CN114181911A - 一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为单克隆细胞株PRM，于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22341。本发明的杂交瘤细胞株可以高效且稳定地分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体，为动物源食品与化妆品中螺内酯及其代谢物残留量的检测提供有力的检测方法与手段，具有较好的灵敏度和特异性。

Description

一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其 应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

螺内酯又名安体舒通，是由美国辉瑞公司研发的盐皮质类固醇拮抗剂。螺内酯化学结构与醛固酮相似，是临床最早使用的醛固酮受体拮抗药，可竞争性的与胞浆中的醛固酮受体结合，拮抗醛固酮的排钾保钠作用，促进水的排出，减少K⁺的分泌。由于此药利尿作用与体内醛固酮水平有关，属于保钾利尿药。临床在高血压的治疗中常与咪嗦类利尿药联合应用预防低血钾。螺内酯在人体内血药浓度低，代谢速度快，进入体内后由肝脏代谢为坎利酮。目前，利尿剂会被当成兽药添加到饲料，用于治疗牛乳房炎，或者改善禽蛋蛋白比例等。但一些不法分子会用利尿剂来掩盖其他违禁药物的使用，通过利尿剂，以达到违禁药物在尿液中浓度降低并尽快排出体外的目的，从而通过药检等。同时，一些不法商家为获得短期内促进毛发生长的作用，在育发类化妆品中添加螺内酯等化学药物，消费者在不知情的情况下长期使用，会导致激素依赖性皮炎，也会通过皮肤吸收引起全身的副作用，导致免疫功能下降，代谢紊乱，甚至具有致癌风险。我国《化妆品安全技术规范》(2015 年版)和欧盟化妆品法规(EC)No.1223/2009均规定此类化学药物禁用于化妆品。

螺内酯及其代谢物含量分析方法有液质联用(LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的螺内酯及其代谢物检测方法具有重要意义。酶联免疫法 (ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为螺内酯及其代谢物检测提供了一种新的检测途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法，并应用该菌株及其产生的单克隆抗体进行螺内酯及其代谢物的检测。

本发明的第一个目的是提供一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为单克隆细胞株PRM，于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.22341。

进一步地，上述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1：将螺内酯及其代谢物免疫原制备成弗氏佐剂，后将弗氏佐剂注射入免疫动物体内；首次免疫采用完全弗氏佐剂，多次加强免疫采用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫采用螺内酯及其代谢物免疫原；

其中，螺内酯及其代谢物免疫原由坎利酮半抗原制备得到，坎利酮半抗原的结构如式I所示；

S2：对经过上述免疫过程的免疫动物进行采血，检测免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中螺内酯及其代谢物抗体含量高的免疫动物；

S3：将步骤S2中筛选得到的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合并进行培养，检测阳性细胞孔并测定阳性细胞孔的抑制效果，对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行亚克隆，得到分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

进一步地，使用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基碳二亚胺盐酸盐活化螺内酯及其代谢物半抗原。

进一步地，首次免疫与加强免疫之间间隔28-30天，加强免疫之间间隔 20-22天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18-21天。

进一步地，首次免疫的剂量为95-105μg/30g体重，加强免疫的剂量为 45-55μg/30g体重，冲刺免疫的剂量为20-30μg/30g体重。

进一步地，在步骤S1中，弗氏佐剂通过背部皮下注射入免疫动物体内。

进一步地，在步骤S1中，螺内酯及其代谢物免疫原由坎利酮半抗原活化后与牛血清蛋白偶联得到。

进一步地，在步骤S3中，冲刺免疫结束3天后进行细胞融合。

进一步地，在步骤S3中，融合的细胞在RPMI-1640培养基上进行培养。

本发明的第二个目的是提供一种螺内酯及其代谢物单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.22341的杂交瘤细胞株分泌得到。

进一步地，向免疫动物腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为 CGMCC No.22341的杂交瘤细胞株，注射后收集腹水，将腹水纯化，得到上述螺内酯及其代谢物单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供上述杂交瘤细胞株或螺内酯及其代谢物单克隆抗体在检测螺内酯及其代谢物中的应用，尤其是应用于食品、化妆品或药品安全监测中螺内酯及其代谢物残留的分析检测，如制备成螺内酯及其代谢物的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条。

进一步地，代谢物包括坎利酮、睾酮、孕酮、宝丹酮、丙酸睾丸素、去氢雄酮、双氟米松和氢化可的松等。

一种包括上述杂交瘤细胞株和/或螺内酯及其代谢物单克隆抗体的螺内酯及其代谢物检测试剂盒。

进一步地，螺内酯及其代谢物检测试剂盒中还包括螺内酯及其代谢物包被原，螺内酯及其代谢物包被原由螺内酯半抗原活化后与鸡卵白蛋白偶联得到，螺内酯半抗原的结构如式II所示；

进一步地，螺内酯及其代谢物半抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)将螺内酯或坎利酮与2-(氨基氧基)乙酸(CMO)溶于DMF(N,N- 二甲基甲酰胺)中，50-80℃水浴加热5-10h，除去有机溶剂，得到黄色沉淀；

(2)用去离子水与1M HCl交替洗涤，加入乙醇重结晶，得到淡黄色或白色针状晶体，得到螺内酯及其代谢物的半抗原Spi-COOH(螺内酯半抗原)或Can-COOH(坎利酮半抗原)。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供的杂交瘤细胞株可以高效且稳定地分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体，该单克隆抗体对螺内酯及其代谢物具有较好的特异性(对螺内酯及其代谢物类似物交叉率小于2.2％)和检测灵敏度(螺内酯IC₅₀值为0.23 ng/mL，坎利酮IC₅₀值为0.18ng/mL)，可实现对动物源食品、化妆品或药品中螺内酯及其代谢物残留量的检测，具有实际应用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

生物材料保藏

单克隆细胞株PRM，所述单克隆细胞株PRM已于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.22341，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明的螺内酯及其代谢物单克隆抗体对螺内酯的抑制标准曲线；

图2为本发明的螺内酯及其代谢物单克隆抗体对坎利酮的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、 L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B12 0.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5 mL的Tween–20；

PBST：含0.05％Tween–20的PBS；

抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄ ^.12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1： 5混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

螺内酯及其代谢物抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.03，0.1， 0.3和1μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.03，0.1，0.3和1μg/mL。选择最佳工作点后，将螺内酯及其代谢物标准品稀释0，0.04，0.12，0.37， 1.11,3.33，10和30ng/mL等浓度，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro 8.5做图，获得螺内酯及其代谢物标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1螺内酯及其代谢物半抗原的合成

将1g螺内酯(或坎利酮)与3g CMO溶于10mL DMF中，60℃水浴加热8h。减压旋蒸去除有机溶剂，得到黄色沉淀。用去离子水与1M HCl 洗涤三次，加入乙醇重结晶，得到淡黄色或白色针状晶体，即螺内酯及其代谢物的半抗原Spi-COOH(或Can-COOH)。

反应方程式如下所示：

实施例2螺内酯及其代谢物完全抗原的合成

(1)免疫原螺内酯及其代谢物-BSA的制备：称取3.4mg已制备的 Can-COOH，溶于200μL DMF中，搅拌下依次加入4.6mg N-羟基琥珀酰亚胺和7.7mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称为A液；然后称取10mg牛血清蛋白BSA溶于2mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12h，用0.01mol/L磷酸缓冲液 PBS透析3d，即得偶联物螺内酯及其代谢物-BSA，-20℃冻存备用；

(2)包被原螺内酯及其代谢物-OVA的制备：称取1.7mg以制备的 Spi-COOH，溶于200μL DMF中，搅拌下依次加入2.3mg N-羟基琥珀酰亚胺和3.4mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4h，得到的混合物称为A液；然后称取10mg鸡卵清蛋白OVA溶于2mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12h，用0.01mol/L磷酸缓冲液 PBS透析3d，即得偶联物螺内酯及其代谢物-OVA，-20℃冻存备用。

实施例3分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1、小鼠的免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取螺内酯及其代谢物完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21 天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

2、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

(1)摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

(2)收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1～4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

(3)融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640 培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第 7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT 的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃， 5％CO2培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行 RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT 的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用螺内酯及其代谢物为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对螺内酯及其代谢物标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株。

实施例4螺内酯及其代谢物单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

灵敏度检测：使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对螺内酯IC₅₀值为0.23ng/mL，坎利酮IC₅₀值为0.18ng/mL。

特异性检测：交叉率＝(螺内酯及其代谢物的IC₅₀/类似物的IC₅₀)×100％，螺内酯及其代谢物类似物的IC₅₀值及交叉率见下表。

表1螺内酯及其代谢物类似物的IC₅₀值

实施例5螺内酯及其代谢物单克隆抗体的应用

将上述杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于螺内酯及其代谢物的添加回收试验，具体步骤如下：

(1)包被：将包被原螺内酯及其代谢物-OVA用0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100 μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG， 100μL/孔，37℃反应30min。

(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.

(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体对螺内酯IC₅₀值为0.23ng/mL，坎利酮IC₅₀值为0.18ng/mL，说明对螺内酯及其代谢物有很好的灵敏度，可用于螺内酯及其代谢物免疫分析检测。

螺内酯及其代谢物单克隆抗体对螺内酯及其代谢物的抑制标准曲线如图1(螺内酯)和图2(坎利酮)所示。可见该抗体对螺内酯及其代谢物有较好的灵敏度，可用于螺内酯及其代谢物的免疫分析检测，建立螺内酯及其代谢物的免疫学检测方法。

对比例1

将免疫原替换为Spi-COOH-BSA，包被原分别选择Spi-COOH-OVA与 Can-COOH-OVA，其余步骤同实施例，验证小鼠血清对螺内酯和坎利酮的抑制效果，结果见表2和表3。

表2包被原为Spi-COOH-OVA时对螺内酯和坎利酮的抑制效果

注：“-”为读数超过酶标仪检测范围，说明血清效价高。

表3包被原为Can-COOH-OVA时对螺内酯和坎利酮的抑制效果

注：“-”为读数超过酶标仪检测范围，说明血清效价高。

对比例2

免疫原仍然选择Can-COOH-BSA，包被原分别选择Spi-COOH-OVA与 Can-COOH-OVA，其余步骤同实施例，验证小鼠血清对螺内酯和坎利酮的抑制效果，结果见表4和表5。

表4包被原为Can-COOH-OVA时对螺内酯和坎利酮的抑制效果

注：“-”为读数超过酶标仪检测范围，说明血清效价高。

表5包被原为Spi-COOH-OVA时对螺内酯和坎利酮的抑制效果

注：“-”为读数超过酶标仪检测范围，说明血清效价高。

从表2-5可知，当免疫原为Spi-COOH-BSA，包被为Spi-COOH-OVA 与Can-COOH-OVA时，小鼠血清对两种药物都无较好的抑制：当免疫原为 Can-COOH-BSA，包被为Can-COOH-OVA时，仅对螺内酯有抑制，当包被为Spi-COOH-OVA时，对两种药物都有抑制。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株命名为单克隆细胞株PRM，于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.22341。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由以下步骤制备得到：

S1：将螺内酯及其代谢物免疫原制备成弗氏佐剂，注射入免疫动物体内；首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂，冲刺免疫采用螺内酯及其代谢物免疫原；

其中，所述螺内酯及其代谢物免疫原由坎利酮半抗原制备得到，所述坎利酮半抗原的结构如式I所示；

S2：对经过上述免疫过程的免疫动物进行采血，检测免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中螺内酯及其代谢物抗体含量高的免疫动物；

S3：将步骤S2中筛选得到的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合并进行培养，检测阳性细胞孔并测定抑制效果，对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行亚克隆，得到所述分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述螺内酯及其代谢物免疫原由所述坎利酮半抗原活化后与牛血清蛋白偶联得到。

4.一种螺内酯及其代谢物单克隆抗体，其特征在于：所述螺内酯及其代谢物单克隆抗体由权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株分泌得到。

5.权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的螺内酯及其代谢物单克隆抗体在检测螺内酯及其代谢物中的应用。

6.根据权利要求5所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述代谢物选自坎利酮、睾酮、孕酮、宝丹酮、丙酸睾丸素、去氢雄酮、双氟米松和氢化可的松中的至少一种。

7.一种螺内酯及其代谢物检测试剂盒，其特征在于：所述螺内酯及其代谢物检测试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的螺内酯及其代谢物单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的螺内酯及其代谢物检测试剂盒，其特征在于：所述螺内酯及其代谢物检测试剂盒中还包括螺内酯及其代谢物包被原。

9.根据权利要求8所述的螺内酯及其代谢物检测试剂盒，其特征在于：所述螺内酯及其代谢物包被原由螺内酯半抗原活化后与鸡卵白蛋白偶联得到。

10.根据权利要求9所述的螺内酯及其代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述螺内酯半抗原的结构如式II所示：

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