95ml甲基硫酸酯(Aldrich)、5ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)、0.5ml三乙基胺(Aldrich)制备的溶液添加到冷却的盛有微珠的烧杯中。盖住烧杯，并在90℃的水浴中存放24小时。然后微珠每次经澄清和滗析过程用甲基亚砜、1-丙醇和水漂洗6次。将微珠保存在水中直至使用。
EEDQ和EDC化学品通过羧基固定糖类，而高碘酸通过断裂的己糖单元固定糖类。配位体的固定是使用1ml的沉淀微珠进行的，配位体的反应量列于表I，反应物如B所述预混合30分钟。配位体溶解或分散在0.9ml水(对于EEDQ反应)或1.0ml PH值为4.5的0.1M的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液(对于EDC反应)中。反应溶液是102mg EEDQ在11.27g95％乙醇中的0.9ml的溶液或150mg EDC在10ml PH值为4.5的0.1M MES缓冲液中的0.2ml溶液。反应过夜进行，通过充分的洗涤除去过量的反应物，首先用与在其中进行反应的溶液相同的溶液，然后用水，最后用PH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。然后将1ml沉淀微珠分散在1mlPBS中，并在4℃下保存直至使用。
表I
 实施例#     基材 配位体  配位体*mg 连接剂
    1  HyperDTM胺 肝素(Kabi)     25  EEDQ
    2  HyperDTM胺 肝素(Sigma)     25  EEDQ
    3  HyperDTM胺 透明质酸     25  EEDQ
    4  HyperDTM胺 肝素(Kabi)     25  EDC
    5  HyperDTM胺 肝素(Sigma)     21  EDC
    6  HyperDTM胺 硫酸软骨素A     21  EDC
    7  HyperDTM胺 硫酸软骨素B     20  EDC
    8  HyperDTM胺 软骨胶素     22  EDC
    9  HyperDTM胺 海藻酸     23  EDC
    10  HyperDTM胺 透明质酸     20  EDC
    11  玻璃-氨基 肝素(Kabi)     25  EEDQ
    12  玻璃-氨基 肝素(SIGMA)     25  EEDQ
    13  玻璃-氨基 硫酸软骨素A     22  EEDQ
    14  玻璃-氨基 硫酸软骨素B     22  EEDQ
    15  玻璃-氨基 软骨胶素     20  EEDQ
    16  玻璃-氨基 透明质酸     21  EEDQ
17 玻璃-氨基 肝素(Kabi) 26 EDC
    18  玻璃-氨基 肝素(SIGMA)     25  EDC
    19  玻璃-氨基 硫酸软骨素A     23  EDC
    20  玻璃-氨基 硫酸软骨素B     23  EDC
    21  玻璃-氨基 软骨胶素     21  EDC
    22  玻璃-氨基 海藻酸     24  EDC
    23  玻璃-氨基 透明质酸     21  EDC
*在10ML的MES缓冲液(EDC)或者11.27g的95％的乙醇(EEDQ)中。改性基体的测试
在相转移显微镜(Zeiss)下观测制备步骤C和D中得到的微珠，所用显微镜物镜的放大倍数为40×，目镜的放大倍数为10×。在这一情形下，经轻度搅拌使约0.25ml的微珠和2ml含有白细胞的血浆混合30分钟。移出样品，在显微镜下观察白细胞在微珠上的固定。对于每个球形微珠，仅观察一半球上的白细胞的键合。从每一样品中选出富有代表性的四个球形微珠，检测所键合的白细胞的个数。观察到的键合在四个微珠上半部的白细胞的总数作为总结果列在表2中。应当注意到只检测了微珠的上半部所键合的白细胞，所以每一个微珠所键合的白细胞的总数应当是所检测到的数目的两倍。发现与其它配位体相比，用肝素处理的微珠所键合的白细胞数目多。此外，还检测了从市场上购买的肝素微珠对白细胞的键合，但未观察到，只有HyperDTM肝素能键合任何白细胞。
表II
    基材  配位体        在1/2微珠上观察到的白细胞
    #1     #2     #3     #4
 I型琼脂糖  肝素     1     0     0     0
 II型脂糖  肝素     0     0     0     0
 HyperDTM微珠  肝素     4     3     6     3
 琼脂糖RC1-4B  无(对照)     0     0     0     0
 HyperDTMF微珠  无     0     0     0     0
 HyperDTMF微珠  肝素     2     0     0     0
 HyperDTMF微珠  硫酸软骨素A     0     0     0     0
 HyperDTMF微珠  硫酸软骨素B     0     0     0     0
 HyperDTMF微珠  海藻酸     0     0     0     0
初步实验的结果列于表II，表明在一定的环境中白细胞能粘合到涂有肝素的基材上。随后确定，如果所得材料要能键合白细胞的话，肝素键合到基材上必需通过羧酸基团。考虑到这一点，进行在制备步骤C中所描述的实验。化学品、基材和配位体及其效果的变化都列在表III中。在标准实验中，在观察之前，0.25ml微珠用2ml全血浆培养30分钟。
表III
  实施例# 配位体  固定试剂              1/2微珠上的白细胞
 1  2  3  4 总数
    1 肝素(Kabi)  EEDQ  4  1  1  2  8
    1 肝素(Kabi)*  EEDQ  2  3  2  2  9
    2 肝素(Sigma)  EEDQ  2  1  0  0  3
    3 透明质酸  EEDQ  0  0  0  0  0
    4 肝素(Kabi)  EDC  2  1  2  2  7
    5 肝素(Sigma)  EDC  1  1  1  2  5
    6 硫酸软骨素A  EDC  0  1  1  0  2
    11 肝素(Kabi)  EEDQ  2  2  2  3  9
    12 肝素(Sigma)  EEDQ  3  3  2  2  10
    13 硫酸软骨素A  EEDQ  1  1  2  0  4
    14 硫酸软骨素B  EEDQ  2  1  0  0  3
    15 软骨胶素  EEDQ  1  0  0  0  1
    16 透明质酸  EEDQ  1  0  0  0  1
    17 肝素(Kabi)  EDC  1  0  0  0  1
    18 肝素(Sigma)  EDC  0  1  1  0  2
    19 硫酸软骨素A  EDC  1  0  0  0  1
    20 硫酸软骨素B  EDC  0  0  0  0  0
    21 软骨胶素  EDC  0  1  0  0  1
    22 藻酸  EDC  0  0  1  0  1
    23 透明质酸  EDC  0  1  0  0  1
*在这一实验中，用0.02ml微珠代替0.25ml
在相转移显微镜(Zeiss)下观测过滤器，所用显微镜物镜的放大倍数为40×，目镜的放大倍数为10×。在这一放大倍数下血浆中的白细胞是容易观察到的球形(直径约10μm)，能与数量更多的血小板区分开来。从由制备步骤A中得到的干燥过滤器垫的内部抽出一小块，放在载片上，添加几滴含有白细胞的血浆，使之混合约三分钟。将盖片玻璃放在过滤器样品上，检测白细胞在纤维上的键合。过滤器中，聚乙烯纤维的直径为约8μm乙酸纤维素纤丝的直径为约1μm。在显微镜下可观察到，在5-20分钟的观察期内，有几个白细胞键合到乙酸纤维素纤丝上。
在相转移显微镜(Zeiss)下观测A1中制备的肝素过滤器，所用显微镜物镜的放大倍数为40×，目镜的放大倍数为10×。在显微镜下可观察到，在5-20分钟的观察期内，有几个白细胞键合到乙酸纤维素纤丝上。发现经44小时水解的过滤器能键合了最多的白细胞，而水解16和8小时的过滤器似乎只键合了几个白细胞。未经改性的对照纤维(等级No.825，批号3478，目录(R011)kgn2-1-05)也在显微镜下用血浆检测其白细胞的键合。
还检测了肝素改性的过滤器垫在从全血中除去白细胞的应用。其结果列于表IV。当肝素是其中有许多己糖被氧化和所得醛与胺化的基材缩聚固定的时，在白细胞的截留方面没有观察到可测量的改进。另一方面，当肝素是通过葡糖醛酸与胺化的基材固定的时，其除去能力提高了一到两个数量级。白细胞的数量减少到100/ml的范围在临床上是十分有意义的，也接近了检测极限。
由于深过滤的性质，为了提高装置的能力，可把几个过滤器“叠加”起来。因此如果一个过滤器能除去90％它(一定的类型和尺寸)所遇到的颗粒，则两个串连的过滤器则将除去99％。通过使两个未加处理的过滤器(以除去大量的碎屑的一些白细胞)和两个含有肝素的过滤器相结合，能在一个小而成本有效的装置中得到很高的效率。
表IV
  过滤器垫 固定化学品            白细胞/ml
      前       后
    对照     无    4.1×107    6.4×103
    肝素   高碘盐    2.5×107    2.3×103
    对照(4垫)     无    1.1×107    7×103
    肝素(4垫)    EEDQ    5×106    3×102
对照(2)＋肝素(2)    EEDQ    8.3×106    1×102
E.共价地固定有ATP的胺化色谱微珠的制备
将M级(平均粒径85μm，36μm eq/ml氨基)的100g胺化Hyper DTM微珠(从Spracor，Inc.，Marlborough，MA购得)放到1L的Nalgene塑料烧瓶中。HyperDTM微珠是多孔二氧化硅微珠，在其孔中有由交联胺化的甲基丙烯酰胺衍生物组成的凝胶，正如1992年10月5日申请的美国专利申请07/956,404中所描述的一样。将1升按上述实施例A2制备的氧化ATP5.5g(0.01M)添加到烧瓶中，在旋转混合器中混合3小时。在3小时的最后，用10N的氢氧化钠将上清液的PH值调节到7.4，并混合过夜。向烧瓶中添加3.14g(0.05M)的氰基硼氢化钠固体，再混合4小时。微珠转移到1升的烧结玻璃漏斗(25-50μm玻璃料)中，用水充分洗涤，并在空气中干燥。另外两种级别的胺化HyperD微珠也类似地用ATP处理。
F.2，3-二磷酸-D-甘油酸盐(DPG)过滤器垫的制备
按前面描述的方法，将聚丙烯/乙酸纤维素过滤器垫用1N的氢氧化钠水解44小时，并用偏高碘酸钠氧化。用浓盐酸调节PH值，配制1.5升PH值为7.5的1M乙二胺(Aldrich Chemicals)溶液，并与氧化过的垫(13)反应16小时，其方法与用己二酰肼一样。向乙二胺溶液中添加固体氰基硼氢化钠(Sigma)，使氰基硼氢化钠的浓度达到0.1M，再反应4小时。过滤器用去离子水充分洗涤以除去过量的氰基硼氢化合物和乙二胺，并在30℃下干燥过夜。
将    200mg(Sigma)的2，3-二磷酸-D-甘油酸五钠盐，(DPG)，溶解在50ml 0.1M
MES缓冲液中，该缓冲液是将1.92g 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(Sigma Chemicals)溶
解100ml去离子水中，并用1N氢氧化钠将PH值调节到4.5制备的。将200mg 1-乙基-3
-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)(Sigma)溶解在10ml 0.1M的MES缓
冲液中，并用1N氢氧化钠将PH值调节到4.5。2.5mlEDAC溶液与50ml DPG溶液混合1分
钟，轻轻地倾注到两个干燥的90mm的已用乙二胺改性的过滤器垫上。垫支撑在没有底
部膜的Nalgene塑料过滤器架中。15分钟后，从过滤器垫中抽吸掉DPG溶液，再另将
2.5mlEDAC溶液轻轻地添加到过滤器上的过滤器垫中。这一程序可以再重复两次，直
到所有的EDAC都添加上去。DPG/EDAC溶液在重力作用下排过过滤器垫，每30分钟垫
通过抽吸干燥。滤液轻轻地倾注到垫顶部上，此过程再重复7次。过滤器垫用2升1M的
氯化钠溶液洗涤，然后用去离子水充分洗涤，除去未反应的DPG和EDAC。过滤器在30
℃下空气中干燥并保存。第二设备方面实施例和第二方法方面的第一方案
开发了一系列的装置，它们是本发明第二设备方面的实例。它们具有上面描述的多种功能。这些装置用来测定几个关键性能指标；除去亚甲基蓝的程度、过滤一个单元血浆(每个单元单一给体血浆的体积在200-300ml内变动)的时间、白细胞减少的程度和在各种絮凝因子贫化程度上的过滤效果。
图5所示的过滤装置具有一圆柱形室50、装有进口52和出口54管连接件的封盖53。室中装有直径为35mm的过滤介质层。顶层56是非编织织物。这一层的下面是用来除去亚甲基蓝的活性碳/纤维素复合介质层58和多至四层的非编织过滤介质层60，后者可以是由聚丙烯、聚酯、玻璃和乙酸纤维素组分制成，用来除去白细胞和类脂类，和用于滤清(polishing)过滤。用于实施例的过滤器中，碳/纤维素复合物是从Cellulo Company[Cranford，NJ]购得的Carbac2640FHTM，用于过滤白细胞的非编织过滤器是从Lydall，Inc.[Hamptonville，NC]购得的825B型。圆柱体室50的基体具有螺旋形滤液通道62以改进空气的除去和排放效率。
过滤器装置可以在其进口处连接到一密封的长约40cm的无菌接合管上，可以是一管夹，过滤器从其出口处连接到有长约50cm的管道的血液接收袋上。当进口管是无菌地连接到已经将病毒灭活的血浆供应袋上时，从供应袋到接收袋的中点所测得的距离是75cm。
将一个单位的新鲜冷冻血浆解冻到室温，并连皮称重。将一等份的亚甲蓝溶液注入血浆中，使得最终染料浓度为0.1μm(相应于0.4μg/ml)。通过手工搅拌血浆袋30秒，将血浆混合，并取出样品进行分析。通过带夹的过滤器进口管，这一血浆供应袋被无菌连接到过滤器组件上。血浆袋悬挂在一支架上，过滤器和血浆供应袋自由地挂在下面。打开管夹使血浆开始流动。记录整个单元的血浆流过过滤器的总时间。取样分析过滤过的血浆。
实施例1-10所用的装置有一层活性碳过滤器，四层非编织白细胞过滤器；实施例11利用了两层白细胞过滤介质。实施例1-4描述亚甲基蓝的除去；实施例5-8描述亚甲蓝的除去和絮凝因子在过滤前后的变化；实施例9显示了亚甲蓝的除去和白细胞的贫化(相当于除去99.94％)；实施例10和11显示了不同过滤器构形的效果和在亚甲蓝的除去和白细胞的贫化中血浆温度的变化。在解冻后(过滤循环开始时的温度约4℃)立即对集中血浆进行这些测定。
 实施例 血浆重量(g) 过滤后的血浆中亚甲蓝的浓度(μg/ml)[a] 过滤时间(分钟)
    1    300   ＜0.02     17.5
    2    300   ＜0.02     14.9
    3    205   ＜0.02     10.4
    4    212   ＜0.02     10.6
    5    264   ＜0.02     13.0
    6    189   ＜0.02     11.3
    7    199   ＜0.02     8.7
    8    211   ＜0.02     13.5
    9    169   ＜0.02     9.6
    10    242   ＜0.02     39.6
    11    287   ＜0.02     50.7
                   絮凝因子含量的变化(％)   白细胞贫化性能
 实施例 血纤维蛋白原                       因子 过滤前每ml由WBC数 过滤后每ml由WBC数[b]
V VII VIII IX X
    1
    2
    3
    4
    5 -3 2 5 -3 -15 -48
    6 0 -14 9 -6 -11 -54
    7 0 -3 8 -8 -11 -62
    8 -3 0 8 -6 -15 -53
    9 87800 50
    10 7400 0
    11 7400 0
[a]：用HPLC检测亚甲蓝，0.02μg/ml是极限。[b]：Nageotte方法。(American Assoc.of Blood Banks Technical manual；p760；方法11.12)[end of 002b]

Claims (42)

1.一种过滤器包括：含有机械稳定的聚合物基材的编结织物网片，至少一部分所述聚合物基材具有共价地固定在其上的第一配位体，所述第一配位体具有对病毒灭活药剂的亲合力。
2.根据权利要求1的过滤器，所述聚合物基材还具有共价地固定在其上的第二配位体，所述第二配位体具有对白细胞表面的亲合力。
3.一种从全血或血液组分中除去白细胞的过滤器，包括：含有机械稳定的聚合物基材的编结织物网片，至少一部分所述聚合物基材具有共价地固定在其上对白细胞表面具有亲合力的配位体。
4.根据权利要求1-3中任何一项的过滤器，所述配位体是直接固定到聚合物基材上的。
5.根据权利要求1-3中任何一项的过滤器，所述配位体是通过至少一个中间链接头固定到聚合物基材上的。
6.根据权利要求1-3中任何一项的过滤器，其中中间链接头是亚烷基二胺基团。
7.根据权利要求6的过滤器，其中所述链接头是通过一个键合到所述配位体的羧基上的胺固定到所述配位体上的。
8.根据权利要求1或2的过滤器，其中所述第一配位体是端接酰肼的基团。
9.根据权利要求1或2的过滤器，其中所述第一配位体是病毒DNA或RNA的模拟体。
10.根据权利要求2或3的过滤器，其中所述配位体是糖类。
11.根据权利要求10的过滤器，其中所述配位体是含有葡糖醛酸基团的磺基聚糖。
12.根据权利要求11的过滤器，其中所述配位体是肝素。
13.根据权利要求1-3中任何一项的过滤器，包括一个能保持形状的编结织物网片，网片的厚度为1-8mm，堆积密度为0.05-0.4g/cm3，所述网片包括：
    (a)许多平均旦数为0.05-0.75、平均长度为3-15mm的联锁织物纤维，
所述织物纤维在所述网片上基本均匀地分布以形成织物纤维的基体，基体
在相邻联锁纤维间隙之间有空间；和
    (b)许多表面改性的聚合物材料的纤丝化的颗粒，聚合物材料的表面积
为每克5-60平方米，所述纤丝化颗粒大都放置在所述基体空间内，所述纤
丝化颗粒具有许多与所述空间的相邻织物纤维联锁的细纤，所以在所述血
液的过滤期间纤丝化的颗粒基本上不会被从所述网片排出；其中，纤丝化颗粒与织物纤维的重量比率在1∶99和40∶60之间；而所述表面改性的聚合物材料是共价连接到一种或多种配位体上的血溶惰性聚合物；所述配位体具有对白细胞、病毒灭活药剂，或两者，的亲合力；其中所述织物纤维是血溶惰性的。
14.根据权利要求13的过滤器，其中所述表面改性的聚合物材料是乙酸纤维素。
15.根据权利要求13的过滤器，其中所述织物纤维是聚烯烃、聚酰胺、聚砜、聚酯、聚乙烯醇、和聚(乙烯-乙烯醇)共聚物纤维中的一种或多种。
16.一种用于从血液组分或全血中除去白细胞和病毒灭活药剂，或两者，的中空纤维或平板膜，该膜包括：
    (a)作为主要疏水聚合物组分的聚醚砜(PES)，所述PES具有可官能化
的酚链端；
    (b)固定在许多所述酚链端上的第一链接头基团，所述第一链接头基团
是从由选自由乙二醇二环氧甘油醚、1，4-丁二醇二环氧甘油醚和表氯醇
组成的组中的环氧乙烷所衍生的；和
    (c)固定有许多所述第一链接头基团的表面改性聚合物材料，所述表面改性的聚合物材料由血溶惰性的聚合物组成，其上共价地固定的许多病毒灭活药剂、白细胞，或两者的配位体。
17.根据权利要求16的中空纤维或平板膜，其中所述表面改性的聚合物材料是通过第二链接头基团共价地固定有所述许多配位体的羟烷基纤维素或聚乙烯亚胺。
18.根据权利要求16的中空纤维或平板膜，其中所述配位体之一是肝素。
19.根据权利要求16的中空纤维或平板膜，其中所述配位体是肝素或聚胸甘。
20.一种从全血或血液组分中除去一种或多种病毒灭活药剂的方法，包括使全血或血液组分通过权利要求1或2的过滤器。
21.一种从全血或血液组分中除去白细胞的方法，包括使全血或血液组分通过权利要求2或3的过滤器。
22.一种从全血或血液组分中同时除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的方法，包括使全血或血液组分通过权利要求2的过滤器。
23.一种从全血或血液组分中除去病毒灭活药剂的方法，包括使所述血液与权利要求16-19中任何一项的中空纤维膜流动接触。
24.一种从全血或血液组分中除去白细胞的方法，包括使所述血液与权利要求16-19中任何一项的中空纤维膜流动接触。
25.一种从全血或血液组分中除去白细胞和病毒灭活药剂的方法，包括使所述血液与权利要求16-19中任何一项的中空纤维膜流动接触。
26.一种生产病毒灭活药剂过滤器的方法，包括：
   (a)提供一种能保持形状的网片，该网片包括：
      (1)许多抗碱降解的纤维，和
      (2)许多乙酸纤维素纤维；
   (b)用碱的水溶液处理所述网片，使一部分乙酸纤维素酯水解成相应的
游离羟基；
   (c)活化所述游离的羟基以产生氨活性基团；
   (d)使所述氨活性基团与二胺或二酰肼反应；和
   (e)使所得到的胺或酰肼与病毒灭活药剂的配位体的活化衍生物反应。
27.根据权利要求26的生产过滤器的方法，其中步骤(e)中所得到的胺或酰肼进一步与白细胞的配位体的活化衍生物反应。
28.一种生产白细胞过滤器的方法，包括：
   (a)提供一种能保持形状的网片，该网片包括：
      (1)许多抗碱降解的纤维，和
      (2)许多乙酸纤维素纤维；
   (b)用碱的水溶液处理所述网片，使一部分乙酸纤维素酯水解成相应的
游离羟基；
   (c)活化所述游离的羟基以产生氨活性基团；
   (d)使所述氨活性基团与二胺反应；和
29.根据权利要求26-28中任何一项的生产过滤器的方法，包括：
   (a)提供能保持形状的编结织物网片，所述网片的厚度为1-8mm，堆
积密度为0.05-0.4g/cm3，该网片包括：
      (1)许多平均旦数为0.05-0.75，平均长度为3-15mm的联锁聚
烯烃纤维，所述聚烯烃纤维基本均匀地分布在网片上，以形成聚烯烃纤维
基体，在联锁的纤维相邻间隙之间有空间；和
      (2)许多纤丝化的乙酸纤维素颗粒，其表面积为每克5-60平
方米，大都放置在所述基体的空间内，所述纤丝化的颗粒有许多细纤，它
们与所述空间内的相邻聚烯烃纤维相互联锁，所以在血液过滤期间纤丝
化颗粒基本上不会从网片排出；纤丝化颗粒与聚烯烃纤维的重量比率
为1∶99-40∶60；和
   (b)用碱的水溶液处理所述网片，使一部分乙酸纤维素酯水解成相应的
游离羟基；
   (c)活化所述游离的羟基以产生氨活性基团；
   (d)使所述氨活性基团与二胺或二酰肼反应；和
   (e)使所得到的胺或酰肼与选自聚胸苷、肝素和两者混合物组成的组的
的配位体的活化衍生物反应。
30.根据权利要求29的方法，其中所述网片在20-40℃用1N氢氧化钠或氢氧化钾水溶液处理8-312小时。
31.根据权利要求29的方法，其中所述游离羟基通过与选自由溴化氰、羰基二咪唑、二乙烯基砜、吖内酯、磺酰氯、双环氧化合物、二卤化物、卤环氧化物、2，4，6-三氯-S-三嗪、2-氟-1-甲基吡啶鎓盐(methylpyridium salts)、二磺酰氯、高碘酸(盐)、二酰基氯(diacid chloride)、二异氰酸盐和卤代乙酸组成的组中的活化剂反应，再与N-羟基琥珀酸亚胺和碳化二亚胺反应来活化。
32.根据权利要求29的方法，其中所述胺活性基团与己二酰肼反应产生许多N-单取代的酰肼。
33.根据权利要求29的方法，其中所述游离羟基通过与高碘酸反应来活化。
34.一种同时从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的方法，包括使所述血液或血液组分通过适于除去白细胞和杀病毒药剂的过滤器，所述过滤器包括能截留白细胞的机械稳定的聚合物材料，和除去所述病毒灭活药剂的活性碳。
35.根据权利要求34的方法，其中所述血液组分是血浆。
36.根据权利要求34的方法，其中所述病毒灭活药剂是选自由吩噻嗪染料和吩噻嗪染料的光降解产物组成的组。
37.根据权利要求36的方法，其中所述病毒灭活药剂是选自由亚甲蓝、甲苯胺蓝和亚甲蓝、甲苯胺蓝的光降解产物组成的组。
38.一种从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的过滤装置，包括(1)一个室，密封(2)含有活性碳的过滤器元件和(3)至少一个适于截留白细胞的过滤器单元。
39.一种从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的过滤装置，包括(1)一个室，密封(2)含有活性碳的过滤器元件和(3)至少一个权利要求1-3的任何一项中的过滤器单元。
40.根据权利要求38的装置，其中所述含有活性碳过滤器单元包括一活性碳-浸渍纤维素复合介质。
41.一种同时从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的方法，包括使所述血液或血液组分通过权利要求38的过滤器。
42.一种同时从全血或血液组分中除去白细胞和一种或多种病毒灭活药剂的方法，包括使所述血液或血液组分通过权利要求39的过滤器。
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