CN114195877A - 一种重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组合成宠物饲料蛋白技术领域，且公开了一种重组合成宠物饲料蛋白，所述重组合成宠物饲料蛋白序列如SEQ ID1 16.2所示，所述重组合成宠物饲料蛋白的肽链片段序列如SEQ ID2 24.5所示。该重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，将蛋白加入到宠物饲料加工过程中代替肉类，使得宠物食品的蛋白质成分将具有高达50％的蛋白质水平、7％的脂肪水平和35％的碳水化合物，满足狗和猫的生长和繁殖主要膳食类别的最低蛋白质要求，能够创建氨基酸谱(亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等)以及来自酵母的强烈鲜味，通过从内到外提高宠物食品的适口性食物矩阵，与市场上大多数颗粒或粗磨产品的表面消化风味涂层相比，这种独特的完全集成的风味系统将使宠物食品对宠物更具吸引力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞重组饲料技术领域，具体为一种重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺。
背景技术
细胞肌肉蛋白是一种合成生物学实验技术，是指将蛋白的遗传基因植入微生物宿主来合成跟靶蛋白性状相似的合成蛋白技术。
现有宠物饲料主要依赖传统肉类行业来提供蛋白原料，传统肉类行业既是资源密集型的，又对环境不友好，此外，它使用了近三分之一的农业可用淡水，将富含氮和磷的有机物排放到水道中，导致藻华，利用了全球生产的70％的医用抗生素，导致耐药菌株，预计到2050年肉类消费量将增加近50％，现有的畜牧业实践无法继续以可持续的方式满足市场需求，故而我们提出一种细胞重组合成蛋白及生产工艺来解决上述问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，具备植物合成饲料、高蛋白和无公害等优点，解决了现有技术中采用内类生产宠物饲料对环境和生态造成危害，肉类消费量急剧增加，现有的畜牧业实践无法继续以可持续的方式满足市场需求的问题。
(二)技术方案
为实现上述植物合成饲料、高蛋白和无公害目的，本发明提供如下技术方案：重组合成宠物饲料蛋白，所述重组合成宠物饲料蛋白的肌肉蛋白序列如SEQ ID1 16.2所示，所述重组合成宠物饲料蛋白的肽链片段序列如SEQ ID224.5所示。
优选的，所述重组合成宠物饲料蛋白的分子量如SEQ ID3 20.7和SEQ ID442.2KDa所示，所述肽链片通过NdeI和HindIII亚克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上。
优选的，所述重组合成宠物饲料蛋白生产的宿主为枯草芽孢杆菌7024E细胞，所述重组合成宠物饲料蛋白产生合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5μg/ml四环素的LB培养基中37℃摇床200转震荡培养。
优选的，所述光密度达到0.6-0.8后通过添加木糖诱导，培养过程中的温度控制为25-37℃培养。
一种重组合成宠物饲料蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
1)NdeI内切酶和HindIII限制性内切酶将肌肉蛋白克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上；
2)转化枯草芽孢杆菌为7024E细胞，转换之后将合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5-14μg/ml四环素的LB培养基中30-37℃温度下摇床以150-200转震荡速度培养；
3)当培养皿中OD达到0.6-0.8后通过添加2-5％木糖诱导，然后在25-37℃的温度下培养至细胞离心沉淀；
4)细胞离心沉淀以后用超声波裂解破壁，溶剂为50mMTris，酸碱度为6-7.5，从而形成可溶性肌肉蛋白。
优选的，所述步骤二中枯草芽孢杆菌穿梭载体通过向反应皿内加入枯草芽孢杆菌形成载体。
优选的，所述步骤三中采用四环素的LB培养基时一般采用15ml-20ml倒一个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟，用封口胶封边，并倒置放于4℃保存。
优选的，所述步骤四中细胞离心沉淀过程中将液体沉淀8-10h后取出，将标本离心浓缩后得到可溶性肌肉蛋白，用肌肉蛋白代替肉类进行宠物饲料加工。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，具备以下有益效果：
1、该重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，通过采用重组合成宠物饲料蛋白的防止合成蛋白，将蛋白加入到宠物饲料加工过程中代替肉类，使得宠物食品的蛋白质成分将具有高达50％的蛋白质水平、7％的脂肪水平和35％的碳水化合物，蛋白质成分将满足狗和猫的生长和繁殖主要膳食类别的最低蛋白质要求，最终产品的蛋白质要求范围为18-30％，因此，蛋白质成分可以成为领先的蛋白质供应商，使用率为25-40％，为各种主餐宠物食品设计，不受限制地满足不同生命阶段的营养需求，蛋白质原料的适口性和消化率将大大优于使用的传统肉类原料，如家禽副产品粉、牛肉和骨粉，其消化率约为75-85％，我们的蛋白质成分将是低过敏性消化率等级，这意味着超过99.5％的消化率，此外，由于通过精确发酵过程产生的游离氨基酸和肽，我们将能够创建氨基酸谱(亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等)以及来自酵母的强烈鲜味，通过从内到外提高宠物食品的适口性食物矩阵，与市场上大多数颗粒或粗磨产品的表面消化风味涂层相比，这种独特的完全集成的风味系统将使宠物食品对宠物更具吸引力。
2、该重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，由通过蛋白质成分制成的宠物食品具有卓越的适口性和消化率，可与大多数优质宠物食品和品牌竞争，以及所有优质天然、健康和无残忍的宠物食品，宠物食品的价格为每磅2美元至4美元不等，使用我们的成分的宠物食品价格为3美元/磅，全球TAM为96B，天然宠物食品销售的SAM为28B，蛋白质成分通过酵母发酵预计为每磅1.2美元，比这些现有优质宠物食品品牌中使用的牛肉、羊肉和野生鱼便宜得多，蛋白质成分是宠物食品的主要成本，其他成分如碳水化合物和脂肪来源要便宜得多。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：一种重组合成宠物饲料蛋白，所述重组合成宠物饲料蛋白的肌肉蛋白序列如SEQ ID1 16.2所示，所述重组合成宠物饲料蛋白的肽链片段序列如SEQ ID2 24.5所示。
重组合成宠物饲料蛋白的分子量如SEQ ID3 20.7和SEQ ID4 42.2KDa所示，所述肽链片通过NdeI和HindIII亚克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上，HindIII限制性内切酶2％，枯草芽孢杆菌2％，重组合成宠物饲料蛋白生产的宿主为枯草芽孢杆菌7024E细胞，重组合成宠物饲料蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5μg/ml四环素的LB培养基中37℃摇床200转震荡培养，单克隆菌落3％和木糖2％，光密度达到0.6后通过添加木糖诱导，培养过程中的温度控制为25℃培养，通过采用细胞重组的防止合成蛋白，将蛋白加入到宠物饲料加工过程中代替肉类，使得宠物食品的蛋白质成分将具有高达50％的蛋白质水平、7％的脂肪水平和35％的碳水化合物，蛋白质成分将满足狗和猫的生长和繁殖主要膳食类别的最低蛋白质要求，最终产品的蛋白质要求范围为18-30％，因此，蛋白质成分可以成为领先的蛋白质供应商，使用率为25-40％，为各种主餐宠物食品设计，不受限制地满足不同生命阶段的营养需求，蛋白质原料的适口性和消化率将大大优于使用的传统肉类原料，如家禽副产品粉、牛肉和骨粉，其消化率约为75-85％，我们的蛋白质成分将是低过敏性消化率等级，这意味着超过99.5％的消化率，此外，由于通过精确发酵过程产生的游离氨基酸和肽，我们将能够创建氨基酸谱(亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等)以及来自酵母的强烈鲜味，通过从内到外提高宠物食品的适口性食物矩阵，与市场上大多数颗粒或粗磨产品的表面消化风味涂层相比，这种独特的完全集成的风味系统将使宠物食品对宠物更具吸引力。
一种重组合成宠物饲料蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
1)deI内切酶和HindIII限制性内切酶将肌肉蛋白克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上，步骤二中枯草芽孢杆菌穿梭载体通过向反应皿内加入枯草芽孢杆菌形成载体；
2)转化枯草芽孢杆菌为7024E细胞，转换之后将合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5-14μg/ml四环素的LB培养基中30℃温度下摇床以150转震荡速度培养，步骤三中采用四环素的LB培养基时一般采用15ml倒一个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10分钟，用封口胶封边，并倒置放于4℃保存；
3)当培养皿中OD达到0.6后通过添加2％木糖诱导，然后在25℃的温度下培养至细胞离心沉淀；
4)细胞离心沉淀以后用超声波裂解破壁，溶剂为50mMTris，酸碱度为6，从而形成可溶性肌肉蛋白。
实施例二：一种细胞重组合成蛋白，所述细胞合成蛋白的肌肉蛋白序列如SEQ ID116.2所示，所述细胞合成蛋白的肽链片段序列如SEQ ID2 24.5所示。
重组合成宠物饲料蛋白的分子量如SEQ ID3 20.7和SEQ ID4 42.2KDa所示，所述肽链片通过NdeI和HindIII亚克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上，HindIII限制性内切酶4％，枯草芽孢杆菌23％，合成蛋白生产的宿主为枯草芽孢杆菌7024E细胞，合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5μg/ml四环素的LB培养基中37℃摇床200转震荡培养，单克隆菌落5％和木糖2-5％，光密度达到0.8后通过添加木糖诱导，培养过程中的温度控制为37℃培养，通过采用细胞重组的防止合成蛋白，将蛋白加入到宠物饲料加工过程中代替肉类，使得宠物食品的蛋白质成分将具有高达50％的蛋白质水平、7％的脂肪水平和35％的碳水化合物，蛋白质成分将满足狗和猫的生长和繁殖主要膳食类别的最低蛋白质要求，最终产品的蛋白质要求范围为18-30％，因此，蛋白质成分可以成为领先的蛋白质供应商，使用率为25-40％，为各种主餐宠物食品设计，不受限制地满足不同生命阶段的营养需求，蛋白质原料的适口性和消化率将大大优于使用的传统肉类原料，如家禽副产品粉、牛肉和骨粉，其消化率约为75-85％，我们的蛋白质成分将是低过敏性消化率等级，这意味着超过99.5％的消化率，此外，由于通过精确发酵过程产生的游离氨基酸和肽，我们将能够创建氨基酸谱(亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等)以及来自酵母的强烈鲜味，通过从内到外提高宠物食品的适口性食物矩阵，与市场上大多数颗粒或粗磨产品的表面消化风味涂层相比，这种独特的完全集成的风味系统将使宠物食品对宠物更具吸引力。
一种重组合成宠物饲料蛋白的生产工艺，包括以下步骤：
1)NdeI内切酶和HindIII限制性内切酶将肌肉蛋白克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上，步骤二中枯草芽孢杆菌穿梭载体通过向反应皿内加入枯草芽孢杆菌形成载体；
2)转化枯草芽孢杆菌为7024E细胞，转换之后将合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5-14μg/ml四环素的LB培养基中37℃温度下摇床以200转震荡速度培养，步骤三中采用四环素的LB培养基时一般采用20ml倒一个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照15分钟，用封口胶封边，并倒置放于4℃保存；
3)当培养皿中OD达到0.8后通过添加5％木糖诱导，然后在37℃的温度下培养至细胞离心沉淀；
4)细胞离心沉淀以后用超声波裂解破壁，溶剂为50mMTris，酸碱度为7.5，从而形成可溶性肌肉蛋白。
NdeI内切酶为限制性内切酶识别5'-CA↑TATG-3'的酶切位点，并在缓冲液O中具有最佳活性，对某些DNA制剂中存在的杂质敏感，例如，通过标准小量制备程序纯化的DNA以低速率被切割，为了获得100％的活性，应将BSA加入到1X反应混合物中至最终浓度为100μg/ml，使用BSA时不要长时间孵育。
需要说明的是HindIII对dam、dcm和哺乳动物CpG甲基化均不敏感，HindIII在延时酶切条件下可能出现星号活性，HindIII在某些超螺旋质粒上的活性不如预期，可适当增加酶用量。
SEQ ID1:GgACT138序列：
MCDEDETTALVCDNGSGLVKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIHHHHHH
SEQ ID2:GgACT139-351序列：
MQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRLDLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNVMSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLHHHHHH
SEQ ID3:GgACT1-180序列：
MCDEDETTALVCDNGSGLVKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVP IYEGYALPHAIMRLHHHHHH
SEQ ID4:Rabbit Titin Iband
MPPFFDLKPVSVDLALGESGTFKCHVTGTAPIKITWAKDNREIRPGGNYKMTLVENTATLTVLKVTKGDAGQYTCYASNVAGKDSCSAQLGVQEPPRFIKKLEPSRIVKQDEHTRYECKIGGSPEIKVLWYKDETEIQESSKFRMSFVESVAVLEMYNLSVEDSGDYTCEAHNAAGSASSSTSLKVKEPPVFRKKPHPVETLKGADVHLECELQGTPPFQVSWHKDKRELRSGKKYKIMSENFLTSIHILNVDSADIGEYQCKASNDVGSDTCVGSITLKAPPRFVKKLSDISTVVGEEVQLQATIEGAEPISVAWFKDKGEIVRESDNIWISYSENIATLQFSRAEPANAGKYTCQIKNEAGTQECFATLSVLEHHHHHH
本发明的有益效果是：该重组合成宠物饲料蛋白及生产工艺，通过采用细胞重组的防止合成蛋白，将蛋白加入到宠物饲料加工过程中代替肉类，使得宠物食品的蛋白质成分将具有高达50％的蛋白质水平、7％的脂肪水平和35％的碳水化合物，蛋白质成分将满足狗和猫的生长和繁殖主要膳食类别的最低蛋白质要求，最终产品的蛋白质要求范围为18-30％，因此，蛋白质成分可以成为领先的蛋白质供应商，使用率为25-40％，为各种主餐宠物食品设计，不受限制地满足不同生命阶段的营养需求，蛋白质原料的适口性和消化率将大大优于使用的传统肉类原料，如家禽副产品粉、牛肉和骨粉，其消化率约为75-85％，我们的蛋白质成分将是低过敏性消化率等级，这意味着超过99.5％的消化率，此外，由于通过精确发酵过程产生的游离氨基酸和肽，我们将能够创建氨基酸谱(亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等)以及来自酵母的强烈鲜味，通过从内到外提高宠物食品的适口性食物矩阵，与市场上大多数颗粒或粗磨产品的表面消化风味涂层相比，这种独特的完全集成的风味系统将使宠物食品对宠物更具吸引力。
进一步，由通过蛋白质成分制成的宠物食品具有卓越的适口性和消化率，可与大多数优质宠物食品和品牌竞争，以及所有优质天然、健康和无残忍的宠物食品，宠物食品的价格为每磅2美元至4美元不等，使用我们的成分的宠物食品价格为3美元/磅，全球TAM为96B，天然宠物食品销售的SAM为28B，蛋白质成分通过酵母发酵预计为每磅1.2美元，比这些现有优质宠物食品品牌中使用的牛肉、羊肉和野生鱼便宜得多，蛋白质成分是宠物食品的主要成本，其他成分如碳水化合物和脂肪来源要便宜得多。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述重组合成宠物饲料蛋白的肌肉蛋白序列如SEQ ID1 16.2所示，所述细胞合成蛋白的肽链片段序列如SEQ ID2 24.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述重组合成宠物饲料蛋白的分子量如SEQ ID3 20.7和SEQ ID4 42.2KDa所示，所述肽链片通过NdeI和HindIII亚克隆到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上。
3.根据权利要求1所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述重组合成宠物饲料蛋白的宿主为枯草芽孢杆菌7024E细胞，所述重组合成宠物饲料蛋白产生合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5μg/ml四环素的LB培养基中37℃摇床200转震荡培养。
4.根据权利要求1所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述光密度达到0.6-0.8后通过添加木糖诱导，培养过程中的温度控制为25-37℃培养。
5.根据权利要求1所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，生产过程包括以下重量份数配比的原料：NdeI内切酶0.1-10ppm、HindIII限制性内切酶0.1-10ppm、枯草芽孢杆菌0.1-2％、和木糖2％。
6.一种重组合成宠物饲料蛋白的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)NdeI内切酶和HindIII限制性内切酶克隆肌肉蛋白到枯草芽孢杆菌穿梭载体pT7M上；
2)转化枯草芽孢杆菌为7024E细胞，转换之后将合成蛋白产生单克隆菌落接种后在12.5-14μg/ml四环素的LB培养基中30-37℃温度下摇床以150-200转震荡速度培养；
3)当培养皿中OD达到0.6-0.8后通过添加2-5％木糖诱导，然后在25-37℃的温度下培养至细胞离心沉淀；
4)细胞离心沉淀以后用超声波裂解破壁，溶剂为50mMTris，酸碱度为6-7.5，从而形成可溶性肌肉蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述步骤二中枯草芽孢杆菌穿梭载体通过向反应皿内加入枯草芽孢杆菌形成载体。
8.根据权利要求6所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述步骤三中采用四环素的LB培养基时一般采用15ml-20ml倒一个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟，用封口胶封边，并倒置放于4℃保存。
9.根据权利要求6所述的一种重组合成宠物饲料蛋白，其特征在于，所述步骤四中细胞离心沉淀过程中将液体沉淀8-10h后取出，将标本离心浓缩后得到可溶性肌肉蛋白，用肌肉蛋白代替肉类进行宠物饲料加工。
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