CN114206938A

CN114206938A - 抗蛋白酶nexin-1构象单域抗体及其用途

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Publication number: CN114206938A
Application number: CN202080044855.8A
Authority: CN
Inventors: O·克里斯托夫; P·朗坦格; C·德尼斯; M-C·布东
Original assignee: Paris Thackeray, University of; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Sorbonne Paris Nord; Universite de Paris
Current assignee: Paris Thackeray, University of; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Sorbonne Paris Nord; Universite Paris Cite
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-03-18
Also published as: US20220259295A1; JP2022537031A; JP7685957B2; WO2020254619A1; EP3986453A1

Abstract

蛋白酶nexin‑1(PN‑1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族的成员，以凝血酶为主要靶点。当前针对PN‑1的多克隆和单克隆抗体经常与纤溶酶原激活剂抑制剂‑1(PAI‑1，一种结构和功能同源的丝氨酸蛋白酶抑制剂)交叉反应。在本文中，发明人开发了抑制性单域抗体(VHH)，其显示出与人(hPN‑1)和鼠(mPN‑1)PN‑1的特异性结合并且不与PAI‑1交叉反应。重要的是，所有VHH都可以阻断血浆中的PN‑1活性以及从活化血小板中释放的PN‑1，后者是止血过程中PN‑1的主要来源之一。因此，本发明涉及抗蛋白酶nexin‑1(PN‑1)构象单域抗体及其特别是在用于治疗出血性疾病的治疗领域中的用途。

Description

抗蛋白酶NEXIN-1构象单域抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗蛋白酶nexin-1(PN-1)构象单域抗体及其特别是在治疗领域中的用途。

背景技术

目前控制血友病患者和更普遍的组成型出血性疾病患者出血发作的治疗显示出许多缺点。使用抑制剂对这些患者的治疗仅限于FVIII或IX旁路剂，例如重组FVIIa或血浆来源的活化凝血酶原复合物。但是，这些产品价格昂贵，而且相当多的患者对这些试剂没有反应。因此，由于目前主要依赖静脉输注重组或血浆来源的FVIII或FIX的治疗存在局限性，因此出现了旨在靶向天然抗凝蛋白的新策略。

发明人先前证明血小板PN-1是凝血酶活性和生成的负调节剂并且PN-1缺乏促进体内凝血(Boulaftali et al.2010)。他们表明，靶向PN-1可以阻止FVIII或IX缺乏，并证明阻断PN-1在出血性疾病治疗中发挥作用。

在此，发明人开发了靶向血小板蛋白酶nexin-1(PN-1)(一种天然且有效的凝血酶抑制剂)的抑制性单域抗体(VHH或纳米抗体)。发明人强调产生针对PN-1的特异性抗体的困难。我们测试的大多数针对PN-1的商业抗体也被证明是非特异性的。本发明的纳米抗体似乎是第一个能够阻断鼠和人PN-1的抗凝血酶活性的特异性生物工具。因此，它们是阻断血小板中PN-1以恢复血友病患者止血平衡的良好候选者。

发明概述

蛋白酶nexin-1(PN-1)，也称为SERPINE2，是称为serpins的丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员，其是许多生物事件的关键调节剂。PN-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其在血浆中几乎检测不到，但存在于许多器官中并由大多数细胞类型产生，包括单核细胞、血小板和血管细胞。PN-1是一种45-50kDa的糖蛋白，由人染色体2q33-q35上的SERPINE2基因编码。PN-1是包含3个半胱氨酸残基的378个氨基酸残基单链，其在分子的蛋白质核心内不形成二硫键(Bouton et al.,2012and Mc Grogan et al 1988Boulaftali et al.,2010)。发明人先前证明靶向PN-1可改进轻度和中度血友病患者的凝血酶生成。这些发现确定了对PN-1抑制作为血小板中的特异性抗凝剂的要求，并证明阻断PN-1在出血性疾病治疗中发挥作用。

在本申请中，发明人描述了抗蛋白酶nexin-1(PN-1)构象单域抗体的成功选择和表征。所述抗体的序列在表1中描述。使用美洲驼衍生的或合成的纳米抗体文库进行噬菌体展示实验以筛选识别人和鼠PN-1的VHH。使用美洲驼衍生文库，总共7轮淘选和940个测试VHH，得到52个识别PN-1的候选者。但是，仔细的表征显示所有这些VHH也识别纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)。这种缺乏特异性促使我们筛选合成文库，得到与人和鼠PN-1有效结合，并且与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂没有交叉反应的7个阳性纳米抗体。四个证明能够抑制人和鼠PN-1的抗凝血酶活性。特别地，发明人分离了与三个不同表位结合的3个不同的特异性抗PN-1克隆。有趣的是，发现所有3种sdAb对PN-1具有特异性，而与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂或纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)没有交叉反应。因此，这些抗体似乎是阻断抗凝血酶并且易于恢复血友病患者的止血平衡的第一特异性生物工具。

因此，本发明涉及抗蛋白酶nexin-1(PN-1)单域抗体及其特别是在治疗领域中的用途。特别地，本发明由权利要求限定。

发明详述

本发明人已开发出包含三个特异性CDR的单域抗体(sdAb)，其允许选择性结合蛋白酶nexin-1(PN-1)。这些sdAb构成了作为治疗剂的执行工具。

定义

如本文所用，术语“蛋白酶nexin-1”或“PN-1”具有其在本领域的一般含义，并且是指蛋白酶nexin-1，也称为SERPINE2。PN-1具有其在本领域的一般含义，是称为serpins的丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员，其是许多生物事件的关键调节剂。PN-1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其在血浆中几乎检测不到，但存在于许多器官中并由大多数细胞类型产生，包括单核细胞、血小板和血管细胞。PN-1是一种45-50kDa的糖蛋白，由人染色体2q33-q35上的SERPINE2基因编码。PN-1是包含3个半胱氨酸残基的378个氨基酸残基单链，其在分子的蛋白质核心内不形成二硫键(Bouton et al.,2012and Mc Grogan et al 1988Boulaftaliet al.,2010)。

如本文所用，术语“单域抗体”具有本领域的普通含义，是指可以在骆驼科哺乳动物中发现的天然不含轻链的抗体类型的单个重链可变结构域。这种单域抗体也称为VHH或

对于(单)域抗体的一般描述，可以提及以上引用的现有技术，以及EP 0368 684、Ward等(Nature 1989Oct 12；341(6242):544-6),Holt et al.,TrendsBiotechnol.,2003,21(11):484-490；和WO 06/030220、WO 06/003388。纳米抗体的分子量约为人IgG分子的十分之一，并且蛋白质的物理直径仅为几纳米。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合抗原位点的能力，所述抗原位点对于较大的抗体蛋白在功能上是不可见的，即，骆驼纳米抗体可用作检测使用经典免疫学技术是隐蔽的抗原的试剂，并可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是，纳米抗体可以通过与目标蛋白质的凹槽或狭窄裂缝中的特定位点结合而进行抑制，并且因此可以提供比经典抗体更接近经典低分子量药物功能的能力。低分子量和紧凑尺寸进一步导致纳米抗体极度热稳定，对极端pH值和蛋白水解消化稳定，并且抗原性差。另一个后果是纳米抗体很容易从循环系统进入组织，甚至穿过血脑屏障，并且可以治疗影响神经组织的疾病。纳米抗体可以进一步促进药物跨血脑屏障的转运。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性相结合，表明巨大的治疗潜力。可以认为单域抗体的氨基酸序列和结构由四个框架区或“FR”组成，其在现有技术和本文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；“框架区4”或“FR4”，所述框架区被三个互补决定区或“CDR”间隔，其在现有技术中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单域抗体可以定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1-4，并且其中CDR1至CDR3指互补决定区1-3。在本发明上下文中，单域抗体的氨基酸残基根据国际免疫基因信息系统氨基酸编号(http://imgt.cines.fr/)给出的VH结构域的一般编码来进行编号。

如本文所用，术语“氨基酸序列”具有其一般含义并且是赋予蛋白质其一级结构的氨基酸序列。根据本发明，可以用一个、两个或三个保守氨基酸取代来修饰氨基酸序列，而相互作用结合能力没有明显损失。“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸可以被另一个具有相似侧链的氨基酸替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少70％的同一性意味着第一序列与第二氨基酸序列具有70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98；或99％的同一性。氨基酸序列同一性典型地使用合适的序列比对算法和默认参数确定，例如BLAST P(Karlin and Altschul,1990)。

根据本发明的含义，“同一性”通过在比较窗口中比较两个比对序列来计算。序列比对允许测定比较窗口中两个序列的共同位置(核苷酸或氨基酸)数。因此，将共同位置数除以比较窗口中的总位置数，再乘以100即可获得同一百分比。序列的同一性百分比的测定可以手动进行，也可以借助众所周知的计算机程序进行。

如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”涉及本发明的sdAb，并且是指sdAb在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。如本文所用，术语“纯化的”优选是指与存在的大分子的总重量相比，至少75重量％，更优选至少85重量％，甚至更优选至少95重量％，更优选至少98重量％的抗体。

如本文所用，术语“核酸分子”具有其在本领域的一般含义并且指DNA或RNA分子。

单域抗体和多肽

本申请中的目标序列如下表1所示：

本发明的第一个目的涉及分离的单域抗体(sdAb)，其包含在于三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)的式(I)氨基酸序列：

FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4(I)；其中

-CDR1具有以下序列:X₁-T-W-X₄-X₅-E-I，其中X₁是S或D，X₄是F或R，X₅是R或L；并且

-CDR2具有以下序列:S-X2-X3-X4-W-H-A，其中X2是D或E，X3是P或D，X4是T或G；并且

-CDR3具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的序列。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3。(“B11衍生物”)

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:7所示序列的CDR3。(“F06衍生物”)

本发明的另一个目的涉及分离的单域抗体，其包含在于三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)的式(I)氨基酸序列：

FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4(I)；其中

-CDR1具有如SEQ ID NO:9所示的序列；并且

-CDR2具有如SEQ ID NO:10所示的序列；和并且

-CDR3具有如SEQ ID NO:11所示的序列。

(“A08衍生物”)

另一方面，本发明涉及分离的单域抗体(sdAb)，其包含在于三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)的式(I)氨基酸序列：

FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4(I)；其中

-CDR1具有选自下组的序列：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9；并且

-CDR2具有选自下组的序列：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10；并且

-CDR3具有选自下组的序列：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11。

在一些实施方案中，FR1与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少70％的同一性；FR2与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少70％的同一性；FR3与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少70％的同一性并且FR4与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与如SEQ ID NO:4所示的序列(“B11衍生物”)具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少70％的同一性，并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体包含如SEQ ID NO:4所示的序列(“B11”)。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体具有如SEQ ID NO:4所示的序列。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与如SEQ ID NO:8所示的序列(“F06衍生物”)具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与SEQ ID NO:8所示的序列具有至少70％的同一性，并且包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体包含如SEQ ID NO:8所示的序列(“F06”)。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体具有如SEQ ID NO:8所示的序列。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与如SEQ ID NO:12所示的序列具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体与SEQ ID NO:12所示的序列(“A08衍生物”)具有至少70％的同一性，并且包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示的序列CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体包含如SEQ ID NO:12所示的序列(“A08”)。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的单域抗体具有如SEQ ID NO:12所示的序列。

在一些实施方案中，分离的单域抗体是“人源化”单域抗体。

如本文所用，术语“人源化”是指本发明的单域抗体，其中对应于天然存在的VHH域的氨基酸序列的氨基酸序列已被“人源化”，即通过用存在于来自人的常规链抗体的VH结构域中相应位置的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列(特别是框架序列中)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。用于人源化单域抗体的方法是本领域众所周知的。典型地，应选择人源化取代，使得所得人源化单域抗体仍保留本发明单域抗体的有利特性。本领域技术人员能够确定和选择合适的人源化取代或人源化取代的合适组合。

本发明的另一方面涉及交叉竞争的单域抗体，其与本发明的单域抗体交叉竞争结合PN-1。

在一些实施方案中，本发明的交叉竞争单域抗体与所述单域抗体交叉竞争结合PN-1，所述单域抗体包含在于三个互补决定区(CDR1-CDR3)和四个框架区(FR1-FR4)的式(I)氨基酸序列：

FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4(I)；其中

-CDR3具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的交叉竞争单域抗体与所述单域抗体交叉竞争结合PN-1，所述单域抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的交叉竞争单域抗体与所述单域抗体交叉竞争结合PN-1，所述单域抗体包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:7所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的交叉竞争单域抗体与所述单域抗体交叉竞争结合PN-1，所述单域抗体包含具有如SEQ ID NO:9所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:11所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的交叉竞争单域抗体与所述单域抗体交叉竞争结合PN-1，所述单域抗体包含选自下组的氨基酸：序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。

如本文所用，术语“交叉竞争”是指具有结合抗原的特定区域的能力的单域抗体。在本公开中，“交叉竞争”的单域抗体具有在标准竞争性结合测定中干扰另一单域抗体与抗原结合的能力。根据非限制性理论，这样的单域抗体可以，结合与其竞争的单域抗体相同或相关或附近(例如，结构上相似或空间上接近的)表位。如果与缺少所述单域抗体之一的阳性对照相比，单域抗体A将单域抗体B的结合降低至少60％，特别是至少70％，更特别是至少80％，则存在交叉竞争，反之亦然。如技术人员所理解的，可以在不同的测定设置中评估竞争。一种合适的测定涉及使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore,Uppsala,Sweden))，它可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种测量交叉竞争的测定法使用基于ELISA的方法。此外，国际专利申请号WO2003/48731中描述了基于抗体的交叉竞争“合并(binning)”抗体的高通量方法。

根据本发明，如上所述的交叉竞争抗体保留了单抗体的活性，所述单抗体包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNO:3所示序列的CDR3。

根据本发明，如上所述的交叉竞争抗体保留了单抗体的活性，所述单抗体包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNO:7所示序列的CDR3。

根据本发明，如上所述的交叉竞争抗体保留了单抗体的活性，所述单抗体包含具有如SEQ ID NO:9所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNO:11所示序列的CDR3。

根据本发明，如上所述的交叉竞争抗体保留了单抗体的活性，所述单抗体包含选自下组的氨基酸：序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。

本发明的另一方面涉及包含至少一种本发明的单域抗体的多肽。

典型地，本发明的多肽包含本发明的单域抗体，其在其N末端、其C末端或在其N末端和其C末端两者融合至至少一个另外的氨基酸序列，即提供融合蛋白。根据本发明，包含唯一单域抗体的多肽在本文中称为“单价”多肽。包含两个或更多个根据本发明的单域抗体或基本上由其组成的多肽在本文中被称为“多价”多肽。

在一些实施方案中，多肽包含至少一种本发明的单域抗体和至少一种其他结合单元(即针对另一表位、抗原、靶标、蛋白质或多肽)，其典型地也是单域抗体。这种多肽在本文中称为“多特异性”多肽；与包含相同单域抗体的多肽(“单特异性”多肽)相反。因此，在一些实施方案中，本发明的多肽还可提供至少一个针对任何所需蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位的另外的结合位点。所述结合位点针对与本发明的单域抗体所针对的相同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或者可以针对与本发明的单域抗体所针对的不同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位。

本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即蛋白酶nexin-1、PN-1)的单域抗体和至少一个针对第二抗原(即，不同于PN-1)的另外的结合位点的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即PN-1)的单域抗体、至少一个针对第二抗原(即不同于PN-1)的另外的结合位点和至少一个针对第三抗原(即不同于第一和第二抗原)的另外的结合位点的多肽；等。

在一些实施方案中，另外的结合位点针对血清蛋白，从而增加单域抗体的半衰期。典型地，所述血清蛋白是白蛋白。

典型地，一个或多个另外的结合位点可以包含常规链抗体(并且特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，本发明的单域抗体可以任选地通过接头序列连接到常规的(典型地是人)VH或VL上。

在一些实施方案中，多肽包含与免疫球蛋白结构域连接的本发明的单域抗体。例如，多肽包含与Fc部分(例如人Fc)连接的本发明的单域抗体。所述Fc部分可以用于增加本发明的单域抗体的半衰期，甚至是产量。例如，Fc部分可以与血清蛋白结合，从而增加单域抗体的半衰期。在一些实施方案中，至少一种单域抗体可以与一个或多个(典型地是人)CH1、和/或CH2和/或CH3结构域，任选经由接头序列连接。例如，与合适的CH1结构域连接的单域抗体例如可以用于—与合适的轻链一起—制备与常规Fab片段或F(ab')2片段类似的抗体片段/结构，但其中一个(在F(ab')2片段的情况下)或一个或两个常规VH结构域被本发明的单域抗体替换。在一些实施方案中，一个或多个本发明的单域抗体可以与以下连接(优选通过合适的接头或铰链区)：一个或多个恒定结构域(例如，可以用作Fc部分的一部分或可以用于形成Fc部分的2个或3个恒定结构域)、Fc部分和/或一个或多个向本发明多肽赋予一个或多个效应子功能和/或赋予结合一个或多个Fc受体的能力的抗体部分、片段或结构域。例如，为此目的且不限于此，一个或多个进一步的氨基酸序列可以包含一个或多个抗体的CH2和/或CH3结构域，例如来自重链抗体，更典型地来自常规人链抗体；和/或来自Fc区，例如来自IgG(如来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，来自IgE或来自另一种人Ig诸如IgA、IgD或IgM。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼VHH结构域的重链抗体或其人源化衍生物(即单域抗体)，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域被人CH2和CH3结构域替换，从而提供由2条重链组成的免疫球蛋白，各重链包含单域抗体和人CH2和CH3结构域(但没有CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，且所述免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥功能。

在一些实施方案中，多肽如WO2006064136中所述。特别地，该多肽可以由以下组成：i)第一融合蛋白，其中抗体的CL恒定结构域通过其N-末端融合至根据本发明的单结构域抗体(即针对PN-1的单抗体)的C-末端和ii)第二融合蛋白，其中抗体的CH1恒定结构域通过其N-末端融合至针对不同于PN-1的抗原的单结构域抗体的C-末端。在另一个具体实施方案中，多肽由以下组成：第一融合蛋白，其中抗体的CH1恒定结构域通过其N-末端融合至针对效应子细胞(例如CD16)上的激活触发分子的单结构域抗体的C-末端；和第二融合蛋白，其中抗体的CL恒定结构域通过其N-末端融合至本发明的单结构域抗体(即PN-1)的C-末端。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含至少一种单域抗体，其包含：

-CDR1，其具有以下序列:X₁-T-W-X₄-X₅-E-I，其中X₁是S或D，X₄是F或R，X₅是R或L；和

-CDR2，其具有以下序列:S-X2-X3-X4-W-H-A，其中X2是D或E，X3是P或D，X4是T或G；和

-CDR3，其具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的序列。

在一些实施方案中，多肽是单互补位多肽。如本文所用，术语“单互补位”多肽是指包含与本文定义的第二单域抗体连接的本发明的单域抗体的多肽，其中这两个单域抗体针对一种抗原的相同表位。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:4所示的序列具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:4所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其具有如SEQID NO:4所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含如SEQ ID NO:17所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:7所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:8所示的序列具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:8所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其具有如SEQID NO:8所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:9所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示序列的CDR2和具有如SEQ IDNO:11所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:12所示的序列具有至少70％的同一性。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其与如SEQID NO:12所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的单互补位抗体包含至少两种单域抗体，其具有如SEQID NO:12所示的序列。

在一些实施方案中，多肽是双互补位多肽。如本文所用，术语“双互补位”多肽是指包含如本文所定义的单域抗体和第二单域抗体的多肽，其中这两个单域抗体能够结合一个抗原(即PN-1)的两个不同表位，这些表位通常不会同时被一种单特异性免疫球蛋白结合，例如诸如常规抗体或单域抗体。根据本发明的双互补位多肽由具有不同表位特异性的单域抗体组成，且不包含结合相同表位的互相互补的可变结构域对。因此，它们互相不竞争结合PN-1。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含如上定义的B11衍生物和如上定义的F06衍生物。

在一些实施方案中，本发明的双互补位抗体包含i)第一单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3和ii)第二单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:7所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与SEQ IDNO:4所示序列具有至少70％同一性；ii)第二单域抗体，其与SEQ ID NO:8所示序列具有至少70％同一性。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与如SEQ IDNO:4所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的CDR1、CDR2、CDR3；和ii)第二单域抗体，其与如SEQ ID NO:8所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其具有SEQ IDNO:4所示序列；ii)第二单域抗体，其具有SEQ ID NO:8所示序列。

在一些实施方案中，双互补位多肽具有如SEQ ID NO:18所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含如上定义的B11衍生物和如上定义的A08衍生物。

在一些实施方案中，本发明的双互补位抗体包含i)第一单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:1所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:2所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:3所示序列的CDR3和ii)第二单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:9所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:11所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与SEQ IDNO:4所示序列具有至少70％同一性；ii)第二单域抗体，其与SEQ ID NO:12所示序列具有至少70％同一性。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与如SEQ IDNO:4所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示的CDR1、CDR2、CDR3；和ii)第二单域抗体，其与如SEQ ID NO:12所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其具有SEQ IDNO:4所示序列；和ii)第二单域抗体，其具有SEQ ID NO:12所示序列。

在一些实施方案中，双互补位多肽具有如SEQ ID NO:19所示的序列。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含如上定义的F06衍生物和如上定义的A08衍生物。

在一些实施方案中，本发明的双互补位抗体包含i)第一单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:5所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:6所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:7所示序列的CDR3和ii)第二单域抗体，其包含具有如SEQ ID NO:9所示序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示序列的CDR2和具有如SEQ ID NO:11所示序列的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与SEQ IDNO:8所示序列具有至少70％同一性；和ii)第二单域抗体，其与SEQ ID NO:12所示序列具有至少70％同一性。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其与如SEQ IDNO:8所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示的CDR1、CDR2、CDR3；和ii)第二单域抗体，其与如SEQ ID NO:12所示的序列具有至少70％的同一性并且包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的CDR1、CDR2、CDR3。

在一些实施方案中，本发明的双互补位多肽包含i)第一单域抗体，其具有SEQ IDNO:8所示序列；和ii)第二单域抗体，其具有SEQ ID NO:12所示序列。

在一些实施方案中，本发明的双互补位或单互补位多肽的两个单域抗体可以直接(即不使用接头)或通过接头彼此连接。接头典型地是接头肽，并且根据本发明将被选择以允许两个单域抗体结合它们的至少两个不同的PN-1表位中的每一个。合适的接头尤其取决于表位，特别是单域抗体结合的PN-1上表位之间的距离，并且根据本文的公开，任选地在一些有限程度的常规实验之后，这对技术人员将是清楚的。此外，结合PN-1的两个单域抗体也可以通过第三单域抗体相互连接(其中两个单域抗体可以直接连接到第三域抗体或通过合适的接头)。该第三单域抗体可以例如是提供增加的半衰期的单域抗体。例如，后一单域抗体可以是能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白的单域抗体，如本文所进一步描述。在一些实施方案中，结合PN-1的两个或多个单域抗体串联连接(直接或通过合适的接头)并且第三(单)单域抗体(其可提供增加的半衰期，如上所述)直接或通过接头连接到这两个或多个上述单域抗体之一。合适的接头在本文中与本发明的特定多肽相关地描述并且可以-例如但不限于-包含氨基酸序列，该氨基酸序列优选地具有9个或更多个氨基酸，更优选地至少17个氨基酸，例如约20至40个氨基酸的长度。但是，上限不重要，但由于在例如这种融合蛋白的生物制药生产方面的方便而选择。接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。如果用于治疗目的，接头优选在施用本发明的抗EGFR多肽的受试者中是非免疫原性的。一组有用的接头序列是衍生自如WO96/34103和WO 94/04678所述的重链抗体的铰链区的接头。其他实例是聚丙氨酸接头序列，如Ala-Ala-Ala。接头序列的进一步优选的实例是不同长度的Gly/Ser接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。

在一些实施方案中，预期可对用于本发明治疗方法的本发明多肽进行修饰以提高它们的治疗功效。治疗化合物的此类修饰可用于降低毒性、增加循环时间或改变生物分布。例如，通过与多种改变生物分布的药物载体结合，可以显著降低潜在重要治疗化合物的毒性。

在一些实施方案中，多肽包含与免疫球蛋白结构域连接的本发明的单结构域抗体。例如，多肽包含与Fc部分(例如人Fc)连接的本发明的单域抗体。所述Fc部分可用于增加本发明的单域抗体的半衰期甚至生产。例如，Fc部分可以与血清蛋白结合，从而增加单域抗体的半衰期。

提高药物活力的一种策略是利用水溶性聚合物。已表明各种水溶性聚合物可以改变生物分布、改进细胞摄取模式、通过生理屏障改变渗透性；并修改机体的清除率。为了实现靶向或缓释效果，已经合成了包含药物部分作为端基、作为骨架的一部分或作为聚合物链上的侧基的水溶性聚合物。

聚乙二醇(PEG)因其高度的生物相容性和易于修饰而被广泛用作药物载体。已表明与各种药物、蛋白质和脂质体的结合可以改进停留时间并降低毒性。PEG可以通过链端的羟基和其他化学方法与活性剂偶联；但是，PEG本身仅限于每个分子最多两个活性剂。在另一种方法中，PEG和氨基酸的共聚物被探索为新型生物材料，它们将保留PEG的生物相容性特性，但具有每个分子众多附着点的额外优势(提供更大的载药量)，并且可以合成设计为适应各种应用。本领域技术人员知道用于有效修饰药物的PEG化技术。例如，VectraMed(Plainsboro,N.J.)已使用由PEG和三官能单体(例如赖氨酸)的交替聚合物组成的药物递送聚合物。将PEG链(典型地为2000道尔顿或更少)通过稳定的氨基甲酸酯键连接到赖氨酸的a-和e-氨基。这种共聚物保留了PEG的所需特性，同时沿聚合物链以严格控制和预定的间隔提供反应性侧基(赖氨酸的羧酸基团)。反应性侧基可用于衍生化、交联或与其他分子缀合。这些聚合物可用于通过改变聚合物的分子量、PEG链段的分子量以及药物与聚合物之间的可裂解键来生产稳定的、长循环的前药。PEG链段的分子量影响药物/连接基复合物的间距和每个缀合物分子量的药物量(较小的PEG链段提供更大的载药量)。通常，增加嵌段共聚物缀合物的总分子量将增加缀合物的循环半衰期。然而，缀合物必须易于降解或具有低于阈值限制肾小球滤过的分子量(例如，小于45kDa)。此外，由于聚合物骨架在维持循环半衰期和生物分布方面很重要，因此接头可用于将治疗剂维持在前药形式，直到通过特定的触发因素(典型地是目标组织中的酶活性)从骨架聚合物中释放出来。例如，这种类型的组织激活药物递送在需要递送至特定生物分布位点并且将治疗剂在病理位点处或附近释放的情况下特别有用。用于活化药物递送的连接基团文库是本领域技术人员已知的并且可以基于酶动力学、活性酶的普遍性和所选疾病特异性酶的切割特异性(参见例如由VectraMed,Plainsboro,N.J.建立的技术)。此类接头可用于修饰本文所述的本发明多肽以用于治疗性递送。

根据本发明，本发明的单域抗体和多肽可以通过常规的自动化肽合成方法或通过重组表达产生。设计和制备蛋白质的一般原理是本领域技术人员众所周知的。

本发明的单域抗体和多肽可以根据常规技术在溶液中或在固体载体上合成。各种自动合成器是可商购的并且可以根据Stewart and Young；Tam et al.,1983；Merrifield,1986and Barany and Merrifield,Gross and Meienhofer,1979中描述的已知方案使用。本发明的单域抗体和多肽也可以采用示例性肽合成仪(如来自Applied Biosystems Inc的433A型)通过固相技术合成。任何给定蛋白质(通过自动肽合成或通过重组方法产生)的纯度可以使用反相HPLC分析测定。每个肽的化学真实性可以通过本领域技术人员公知的任何方法来建立。

核酸、载体、重组宿主细胞及其用途

作为自动肽合成的替代方法，可以采用重组DNA技术，其中将编码所选蛋白质的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适合如下所述的表达的条件下培养。重组方法特别优选用于产生更长的多肽。

多种表达载体/宿主系统可用于包含和表达肽或蛋白质编码序列。这些包括但不限于：微生物，例如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母(Giga-Hama等,1999)；用病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒,参见Ghosh等,2002)；用病毒表达载体转染(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体转化(例如Ti或pBR322质粒；参见例如Babe等,2000)的植物细胞系统；或动物细胞系统。本领域技术人员已知用于优化哺乳动物的蛋白质表达的各种技术，参见例如Kaufman,2000；Colosimo等,2000。用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。在细菌、酵母和其他无脊椎动物中重组表达肽底物或融合多肽的实验方案是本领域技术人员已知的，且简要描述如下。表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员已知的。可以选择具有特定能力的宿主细胞菌株以加工所表达的蛋白或产生可用于提供蛋白活性的一些翻译后修饰。多肽的这种修饰包括但不限于乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。切割蛋白质的“预制”形式的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也可能是重要的。不同的宿主细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等)具有针对这种翻译后活性的特殊的细胞机器和特征机制，且可以选择以确保引入的外源蛋白的正确修饰和加工。

在本发明的单域抗体和多肽的重组生产中，需要使用包含编码本发明的单域抗体和多肽的多核苷酸分子的载体。制备这种载体以及产生用这种载体转化的宿主细胞的方法是本领域技术人员已知的。

因此，本发明的另一个目的涉及编码根据本发明的单域抗体和/或多肽的核酸分子。

典型地，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，例如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。如本文所用，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞以转化宿主和促进引入序列的表达(例如转录和翻译)。术语“表达载体”、“表达构建体”或“表达盒”在本说明书中可交替使用，且包括任何类型的含有编码基因产物的核酸的遗传构建体，其中核酸编码序列的一部分或全部能够被转录。

因此，本发明的另一方面涉及包含本发明的核酸的载体。此类载体可包含调控元件，例如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者时引起或指导所述抗体的表达。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(MizukamiT.等1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason JO等，1985)和增强子(Gillies SD等，1983)等。可以使用任何用于动物细胞的表达载体，只要可以插入和表达编码人抗体C区的基因。合适载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等1990)、pAGE103(Mizukami T等1987)、pHSG274(Brady G等1984)、pKCR(O'Hare K等1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等，1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的复制质粒或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染产生。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中找到。

用于表达本发明的肽或多肽的合适表达载体的选择当然取决于待使用的特定宿主细胞，且在本领域技术人员能力范围内。

表达需要在载体中提供适当的信号，例如可以用于在宿主细胞中驱动目标核酸表达的来自病毒和哺乳动物来源两者的增强子/启动子。通常，被表达的核酸是在启动子的转录控制下。“启动子”是指被细胞的合成机器或引入的合成机器识别，需要启动基因的特定转录的DNA序列。当调控序列与编码目标蛋白(例如单域抗体)的DNA功能相关时，核苷酸序列可操作连接。因此，如果启动子核苷酸序列指导序列转录，则启动子核苷酸序列与给定DNA序列可操作地连接。

本发明的另一方面涉及用根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。

术语“转化”是指将“外源”(即外源或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，典型地是通过引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞被“转化”。

本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的抗体。术语“表达系统”是指在(例如，用于表达由载体携带的外源DNA编码的蛋白质并引入宿主细胞的)合适条件下的宿主细胞和相容载体。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或酵母菌酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)缺陷型的CHO细胞(Urlaub G等；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，下文称为“YB2/0细胞”)等。本发明还涉及产生表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将如上所述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这些重组宿主细胞可用于产生本发明的抗体。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析适当地从培养基分离本发明的抗体。

治疗方法和用途

本发明的单域抗体和多肽用作蛋白酶nexin-1(PN-1)的抑制剂。

因此，本发明的单域抗体和多肽特别适用于预防或治疗有需要的受试者的出血性疾病。

本发明还涉及用于在有需要的受试者中预防或治疗出血性疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的本发明的单域抗体和/或多肽。

如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物。在本发明的优选实施方案中，根据本发明的受试者是指患有或易患出血性疾病的任何受试者(优选人)。在另一个优选实施方案中，根据本发明的受试者是指患有或易患缺乏因子V、VIII、IX和/或XI的出血性疾病的任何受试者(优选人)。

如本文所用，术语“出血性疾病”具有其在本领域中的一般含义并且是指诸如世界卫生组织分类D65-D69中修订的出血性疾病。术语“出血性疾病”还指组成性出血性疾病、罕见出血性疾病、缺乏因子V、VIII、IX和/或XI的出血性疾病。术语“出血性疾病”还指出血性疾病，例如血友病、遗传性因子VIII缺乏症(血友病NOS、A型血友病、经典血友病)；遗传性因子IX缺乏症(克雷司马斯病、因子IX缺乏症伴功能缺陷、血浆凝血活酶成分[PTC]缺乏症、B型血友病)；凝血缺陷，如血管性血友病、血管性血友病、因子VIII缺乏症伴血管缺陷、血管性血友病；遗传性因子XI缺乏症(C型血友病、血浆凝血活酶前质[PTA]缺乏症)；其他凝血因子的遗传性缺乏症(先天性无纤维蛋白原血症、AC球蛋白缺乏症、加速素原、因子I[纤维蛋白原]、II[凝血酶原]、V[不稳定]、VII[稳定]、X[Stuart-Prower]、XII[Hageman]和XIII[纤维蛋白稳定]缺乏症、纤维蛋白原血症(先天性)、低纤维蛋白原血症、欧伦病)；循环抗凝剂引起的出血性疾病(长期使用抗凝剂期间的出血、高肝素血症、抗凝血酶、抗VIIIa、抗IXa、抗Xa和抗Xia增加、Coding-Hint)；获得性凝血因子缺乏症(肝病和维生素K缺乏导致的凝血因子缺乏症)；原发性血栓形成(活化蛋白C抗性[因子V Leiden突变]、抗凝血酶、蛋白C和蛋白S缺乏症、凝血酶原基因突变)；其他血栓形成倾向(抗心磷脂综合征、抗磷脂综合征、狼疮抗凝剂的存在)；紫癜、过敏性紫癜、定性血小板缺陷、血小板减少症、毛细血管脆性(遗传性)和血管性假血友病。术语“出血性疾病”还指出血性疾病(如血友病和其他罕见的出血性疾病)中的出血事件。

在一些实施方案中，出血性疾病是缺乏因子V、VIII、IX和/或XI的出血性疾病。

在一些实施方案中，出血性疾病是血友病。

在一些实施方案中，出血性疾病是A型血友病或B型血友病。

在一些实施方案中，出血性疾病是轻度或中度A型血友病。

在一些实施方案中，出血性疾病是轻度或中度B型血友病。

术语“轻度A型血友病”具有其在本领域的一般含义并且指由5-40％的血浆FVIII定义的出血性疾病。

术语“中度A型血友病”具有其在本领域的一般含义并且是指由1-5％的血浆FVIII定义的出血性疾病。

术语“重度A型血友病”具有其在本领域的一般含义并且是指由小于1％的血浆FVIII定义的出血性疾病。

术语“轻度B型血友病”具有其在本领域的一般含义并且是指由5-40％的血浆FIX定义的出血性疾病。

术语“中度B型血友病”具有其在本领域的一般含义并且是指由1-5％的血浆FIX定义的出血性疾病。

术语“重度B型血友病”具有其在本领域的一般含义并且是指由小于1％的血浆FIX定义的出血性疾病。

因此，本发明还涉及本发明的单域抗体和多肽，其用于预防凝血因子抗性的发展。

在一些实施方案中，本发明的单域抗体或多肽与出血性疾病的经典治疗联合使用。

因此，本发明涉及预防或治疗有需要的受试者的出血性疾病的方法，包括向所述受试者施用i)有效量的本发明的单域抗体和/或多肽和ii)出血性疾病的经典治疗。

如本文所用，术语“出血性疾病的经典治疗”是指用于治疗出血性疾病的任何天然或合成化合物。

根据本发明，用于治疗出血性疾病的化合物可以选自下组：凝血因子；去氨加压素；抗纤溶药(如氨甲环酸和ε氨基己酸)；血纤蛋白粘合剂；模拟凝血因子功能的抗体，如艾美赛珠单抗。

如本文所用，术语“模拟凝血因子功能的抗体”是指表现出凝血因子活性的抗体，其在血友病中缺失。模拟因子VIII功能的抗体，如艾美赛珠单抗，可以结合活化的凝血因子IX和因子X，介导后者的激活。

在一些实施方案中，本发明的单域抗体或多肽与模拟因子VIII的抗体联合使用。

在一些实施方案中，本发明的单域抗体或多肽与艾美赛珠单抗联合使用。

因此，在另一方面，本发明涉及根据本发明的单域抗体和多肽与艾美赛珠单抗联合用于预防或治疗有需要的受试者的出血性疾病。

如本文所用，术语“凝血因子”具有其在本领域的一般含义并且指因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、因子VIIa(FVIIa)、血浆来源的活化凝血酶原复合物和纤维蛋白原。术语“凝血因子”还涉及重组或纯化的凝血因子。

在一些实施方案中，本发明的单域抗体或多肽与一种或多种凝血因子联合使用。

因此，在另一方面，本发明涉及根据本发明的单域抗体和多肽与一种或多种凝血因子联合用于预防或治疗有需要的受试者的出血性疾病。

典型地，本发明的单域抗体和多肽以及如上所述的出血性疾病的经典治疗以治疗有效量向受试者施用。

“治疗有效量”的如上所述的本发明的单域抗体和多肽是指足够量的抑制剂。但是，应该理解，本发明的抑制剂和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定抑制剂的活性；使用的具体组合物，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用特定抑制剂的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定抑制剂联合或一起使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，在本领域技术人员中众所周知的是，以低于实现期望治疗效果所需的水平开始本发明的单域抗体和多肽的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。但是，产品的每日剂量可在每个成人每天0.01至1,000mg的宽范围内变化。典型地，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的本发明抑制剂，用于对待治疗的受试者的剂量的症状调整。药物典型地含有约0.01mg至约500mg的本发明的单域抗体和多肽，优选1mg至约100mg的本发明的单域抗体和多肽。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，特别是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物。

在一个具体实施方案中，本发明的单域抗体和多肽可以0.01μM-20μM的浓度使用，特别地，本发明的抑制剂可以0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μM的浓度使用。

本发明的凝血因子的治疗有效量是本领域公知的。典型地，凝血因子的治疗有效量涉及约10IU-300IU/kg体重，尤其是约10IU-100IU/kg体重的凝血因子(例如FVIII)。特别地，凝血因子的治疗有效量涉及10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0IU/kg体重的凝血因子量。

在一个具体实施方案中，根据本发明的凝血因子可以低剂量使用以避免产生凝血因子抗性。典型地，术语“低剂量”是指约5IU-40IU/kg体重的凝血因子(例如FVIII)。特别地，术语“低剂量”是指约5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0IU/kg体重的凝血因子量。

根据本发明，本发明的单域抗体和多肽与一种或多种凝血因子顺次或伴随施用。

本发明的药物组合物和试剂盒

典型地，本发明的单域抗体和多肽可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质(例如生物可降解的聚合物)组合以形成药物组合物。因此，本发明的单域抗体和多肽以药物组合物的形式向受试者施用。

“药学上”或“药学上可接受的”是指当酌情向哺乳动物(尤其是人)施用时，不会产生有害的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的配制辅剂。

在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠施用的本发明的药物组合物中，活性成分(单独或与另一种活性成分组合)可作为与常规药物载体的混合物以单位施用形式向动物和人施用。合适的单位施用形式包括口服途径形式如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒剂和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、喷雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。

优选地，药物组合物包含对于能够被注射的制剂而言药学上可接受的介质。这些特别可以是等渗、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情况，当加入无菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。

适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须无菌，且必须具有易于注射的程度的流动性。它在制备和储存条件下必须稳定，且必须防止微生物，例如细菌和真菌的污染作用。

含有本发明的抑制剂作为游离碱或药学上可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂，例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备分散体。在储存和使用的一般条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。

本发明的抑制剂可以中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其是用无机酸(例如盐酸或磷酸)、或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。用游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，或有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散体介质。例如，可以通过使用包衣(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来获得，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来获得可注射组合物的延迟吸收。

通过以下来制备无菌可注射溶液：根据需要将所需量的活性化合物和数种以上列举的其他成分引入合适的溶液中，随后过滤灭菌。通常，通过以下制备分散体：将各种灭菌的活性成分引入无菌介质中，所述无菌介质包含基础的分散体介质和所需的来自以上列举的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从之前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。

一旦配制，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的这种量施用。制剂容易以各种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型，但也可以使用药物释放胶囊等。

例如，为了水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹腔内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员基于本公开将知晓的。取决于被治疗的受试者的情况，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂量。

除了配制用于肠胃外施用，例如静脉内或肌肉内注射的本发明抑制剂之外，其他药学上可接受的形式包括，例如，用于口服施用的片剂或其他固体；脂质体制剂；定时释放胶囊；以及当前使用的任何其他形式。

本发明的药物组合物可以包括用于预防或治疗出血性疾病的任何其他试剂。

在一个实施方案中，所述另外的活性剂可以包含在相同的组合物中或分开施用。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物涉及同时、分开或顺次使用的组合制剂用于预防和治疗出血性疾病。

最后，本发明还提供包含至少一种本发明的单域抗体或多肽的试剂盒。含有本发明的抗-PN-1单域抗体或多肽的试剂盒可用于治疗方法。

本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：分离自合成文库的sdAb的鉴定和序列。非吸附噬菌体ELISA确定3轮噬菌体展示实验后获得的阳性克隆。将噬菌体添加到包被有hPN-1、mPN-1或hPAI-1的平板上。HRP缀合的抗M13抗体和比色底物用于测量结合。在mPN-1和hPN-1存在下显示显著的ELISA信号并且在hPAI-1存在下显示非常低的信号的VHH克隆被认为是特异性的。

图2：获得自合成文库的VHH的表征。A-B.将孔包被mAb抗PAI-1，并将2pg/mL的hPAI-1(A)或mPAI-1(B)与VHH(10μg/mL)一起孵育。用过氧化物酶标记的pAb抗6X-His标签探测结合的VHH。C-D.将孔包被0.5μg的hPN-1(C)或mPN-1(D)，并与不同浓度的单价VHH(0.3-20μg/mL)一起孵育。用过氧化物酶标记的pAb-cMyc标签探测结合的VHH。E-F.在存在或不存在VHH(10μM)的情况下，将1nM的凝血酶与10nM hPN-1(E)或mPN-1(F)一起孵育。通过PNAPEP-0238-水解底物的速率测量残余凝血酶活性。数据(平均值±SD；n＝3-5)代表作为单独凝血酶百分比的残余凝血酶活性。G.在不存在或存在VHH(10μM)的情况下，将尿激酶纤溶酶原激活剂(u-PA；1.3nM)与hPAI-1(10nM)一起孵育。通过PNAPEP-1344-水解底物的速率测量残留的uPa活性。数据(n＝3-5)表示作为单独u-PA百分比的残余u-PA活性。

图3：确定单价VHH的半数最大抑制浓度以及识别和改进最佳单价VHH的策略。A.将hPN-1或mPN-1与不同浓度的单价VHH(0-2μM)一起孵育，并在每孔中添加1nM的凝血酶。通过测定PNAPEP-0238-水解底物的速率测量残留的凝血酶催化活性。数据表示作为单独凝血酶的百分比的残余凝血酶活性。每个数据点代表单个测量。该表概括了针对mPN-1和hPN-1的单价VHH获得的IC50(平均值±SD；n＝3)。B.选择最佳单价VHH的策略导致选择二价VHH以改进其特性。

图4：二价VHH的表征：A-B.将孔包被0.5μg人(A)或鼠PN-1(B)，并与不同浓度的二价VHH(0.3-20μg/mL)一起孵育。用过氧化物酶标记的pAb 6XHis标签探测结合的VHH。C.将hPN-1或mPN-1(10nM)与不同浓度的二价VHH(0-2000nM)一起孵育，并在每孔中添加1nM的凝血酶。通过测量PNAPEP-0238-水解的速率测量残留的凝血酶催化活性。通过测定PNAPEP-0238-水解底物的速率测量残留的凝血酶催化活性。数据表示作为单独凝血酶的百分比的残余凝血酶活性。每个数据点代表单个测量。该表概括了针对mPN-1和hPN-1的二价VHH获得的IC50(平均值±SD；n＝3)。D.VHH结合(100μg/mL)包含RCL(50μg/mL)的生物素化肽的代表性BLI分析图(Octet)。在不存在凝血酶(肽-RCL)或存在凝血酶(肽-RCL+IIa)(5U/ml)的情况下，将固定化的肽在37℃下孵育30分钟，然后暴露于VHH。Ctrl曲线对应于阴性对照。结果表示为由不同分子结合产生的波长偏移(以nm表示)。

图5：二价VHH的离体实验。A.将稀释的鼠野生型血浆与62.5nM的mPN-1一起孵育，并添加288nM的二价VHH，并测量凝血酶原时间(PT)。B.将稀释的缺乏FVIII的鼠血浆与500nM的mPN-1一起孵育，并添加625nM的二价VHH，并进行修饰的活化部分凝血活酶时间(aPTT)。C-D.在存在或不存在1μM二价VHH的情况下，将0.1nM的凝血酶与衍生自未活化(C)或TRAP活化(D)的血小板(5x10⁸个细胞/mL)的上清液一起孵育。通过PNAPEP 0238-水解底物的速率测量残留的凝血酶催化活性。数据(平均值±SD；n＝3-4)代表作为单独凝血酶百分比的残余凝血酶活性。

具体实施方式

实施例1：

材料和方法

发明人使用凝血酶S-2238的显色底物(Cryopep,Montpellier,France)确定了对人和鼠PN-1的抗凝血酶催化活性的抑制。S-2238是特异于与pNA(4-硝基苯胺)共价结合的凝血酶的短肽。当被凝血酶裂解时，它释放可以在405nm处被分光光度计检测到的游离pNA。将人或鼠PN-1(20nM)在Hepes缓冲液(20mM Hepes,,0.15M NaCl,pH7,5-0.1％HSA)中与二价杂交体(B11-Bv、B11-F06或B11-A08,10或1μM)在37℃下孵育5分钟，然后在37℃下与凝血酶(1nM)孵育10分钟，然后添加显色底物S-2238(2mM)。在405nm处记录吸光度的变化90分钟。残余凝血酶活性表示为在PN-1存在下与或不与二价杂交体孵育的情况下测量的活性与单独凝血酶活性的比率。

发明人通过使用显色底物PNAPEP-1344(Cryopep,Montpellier,France)通过测量二价杂交体对由PAI-1抑制uPA的影响，验证了杂交体对PN-1的特异性。将人PAI(10nM)与二价杂交体(B11-Bv、B11-F06或B11-A08，10或1μM)在含有0.1％HSA的PBS缓冲液中在37℃下孵育5分钟，然后与uPa(1.3nM)在37℃下一起孵育10分钟，然后添加显色底物S-1344(0.4mM)，开始反应。在405nm处记录吸光度的变化120分钟。残留的uPA活性表示为在PN-1存在下与或不与二价杂交体孵育的情况下测得的活性与单独的uPA活性的比率。

发明人使用凝血酶S-2238的显色底物(Cryopep,Montpellier,France)测定了人PN-1的二价杂交体的IC50。将人或鼠PN-1(20nM)在Hepes缓冲液(20mM Hepes，0.15M NaCl,pH7,5-0.1％HSA)在37℃下孵育5分钟，然后与凝血酶(1nM)在37℃下一起孵育10分钟，然后添加显色底物S-2238(2mM)。在405nm处记录吸光度的变化90分钟。在图中，抑制％相当于PN-1活性％。

结果

抑制人和鼠PN-1的抗凝血酶活性。

使用美洲驼衍生文库，总共7轮淘选和940个测试VHH，得到52个识别PN-1的候选者。证明三种纳米抗体(B11、F06和A08)能够抑制人和鼠PN-1的抗凝血酶活性。测试了二聚体组合并显示出更好的亲和力和抑制活性。事实上，杂交体B11-Bv、B11-F06和B11-A08能够抑制人和小鼠PN-1的抗凝血酶活性(图2E-F)。

第一特异性抗PN-1抗体。

对识别美洲驼衍生文库PN-1的候选者的仔细表征表明，所有这些VHH导致52个也识别纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)的候选者。此外，我们测试的所有商业抗PN-1抗体也被证明是非特异性的。在此，发明人发现单域抗体B11、F06和A08以及二价杂交体B11-Bv；B11-F06、B11-A08与人和鼠PN-1均有效结合，而不会与PAI-1(PN-1的系统发育最接近的丝氨酸蛋白酶抑制剂物种)发生交叉反应(图2E-G)。

本发明人之前表明，PN-1抑制剂，例如抗PN-1抗体，可改进轻度和中度血友病患者的凝血酶生成。他们确定阻断PN-1在出血性疾病治疗中起作用。在本文中，发明人描述了第一种能够阻断鼠和人PN-1的抗凝血酶活性而不与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂交叉反应的特异性单域抗体。这些单域抗体可以成为治疗出血性疾病，特别是血友病患者的有力工具。

实施例2：

材料和方法

材料

异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)来自Sigma-Aldrich(Saint-Quentin Fallavier,France)。多克隆兔抗cMyc标签过氧化物酶标记的多克隆兔抗6xHis标签抗体来自Abcam(Paris,France)。如所述制备人和鼠PN-1和人α-凝血酶20,21。PT和aPTT试剂来自Stago-Diagnostica(Asnières-sur-Seine,France)。显色底物PNAPEP-1344和PNAPEP-0238来自Cryopep(Montpellier,France)。Dynabeads M-450环氧树脂珠、大肠杆菌TG1细胞、Terrific Broth(TB)-培养基、LysogenyBroth(LB)-培养基来自ThermoFisher Scientific(Villebon-sur-Yvette,France)。纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)来自Stago BNL(Lille,France)。AEBSF来自vWR(Fontenay-sous-Bois,France)。

通过噬菌体展示从淋巴细胞文库构建抗PN-1VHH

将单个美洲驼(L.glama)的免疫工作外包给Centre de Recherche en Cancérologie(UniversitéAix-Marseille,Marseille,France).22。简言之，用100μg人或鼠PN-1与弗氏不完全佐剂等比例的混合物对美洲驼进行免疫接种。采样血液后，从淋巴细胞中提取mRNA并按照描述构建VHH文库22-24。文库包含VHH编码DNA片段，将这些片段克隆到pHEN6-噬菌粒载体中并转化到电感受态大肠杆菌TG1细胞中25(ThermoFischerScientitic)以生成0.9x108克隆的文库。M13K07辅助噬菌体用于感染TG1 VHH文库以允许VHH的表面表达。

VHH的负选择和正选择

为了减少与PAI-1交叉反应的VHH的数量，首先将噬菌体颗粒与包被有100μg PAI-1的珠子一起孵育(在室温下在PBS-3％BSA中1小时)。将未结合噬菌体传递到包被有鼠PN-1和人PN-1混合物(各50μg)的珠子上。将捕获的噬菌体用0.5mg/ml胰蛋白酶洗脱。连续进行三轮富集。

抗PN1特异性VHH的选择。

用分离的噬菌体感染TG1细菌后，将细胞在TB培养基中搅拌下生长4小时，然后添加1mM IPTG以在30℃下诱导VHH表达。诱导后18小时，将细胞离心并在TES缓冲液(200mMTris-HCl，pH8、0.5mM EDTA和500mM蔗糖)中于4℃裂解1小时后收集周质提取物，然后用在PBS中4倍稀释的TES缓冲液裂解30分钟。测试释放的可溶性蛋白质与PN-1、PAI-1或BSA的结合。将蛋白质(1μg/孔)包被在PBS中的NUNC Maxisorp板(ThermoFischer Scientific)上，在4℃下过夜。饱和后，(PBS-BSA 3％，37℃下1小时)，使用碱性磷酸酶偶联的多克隆抗6xHis-tag抗体探测结合的VHH，通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺的水解检测(TMB)，并在450nm处读取吸光度。

从合成文库分离抗PN-1VHH。

在第二种方法中，合成VHH文库用于分离抗PN-1VHH(Hybrigenics Services SAS,Paris,France)。将这个包含3x109VHH的hs2dAb噬菌体展示文库首先与人PAI-1包被的珠一起孵育，以减少非特异性结合物。然后，将未结合的VHH与鼠或人PN-1包被的珠一起孵育。总共进行三轮噬菌体展示，其中在每一轮中重复耗尽步骤。3轮后，随机挑选90个大肠杆菌克隆并分析与人和鼠PN-1以及PAI-1的结合。与PAI-1相比，显示对PN-1的信号增加>5倍的噬菌体克隆被认为是PN-1(小鼠、人或两者)的特异性结合物。阳性克隆的测序显示存在18种不同的阳性VHH。这些中的四个同时识别mPN-1和hPN-1，并将其亚克隆到pHEN2载体中以进行进一步表征。

VHH亚克隆、表达和纯化。

将抗PN-1VHH直接转化到大肠杆菌WK6细胞中。使每个克隆首先在10mL LB-培养基/100μg/mL氨苄青霉素/2％葡萄糖/1mM MgCl2中在37℃温和搅拌下生长过夜。将3mL该预培养物用于接种330mL TB-培养基/100μg/mL氨苄青霉素/0.1％葡萄糖/1mM MgCl2。搅拌培养物(170rpm,37℃)直至达到OD600为0.8-1。然后，通过1mM IPTG诱导VHH表达并使培养基生长过夜(170rpm,28℃)。通过超声处理(Fisher science，Illkirch，France)以10秒开启/10秒关闭的循环提取周质蛋白30分钟。裂解的百分比通过比率(裂解后的OD/裂解前的OD)x100来验证。接着，按照说明通过Co2+-亲和层析(vWR)纯化带有His标签的VHH。使用20mMHepes(pH 7.4)/0.1M NaCl作为平衡缓冲液，通过大小排阻色谱去除少量污染物。通过SDS-Page和考马斯染色评估，纯化的VHH显示>95％的同质性。对于二价VHH，将单价sdAb的两个拷贝通过由[GGGs]3和C端6xHis-Tag组成的接头分开，以通过Co2+-亲和层析进行纯化。

hPN-1和mPN-1ELISA。

将Microlon-Med半孔板(Greiner bio-one,Courtaboeuf,France)在4℃下用0.5μg mPN-1或hPN-1/孔包被过夜，然后与不同浓度的VHH(0-20μg/mL)在PBS/BSA 0.1％/Tween-20 0.1％中在37℃下孵育2小时。在相同的缓冲液中，针对单价VHH用过氧化物酶标记的多克隆抗cMyc标签抗体探测结合的抗PN-1VHH，或针对二价VHH用抗6xHis标签抗体探测，并通过TMB水解进行检测，并在450nm处读取吸光度。

通过PN-1抑制凝血酶活性

在96孔板(Greiner Bio-one)中，将不同浓度的抗PN-1VHH与10nM PN-1在室温下在20mM Hepes/0.15M NaCl/0.1％HSA中孵育15分钟。然后，将1nM纯化的凝血酶加入孔中并在室温下孵育30分钟。在37℃下通过测量对硝基苯胺从显色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(PNAPEP-0238)(0.2mM)中释放的速率来量化凝血酶活性，并在多孔板中在405nm处读数。为了计算每个VHH的IC50，使用略微修改的方案：以0-2μM的浓度使用抗PN-1VHH，在5分钟内进行VHH孵育，然后与1nM凝血酶孵育10分钟。添加浓度为0.2mM的PNAPEP-0238底物并在37℃下孵育2小时。如上所述进行凝血酶活性的量化。

通过内源性PN-1抑制凝血酶活性

在ACD-A抗凝管中采集血样。在15分钟内以120g离心血液以回收富含血小板的血浆(PRP)。然后，添加2μL/mL三磷酸腺苷双磷酸酶(5mg/mL)和1μL/mL PGE1(10mM)，并将PRP以1200g在20℃下离心12分钟。将沉淀轻轻重悬于洗涤缓冲液(3.6mM柠檬酸、0.5mM葡萄糖、0.5mM KCl、10.3mM NaCl、2mM CaCl2 pH6.5、0.30％BSA、2μL/mL三磷酸腺苷双磷酸酶(5mg/mL)和1μL/mL PGE1(10mM))并在20°下以1200g离心12分钟。在反应缓冲液(0.03mMNaH2PO4、0.5mM Hepes、0.55mM葡萄糖、0.2mM MgCl2、0.1mM KCl、13.7mM NaCl、12mMNaHCO3、2mM CaCl2、pH 7.3和0.3％BSA)中将血小板调节至5x108个细胞/mL的浓度。对于“活化血小板”条件，在37℃下将50μM的TRAP(凝血酶受体激活肽)添加到血小板中30分钟。将血小板在室温下以1200g离心10分钟以保留上清液。在96孔板(Greiner Bio-one)中，在80μL活化或未活化的血小板上清液中添加1μM的VHH，并在室温下孵育15分钟。然后，每孔添加0.1nM凝血酶并在室温下孵育30分钟。添加浓度为0.2mM的PNAPEP-0238底物并在37℃下孵育2小时。如上所述进行凝血酶活性的量化。

通过人PAI-1抑制uPA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)

在96孔板(Greiner Bio-one)中，将10μM抗PN-1VHH与10nM PAI-1在室温下在20mMHepes pH7.5、150mM NaCl、0.1％HSA、pH7.5中孵育15分钟。随后添加1.3nM uPA。在室温下孵育10分钟后，通过在37℃下测量对硝基苯胺从显色底物Glu-Gly-Arg-pNA、PNAPEP-1344(0.2mM)中释放的速率并通过多孔板读数器在405nm处读数来量化孔的uPA活性。

通过生物层干涉仪(BLI)分析测试VHH的特异性

使用Octet QK设备(Fortebio，Reading，UK)通过BLI分析进行平衡结合。将在100mM MES(pH 5.0)中稀释的单价VHH(25μg/mL)固定在胺反应生物传感器上。通过乙醇胺淬灭后，将VHH包被的传感器与人或鼠PN-1或人PAI-1(1μM)在PBS-吐温0.1％缓冲液中孵育15分钟以允许结合。随后，将生物传感器在PBS-Tween 0.1％缓冲液中孵育10分钟以开始解离。在替代实验中，将PN-1的50μg/mL生物素化RCL固定在PBS-Tween 0.1％缓冲液中的链霉亲和素传感器上。在结合之前，将5U的凝血酶或缓冲液PBS-Tween与传感器在37℃下孵育30分钟，然后在37℃下跟踪二价VHH(100μg/mL)结合15分钟。随后，将生物传感器放入PBS-吐温0.1％缓冲液中10分钟以开始解离。使用Octet软件4.0版分析数据。

修饰的凝血酶原时间(PT)

将50微升鼠正常混合血浆(MNPP)在Owren-Koller缓冲液中稀释8倍，并添加50μLFII缺失(凝血酶原缺失)冻干血浆(Stago-Diagnostica)。在有或没有288nM二价VHH的情况下，将混合物在37℃下与62.5nM的mPN-1一起孵育15分钟。通过向混合物中添加100μLNeoplastin CI(Stago-Diagnostica)开始凝血酶原时间。凝块形成通过凝血计STArt(Stago-Diagnostica)测量。在37℃下进行3次一式两份的测定。

修饰的活化部分凝血活酶时间(aPTT)

将50微升FVIII缺失的鼠血浆在Owren-Koller缓冲液中稀释8倍，并添加50μLFVIII缺失的冻干血浆和50μL的PTT试剂(Stago-Diagnostica)。孵育100秒后，添加625nMVHH和500nM mPN-1。在37℃下孵育240秒后，通过添加100μL 0.025M CaCl2开始aPTT测试。凝块形成通过凝血计测量。在37℃下进行3次一式两份的测定。

统计分析

数据以带标准误差(SD)的平均值表示，并使用Prism软件进行分析。单向ANOVA分析用于与对照的值比较。P值<0.05&P<0.0001分别被认为是显著和高度显著的。

结果

从合成VHH文库开发抗PN-1VHH。

为了获得特定的有效抑制性抗PN-1VHH，我们使用了合成的VHH文库。使用与经典VHH相同的方案选择VHH。选择了4种最强的结合物进行进一步表征：H12、B11、F06和A08。图1中的hPN-1、mPN-1和PAI-1非吸附噬菌体ELISA突出了所有4个VHH对hPN-1和mPN-1的独特识别以及它们对hPAI-1的不识别。

从合成文库获得的抗PN-1VHH的表征

分析纯化的VHH与PAI-1以及hPN-1和mPN-1的相互作用。与初始筛选一致，4个选定的VHH中没有一个显示与人或鼠PAI-1的相关结合(图2A-B)。相比之下，VHH H12、B11、F06和A08都显示出与人和鼠PN-1的剂量依赖性结合(图2C-D)。为了评估不同VHH对PN-1的抑制活性，我们接下来进行了在PN-1和各种VHH存在下测量凝血酶活性的测定。尽管与hPN-1和mPN-1结合最有效，但VHH H12仅部分干扰PN-1介导的凝血酶活性抑制，将hPN-1和mPN-1的凝血酶活性分别恢复到74±5％和53±17％(图2E-F)。VHH B11、F06和A08证明在解除hPN-1对凝血酶的抑制方面更有效，其中B11的凝血酶活性恢复率为100±7％，F06为100±5％，并且A08为100±11％(图2E)。对mPN-1也观察到类似的有效抑制能力：B11为92±10％，F06为96±9％，A08为94±14％(图2F)。这些VHH均不影响PAI-1对u-PA的抑制(图2G)。总之，这种第二种选择策略确实产生了对hPN-1和mPN-1具有选择性和抑制性的VHH。

测定B11、F06、A08 VHH的IC50

为了测定B11、F06和A08对hPN-1和mPN-1的半数最大抑制浓度，我们将不同浓度的VHH与10nM PN-1和1nM凝血酶一起孵育。跟踪PNAPEP-0238底物的降解2小时。测试的VHH对hPN-1的计算IC50值为B11为0.05±0.01μM、F06为0.29±0.03μM和A08为0.96±0.39μM(图3A)。使用mPN-1，IC50分别计算值为B11为1.58±0.24μM，F06为0.56±0.13μM，和A08为2.88±0.77μM(图3A)。为了增加VHH尤其是对mPN-1的抑制作用，我们接下来生成了3种不同的二价构建体，B11bv、B11F06和B11A08(图3B)。在此工程化步骤之后，我们验证了纯化的二价VHH是否保持其结合hPN-1和mPN-1的能力(图4A-B)。我们还确认他们仍然无法识别PAI-1(未显示)。

与单价VHH相比，二价VHH的IC50显著提高，对于hPN-1，B11bv的值为41±7nM，B11F06的值为62±6nM，B11A08的值为142±28nM。对于mPN-1，B11bv、B11F06和B11A08的IC50值也提高了，其值分别为825±9nM、414±141nM和524±174nM(图4C)。

为了确定PN-1上VHH的结合区域，我们进行了BLI分析以测试覆盖PN-1的RCL区域的肽(完整的或被凝血酶切割后)与二价VHH之间的相互作用。所有三种二价sdAb均与RCL肽有效结合，表明它们针对蛋白质的这一区域(图4D)。对于每个二价构建体，一旦被凝血酶切割RCL，与该肽的结合显著降低。这些数据与VHH B11与RCL的C端部分(凝血酶裂解后，其从传感器中释放)或与P1-P'1裂解位点重叠的表位的结合相一致。没有一个VHH似乎识别RCL的N端部分(在凝血酶裂解后，其仍与传感器结合)。数据不区分F06和A08与RCL的C端部分或RCL外的表位的结合。

二价VHH对体外凝血测定的影响。

为了测试二价VHH对凝血的影响，我们使用鼠血浆对mPN-1进行了修饰的PT和aPTT凝血测定。

首先，使用野生型血浆开发了PT，所述血浆与凝血酶原缺陷的冻干血浆一起孵育，以便能够仅使用少量mPN-1。使用这种修饰的测定法，PT为69.0±2.4秒，并在添加62.5nMmPN-1后增加到123.8±6.6秒(图5A)。在288nM的浓度下，所有三种二价VHH都能够恢复PT，同时在不添加mPN-1的情况下不影响PT(B11bv为83.5±1.1秒；B11F06为83.3±1.5秒；B11A08为93.2±4.4秒)。在该测定中，B11A08的效率略低于其他两个VHH。

我们还测试了二价VHH在修饰的aPTT中的作用(图5B)。与PT类似，我们设计了增加aPTT的特定条件，通过使用F8缺陷鼠血浆，以使测试对PN-1更敏感。F8缺陷鼠血浆中的aPTT为97.0±2.7秒，当添加mPN-1时增加1.6倍至148.4±7.9秒。三个VHH显著降低了aPTT，其中B11F06最有效(112.5±7.0秒；图5B)。

我们接下来研究了我们的二价VHH是否也能够抑制血小板α颗粒中存在的内源性PN-1。在这个实验中，来自未激活或TRAP激活的血小板的上清液用作PN-1的来源。因此研究了分泌的PN-1抑制凝血酶活性的功效。如所预期，当来自未活化血小板的上清液与凝血酶一起孵育时，没有测量到抑制作用，因为PN-1没有从血小板α-颗粒中释放(图5C)。相比之下，在存在衍生自TRAP激活的血小板的上清液的情况下，残余凝血酶活性下降至18±15％(图5D)。二价VHH消除了分泌的血小板PN-1对凝血酶活性的抑制，B11bv的凝血酶活性恢复为97±23％，B11F06为88±21％和B11A08为100±15％。

我们之前已经表明，血小板在激活后会释放PN-1，而这种PN-1会损害凝血酶的生成。事实上，通过使用非活化和TRAP活化血小板的上清液，我们可以确认凝血酶抑制分子的释放(图5C-D)。有趣的是，这种抑制作用可以通过添加VHH来中和，表明它们能够与血小板释放的PN-1相互作用并抑制PN-1。

总而言之，我们已经制定了一种开发靶向PN-1的抑制性VHH的策略，其不与PAI-1交叉反应。这些VHH可用作研究工具，以更好地了解PN-1在生理和病理过程中的作用。此外，还可以探索它们在血友病治疗中的潜在治疗应用。

参考文献

在本申请中，各种参考文献描述了与本发明相关的现有技术。这些参考文献的公开在此通过引用并入本公开。

Boulaftali Y,Adam F,Venisse L,Ollivier V,Richard B,Taieb S,Monard D,Favier R,Alessi MC,Bryckaert M,Arocas V,Jandrot-Perrus M,BoutonMC.Anticoagulant and antithrombotic properties of platelet protease nexin-1.Blood.2010；115:97-106.

Bouton MC,Boulaftali Y,Richard B,Arocas V,Michel JB,Jandrot-PerrusM.Emerging role of serpinE2/protease nexin-1in hemostasis and vascularbiology.Blood.2012Mar 15；119(11):2452-7.

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