CN114196710B - 盐霉素作为杀菌剂在酒精发酵中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了盐霉素作为杀菌剂在酒精发酵中的应用，属于生物发酵技术领域。包括如下步骤：将糖质原料用水稀释至20～40Bx，得到糖质溶液；或将淀粉质原料依次进行糊化，液化，糖化，得到糖化液；取所得糖质溶液或糖化液，添加0.1～0.3wt％尿素，接种0.4～0.6wt％酿酒活性干酵母；将盐霉素和/或盐霉素预混剂用30～35℃无菌水充分溶解，以盐霉素计，按发酵液量的8～10ppm添加到发酵液中，混合均匀，30～35℃发酵40～50h，即可。在本发明的酒精发酵方法中，盐霉素添加4小时后发酵罐内细菌减少，挥发酸降低到0.015以下，酵母数升高到1.5亿/mL以上，发酵含酒份提高到11％(v/v)以上。

Description

盐霉素作为杀菌剂在酒精发酵中的应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及盐霉素作为杀菌剂在酒精发酵中的应用。

背景技术

酒精作为工业基础原料，广泛应用于国民经济许多部门，一直是我国发酵行业的主要产品，近年来酒精作为可再生清洁能源日益受到各国的重视，目前绝大多数酒精是以淀粉质或糖质原料通过酿酒酵母发酵生产。酒精实际生产相对粗放，生产原辅料和水一般没有严格灭菌，发酵不可避免会滋生杂菌，发酵过程杂菌感染会影响原料产酒精率。酒精企业避免细菌感染一般通过添加硫酸和杀菌剂等抑制杂菌。大量使用浓硫酸，不仅对环境造成很大的危害，而且容易造成设备腐蚀和积垢，还会增加酒精废液处理难度，酒精环保资金投入增加。硫酸抑制杂菌的同时也很会抑制酵母发酵，影响原料出酒率。常用杀菌剂通常包括抗生素、防腐剂或二者的复配产品。使用较多防腐剂有氟化钠、漂白粉、强氯精和五氯苯酚钠等，抑制杂菌很会抑制酵母发酵，防腐剂大多毒性较强，大量使用容易危害操作人员健康，酒精废液中的防腐剂残留会污染环境。使用抗生素主要有青霉素、链霉素和土霉素等，它们是人类抗菌的常用药剂，大量使用青霉素等抗生素，容易使细菌产生抗药性，失去杀菌作用，影响人类疾病防控。因此，寻找低毒高效盐霉素杀菌剂是目前发酵酒精行业研究的方向。

盐霉素(分子式：C₄₂H₆₉O₁₁Na；CAS：53003-10-4)为一元羧酸聚醚类抗生素，是典型的离子载体抗生素，盐霉素常以钠盐形式存在。能够抑制大部分革兰氏阳性菌生长，其作用原理是盐霉素可以作为金属离子螯合剂，能够结合钠钾离子从而改变细胞膜内外钠钾离子的浓度，形成离子梯度导致细胞死亡。对大多数革兰氏阳性菌和各种球虫有较强的抑制和杀灭作用，不易产生耐药性和交叉抗药性。盐霉素主要用于动物词料中作为饲料添加剂使用，主要用于预防鸡球虫病，不作为人类抗菌药。目前市场上一般使用盐霉素钠与大豆粕、大豆粉、米糠、无水硅酸或硅藻土配制而成的盐霉素预混剂。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的酒精发酵工艺中的常用杀菌剂毒性较强、杀菌效果不佳等问题，提供盐霉素作为盐霉素杀菌剂在酒精发酵中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

盐霉素在制备杀菌剂中的应用，所述菌为醋酸菌和/或乳酸菌。

进一步地，所述盐霉素对醋酸菌的最小抑菌浓度为8μg/mL，所述盐霉素对醋酸菌的最小抑菌浓度为5μg/mL。

进一步地，所述杀菌剂还含有一种或多种药学上可接受的辅料，比如载体、赋形剂或稀释剂。

盐霉素作为杀菌剂在酒精发酵中的应用。

进一步地，盐霉素的添加量为发酵液量的1～10ppm，优选为2～3ppm。

进一步地，盐霉素的添加方法为：先将盐霉素和/或盐霉素预混剂用无菌水充分溶解，然后按所需添加量添加到发酵液中。

一种酒精发酵方法，包括如下步骤：

S1、将糖质原料用水稀释至20～40Bx，得到糖质溶液；或将淀粉质原料依次进行糊化，液化，糖化，得到糖化液；

S2、取S1所得糖质溶液或糖化液，添加0.1～0.3wt％尿素，接种0.4～0.6wt％酿酒活性干酵母；将盐霉素和/或盐霉素预混剂用30～35℃的无菌水充分溶解，以盐霉素计，按发酵液量的1～10ppm添加到发酵液中，混合均匀，30～35℃发酵40～50h，即获得目标产物。

进一步地，S1中所述糖质原料选自甘蔗、甜菜、甜高粱和糖蜜中的一种或多种，所述淀粉质原料选自谷物类或薯类原料中的一种或多种，优选自玉米、木薯和甘薯中的一种或多种。

进一步地，S1中所述糖化液的制备过程为：取淀粉质原料用2～5倍体积水溶解，加入高温型α-淀粉酶100～150U/g，搅拌均匀配成淀粉浆，缓慢加热至98～102℃糊化25～35min；降温至90～95℃，保温不断搅拌液化60～120min，至碘反应不显蓝色，即制成液化液；液化液降温至60～65℃，用浓硫酸调节pH值4.2～4.5，加入糖化酶100～150U/g糖化25～35min，即制成糖化液。

进一步地，S2中所述尿素的添加量为0.2wt％，酿酒活性干酵母的添加量为0.5wt％。

进一步地，S2中所述发酵的条件为31℃发酵48h。

进一步地，S2中所述盐霉素可以选自市售的高纯度(45％～99％)盐霉素工业盐，所述盐霉素预混剂可以选自市售的盐霉素含量12％或24％的盐霉素预混剂，但24％的盐霉素预混剂水溶性差，对发酵液的杀菌效果不佳。在实际应用过程中，优选将纯度45％的盐霉素工业盐和盐霉素含量12％的盐霉素预混剂按质量比4:6混合使用，可以最大程度的节约成本。

上述盐霉素工业盐和盐霉素预混剂优选购自山东齐发药业有限公司。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)传统的酒精发酵杀菌剂容易产生抗药性，本发明酒精发酵所用杀菌剂主要原料盐霉素，主要对革兰氏阳性菌有强大的抗菌作用，对人类几乎不具有医用价值，而且内服不易吸收，因此不易产生交叉耐药性和药物残留。盐霉素是典型的离子载体抗生素，它对细胞中的阳离子，尤其K⁺、Na⁺、Rb⁺的亲和力特别强，妨碍细胞内外阳离子的传递，影响渗透压，最终使细胞崩解，起到杀菌作用。酒精生产发酵液中K⁺、Na⁺金属离子含量较高，更加速杀灭细菌细胞，能够对酒精发酵液进行有效的杀菌，从而提高发酵产酒率。

(2)酒精生产废液常资源化用于加工饲料和肥料，防腐剂和青霉素等杀菌剂的残留会影响酒精废液的资源化利用，本发明酒精发酵所用杀菌剂原料盐霉素工业盐和盐霉素预混剂，是可以用于饲料工业的抗生素，酒精废液浓缩制取生物饲料，对人和动物都具有很高的安全性。

(3)在本发明的酒精发酵方法中，杀菌剂添加4小时后发酵罐内细菌减少，挥发酸降低到0.015以下，酵母数升高到1.5亿/mL以上，发酵含酒份提高提高到11％(v/v)以上。

附图说明

图1为抑菌圈法测定盐霉素对乳酸杆菌的抑制作用的实验结果图；其中，A为未添加盐霉素，B为添加了盐霉素。

图2为抑菌圈法测定盐霉素对醋酸杆菌的抑制作用的实验结果图；其中，A为未添加盐霉素，B为添加了盐霉素。

图3为实施例2中盐霉素杀菌剂用于糖蜜发酵和传统杀菌剂酒精含量对比图。

图4为实施2中盐霉素杀菌剂用于糖蜜发酵和传统杀菌剂挥发酸对比图。

图5为实施例3中盐霉素杀菌剂用于木薯发酵和传统杀菌剂酒精含量对比图。

图6为实施例3中盐霉素杀菌剂用于木薯发酵和传统杀菌剂挥发酸对比图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。可用于本发明的酒精发酵原料没有特别限制，可以是任何淀粉质和/或糖质原料，尤其是目前乙醇生产常用的原料。在本发明的优选方式中，所述淀粉质原料有谷物和薯类原料，如玉米、木薯和甘薯；所述的糖质原料包括甘蔗、甜菜、甜高粱和糖蜜等。

实施例1

盐霉素对酒精发酵常见杂菌抑制作用的研究：

酒精分解过程中，发酵液污染菌时有发生，杂菌以细菌为主，主要包括乳酸菌和醋酸菌。这些杂菌代谢不但会消耗糖分，造成糖分的损失，而且还会产生代谢产物乳酸和醋酸等有机酸，有机酸会进一步抑制酵母繁殖，减少酒精产率；醋酸菌还会将酒精连续转变为醋酸，造成酒精含量下降。下面通过抑菌试验研究盐霉素对酒精发酵液中乳酸杆菌和醋酸杆菌的抑菌作用。

1、实验材料：盐霉素(盐霉素含量24％)(山东齐发药业有限公司)：乳酸杆菌ATCC8014(G⁺)：醋酸杆菌ATCC15973(G^-)(广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院微生物检测培养室保藏)。乳酸菌培养基(MRS)，MRS琼脂培养基，醋酸菌基础培养基(YG)，醋酸菌琼脂培养基(YGC)

乳酸菌培养基(MRS)：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。

MRS琼脂培养基：在MRS培养基中加入MRS培养基质量18％的琼脂。

醋酸菌基础培养基(YG)：1％酵母提取粉，1％葡萄糖，0.1MPa 121℃灭菌20min，待培养基冷却至50～60℃，加入2％无水乙醇。

醋酸菌平板计数培养基(YGC)：1％酵母膏，1％葡萄糖，1.5％CaCO₃，1.5％琼脂，0.1MPa 121℃灭菌20min，待培养基冷却至50～60℃，加入2％无水乙醇。

实验仪器：生化培养箱，超净工作台、接种环、酒精灯、多点接种器，打孔器。

2、实验方法：

2.1最低抑菌浓度(MIC)的测定

(1)将乳酸杆菌(G⁺)：乳酸杆菌在无菌条件下接种于MRS斜面试管中进行37℃活化培养24h，然后接种到MRS液体试管中(每管约15mL)，在37℃条件下培养24h。采用平板计数法，将液体试管乳酸菌分别稀释至1×10⁶CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁴CFU/mL以备使用。

(2)将醋酸杆菌(G-)：醋酸杆菌在无菌条件下接种于YGC斜面试管中进行30℃活化培养48h，斜面试管中勾取一环单菌落到准备好的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，随后将装有YG液体培养基的摇瓶放置于30℃恒温摇床中培育48h，制成菌悬液原液。采用平板计数法，将醋酸菌原液稀释至1×10⁶CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁴CFU/mL以备使用。

(3)准确称取0.2g盐霉素，用无菌水稀释成并定容到1000mL，配制成浓度为200μg/mL的盐霉素抑菌溶液备用。用无菌水将盐霉素溶液抑菌分别稀释为0、20、40、60、80、100、120μg/mL盐霉素浓度梯度。

(4)将步骤(3)配制的不同浓度盐霉素溶液分别按体积比1∶9的比例，加入到已加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的MRS琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm。使平板中盐霉素浓度分别为0、2、4、6、8、10、12μg/mL。用多点接种器吸取步骤(1)制备好的乳酸杆菌悬(约1～2μL)，分别接种于在含不同浓度盐霉素的琼脂平板表面，每点菌数约为10⁴CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。37℃恒温培养48h。将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，最低抑菌浓度如表1。

(5)将步骤(3)配制的不同浓度盐霉素分别按体积比1∶9比例，加入到已加热溶解，并在45～50℃水浴中平衡的YGC琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3～4mm。使平板中盐霉素浓度分别为0、2、4、6、8、10、12μg/mL。用多点接种器吸取步骤(2)制备好的醋酸杆菌悬液(约1～2μL)，分别接种于在含不同浓度盐霉素的琼脂板表面，每点菌数约为10⁴CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。30℃恒温培养48h。将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，最低抑菌浓度如表1。

表1盐霉素对乳酸杆菌和醋酸杆菌的最小抑菌浓度测定

从表1所示结果可以看出，盐霉素在一定浓度范围内能有效抑菌，盐霉素对于乳酸杆菌的MIC≥5μg/mL，对于醋酸杆菌的最低抑菌浓度MIC≥8μg/mL。

2.2抑菌圈法

(1)将MRS琼脂培养基灭菌后，冷却至45～50℃，注入约培养基质量10％的乳酸菌悬液(浓度为1×10⁶CFU/mL)，混合均匀，倾注平板(约20mL/平板)，水平静置凝固后备用。

(2)用已经灭好菌的打孔器在MRS琼脂平板的培养基上打出直径为6.0mm的孔，每个平板打3个孔，用移液枪取0.1mL的盐霉素(10μg/mL)提取液注入孔中，在37℃培养箱中培养24h后，取出观察细菌生长情况，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。同时做空白实验对比。抑菌圈如图1，抑菌圈直径如表2。

(3)将YGC琼脂培养基灭菌后，冷却至45～50℃，注入约培养基质量10％的醋酸菌悬液(浓度为1×10⁶CFU/mL)，混合均匀，倾注平板(约20mL/平板)，水平静置凝固后备用。

(4)用已经灭好菌的打孔器在YGC琼脂平板的培养基上打出直径为6.0mm的孔，每个平板打3个孔，用移液枪取0.1mL的盐霉素(10μg/mL)提取液注入孔中，在37℃培养箱中培养24h后，取出观察细菌生长情况，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。同时做空白实验对比。抑菌圈如图2，抑菌圈直径如表2。

表2盐霉素对乳酸菌和醋酸菌的抑菌圈测定

从图1和图2可以看出，与空白样对比，盐霉素能显著抑制乳酸杆菌和醋酸杆菌的生长繁殖，从表2可以看出，盐霉素对乳酸杆菌抑菌圈平均直径为11.76mm，对醋酸杆菌抑菌圈平均直径为9.36mm，都明显大于空白样6mm的孔径，抑菌效果明显。

综上所述，盐霉素不仅能够显著抑制革兰氏阳性菌(乳酸杆菌)生长，能够明显抑制革兰氏阴性菌(醋酸杆菌)，不易产生耐药性和交叉抗药性。盐霉素主要用于动物词料中作为饲料添加剂使用，主要用于预防鸡球虫病，不作为人类抗菌药。上述实验结果提示了盐霉素作为酒精发酵杀菌剂的可能性。

实施例2

(1)酒精发酵盐霉素杀菌剂配制：分别称取盐霉素工业盐(盐霉素含量45％)4g，盐霉素预混剂(盐霉素含量12％)6g，称取上述配制好的杀菌剂1g放1000mL的容量瓶中，加无菌水充分溶解后，定容备用。

(2)糖蜜发酵酒精：取80Bx甘蔗糖蜜用自来水稀释，配制成500mL 20Bx糖蜜溶液，添加0.2wt％尿素，接种0.5wt％酿酒活性干酵母(英联马利)，加入步骤(1)配制定容的杀菌剂溶液4mL，混合均匀后，恒温31℃发酵48h后，检测发酵液的酒精度和挥发酸，实验重复三次。

(3)传统杀菌剂的酒精发酵抑菌对比：80Bx甘蔗糖蜜用自来水稀释，配制成500mL20Bx糖蜜溶液，添加0.2wt％尿素，接种0.5wt％酿酒活性干酵母，用浓硫酸调节pH值至3.8，混合均匀后，恒温31℃发酵48h后，检测发酵液的酒精度和挥发酸，实验重复三次。

结果：从表3、图3、图4所示结果可以看出，在糖蜜酒精发酵中，与传统硫酸抑菌相比较，采用本发明盐霉素杀菌剂抑菌酒精含量明显提高，挥发酸明显降低，感染产酸细菌明显减少，本发明盐霉素杀菌剂抑菌效果优于浓硫酸抑菌。

表3糖蜜发酵酒精中本发明盐霉素杀菌剂与传统杀菌剂比较

实施例3

(1)酒精发酵盐霉素杀菌剂配制：分别称取盐霉素工业盐(盐霉素含量45％)0.4g，盐霉素预混剂(盐霉素含量12％)0.6g，放入1000mL的容量瓶中，加无菌水充分溶解后，定容备用。

(2)木薯发酵酒精：称取木薯粉200g用500mL自来水溶解，加入高温型α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖水解酶)150U/g搅拌均匀配成淀粉浆，缓慢加热至100℃糊化30min，降温至95℃，保温不断搅拌液化60～120min，至碘反应不显蓝色，即制成液化液。液化液降温至60～65℃，用浓硫酸调节pH值4.2～4.5，加入糖化酶100U/g糖化30min，即制成糖化液。糖化液降温至31℃，添加0.2wt％尿素，接种0.5wt％酿酒活性干酵母，加入步骤(1)配制的杀菌剂溶液7mL，混合均匀后，恒温31℃发酵48h后，检测发酵液的酒精度和挥发酸。实验重复三次。

(3)传统杀菌剂的酒精发酵抑菌对比：称取木薯粉200g用500mL自来水溶解，加入高温型α-淀粉酶150U/g搅拌均匀配成淀粉浆，缓慢加热至100℃糊化30min，降温至95℃，保温不断搅拌液化60～120分钟，至碘反应不显蓝色，即制成液化液。液化液降温至60～65℃，用浓硫酸调节pH值4.2～4.5，加入糖化酶100U/g糖化30min，即制成液化液。糖化液降温至31℃，添加0.2wt％尿素，接种0.5wt％酿酒活性干酵母，加入加青霉素钾5ppm，混合均匀后，恒温31℃发酵48h后，检测发酵液的酒精度度和挥发酸，实验重复三次。数据对比如表5。

结果：从表4、图5、图6所示结果可以看出，在木薯酒精发酵中，与传统硫酸和青霉素抑菌相比较，采用本发明盐霉素杀菌剂抑菌酒精含量明显提高，挥发酸明显降低，感染产酸细菌明显减少，本发明盐霉素杀菌剂抑菌效果优于浓硫酸和青霉素等抑菌。

表4木薯发酵酒精中本发明盐霉素杀菌剂与传统杀菌剂比较

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.盐霉素在制备杀菌剂中的应用，其特征在于：所述盐霉素作为唯一活性物质，所述菌为醋酸杆菌。

2.盐霉素在制备杀菌剂中的应用，其特征在于：所述盐霉素作为唯一活性物质，所述菌为醋酸杆菌和乳酸杆菌。

3.根据权利要求1所述的盐霉素在制备杀菌剂中的应用，其特征在于：

所述盐霉素对醋酸杆菌的最小抑菌浓度为8 μg/mL。

4.根据权利要求2所述的盐霉素在制备杀菌剂中的应用，其特征在于：

所述盐霉素对醋酸杆菌的最小抑菌浓度为8 μg/mL，所述盐霉素对乳酸杆菌的最小抑菌浓度为5 μg/mL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的盐霉素在制备杀菌剂中的应用，其特征在于：

所述杀菌剂还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。

6.一种酒精发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、将糖质原料用水稀释至20～40 Bx，得到糖质溶液；或将淀粉质原料依次进行糊化，液化，糖化，得到糖化液；

S2、取S1所得糖质溶液或糖化液，添加0.1～0.3wt %尿素，接种0.4～0.6wt %酿酒活性干酵母；将盐霉素和/或盐霉素预混剂用30～35℃的无菌水充分溶解，以盐霉素计，按发酵液量的1～10 ppm添加到发酵液中，混合均匀，30～35℃发酵40～50 h，即获得目标产物；

S1中所述糖质原料为糖蜜，所述淀粉质原料为木薯；

S2中所述尿素的添加量为0.2 wt %，酿酒活性干酵母的添加量为0.5 wt %；

S2中所述发酵的条件为31℃发酵48 h。

7.根据权利要求书6所述的酒精发酵方法，其特征在于：

S1中所述糖化液的制备过程为：取淀粉质原料用2～5倍体积水溶解，加入高温型α-淀粉酶100～150U/g，搅拌均匀配成淀粉浆，缓慢加热至98～102℃糊化25～35 min；降温至90～95℃，保温不断搅拌液化60～120 min，至碘反应不显蓝色，即制成液化液；液化液降温至60～65℃，用浓硫酸调节pH值4.2～4.5，加入糖化酶100～150 U/g糖化25～35 min，即制成糖化液。