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CN114174343A - 双特异性抗体 - Google Patents

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CN114174343A
CN114174343A CN202080054077.0A CN202080054077A CN114174343A CN 114174343 A CN114174343 A CN 114174343A CN 202080054077 A CN202080054077 A CN 202080054077A CN 114174343 A CN114174343 A CN 114174343A
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antibody
arm
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CN202080054077.0A
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柴山史朗
新坊拓也
手塚智也
马克.索罗斯比
科尼利斯.阿德里安.迪克夫
彼得.福克.凡罗
林斯.克罗斯特
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Ono Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明的问题是提供一种用于针对自身免疫疾病等的预防、症状进展抑制、再发抑制或治疗的新型药剂。本发明的发明者们经过深入研究，其结果，作为能够解决所述问题的物质而着眼于PD‑1/CD3双特异性抗体，确认到了它们能够成为减轻被称为输液反应或细胞因子释放综合征的副作用的出现的制剂。此外，确认到了该双特异性抗体具有允许PD‑1和作为其配体的PD‑L1的相互作用的特征，并发现了这样的特征有助于针对自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制或治疗效果的增强或持续。

Description

双特异性抗体
技术领域
本发明涉及能够分别与PD-1和CD3特异性结合的双特异性抗体(在下文中，有时简称为“PD-1/CD3双特异性抗体”)或其抗体片段(在下文中，有时将它们合称为“PD-1/CD3双特异性抗体等”)、将其作为有效成分而含有的药物组合物和它们在药物治疗上的用途。
背景技术
PD-1是属于免疫球蛋白家族的免疫抑制受体，是具有抑制通过来自抗原受体的刺激而活化的T细胞的免疫活化信号的功能的分子。从PD-1敲除小鼠的解析等中，发现了PD-1信号在自身免疫性扩张型心肌病、狼疮样综合征、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫疾病的抑制中起到重要的作用。因此，增强PD-1信号的物质被认为能成为自身免疫疾病等的预防或治疗剂。
目前为止作为增强PD-1信号的物质，已知有识别PD-1的双特异性抗体(专利文献1或3)。该双特异性抗体是将识别作为T细胞受体复合体的成员的CD3的抗体的抗原识别部位和识别PD-1的抗体的抗原识别部位通过基因工程连接而得的抗体，其具有通过使得PD-1位于T细胞受体复合体附近的频率上升，而增强PD-1对T细胞受体复合体的抑制信号的作用。并且，在所述专利文献中，也有记载PD-1双特异性抗体能够用于自身免疫疾病等的预防或治疗。
然而，就蛋白质制剂而言，存在在投药之后出现被称为输液反应或细胞因子释放综合征的副作用的风险，故而需要减轻或抑制这样的副作用的制剂。
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等能够充分地减轻投药后对细胞因子产生的刺激(被认为是这样的副作用的原因)，因此，有希望成为使上述副作用的出现得到抑制的药物。具有这样的特征的双特异性抗体到目前为止从未被报道过。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/011911号小册
专利文献2：国际公开第2004/072286号小册
专利文献3：国际公开第2013/022091号小册
发明内容
本发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供一种用于对自身免疫疾病等的预防、症状进展抑制、再发抑制或治疗的新药剂。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明者经过深入研究，其结果，作为能够解决上述问题物质而着眼于本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等，并且还确认了它们能够成为使被称为输液反应或细胞因子释放综合征的副作用的出现得到减轻的药剂，从而完成了本发明。
并且，本发明的发明者确认了该PD-1/CD3双特异性抗体等具有允许PD-1和作为其配体PD-L1的相互作用的特征，且发现了这样的特征有助于该PD-1/CD3双特异性抗体等对自身免疫疾病等的预防、症状进展抑制、再发抑制或治疗效果的增强或持续。
即，本发明如下：
[1]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其为具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂的双特异性抗体(在下文中，对此与上述同样地，有时简称为“PD-1/CD3双特异性抗体”)或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂具有选自下述(A)～(E)中的任一种VH：
(A)具有(a)包含序列编号6的氨基酸序列的重链可变区域的互补性决定区域1(在下文中，“重链可变区域的互补性决定区域1”有时简称为VH-CDR1)、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的重链可变区域的互补性决定区域2(在下文中，“重链可变区域的互补性决定区域2”有时简称为VH-CDR2)、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的重链可变区域的互补性决定区域3(在下文中，“重链可变区域的互补性决定区域3”有时简称为VH-CDR3)的重链可变区域(在下文中，“重链可变区域”有时简称为“VH”)；
(B)具有(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(C)具有(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(D)具有(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(E)具有(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3的VH，
与CD3特异性结合的第二臂具有：具有下述(a)～(c)的VH：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3，
此处，与PD-1特异性结合的第一臂中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的任意一个或多个VH-CDR中，各自任意1～5个氨基酸残基可以被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换；和/或与CD3特异性结合的第二臂中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的任意一个或多个VH-CDR中，各自任意1～5个氨基酸残基可以被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换。
[2]如前项[1]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂具有选自下述(A)～(E)中的任一种VH：
(A)具有(a)包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(B)具有(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(C)具有(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(D)具有(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(E)具有(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3的VH，
与CD3特异性结合的第二臂具有：具有下述(a)～(c)的VH，
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[3]如前项[1]或[2]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[4]如前项[1]或[2]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[5]如前项[1]或[2]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[6]如前项[1]或[2]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[7]如前项[1]或[2]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[8]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂具有：具有下述(a)～(c)的VH，
(a)包含HYJ1LH表示的氨基酸序列[序列中，J1表示G(甘氨酸)或A(丙氨酸)，此处，J1或其它的字母分别表示氨基酸的单字母缩写]的VH-CDR1；
(b)包含WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG表示的氨基酸序列[序列中，J2表示L(亮氨酸)或I(异亮氨酸)，U2表示E(谷氨酸)或G(甘氨酸)，X2表示F(苯丙氨酸)或Y(酪氨酸)，此处，J2、U2和X2或其它的字母分别表示与上述相同的意思]的VH-CDR2；
(c)包含GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V表示的氨基酸序列[序列中，J3表示M(蛋氨酸)或L(亮氨酸)，U3表示H(组氨酸)或Y(酪氨酸)，X3表示F(苯丙氨酸)或Y(酪氨酸)，Z3表示D(天冬氨酸)或E(谷氨酸)，此处，J3、U3、X3和Z3或其它的字母分别表示与上述相同的意思]的VH-CDR3，并且
与CD3特异性结合的第二臂具有：具有下述(a)～(c)的VH，
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[9]如前项[8]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
(a)J1表示G(甘氨酸)、J2表示L(亮氨酸)、U2表示E(谷氨酸)、X2表示F(苯丙氨酸)、J3表示M(蛋氨酸)、U3表示H(组氨酸)、X3表示F(苯丙氨酸)并且Z3表示D(天冬氨酸)；或
(b)J1表示G(甘氨酸)、J2表示I(异亮氨酸)、U2表示G(甘氨酸)、X2表示Y(酪氨酸)、J3表示L(亮氨酸)、U3表示H(组氨酸)、X3表示Y(酪氨酸)并且Z3表示E(谷氨酸)；或
(c)J1表示A(丙氨酸)、J2表示L(亮氨酸)、U2表示E(谷氨酸)、X2表示Y(酪氨酸)、J3表示M(蛋氨酸)、U3表示Y(酪氨酸)、X3表示Y(酪氨酸)并且Z3表示D(天冬氨酸)；或
(d)J1表示A(丙氨酸)、J2表示L(亮氨酸)、U2表示E(谷氨酸)、X2表示F(苯丙氨酸)、J3表示M(蛋氨酸)、U3表示H(组氨酸)、X3表示F(苯丙氨酸)并且Z3表示D(天冬氨酸)。
[10]如前项[1]～[9]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的框架(在下文中，“框架”有时简称为FR)区域中，框架1(在下文中，有时简称为FR1)、框架2(在下文中，有时简称为FR2)和框架3(在下文中，有时简称为FR3)区域分别对应生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1或发生了体细胞突变的该基因所编码的氨基酸序列。
[11]如前项[10]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的框架4(在下文中，“框架4”有时简称为FR4)区域包含生殖细胞系列型J基因JH6c或发生了体细胞突变的该基因所编码的氨基酸序列(其中，VH-CDR3区域中包含的氨基酸序列除外)。
[12]如前项[10]或[11]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的FR区域由可受到生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1的体细胞突变的该基因进行编码，通过该体细胞突变，其包含：序列编号21的氨基酸序列中的位置13的赖氨酸被谷氨酰胺置换、位置16的丙氨酸被缬氨酸置换或位置19的赖氨酸被蛋氨酸置换，或以它们任意的多个组合形式被置换或任选被置换的FR1区域。
[13]如前项[10]～[12]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的FR区域由可受到生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1的体细胞突变的该基因进行编码，通过该体细胞突变，其包含：序列编号21的氨基酸序列中的位置37的缬氨酸被亮氨酸置换或任选被置换的FR2区域。
[14]如前项[10]～[13]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的FR区域由可受到生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1的体细胞突变的该基因进行编码，通过该体细胞突变，其包含：序列编号21的氨基酸序列中的位置77的丝氨酸被苏氨酸置换、或位置84的半胱氨酸被丝氨酸或天冬酰胺置换，或以它们任意的多个组合形式被置换或任选被置换的FR3区域。
[15]如前项[10]～[14]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的FR4区域由可受到生殖细胞系列型J基因JH6c的体细胞突变的该基因(其中，编码VH-CDR3区域的基因区域除外)进行编码，其FR4区域的氨基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Va l-Ser-Ser)(序列编号41)中的赖氨酸(Lys)被谷氨酰胺或天冬酰胺置换或任选被置换，和/或＊记号的苏氨酸(Thr)被亮氨酸置换或任选被置换。
[16]如前项[1]～[15]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含：选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
[17]如前项[1]和[3]～[7]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含：选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列。
[18]如前项[1]～[17]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含：序列编号36的氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
[19]如前项[1]和[3]～[18]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[20]如前项[1]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[21]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含：选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含：序列编号36的氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
[22]如前项[1]或[3]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号1的氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[23]如前项[1]或[4]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号2的氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[24]如前项[1]或[5]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号3的氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[25]如前项[1]或[6]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号4的氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[26]如前项[1]或[7]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号5的氨基酸序列，与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[27]如前项[1]～[26]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂和/或与CD3特异性结合的第二臂分别具有：具有(a)～(c)的轻链可变区域(在下文中，“轻链可变区域”有时简称为“VL”)，
(a)包含序列编号26的氨基酸序列的轻链可变区域的互补性决定区域1(在下文中，“轻链可变区域的互补性决定区域1”有时简称为VL-CDR1)、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的轻链可变区域的互补性决定区域2(在下文中，“轻链可变区域的互补性决定区域2”有时简称为VL-CDR2)、
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的轻链可变区域的互补性决定区域3(在下文中，“轻链可变区域的互补性决定区域3”有时简称为VL-CDR3)。
[28]如前项[1]～[27]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂和/或与CD3特异性结合的第二臂分别具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL。
[29]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
(A)与PD-1特异性结合的第一臂具有：包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL；以及
(B)与CD3特异性结合的第二臂具有：包含序列编号36的氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL。
[30]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
该与PD-1特异性结合的第一臂与下述(1)或(2)所述的结合发生交叉竞合：
(1)具有包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与PD-1特异性结合的第一臂对PD-1的结合；
(2)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域对PD-1的结合。
[31]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
该与PD-1特异性结合的第一臂对PD-1的结合通过下述(1)或(2)而发生交叉竞合：
(1)具有包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与PD-1特异性结合的第一臂；
(2)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域。
[32]如前项[30]或[31]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
该与CD3特异性结合的第二臂进一步与下述(1)或(2)所述的结合发生交叉竞合：
(1)具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与CD3特异性结合的第二臂对CD3的结合；
(2)包含该VH和VL的与CD3特异性结合的单克隆抗体的可变区域对CD3的结合。
[33]如前项[30]或[31]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂具有：具有下述(a)～(c)的VH，
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
[34]如前项[30]、[31]和[33]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含：序列编号36的氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
[35]如前项[30]或[31]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
[36]如前项[30]、[31]和[33]～[35]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂具有：具有下述(a)～(c)的VL，
(a)包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2、
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3。
[37]如前项[30]、[31]和[33]～[35]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL。
[38]如前项[1]～[37]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
PD-1/CD3双特异性抗体为IgG抗体。
[39]如前项[38]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[38]所述的IgG抗体为IgG1抗体或IgG4抗体。
[40]如前项[38]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[38]所述的IgG抗体为IgG1抗体。
[41]如前项[38]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[38]所述的IgG抗体为IgG4抗体。
[42]如前项[40]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
该IgG1抗体对Fc受体的结合已消失或已减弱。
[43]如前项[40]或[42]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[40]所述的IgG1抗体中的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第235号的亮氨酸分别被甘氨酸置换，和/或第236号的甘氨酸分别被精氨酸置换。
[44]如前项[40]、[42]或[43]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸和第366号的苏氨酸都被赖氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换。
[45]如前项[40]、[42]或[43]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸和第366号的苏氨酸都被赖氨酸置换。
[46]如前项[40]和[42]～[45]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[40]和[42]～[45]中任一项所述的IgG1抗体的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第447号的赖氨酸分别缺失。
[47]如前项[38]～[46]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其对新生儿Fc受体(在下文中，有时简称为“FcRn”)的结合已消失或已减弱。
[48]如前项[40]、[42]～[47]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
该IgG1抗体中的2个重链恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换。
[49]如前项[40]、[42]～[48]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
该IgG1抗体中的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被天冬氨酸置换。
[50]如前项[48]或[49]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[48]或[49]所述的IgG1抗体在血液中的半衰期与该氨基酸未被置换的原来的抗体相比有所缩短。
[51]如前项[48]或[49]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[48]或[49]所述的IgG1抗体在血液中的半衰期与该氨基酸未被置换的原来的抗体相比，缩短至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[52]如前项[41]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
前项[41]所述的IgG4抗体中的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第228号的丝氨酸分别被脯氨酸置换。
[53]如前项[1]～[38]、[40]、[42]、[43]和[45]～[51]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链含有：包含选自序列编号23、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46和序列编号47中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域。
[54]如前项[1]～[38]、[40]、[42]、[43]、[45]～[51]和[53]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链含有：包含选自序列编号24、序列编号48、序列编号49、序列编号50、序列编号51、序列编号52和序列编号53中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域。
[55]如前项[1]～[54]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VL的轻链和/或具有与CD3特异性结合的第二臂的VL的轻链含有：包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
[56]一种PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
(A)具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链含有：包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含选自序列编号23、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46和序列编号47中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域；
(B)具有与PD-1特异性结合的第一臂的VL的轻链含有：包含序列编号25的氨基酸序列的VL和包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域；
(C)具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链含有：包含序列编号36的氨基酸序列的VH以及包含选自序列编号24、序列编号48、序列编号49、序列编号50、序列编号51、序列编号52和序列编号53中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域；和
(D)具有与CD3特异性结合的第二臂的VL的轻链含有：包含序列编号25的氨基酸序列的VL和包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
[57]如前项[1]～[56]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其其分别与靶标细胞表达的PD-1和CD3特异性结合。
[58]如前项[1]～[57]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂允许PD-1和PD-L1间的相互作用。
[59]如前项[1]～[58]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
投药过程中或投药后24小时以内的细胞因子产生得到充分减少。
[60]如前项[1]～[57]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂允许PD-1和PD-L1间的相互作用，并且，细胞因子产生得到充分减少。
[61]如前项[59]或[60]所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
细胞因子至少为IL-2、IFN-γ或TNF-α。
[62]如前项[1]～[61]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
PD-1和CD3分别为人类PD-1和人类CD3。
[63]如前项[1]～[62]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
CD3为CD3ε。
[64]如前项[1]～[63]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
PD-1/CD3双特异性抗体为单克隆抗体。
[65]如前项[1]～[64]中任一项所述的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段，其中，
PD-1/CD3双特异性抗体为纯化抗体。
[1-1]一种药物组合物，其包含选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分。
[1-2]如前项[1-1]所述的药物组合物，其还包含药学上允许的载体。
[2-1]一种自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其包含选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分。
[2-2]如前项[2-1]所述的药剂，其中，
自身免疫疾病为白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎、显微镜下多血管炎)、主动脉炎综合征(高安动脉炎)、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎(例如，韦格纳肉芽肿和嗜酸性韦格纳肉芽肿)、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病(例如，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰岛炎等)、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病(格雷夫斯病(甲亢))、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病(慢性肾上腺皮质功能减退症)、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病(成人隐匿性自身免疫性糖尿病)、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病)、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。
[2-3]一种移植物抗宿主病(GVHD)的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分。
[2-4]一种含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分的、I型糖尿病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其与选自胰岛素制剂(例如人胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素等)、磺酰脲类药物(例如格列本脲、格列齐特和格列美脲等)、速效胰岛素分泌促进剂(例如那格列奈等)、双胍制剂(例如二甲双胍等)、胰岛素抵抗改善剂(例如吡格列酮等)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格列波糖等)、糖尿病神经病变治疗剂(例如依帕司他、美西律、咪达普利等)、GLP-1类似物制剂(例如利拉鲁肽、艾塞那肽、利西拉肽等)和DPP-4抑制剂(例如西格列汀、维格列汀、阿格列汀等)中的任何一种以上的药剂一同进行投药。
[2-5]一种含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分的、多发性硬化症的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其与选自类固醇药物(例如，可的松、醋酸可的松、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、醋酸氟氢可的松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙琥珀酸钠、醋酸泼尼松龙丁酯、泼尼松龙磷酸钠、醋酸氟氢可的松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、琥珀酸甲泼尼龙、去炎松、醋酸去炎松、曲安奈德、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松戊酸酯、Dexa methasonecipecilate、地塞米松棕榈酸酯、地塞米松丙酸酯、地塞米松磷酸钠、地塞米松间磺基苯甲酸酯钠、帕拉米松、帕拉米松醋酸酯、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他塞酮醋酸酯、倍他米松丁酸酯丙酸酯和倍他米松磷酸钠等)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、甲氨蝶呤、克拉屈滨、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素、咪唑立滨、他克莫司、芬戈莫德和阿仑单抗中的任何一种以上的药剂一同进行投药。
[2-6]一种含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分的、全身性红斑狼疮的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其与选自类固醇药(例如，前项[2-5]所述的类固醇药)、免疫抑制剂(例如，环孢素、他克莫司和芬戈莫德等)和贝利木单抗中的任何一种以上的药剂一同进行投药。
[2-7]一种含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分的、类风湿关节炎的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其与选自类固醇药(例如，前项[2-5]所述的类固醇药)、抗类风湿药(例如，甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、布西拉明、来氟米特、咪唑立宾和他克莫司等)、抗细胞因子药(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、托珠单抗、依那西普、戈利木单抗和赛妥珠单抗)和阿巴西普中的任何一种以上的药剂一同进行投药。
[2-8]一种含有选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段作为有效成分的、自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其与前项[2-4]～[2-7]中举出的任意一种以上的药剂一同进行投药。
[2-9]如前项[2-4]～[2-8]所述的各疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其对投药有前项[2-4]～[2-7]中举出的任意一种以上的药剂的患者进行投药。
[2-10]如前项[2-4]～[2-8]所述的各疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其在前项[2-4]～[2-7]中举出的任意一种以上的药剂的投药后进行投药。
[2-11]如前项[2-4]～[2-8]所述的各疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其在前项[2-4]～[2-7]中举出的任意一种以上的药剂的投药前进行投药。
[3-1]一种静脉内注射用制剂，其包含选自前项[1]～[65]中的任一项的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段和药学上允许的载体。
[3-2]如前项[3-1]所述的静脉内注射用制剂，其用于自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗。
[3-3]如前项[3-1]或[3-2]所述的静脉内注射用制剂，其为点滴用。
[4-1]一种自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗方法，其包含：将选自前项[1]～[65]中的任一项的该双特异性抗体或其抗体片段的有效量对患者进行投药。
[4-2]一种选自前项[1]～[65]中的任一项的该双特异性抗体或其抗体片段，其在自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗中使用。
[4-3]一种选自前项[1]～[65]中的任一项的该双特异性抗体或其抗体片段的用途，其是在用于自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗的药物的制造中使用。
发明的效果
由于本发明的PD-1/CD3双特异性抗体使对细胞因子产生的诱导得到了减轻，因此可以期待在其投药后输液反应或细胞因子释放综合征的出现得到抑制。此外，可以期待其允许PD-1和PD-L1间的相互作用这一特征有助于其在预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗上的效果的增强或持续。
附图说明
[图1]表示通用轻链的VL和恒定区域的氨基酸序列。
[图2]表示通用轻链的VL的各CDR的氨基酸序列。
[图3]表示由生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1和IGHV3-33分别编码的氨基酸序列。
[图4]表示与PD-1特异性结合的抗体(在下文中，有时简称为抗PD-1抗体)各克隆的VH与生殖细胞系列型基因IGHV7-4-1和JH6c的序列比对。图中，各克隆的氨基酸序列中的“-”表示与对应的生殖细胞系列型基因IGHV7-4-1或JH6c的氨基酸序列相同的氨基酸，记载有氨基酸的缩写的部分表示与同生殖细胞系列型基因的氨基酸序列不同的氨基酸。
[图5]表示抗PD-1抗体各克隆的VH的氨基酸序列。
[图6]表示抗PD-1抗体各克隆的VH中的各CDR的氨基酸序列。
[图7]表示与CD3特异性结合的抗体(在下文中，有时简称为抗CD3抗体)克隆CD3-2的VH的氨基酸序列。
[图8]表示抗CD3抗体克隆CD3-2的VH中的各CDR的氨基酸序列。
[图9]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各重链恒定区域的氨基酸序列。
[图10]表示WO2005/118635中记载的抗CD3抗体克隆15C3的VH的氨基酸序列。需要说明的是，显示有下划线的氨基酸表示在克隆CD3-1的制备中被转换为丙氨酸的第55个甘氨酸。
[图11]表示分别确认了PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆对PD-1和CD3的结合活性的Biacore(注册商标)测定结果。
[图12]表示确认了PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆对PD-1和CD3的同时结合性的流式细胞术(flowcytometry)。
[图13]表示确认了PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆对PD-1/PD-L1相互作用的影响的流式细胞术。
[图14]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆对活化人类T细胞的IFN-γ产生的作用结果。需要说明的是，图中的“Ctrl”表示对照组。
[图15]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆(PD1-1(Bi)，PD1-2(Bi))在实验性过敏性脑脊髓炎小鼠模型(EAE模型)中的治疗效果。
[图16]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆(PD1-3(Bi)，PD1-4(Bi))在实验性过敏性脑脊髓炎小鼠模型中的治疗效果。
[图17]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆(PD1-5(Bi)，PD1-6(Bi))在实验性过敏性脑脊髓炎小鼠模型中的治疗效果。
[图18]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆对人外周血单核细胞的细胞因子产生的作用结果。
[图19]表示PD1-5(Bi)对PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆与PD-1间的结合的交叉竞合性。
[图20]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体在外周血单核细胞移植小鼠模型中的作用结果。图中，“*”，“**”和“***”分别表示通过与比较对象的t检验，得到以p<0.05、p<0.01和p<0.001的水平而显著的结果。
[图21]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体在小鼠抗体产生模型中的作用结果。图中，“*”和“**”分别表示通过与各评价日的对照的t检验，得到以p<0.05和p<0.01的水平而显著的结果。
[图22]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体在自然发病糖尿病模型小鼠中的治疗效果。
[图23]表示用Biacore(注册商标)对PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)和Mut1～Mut3的人类FcRn结合性进行评价的结果。
[图24]表示用Biacore(注册商标)对PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆Mut4～Mut6的人类FcRn结合性进行评价的结果。
[图25]表示用Biacore(注册商标)对PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)、Mut1和Mut4的小鼠FcRn结合性进行评价的结果。
[图26]表示PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆Mut4在EAE模型中的治疗效果。图中，“**”表示通过Wilcoxon秩和检验(正确法)，得到以p<0.01的水平显著的结果。
本发明的具体实施方式
PD-1(Programmed Cell Death-1)在人类中是由GenBank登录编号NP_005009所示的氨基酸序列所构成的膜型蛋白质。在本说明书中，“PD-1”这一表述，只要没有特别限定，有时会以包含其所有同源异构体、保守地具有本发明所涉及的“与PD-1特异性结合的第一臂”的表位的这些修饰体的概念而进行使用。在本发明中，PD-1优选为人类PD-1。
CD3是与T细胞受体缔合而形成T细胞受体复合体的膜型蛋白质。在本说明书中，“CD3”这一表述，只要没有特别限定，有时会以包含其亚型(ε、δ、γ和ζ亚型)、保守地具有本发明所涉及的“与CD3特异性结合的第二臂”的表位的这些修饰体的概念而使用。在本发明中，作为CD3优选为CD3ε，此外，人类CD3，更优选为人类CD3ε。
在本说明书中，“纯化”是指，通过鉴定、分离和/或提纯而从宿主细胞中提取的包含多种或无数种成分的混合物中获得实质上单一纯粹的成分。
在本说明书中，“单克隆抗体”是指，从对相同特定的抗原进行结合的、实质上均一的抗体集团中得到的抗体。
在本说明书中，“双特异性抗体”是指，在一个分子上具备针对二种不同的抗原分子或表位的结合特异性的抗体，“双特异性单克隆抗体”是指，从实质上均一的抗体集团中得到的双特异性抗体。
本发明涉及能够分别与PD-1和CD3特异性结合的双特异性抗体(在本说明书中，有时简称为PD-1/CD3双特异性抗体)。在本发明中，作为PD-1/CD3双特异性抗体，优选为PD-1/CD3双特异性单克隆抗体，更优选为纯化PD-1/CD3双特异性单克隆抗体，进一步优选为纯化人类PD-1/人类CD3双特异性单克隆抗体。此处，“纯化人类PD-1/人类CD3双特异性单克隆抗体”是指，针对人类PD-1和人类CD3的、纯化的双特异性单克隆抗体。
此处，双特异性抗体的形态，例如，有双体抗体(Diabody)、双特异性sc(Fv)2、双特异性微型抗体、双特异性F(ab′)2、双特异性杂交抗体、共价双体抗体(双特异性DART)、双特异性(FvCys)2、双特异性F(ab′-zipper)2、双特异性(Fv-zipper)2、双特异性三链抗体、双特异性mAb2、Addbody(注册商标)和Mira body(注册商标)等。
双体抗体是指，识别不同的抗原的VH、VL彼此通过肽接头连接的单链肽的二聚体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993),Vol.90,No.14:p.6444-6448)。
双特异性sc(Fv)2是指，被编辑为以单链的形态产生的低分子化抗体，其中所述单链是使识别不同抗原的2个抗体的2组VH/VL介由肽接头接续而成的(参照J.BiologicalChemistry(1994),Vol.269:p.199-206)。
双特异性F(ab′)2是指，识别不同的2种抗原的抗体的Fab′片段通过二硫键等而共价键合的低分子化抗体。
双特异性微型抗体是指，使被编辑为抗体的恒定区域CH3结构域分别与识别不同的抗原的scFv连接的低分子抗体片段，通过该CH3结构域上的二硫键等而共价键合的低分子化抗体(参照Biochemistry(1992),Vo.31,No.6,p.1579-1584)。
双特异性杂交抗体是指，识别不同的2种抗原的抗体的重链/轻链复合体通过二硫键等而共价键合的完整抗体。
在本发明中，作为双特异性抗体的形态，优选双特异性杂交抗体。
双特异性杂交抗体，例如，可以从用杂交-杂交瘤法(参照US4474893)制备的杂交瘤中产生。此外，分别编码识别不同的抗原的抗体的重链和轻链的共4种cDNA可以通过使其在哺乳动物细胞中共表达并分泌而制造。
本发明中使用的单克隆抗体，可以通过杂交瘤法(例如，参照Kohler和Milstein等,Natur(1975),Vol.256,p.495-97，Hongo等,Hybridoma(1995),Vol.14,No.3,p.253-260，Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Col d Spring Harbor LaboratoryPress(1988),Vol.2)和Hammerling等,Monoclo nal Antibodies and T-CellHybridomas,p.563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(例如，参照US4816567)、噬菌体展示法(例如，参照Ladner等的US5223409、US5403484和US5571698，Dower等的US5427908和US5580717，McCafferty等的US5969108和US6172197和Griffiths等的US5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915和US6593081)制备。
如果对人类投药抗体或单克隆抗体，则为了减轻或消除其抗原性，可以以嵌合抗体、人源化抗体或全人源化抗体的形态进行制备。
“嵌合抗体”是指可变区域序列和恒定区域序列来自于不同的哺乳动物的抗体，例如，可变区域序列来源于小鼠抗体、恒定区域序列来源于人类抗体的抗体。嵌合抗体可以如下制备：从用所述杂交瘤法、重组DNA法或噬菌体展示法纯化的抗体产生杂交瘤中，通过公知手法纯化出编码抗体可变区域的基因，并使用公知方法将其与来源于人类的编码抗体恒定区域的基因连接(例如，参照Cabilly等的US4816567)。
“人源化抗体”是指，将来源于如小鼠这样的其他哺乳动物的生殖细胞型的互补性决定区域(CDR)序列移植到人类框架序列上的抗体。人源化抗体也可以如下制备：从用所述方法纯化的抗体产生杂交瘤中，通过公知手法纯化出编码抗体CDR区域的基因，使用公知方法，使其与来源于人类的编码抗体框架区域的基因连接(例如，参照Winter的US5225539和US5530101，Queen等的US5585089号和US6180370)。
“人类抗体”或“全人源化抗体”是指，包含框架区域和CDR区域的可变区域以及恒定区域这两者都来源于人类生殖细胞型免疫球蛋白序列的抗体。本发明中使用的人类抗体可以通过以下方法制备：使用了经过转化而产生人类抗体的小鼠，例如，Humab小鼠(例如，参照Lonberg、Kay等的US5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299和US5770429)、KM小鼠(例如，参照Is hida等的WO2002/43478)、Xeno小鼠(例如，参照US5939598、US6075181、US6114598、US6150584和US6162963)或Tc小鼠(例如，参照Tomizuka等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000),p.722-727)的方法。此外，也可以使用以使其因免疫而发生人类抗体应答的方式进行了人类免疫细胞再构建的SCID小鼠(例如，参照Wilson等的US5476996和US5698767)进行制备。并且，本发明中使用的人类抗体也可以通过所述噬菌体展示法进行制备。
本说明书中，PD-1/CD3双特异性抗体的“抗体片段”是指作为全长抗体的一部分并且具有针对PD-1的抗原结合部分和针对CD3的抗原结合部分的抗体，例如，可以举出F(ab′)2等。此处，抗原结合部分是指抗体能够与其抗原结合的最小单位，例如，其由VH和VL各具有的3个CDR和这些CDR的组合以能够识别目标抗原的形式进行配置的框架区域而构成。
在本说明书中，“通用轻链”是指，能够与不同的2种以上的重链缔合，表现出针对各个抗原的结合能力的轻链(De Wildt RM等，J.Mol.Biol.(1999),Vol.285,p.895-901，DeKruif等，J.Mol.Biol.(2009),Vol.387,p.548-58，WO2004/009618、WO2009/157771和WO2014/051433)。作为这样的通用轻链，例如优选为人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(IMGT数据库的命名法)生殖细胞系列型基因所编码的轻链(在下文中，有时简称为IGVK1-39/JK1通用轻链)，例如更优选为具有含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL的该轻链，例如进一步优选为具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL的该轻链。此外，作为通用轻链的恒定区域，可以优选地举出包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。本发明中使用的通用轻链的VL和恒定区域的各个氨基酸序列在图1中表示，其可变区域的各CDR的氨基酸序列在图2中表示。
在本说明书中，“同种型”是指由重链恒定区域基因编码的抗体类型(例如，IgM或IgG)。作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体，优选的同种型为IgG，更优选为IgG1或IgG4。此处，作为IgG1，优选对Fc受体(例如，Fcγ受体)的结合已消失或已减弱的抗体。具体而言，可以通过对其重链恒定区域中置换、缺失或插入任意氨基酸，而得到对Fc受体的结合已消失或已减弱的IgG1抗体。例如，可以举出在双特异性抗体的各二个重链恒定区域或铰链区域上，EU编号系统中的第235号的亮氨酸被甘氨酸置换和/或第236号的甘氨酸被精氨酸置换的抗体。此外，为了减轻抗体的不均一性，优选C末端的氨基酸(例如，EU编号系统中的第447号的赖氨酸缺失了的抗体)。并且，为了缩短在血液中的半衰期，特别优选，对FcRn的结合已消失或已减弱的抗体。具体而言，通过使属于重链恒定区域中的FcRn结合部位的氨基酸的置换或缺失，能够使其对该受体的结合已消失或已减弱。如果是IgG1抗体，则作为这样的抗体，例如，可以举出(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换；(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换；和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换的抗体。另一方面，如果双特异性抗体为IgG4，则更优选其重链恒定区域的任意的氨基酸被置换、缺失或插入以达到抑制抗体分子内的交换效果的修饰体。例如，优选位于铰链区域的、EU编号系统中的第228号的丝氨酸被脯氨酸置换的抗体。需要说明的是，在本说明书中，存在被分配到抗体的可变区域的CDR和框架中的氨基酸位置由Kabat所编号的情况(参照Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,(1987)和(1991))。此外，恒定区域的氨基酸依照参照了Kabat的氨基酸位置的EU编号系统(参照Sequences of proteins ofimmunological interest,NIH Publica tion No.91-3242)进行表示。
就本发明的PD-1/CD3双特异性抗体的Fc区域而言，可以对该区域的任意氨基酸进行置换，以使得二条不同的重链容易缔合。作为优选的形态，例如，可以举出具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换了的PD-1/CD3双特异性抗体。此外，还可以举出具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，并且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换了的PD-1/CD3双特异性抗体。
与PD-1特异性结合的第一臂
在本说明书中，“与PD-1特异性结合的第一臂”(在下文中，有时简称为“第一臂”)是指：不论其是否包含在抗体或抗体片段的一部分中或是否不作为一个部分而作为其自身的单体而存在，至少，其是包含与PD-1特异性结合的抗体(在下文中，有时简称为抗PD-1抗体)的VH并且能与PD-1特异性结合的抗体部分，例如，这样的第一臂包含抗PD-1抗体的VH和构成该抗PD-1抗体的通用轻链的VL，并且，第一臂中也包含含有该VH和VL的抗体的Fab部分。此处，“与PD-1特异性结合”是指至少能够以具有比1x10-5M，优选1x10-7M，更优选1x10-9M高的亲和性(解离定数(Kd值))的结合活性对PD-1进行直接结合，且至少与CD28、CTLA-4和ICOS等所谓的属于CD28家族受体的其他受体成员实质上不结合的特征。此外，“与PD-1特异性结合的抗体”或“抗PD-1抗体”中的“抗体”是指，全长抗体，即，包含以二硫键连接的2条重链和2条轻链的完全长度的抗体，优选为其单克隆抗体。
此处，作为“与PD-1特异性结合的第一臂”，例如，可以举出具有以下VH的抗体，所述VH具有：
(a)包含HYJ1LH表示的氨基酸序列[序列中，J1表示G(甘氨酸)或A(丙氨酸)，此处J1或其它的字母分别表示氨基酸的单字母缩写]的VH-CDR1；
(b)包含WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG表示的氨基酸序列[序列中，J2表示L(亮氨酸)或I(异亮氨酸)，U2表示E(谷氨酸)或G(甘氨酸)，X2表示F(苯丙氨酸)或Y(酪氨酸)，此处，J2、U2和X2或其它的字母分别表示与上述相同的意思]的VH-CDR2；以及
(c)包含GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V表示的氨基酸序列[序列中，J3表示M(蛋氨酸)或L(亮氨酸)，U3表示H(组氨酸)或Y(酪氨酸)，X3表示F(苯丙氨酸)或Y(酪氨酸)，Z3表示D(天冬氨酸)或E(谷氨酸)，此处，J3、U3、X3和Z3或其它的字母分别表示与上述相同的意思]的VH-CDR3。
此处，作为优选的“与PD-1特异性结合的第一臂”的形态，例如，可以举出具有下述VH的第一臂：
(1a)具有以下各VH-CDR的VH：作为其VH-CDR1的HYJ1LH序列中的J1表示G(甘氨酸)，作为其VH-CDR2的WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中的J2表示L(亮氨酸)，U2表示E(谷氨酸)，X2表示F(苯丙氨酸)，作为其VH-CDR3的GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中的J3表示M(蛋氨酸)，U3表示H(组氨酸)，X3表示F(苯丙氨酸)，Z3表示D(天冬氨酸)；
(2a)具有以下各VH-CDR的VH：作为其VH-CDR1的HYJ1LH序列中的J1表示G(甘氨酸)，作为其VH-CDR2的WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中的J2表示I(异亮氨酸)，U2表示G(甘氨酸)，X2表示Y(酪氨酸)，作为其VH-CDR3的GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中的J3表示L(亮氨酸)，U3表示H(组氨酸)，X3表示Y(酪氨酸)，Z3表示E(谷氨酸)；
(3a)具有以下各VH-CDR的VH：作为其VH-CDR1的HYJ1LH序列中的J1表示A(丙氨酸)，作为其VH-CDR2的WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中的J2表示L(亮氨酸)，U2表示E(谷氨酸)，X2表示Y(酪氨酸)，作为其VH-CD R3的GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中的J3表示M(蛋氨酸)，U3表示Y(酪氨酸)，X3表示Y(酪氨酸)，Z3表示D(天冬氨酸)；或
(4a)具有以下各VH-CDR的VH：作为其VH-CDR1的HYJ1LH序列中的J1表示A(丙氨酸)，作为其VH-CDR2的WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中的J2表示L(亮氨酸)，U2表示E(谷氨酸)，X2表示F(苯丙氨酸)，作为其VH-CDR3的GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中的J3表示M(蛋氨酸)，U3表示H(组氨酸)，X3表示F(苯丙氨酸)，Z3表示D(天冬氨酸)。
此外，作为“与PD-1特异性结合的第一臂”的其他形态，例如可优选举出具有选自以下VH中的任意一个VH的第一臂：
(1b)包含以下CDR的VH：包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3；
(2b)包含以下CDR的VH：包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3；
(3b)包含以下CDR的VH：包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3；
(4b)包含以下CDR的VH：包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3；以及
(5b)包含以下CDR的VH：包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3。
并且，本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”还包含：在选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一种VH的各个VH-CDR中，其任意的1～5个氨基酸残基被其他氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，并且，具有与未被该氨基酸置换前的原第一臂对PD-1的结合活性实质上同等的结合活性的第一臂。例如，可以举出：在VH-CDR1的情况下，1个氨基酸残基被其他氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，在VH-CDR2或VH-CDR3的情况下，各自的1～5个氨基酸残基被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换的第一臂。此外，如图4所示，在分别和与PD-1特异性结合的第一臂对应的抗PD-1抗体克隆的各CDR中，在各克隆间不同的各氨基酸或任意多个这些氨基酸的组合在这些克隆之间可以相互置换。此处，以保守氨基酸进行的置换是指具有类似的侧链的残基的可换性，例如，在具有脂肪族侧链的氨基酸群中，有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸群中，有丝氨酸和苏氨酸，在具有含酰胺侧链的氨基酸的群中，有天冬酰胺和谷氨酰胺，在具有芳香族侧链的氨基酸群中，有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，在具有碱性侧链的氨基酸的群中，有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，在具有含硫侧链的氨基酸群中，有半胱氨酸和蛋氨酸。作为优选的以保守氨基酸进行置换的例子，可以举出缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的置换；苯丙氨酸和酪氨酸之间的置换；赖氨酸和精氨酸之间的置换；丙氨酸和缬氨酸之间的置换以及天冬酰胺和谷氨酰胺之间的置换。此外，此处，所述的“具有与未被该氨基酸置换前的原第一臂对PD-1的结合活性实质上同等的结合活性”是指，被该氨基酸置换了的第一臂对PD-1的结合活性为未被该氨基酸置换的原第一臂的结合活性的95％以上，优选为98％以上，更优选为99％以上。
并且，本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”还包含具有以下VH的第一臂：在该VH中，包含具有上述的特定氨基酸序列的各VH-CDR，该VH的框架的氨基酸序列由特定的生殖细胞系列型基因或发生了体细胞突变的该基因编码。例如，就选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH而言，其由生殖细胞系列型V基因为IGHV7-4-1，生殖细胞系列型J基因为JH6c的VDJ重组基因或发生了体细胞突变的该基因编码所得。此处，分别由生殖细胞系列型的V基因IGHV7-4-1编码的氨基酸序列与序列编号21的氨基酸序列对应(图3)。
就本发明的与PD-1特异性结合的第一臂的VH的框架而言，有时是由生殖细胞系列型的VDJ重组基因受到体细胞突变后的该基因进行编码。例如，选自生殖细胞系列型V基因为IGHV7-4-1的、所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH的FR1、FR2、FR3在图4所示的氨基酸位置上，与IGHV7-4-1基因编码的氨基酸序列不同，因此，在该各个位置上受到了体细胞突变。例如，就FR1区域而言，序列编号21的氨基酸序列中的位置13的赖氨酸可以被谷氨酰胺置换、位置16的丙氨酸可以被缬氨酸置换、或位置19的赖氨酸可以被蛋氨酸置换，或者也可以以任意多个这些置换的组合进行置换。就FR2区域而言，序列编号21的氨基酸序列中的位置37的缬氨酸可以被亮氨酸置换。就FR3区域而言，序列编号21的氨基酸序列中的位置77的丝氨酸可以被苏氨酸置换，位置84的半胱氨酸可以被丝氨酸或天冬酰胺置换，又或者可以以任意多个这些置换的组合进行置换。此外，就选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH的FR4区域而言，来源于J基因JH6c的FR4区域氨基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(序列编号41)中的赖氨酸(Lys)可以被谷氨酰胺或天冬酰胺置换，和/或有＊记号的苏氨酸(Thr)可以被亮氨酸置换。具有所述的任意氨基酸置换的组合的各个FR1、FR2、FR3和FR4不会对与PD-1特异性结合的第一臂的功能产生实质性的影响，可以作为框架使用。
并且，在本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”中，还包含具有上述的特定氨基酸序列的各CDR，且其VH的FR的氨基酸序列由特定的生殖细胞系列型基因或发生了体细胞突变的该基因所编码的第一臂。例如，作为这样的第一臂，可以举出具有包含选自序列编号1～5中的氨基酸序列的VH的第一臂。
并且，在这样的“与PD-1特异性结合的第一臂”中，也包含：例如，具有包含与选自序列编号1～5中的任意一个氨基酸序列至少80％相同，优选为至少90％相同，更优选为至少95％相同，进一步优选为至少98％相同，更进一步优选为至少99％相同的氨基酸序列的VH，并且，与原第一臂的VH的氨基酸序列的差异对与PD-1的结合活性没有实质性影响的第一臂(在下文中，有时简称为相同第一臂)。此处，关于氨基酸序列的同一性的比较中使用的“％相同”的定义为：将2个序列比对，与参照的氨基酸序列(此处，在为达到最大的百分比的同一性所必要的情况下，是导入间隔后进行参照的氨基酸序列)相同的氨基酸序列的百分率。此外，此处，“与原第一臂的VH的氨基酸序列的差异对与PD-1的结合活性没有实质性影响”是指，相同第一臂对PD-1的结合活性为原第一臂的该结合活性的95％以上，优选为98％以上，更优选为99％以上。
在其他的形态中，本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”中还包含具有与以下(1)或(2)发生交叉竞合的抗PD-1抗体的可变区域(此处，该可变区域包含构成它的VH和VL)的第一臂，
(1)具有选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH或包含选自序列编号1～5中的氨基酸序列的VH和通用轻链的VL的第一臂对PD-1的结合；
(2)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域对PD-1的结合，
此外，还包含具有其对PD-1的结合通过以下(3)或(4)发生交叉竞合的抗PD-1抗体的可变区域的第一臂，
(3)具有选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH或包含选自序列编号1～5中的氨基酸序列的VH和通用轻链的VL的第一臂；
(4)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域。
此处，“与对PD-1的结合发生交叉竞合”是指，通过对与本说明书中例示的第一臂相同的或一部分重复的表位进行结合，而与其程度无关地抑制该第一臂对PD-1的结合，或就对与该例示的第一臂相同的或一部分重复的表位进行结合的抗体而言，其对PD-1的结合，与其程度无关地被所例示的第一臂抑制，是否发生交叉竞合可以通过竞争结合测定进行评价。例如，可以使用Biacore分析、ELISA测定、流式细胞术、酶联免疫吸附检验法(ELISA)、荧光能量转移测定法(FRET)、荧光微量测定技术(FMAT(注册商标))进行判断。
例如，作为与具有所述(5b)所示的VH和通用轻链的VL的第一臂对PD-1的结合发生交叉竞合的物质，例如，可以举出具有选自所述(1b)～(4b)中的任一个所示的VH和通用轻链的VL(优选为具有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL)的第一臂，还可以举出具有包含选自序列编号1～4中的氨基酸序列的VH和通用轻链的VL(优选为包含序列编号25的氨基酸序列的VL)的第一臂。
此外，例如，作为与具有选自所述(1b)～(4b)中的任一个所示的VH或包含选自序列编号1～4中的氨基酸序列的VH和通用轻链的VL的第一臂对PD-1的结合发生交叉竞合的物质，例如，可以举出具有所述(5b)所示的VH和通用轻链的VL(优选为具有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL)的第一臂，还可以举出具有包含序列编号5的氨基酸序列的VH和通用轻链的VL(优选为包含序列编号25的氨基酸序列的VL)的第一臂。
此处，作为本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”，可以优选地举出具有选自所述(1b)～(5b)中的任一个所示的VH的第一臂，并且，在该优选的第一臂中，如上所述，还包含：在其VH的各CDR中，其任意的1～5个氨基酸残基被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，并且，该氨基酸置换对与PD-1的结合活性没有实质性影响的第一臂，此外，还包含：如上所述，具有VH的框架的氨基酸序列由生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1或生殖细胞系列型J基因JH6c或发生了体细胞突变的这些基因所编码的VH的序列。并且，作为该第一臂，可以更优选地举出具有包含选自序列编号1～5中的任意一个氨基酸序列的VH的第一臂。
并且，本发明中的“与PD-1特异性结合的第一臂”优选包含通用轻链的VL，作为这样的通用轻链，例如优选为IGVK1-39/JK1通用轻链，例如更优选为具有含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL的轻链，例如进一步优选为具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL的轻链。此外，作为通用轻链的恒定区域，可以优选地举出：包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
此外，“与PD-1特异性结合的第一臂”更优选允许PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用。此处，“允许PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用”是指，即使在本发明的PD-1/CD3双特异性抗体以可溶型PD-L1或PD-L2的浓度的20倍以上的量存在的情况下，该PD-L1和PD-1的相互作用、该PD-L2和PD-1的相互作用、或这两种相互作用与本发明的PD-1/CD3双特异性抗体不存在时的该相互作用相比，保持在50％以上，优选保持在70％以上，更优选保持在80％以上。此外，“允许PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用”这一定义有时以与“实质上不抑制PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用”相同的意义进行使用。
为了构建本发明的PD-1/CD3双特异性抗体而取得的抗PD-1单克隆抗体的各克隆与它们的VH的氨基酸序列和其序列编号的对应关系在图5中表示，另外，该抗PD-1单克隆抗体的各克隆的VH中的各CDR的氨基酸序列与其序列编号的对应关系在图6中表示。
与CD3特异性结合的第二臂
在本说明书中，“与CD3特异性结合的第二臂”(在下文中，有时简称为“第二臂”)是指：不论其是否包含在抗体或抗体片段的一部分中或是否不作为一个部分而作为其自身的单体而存在，至少，其是包含与CD3特异性结合的抗体(在下文中，有时简称为抗CD3抗体)的VH并且能够与CD3特异性结合的抗体部分，例如，这样的第二臂包含抗CD3抗体的VH和构成该抗CD3抗体的通用轻链的VL，并且，第二臂中也包含含有该VH和VL的抗体的Fab部分。此处，“与CD3特异性结合”是指至少能够以比1x10-5M，优选1x10-7M，更优选1x10-9M更高的亲和性(解离定数(Kd值))的结合活性与CD3直接结合，且与其他的蛋白质实质上不结合的特征。此外，“与CD3特异性结合的抗体”或“抗CD3抗体”中的“抗体”是指，全长抗体，即，包含以二硫键连接的2条重链和2条轻链的完全长的抗体，优选为其单克隆抗体。
此处，作为这样的“与CD3特异性结合的第二臂”，例如，可以举出：
(1c)具有含有包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3的VH的第二臂。
并且，本发明中的，“与CD3特异性结合的第二臂”还包含：所述(1c)的VH中的各个CDR中任意的1～5个氨基酸残基被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，并且，具有与未被该氨基酸置换前的第二臂对CD3的结合活性实质上同等的结合活性的第二臂。例如，可以举出：在CDR1的情况下，1个氨基酸残基被其他氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，在CDR2或CDR3的情况下，各自的1～5个氨基酸残基被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换的第二臂。此处，“具有与未被该氨基酸置换前的第二臂对CD3的结合活性实质上同等的结合活性”是指，被该氨基酸置换了的第二臂对CD3的结合活性为未被该氨基酸置换的原第二臂的结合活性的95％以上，优选为98％以上，更优选为99％以上。需要说明的是，就第二臂的各VH-CDR中的“以保守氨基酸进行的置换”而言，例如，可以举出上述的第一臂中的氨基酸置换的例子。
并且，本发明中的“与CD3特异性结合的第二臂”还包含具有以下VH的第二臂：在该VH中，包含具有上述的特定氨基酸序列的各CDR，该VH的FR的氨基酸序列由特定的生殖细胞系列型基因或发生了体细胞突变的该基因编码。例如，就所述(1c)的VH而言，其由生殖细胞系列型V基因为IG HV3-33的VDJ重组基因或发生了体细胞突变的该基因所编码。此处，由生殖细胞系列型的V基因IGHV3-33编码的氨基酸序列(序列编号22)如图3所示。并且，作为这样的第二臂，可以举出具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH第二臂。此外，在这样的第二臂中，也包含：例如，具有包含与序列编号36的氨基酸序列至少80％相同，优选为至少90％相同，更优选为至少95％相同，进一步优选为至少98％相同，更进一步优选为至少99％相同的氨基酸序列的VH，并且，与原第二臂的VH的氨基酸序列的差异对与CD3的结合活性没有实质性影响的第二臂(在下文中，有时简称为相同第二臂)。此处，“与原第二臂的VH的氨基酸序列的差异对与CD3的结合活性没有实质性影响”是指，相同第二臂对CD3的结合活性为原第二臂的该结合活性的95％以上，优选为98％以上，更优选为99％以上。
在其他的形态中，本发明中的“与CD3特异性结合的第二臂”还包含具有与以下(1)或(2)发生交叉竞合的抗CD3抗体的可变区域(此处，该可变区域包含构成它的VH和VL)的第二臂：
(1)具有所述(1c)所示的VH或包含序列编号36的氨基酸序列的VH和共有轻链的VL的第二臂对CD3的结合；
(2)包含该VH和VL的与CD3特异性结合的单克隆抗体的可变区域对CD3的结合。
此处，“与对CD3的结合发生交叉竞合”是指，通过对与本说明书中例示的第二臂相同的或一部分重复的表位进行结合，而与其程度无关地抑制该第二臂对CD3的结合。此处，是否发生交叉竞合可以依照关于“与PD-1特异性结合的第一臂”的说明中记载的方法，同样地进行测定。
此处，作为本发明中的“与CD3特异性结合的第二臂”，可以优选地举出具有所述(1c)所示的VH的第二臂，并且，该优选的第二臂中还包含：如上所述，在其VH的各CDR中，其任意的1～5个氨基酸残基被其他氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换，并且，其氨基酸置换对与CD3的结合活性没有实质性影响的第二臂，此外，还包含：如上所述，具有VH的框架的氨基酸序列由生殖细胞系列型基因IGHV3-33或发生了体细胞突变的该基因所编码的VH的第二臂。并且，作为该第二臂，可以更优选地举出具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH的第二臂。
以下，用于构建本发明的PD-1/CD3双特异性抗体的抗CD3抗体的各克隆与它们的VH的氨基酸序列和其序列编号的对应关系在图7中表示，另外，该抗CD3抗体的各克隆的VH中的各CDR的氨基酸序列与其序列编号的对应关系在图8中表示。
本发明中的“与CD3特异性结合的第二臂”优选包含通用轻链的VL，作为这样的通用轻链，例如优选为IGVK1-39/JK1通用轻链，例如更优选为具有含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL的轻链，例如进一步优选为具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL的轻链。此外，作为通用轻链的恒定区域，可以优选地举出，包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
作为本发明中的“与CD3特异性结合的第二臂”，可以优选地举出，与CD3ε特异性结合的第二臂。
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体优选的同种型是IgG抗体，进一步优选为IgG1或IgG4抗体，更进一步优选为IgG1抗体。
作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等优选的形态，例如，可以举出具有以下特征的PD-1/CD3双特异性抗体，其与PD-1特异性结合的第一臂具有：
(A)在选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一个所示的VH中的、选自VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的任意一个或多个CDR中，各自任意的1～5个氨基酸残基可以被其他的氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换的VH；和
(B)含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的通用轻链的VL，且
其与CD3特异性结合的第二臂具有：
(C)在所述(1c)所示的VH中的、选自VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的任一个或多个CDR中，各自任意的1～5个氨基酸残基可以被其他氨基酸(优选为其保守氨基酸)置换的VH；和
(D)含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的通用轻链的VL。
例如更优选为具有以下特征的PD-1/CD3双特异性抗体，其与PD-1特异性结合的第一臂具有：
(A)选自所述(1a)～(4a)或(1b)～(5b)中的任一种VH；和
(B)含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的通用轻链的VL，且
其与CD3特异性结合的第二臂具有：
(C)所述(1c)所示的VH；和
(D)含有包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2和包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的通用轻链的VL。
此外，作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等优选的其他形态，例如，可以举出具有以下特征的PD-1/CD3双特异性抗体，其与PD-1特异性结合的第一臂具有：
(A)包含选自序列编号1～5中的任意一个氨基酸序列的VH，或包含与该VH的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的VH；和
(B)包含序列编号25的氨基酸序列的通用轻链的VL，且，
其与CD3特异性结合的第二臂具有：
(C)包含序列编号36的氨基酸序列的VH，或包含与该VH的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的VH；和
(D)包含序列编号25的氨基酸序列的通用轻链的VL。
作为该其他形态，可以更优选地举出，例如，具有以下特征的PD-1/CD3双特异性抗体，其与PD-1特异性结合的第一臂具有：
(A)包含选自序列编号1～5中的任意一个氨基酸序列的VH；和
(B)包含序列编号25的氨基酸序列的通用轻链的VL，且，
其与CD3特异性结合的第二臂具有：
(C)包含序列编号36的氨基酸序列的VH；和
(D)包含序列编号25的氨基酸序列的通用轻链的VL。
在本发明的PD-1/CD3双特异性抗体中，如果该抗体为IgG1抗体，则优选分别在二条重链恒定区域或铰链区域上，EU编号系统中的第235号的亮氨酸被甘氨酸置换，和/或第236号的甘氨酸被精氨酸置换的IgG1抗体。并且，更优选这些双特异性抗体的重链C末端的氨基酸，例如，EU编号系统中的第447号的赖氨酸缺失了的抗体。此外，如果PD-1/CD3双特异性抗体是IgG4抗体，则优选位于其铰链区域中的、EU编号系统中的第228号的丝氨酸被脯氨酸置换的抗体。
并且，如果这些PD-1/CD3双特异性抗体是IgG1抗体，作为优选的形态，可以举出：具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，并且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换了的IgG1抗体。此外，具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，并且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换了的IgG1抗体同样是优选的。
并且，如果这些PD-1/CD3双特异性抗体是IgG1抗体，作为优选的形态，可以举出：分别在二条重链上的恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸的置换了的IgG1抗体。通过这些氨基酸的置换，可以期待该PD-1/CD3双特异性抗体在血液中的半衰期与未进行所述氨基酸置换的所述抗体相比缩短至少50％，优选缩短至少60％，更优选缩短至少70％，进一步优选缩短至少80％，最优选缩短至少90％。
作为在重链恒定区域中导入了所述氨基酸置换的PD-1/CD3双特异性Ig G1抗体的优选形态，例如，可以举出具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链具有包含选自序列编号23、序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46和序列编号47中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链具有包含选自序列编号24、序列编号48、序列编号49、序列编号50、序列编号51、序列编号52和序列编号53中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域的抗体。这些氨基酸序列中的其中几个在图9中表示。
作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等的形态，最优选本说明书实施例8中制备的克隆PD1-1(Bi)、克隆PD1-2(Bi)、克隆PD1-3(Bi)、克隆PD1-4(Bi)和克隆PD1-5(Bi)以及实施例19中制备的克隆Mut1、克隆Mut2、克隆Mut3、克隆Mut4、克隆Mut5和克隆Mut6。
作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等优选的特征，可以举出：(1)允许PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用；和/或(2)细胞因子的产生被充分减少。此处，“允许PD-1和PD-L1的相互作用、PD-1和PD-L2的相互作用、或这两种相互作用”表示与关于“与PD-1特异性结合的第一臂”的说明中记载的定义相同的意思。另一方面，“细胞因子的产生被充分减少”是指，例如，在将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等通过点滴等投药至静脉内的过程中，或在投药后24小时以内，例如，血中或组织中包含IL-2、IFN-γ和/或TNF-α在内的细胞因子的浓度不增加，即使增加，也在能够通过类固醇投药进行抑制的范围内。
PD-1/CD3双特异性抗体等的制造和提纯方法
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体和其抗体片段可以通过WO2014/051433、WO2013/157953或WO2013/157954中公开的方法制造。
具体而言，可以将分别插入有(1)编码具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链的多聚核苷酸、(2)编码具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链的多聚核苷酸、和(3)编码通用轻链的多聚核苷酸的表达载体转基因至哺乳动物细胞中进行转化，使两条重链和共有轻链同时表达并分泌而制造。
此处，就表达本发明的PD-1/CD3双特异性抗体的宿主细胞而言，只要是能够对表达载体进行转基因，导入的表达载体能够表达的宿主细胞即可。可举出优选为如SF-9和SF-21细胞这样的昆虫细胞，更优选为包含CHO细胞、BHK细胞、SP2/0细胞和NS-0骨髓瘤细胞的小鼠细胞、如COS和Vero细胞这样的灵长类细胞、MDCK细胞，BRL 3A细胞、杂交瘤、肿瘤细胞、不死化的初代细胞、W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或PER.C6这样的胚胎视网膜等哺乳类细胞。需要说明的是，在表达系统的选择中，为了使抗体得到适当的糖基化，有时会使用哺乳类细胞的表达载体和宿主。人类细胞株，优选PER.C6有利地用于获得与人类的糖基化模式一致的抗体。
通过表达载体的转基因而被转化的宿主细胞中的蛋白质的产生，例如，可以参考Current Protocols in Protein Science(1995),Coligan JE,Dunn BM,Ploegh HL,Speicher DW,Wingfield PT,ISBN 0-471-11184-8，Bendig,1988进行实施，并且，为了使宿主细胞的培养生产性达到最大，一般的指标、步骤和实用方法可以参考Mammalian CellBiotechnology:a Practical Approa ch(M.Butler,ed.,IRL Press,1991)进行实施。宿主细胞中的抗体表达，例如，在EP0120694、EP0314161、EP0481790、EP0523949、US4816567和WO2000/63403等的公开公报有所记述。
此处，宿主细胞的培养条件可以通过公知的方法进行最优化，可以对蛋白质的生产量进行最优化。就培养而言，例如，可以在培养皿、滚瓶或反应槽中，以分批培养、流加培养、连续培养、使用中空纤维的培养等方式实施。为了通过细胞培养进行大规模且连续的重组蛋白的生产，优选使细胞在悬浮液中增殖。此外，优选在没有来源于动物或人类的血清或来源于动物或人类的血清的构成要素的条件下进行细胞培养。
在宿主细胞中表达并通过公知的方法从该细胞或细胞培养基中回收的抗体，可以使用公知方法进行提纯。提纯方法包含免疫沈降法、离心分离法、过滤、尺寸排除色谱法、亲和性色谱法、阳离子和/或阴离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法等。并且，存在优选使用protein A或protein G亲和性色谱法的情况(例如，参照US4801687和US5151504)。
[药物的用途]
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等在自身免疫疾病或移植物抗宿主病(GVHD)的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗中有效。
作为本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等能够预防、症状进展抑制和/或治疗的自身免疫疾病，例如，可以举出白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎、显微镜下多血管炎)、主动脉炎综合征(高安动脉炎)、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎(例如，韦格纳肉芽肿和嗜酸性韦格纳肉芽肿)、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病(例如，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰岛炎等)、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病(格雷夫斯病(甲亢))、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病(慢性肾上腺皮质功能减退症)、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病(成人隐匿性自身免疫性糖尿病)、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病)、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症和包涵体肌炎等。
本发明中“治疗”是指，例如，使某种疾病或其症状治愈或改善，“预防”是指，将某种疾病或症状的出现防范于未然或延迟一定的时间，“症状进展抑制”是指抑制症状的进展或恶化而使病态的进展停止。需要说明的是，“预防”的意义中也包含再发抑制。“再发抑制”是指，防止某种疾病或症状的再发或减轻再发的可能性。
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等，通常，对全身或局部，以非经口的形式进行投药。作为所述投药方法，具体而言，可以举出注射投药、经鼻投药、经肺投药、经皮投药等。作为注射投药，例如，可以举出静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射等，在静脉内注射的情况下，优选通过点滴进行的投药。其投药量根据年龄、体重、症状、治疗效果、投药方法、处理时间等而不同，通常，成人每人每次，以0.1μg/kg到300mg/kg的范围，特别优选为以0.1mg/kg到10mg/kg的范围，一天一次到数次进行非经口投药，或以一天30分钟到24小时的范围对静脉进行持续投药。当然如上所述，投药量会因各种条件而变动，存在比所述投药量少的量就足够的情况，或需要以超过所述范围的量进行投药的情况。
制剂
在本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等以注射剂或用于点滴的输液的形式制剂化而进行使用的情况下，该注射剂或输液可以是水溶液、悬浮液或乳浊液中任一种形态，此外，也可以与药学上允许的载体一同，以固形剂的形式而制剂化，通过在使用时添加溶剂，进行溶解、悬浮或乳浊而使用。作为注射剂或用于点滴的输液中使用的溶剂，例如，可以使用注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液和等渗液(例如，氯化钠、氯化钾、丙三醇、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等溶液)等。
此处，作为药学上允许的载体，例如，可以举出稳定剂、增溶剂、悬浮化剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、保存剂、防腐剂、pH调整剂和抗氧化剂等。作为稳定剂，例如，可以使用各种氨基酸、白蛋白、球蛋白、明胶、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、二丁基羟基甲苯等。作为增溶剂，例如，可使用酒精(例如，乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如，Polysorbate 20(注册商标)、Polysorbate 80(注册商标)、HC O-50等)等。作为悬浮化剂，例如，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠。作为乳化剂，例如，可以使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为舒缓剂，例如，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇。作为缓冲剂，例如，可以使用磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、谷氨酸缓冲液、ε-氨基己酸缓冲液。作为保存剂，例如可以使用对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等。作为防腐剂，例如，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。作为pH调整剂，例如，可以使用盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等。作为抗氧化剂，例如，可以使用(1)抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠等这样的水溶性抗氧化剂；(2)抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯和α-生育酚等这样的油溶性抗氧化剂和(3)柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸和磷酸等这样的金属螯合剂等。
用于注射剂或点滴的输液可以通过在其最终工序中进行灭菌或通过无菌操作法而制造，例如，以过滤器等进行过滤而灭菌，再充填至无菌的容器中。此外，就注射剂或用于点滴的输液而言，也可以是将通过真空干燥和冻结干燥而得无菌粉末(可以包含药学上允许的载体的粉末)，在使用时溶解在适当的溶剂中而使用。
组合使用或配合剂
并且，本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等也可以与在自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗中使用的其他药剂一起组合使用。本发明中，就与其他药剂一起组合使用时(组合使用)的投药方式而言，可以是在1种制剂中配合两种成分的配合剂的方式，或以独立的制剂的形式而进行投药的方式。通过该组合使用，可以对其它的药剂的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗效果进行补充，或使投药量或投药次数保持或降低。本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等与其他药剂分别进行投药时，可以在一定期间内同时投药，然后，只投药PD-1/CD3双特异性抗体等或只投其药他药剂。此外，可以先投药本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等，其投药结束后再投药其他药剂，也可以先投药其他药剂，其投药结束后再投药本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等，各自的投药方法可以相同也可以不同。可以以包含本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等的制剂和包含其他药剂的制剂的试剂盒的形式进行提供。此处，其他药剂的投药量可以以临床上使用的用量为基准，适宜进行选择。此外，就其他药剂而言，可以将任意2种以上以适宜的比例进行组合而投药。此外，所述其他药剂中不仅包含目前发现的物质，也包含今后将会被发现的物质。
例如，在将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等适用于I型糖尿病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗中的情况下，可以与选自胰岛素制剂(例如，人类胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素等)、磺酰脲类剂(例如，格列本脲、格列齐特、格列美脲等)、速效型胰岛素分泌促进药(例如，那格列奈等)、双胍制剂(例如，二甲双胍等)、胰岛素抵抗性改善剂(例如，吡格列酮等)、α-葡萄糖苷酶抑制药(例如，阿卡波糖、伏格列波糖等)、糖尿病性神经症治疗药(例如，依帕司他、美西律、咪达普利等)、GLP-1类似物制剂(例如，利拉鲁肽、艾塞那肽、利西拉肽等)和DPP-4抑制剂(例如，西格列汀、维格列汀、阿格列汀等)等中的任何一种以上的药剂进行组合使用。
此外，例如，在将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等适用于多发性硬化症的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗的情况下，可以与选自类固醇药物(例如，可的松、醋酸可的松、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、醋酸氟氢可的松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙琥珀酸钠、醋酸泼尼松龙丁酯、泼尼松龙磷酸钠、醋酸氟氢可的松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、琥珀酸甲泼尼龙、去炎松、醋酸去炎松、曲安奈德、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松戊酸酯、Dexamethasone cipecilate、地塞米松棕榈酸酯、地塞米松丙酸酯、地塞米松磷酸钠、地塞米松间磺基苯甲酸酯钠、帕拉米松、帕拉米松醋酸酯、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他塞酮醋酸酯、倍他米松丁酸酯丙酸酯和倍他米松磷酸钠等)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、甲氨蝶呤、克拉屈滨、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素、咪唑立滨、他克莫司、芬戈莫德和阿仑单抗等中的任何一种以上的药剂进行组合使用。
此外，例如，在将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等适用于全身红斑狼疮的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗的情况下，可以与选自类固醇药(例如，以上记载的类固醇药)、免疫抑制剂(例如，环孢素、他克莫司、芬戈莫德等)和贝利木单抗中的任何一种以上的药剂进行组合使用。
例如，在将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等适用于类风湿关节炎的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗的情况下，可以与选自类固醇药(例如，以上记载的类固醇药)、抗类风湿药(例如，甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、布西拉明、来氟米特、咪唑立宾、他克莫司等)或抗细胞因子药(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、托珠单抗、依那西普、戈利木单抗、赛妥珠单抗等)和阿巴西普等中的任何一种以上的药剂进行组合使用。
在适用于其它的自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗的情况下，可以将本发明的PD-1/CD3双特异性抗体等和以上记载的其他药剂中的任何一种以上进行组合使用。
接下来将通过以下的实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围不受其限制。对本领域技术人员而言，基于本发明的记载的各种变更、修改都是可能的，这些变更、修改也包含在本发明中。
实施例
实施例1：使用重组人类PD-1-Fc融合蛋白的对MeMo(注册商标)小鼠进行的免疫
作为取得本发明的与PD-1特异性结合的第一臂的方法，选择了用重组人类PD-1蛋白质使MeMo(注册商标)小鼠(参照WO2009/157771)免疫的方法。MeMo(注册商标)小鼠是进行了如下基因编辑的小鼠：使包含非重组人类重链V基因区域、D基因区域和J基因区域以及重组人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖细胞系列型基因的基因片段连接至小鼠恒定区域基因中。通过用抗体的靶标蛋白进行直接免疫，能够使其产生包含具有多样性的重链和通用轻链的抗体。
在12～16周龄的12匹MeMo(注册商标)MS5B/MS9小鼠中，使用GerbU adjuvant MM(GerbUBiotechnik，型号#3001)进行了乳化，使用重组人类PD-1-Fc融合蛋白(R&DSystems，型号1086-PD)以14天的间隔分别进行了免疫。在免疫第0天、第14天和第28天使用该重组人类PD-1-Fc融合蛋白进行皮下投药，在之后的时间点，使用溶解在PBS中的该重组人类PD-1-Fc融合蛋白进行了皮下投药。在免疫第21天、第35天、第56天、第77天和第98天，通过使用了人类PD-1强制表达HEK293T细胞株的流式细胞术，对血清中抗体效价进行了评价。在对1000倍稀释的血清中的人类PD-1强制表达HEK293T细胞株进行了染色的情况下，将与作为对照的人类PD-1非表达HEK293T细胞株相比，MFI值增加至3倍以上的小鼠的淋巴组织用于噬菌体展示·文库的构建。对于满足进入文库构建标准的小鼠，在抗体效价评价日之后的3天之间，使用重组PD-1-Fc融合蛋白进行追加免疫，并对其脾脏和腹股沟淋巴结进行了回收。对于针对人类PD-1和食蟹猴PD-1的血清中抗体效价为1/100以上，并且进行了追加免疫后抗体效价不上升的小鼠，也回收了其脾脏和腹股沟淋巴结。从这些淋巴组织提取RNA后，进行了cDNA的合成。
实施例2：用于取得具有与PD-1特异性结合的第一臂的抗PD-1抗体的噬菌体展 示·文库的构建(蛋白免疫)
使用实施例1中制备的DNA，并使用对免疫球蛋白重链可变区域家族特异的引物进行了PCR反应。用制限酶SfiI和XhoI切断该PCR产物后，将其插入使用同样的制限酶进行了切断的MV1473噬菌粒载体[包含编码通用轻链的基因(人类κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖细胞系列型基因)]中，构建了所述文库。
实施例3：具有与PD-1特异性结合的第一臂的抗PD-1抗体的筛选
使用涂覆有人类PD-1-Fc融合蛋白、人类PD-1-His tag融合蛋白、食蟹猴PD-1-Histag融合蛋白或小鼠PD-1-His tag融合蛋白的板(plate)，实施了基于针对PD-1的结合性的噬菌体筛选。在使用人类PD-1-Fc融合蛋白的情况下，在其与噬菌体孵育时，通过添加人类IgG(SIGMA，型号I4506)，对Fc反应性克隆进行了吸收。对针对人类PD-1、食蟹猴PD-1和小鼠PD-1进行结合的结合噬菌体进行了浓缩。通过使用食蟹猴PD-1表达HEK293T细胞株的筛选，对与食蟹猴PD-1结合的噬菌体进行了浓缩。使用通过筛选而得到的噬菌体,取得转化了的大肠菌株TG1的克隆，并制备了母板(master plate)。
并且，基于在吸附有人类PD-1-Fc融合蛋白的板上对PD-1的结合性，从通过所述筛选而得到的克隆的周质提取物中，实施了噬菌体筛选。需要说明的是，作为选择的基准，将相对于阴性对照孔(PBS)中得到的信号(OD450值)，得到3倍以上的信号的克隆作为阳性克隆。
实施例4：具有与PD-1特异性结合的第一臂的抗PD-1抗体的候补克隆的DNA测序
对通过实施例3的筛选取得的阳性克隆的重链可变区域基因进行了DNA测序。解析的DNA序列分类为超级集群(CDR3的长度相同，CDR3的氨基酸序列有70％以上相同的群)和集群(重链CDR3的氨基酸序列相同的群)。取得了924个克隆，它们被分类为146种超级集群和194种集群。
实施例5：基于针对PD-1表达细胞的结合性评价的筛选
从分类的各个超级集群中，筛选满足以下的条件的抗PD-1单克隆抗体克隆，并进行纯化。
(1)CDR区域中导入有高频率的体细胞突变、
(2)具有使用频率较高的VH的生殖细胞系列型基因、和
(3)在针对人类PD-1-Fc融合蛋白的结合性筛选中得到了高信号。
使用它们的周质提取物中包含的Fab片段，通过以抗小鼠IgG多克隆抗体进行检测，对其针对人类PD-1表达CHO-S细胞株、食蟹猴PD-1表达CH O-S细胞株的结合性进行了评价。在进行了评价的117个克隆(105种集群)中，包含抗PD-1单克隆抗体克隆PD1-1、PD1-2、PD1-3和PD1-4的22个克隆的针对人类PD-1表达CHO-S细胞株的结合性得到了承认。
实施例6：具有与PD-1特异性结合的第一臂的抗PD-1单克隆抗体的氨基酸置换体 的制备
就克隆PD1-1和PD1-4而言，其重链可变区域的框架4中包含脱酰胺化基序(motif)(Asn-Gly)。为了取得脱酰胺化的风险得到减低的第一臂，制备使该脱酰胺化基序变异了的变异体。通过公知的定点变异法，制备了克隆PD1-4的EU编号系统中的第119号的天冬酰胺(Asn)变异为谷氨酰胺的克隆PD1-5，并进行了纯化。该克隆对人类PD-1表达CHO-S细胞的结合性与克隆PD1-4同等。
实施例7：具有与CD3特异性结合的第二臂的抗CD3单克隆抗体的筛选
基于包含WO2005/118635中记载的抗CD3抗体克隆15C3的VH和IGV K1-39/JK1通用轻链的抗CD3抗体克隆，且为了取得电荷不均一性进一步降低的、稳定的CD3结合Fab，使用下述的方法，取得了具有本发明的“与CD3特异性结合的第二臂”的抗CD3抗体。
通过将图10所示的15C3的VH的氨基酸序列中下划线所示的第55个甘氨酸置换为丙氨酸，取得了具有与所述抗CD3抗体克隆同等的人类CD3结合性，并且电荷不均一性得到改善的抗CD3抗体克隆CD3-1。
并且，为了获得与通用轻链(IgVκ1-39*01/IGJκ1*01)的VH/VL相互作用得到了改善的多种CD3结合Fab，构建了表达多种基于克隆CD3-1的VH的、包含其氨基酸残基被置换了的克隆CD3-1的VH变异体的Fab的噬菌体展示·文库。使用HBP-ALL细胞或重组人类CD3ε-Fc蛋白，对该噬菌体文库进行了筛选。使与重组人类CD3ε-Fc蛋白结合的噬菌体化学溶出，用于细菌的再感染。取出多个存活的细菌菌落后，对噬菌体进行提取，通过流式细胞术基于与细胞表面表达CD3的结合进行了筛选。对于表现CD3结合的全部噬菌体，进行菌落PCR，扩增编码VH的cDNA，确定了其DNA序列。
其结果，取得的具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH的抗CD3抗体克隆CD3-2表现出了与克隆CD3-1同等的CD3结合性和电荷均一性。
实施例8：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的制备
表达与PD-1特异性结合的第一臂的各自的重链的表达载体如下制备：将实施例5中选择的编码抗PD-1单克隆抗体克隆PD1-1～PD1-5和PD1-6的各自的重链可变区域的DNA，分别与编码IgG1重链恒定区域的DNA连接。另一方面，表达与CD3特异性结合的第二臂的重链表达载体如下制备：将实施例7中选择的抗CD3单克隆抗体克隆中编码CD3-2的重链可变区域的DNA与编码IgG1重链恒定区域的DNA连接。此处，在表达这些重链恒定区域的基因中，与PD-1特异性结合的第一臂使用了表达具有L351D/L368E变异(DE变异)的Fc区域的，与CD3特异性结合的第二臂使用了表达具有L351K/T366K变异(KK变异)的Fc区域的。以使其包含编码IGVK1-39/JK1通用轻链的基因的方式构建这些表达载体，以使得IGVK1-39/JK1通用轻链也一起表达。并且，在表达这些重链恒定区域的基因中，为了使Fc效应子活性消失，分别，以使重链恒定区域的第235号的亮氨酸置换为甘氨酸，第236号的甘氨酸置换为精氨酸的形式进行了编辑，并且，为了避免翻译后的加工，因此进行了使重链恒定区域C末端第447号的赖氨酸缺损的编辑。将这些表达载体一同导入Free Style 293F细胞中，使其在培养上清中产生抗体。对培养上清进行回收，通过以protein A亲和色谱法进行处理，对作为本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的克隆PD1-1(Bi)、克隆PD1-2(Bi)、克隆PD1-3(Bi)、克隆PD1-4(Bi)和克隆PD1-5(Bi)分别进行了提纯。此外，克隆PD1-6(Bi)也通过同样的方法进行了制备。需要说明的是，就这些PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆而言，就具有来源于其制备中使用的抗PD-1单克隆抗体克隆PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4和PD1-5以及PD1-6的、与PD-1特异性结合的第一臂这点而言，分别与这些抗PD-1单克隆抗体克隆对应。
实施例9：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的结合性评价
通过在使用了人类IgG1-Fc融合人类PD-1细胞外区域重组蛋白或6×His tag融合食蟹猴PD-1细胞外区域重组蛋白的Biacore(注册商标)测定，对实施例8中取得的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的第一臂的、针对各PD-1重组蛋白的结合亲和性进行了评价。需要说明的是，该重组蛋白的固定化使用了Series S Sensor Chip CM5传感器芯片(GEhealthcare，型号29-1049-88)。同样地，通过使用了人类IgG1-Fc融合CD3δ/CD3ε细胞外区域重组蛋白的Biac ore(注册商标)测定，对该抗体的第二臂的CD3结合亲和性进行了评价。各克隆的第一臂对PD-1的结合亲和性(Kd值)以及第二臂对CD3δ/CD3ε的结合亲和性如图11所示。
实施例10：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的结合性确认
确认了实施例8中取得的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体能够同时与PD-1和CD3各自进行特异性结合。
首先，对于表达人类CD3的人类PD-1缺失Jurkat细胞株(人类T细胞株)，分别添加克隆PD1-1(Bi)～PD1-6(Bi)，在冰上孵育15分钟。清洗细胞后，添加标记有3倍量的生物素的可溶性PD-1重组蛋白(R&D systems，型号1086-PD-050)，在冰上孵育15分钟。清洗细胞后，添加Alexa Fluor 488标识链霉亲和素(BioLegend，型号405235)1.25μg/mL 100μL，在冰上孵育15分钟。清洗细胞后，使用流式细胞术对可溶性PD-1重组蛋白的结合量进行了评价。该测定的结果如图12所示。
所以克隆都同时与PD-1和CD3结合。需要说明的是，未检测到该实验体系的非特异性结合。
实施例11：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的第一臂的结合特性评价
为了评价对实施例8中取得的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的第一臂对PD-1/PD-L1结合的影响，进行了该双特异性单克隆抗体克隆和可溶性PD-L1重组蛋白对PD-1的结合的竞争结合测定。首先，对人类PD-1表达CHO-S细胞株分别添加克隆PD1-1(Bi)～PD1-6(Bi)，在冰上孵育30分钟。并且，添加标记有1/20量的生物素的可溶性PD-L1重组蛋白(R&Dsystems，型号156-B7-100)，在冰上孵育30分钟。清洗细胞后，添加PE标识链霉亲和素(BDPha rmingen，型号554061)，在冰上孵育30分钟。清洗细胞后，使用流式细胞术对可溶性PD-L1重组蛋白的结合量进行了评价。其结果如图13所示。
即使克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)以相对于可溶性PD-L1重组蛋白20倍的量存在，还是允许了可溶性PD-L1重组蛋白对PD-1的结合。另一方面，PD1-6(Bi)在同一条件下完全抑制了可溶性PD-L1重组蛋白对PD-1的结合。
实施例12：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体对活化CD4 T细胞的体外(in vitro)抑 制作用
使用来源于健康人外周血的CD4阳性T细胞(LONZA，型号2W-200)(人类T细胞)，评价其对活化T细胞的IFN-γ产生的抑制作用。向固相化有抗人类TCRVβ8抗体(ThermoScientific，型号TCR1750)的细胞培养板中接种人类T细胞，添加抗人类CD28抗体(BioLegend，型号302923)，进行了72小时的活化处理。接下来，将进行了该活化处理的人类T细胞用包含100Units/mL人类IL-2(R&D systems，型号202-IL)的新鲜培养基培养一晚上。并且，将回收的人类T细胞接种至固相化有抗人类TCRVβ8抗体的其他细胞培养板中，同样地添加抗人类CD28抗体，再次进行了活化处理。此时，在分别添加克隆PD1-1(Bi)～PD1-6(Bi)后，使用ELISA法对再活化处理96小时后的培养上清中包含的IFN-γ进行了定量(pg/mL)。其结果如图14所示。对于克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)，IFN-γ产生抑制作用得到了确认。观察到了克隆PD1-6(Bi)的抑制作用与其他克隆相比有减弱的倾向。需要说明的是，作为对照抗体，使用了通过与第一臂的取得方法同样的手法用破伤风类毒素进行免疫而取得的抗体作为非特异性抗体。
实施例13：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的实验性过敏性脑脊髓炎小鼠模型(EAE 模型)中的体内(in vivo)作用
在使用了将CD3ε和PD-1的各基因分别置换为人类CD3ε和人类PD-1基因的人类CD3ε/人类PD-1敲入C57BL/6小鼠的EAE模型中，对本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的体内作用进行了评价。将结核死菌H37Ra(BD Biosciences，型号231141)和不完全弗氏佐剂(BD Biosciences，型号263910)混合，制备了含有4mg/mL的结核死菌H37Ra完全弗氏佐剂(CFA)。将1mg/mL的MOG肽(ANASPEC，型号AS-60130)和等量的CFA混合以制备乳液，以此作为EAE模型的引发剂。使用200μL的该引发剂对该C57BL/6小鼠尾根部进行皮下投药，在该免疫处理当天和第2天，分别将200μL的1μg/mL百日咳毒素(SIGMA-ALDRICH，型号P7208)投药至尾静脉内。接下来，对于该C57BL/6小鼠，使用克隆PD1-1(Bi)～PD1-6(Bi)，在免疫处理的第6天和第7天，分别以2mg/kg的投药量，对腹腔内进行1天1次的投药。免疫处理日之后，依照大贯等的方法对神经症状进行了评价(Onuki M，et al.,Microsc Res Tech 2001；52:731-9.)。对神经症状的程度进行了分值化(正常：分值为0；尾弛缓：分值为1；后肢部分麻痹：分值为2；后肢麻痹：分值为3；前肢麻痹：分值为4和濒死或死亡：分值为5)，确认到多种神经症状时采用较高的值作为评价日的神经症状分值。需要说明的是，死亡例是在试验结束之前神经症状分值为5的情况。图15～17表示该评价的结果。需要说明的是，人类CD3ε/人类PD-1敲入C57BL/6小鼠如下制备：通过公知的方法使依照Genesis.2009Jun；47(6):414-22中记载的方法所制备的人类CD3ε敲入小鼠和人类PD-1敲入小鼠交配。
克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)显著抑制了EAE模型中神经症状的发作，但克隆PD1-6(Bi)没有表现出显著的抑制效果。
实施例14：对于人外周血单核细胞的细胞因子释放的、PD-1/CD3双特异性单克隆 抗体的体外作用的评价
以对PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的细胞因子释放活性进行解析为目的，进行了将本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆或专利文献3中公开的PD-1/CD3双特异性scDb(J110×UCHT1)添加至人外周血单核细胞(在下文中，人类PBMC)中的添加实验。向人类PBMC(LONZA，型号CC-2702)中分别添加PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆和J110×UCHT1以达到30μg/mL和10μg/mL的浓度，进行24小时的培养。使用多重免疫测定(BIO-RA D，型号M50000007A)对培养24小时后的培养上清中包含的IL-2进行了定量。其结果如图18所示。需要说明的是，图中的IL-2产生量(pg/mL)是以平均值±标准误差(N＝3)的形式表示的。
J110×UCHT1显著诱导了IL-2的产生，与之相比，基于PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆的IL-2的产生都较低。
实施例15：对于PD-1/CD3双特异性单克隆抗体各克隆对PD-1的结合的、PD1-5(Bi) 的交叉竞合性的评价
为了评价PD1-5(Bi)对实施例8中取得的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的各克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)与PD-1的结合的交叉竞合性，进行了竞争结合测定。
首先，对人类PD-1表达CHO-S细胞株添加克隆PD1-5(Bi)，在冰上孵育20分钟。并且，对于添加了的克隆PD1-5(Bi)，分别添加1/100量的生物素标记的克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)，在冰上孵育20分钟。清洗细胞后，添加PE标记的链霉亲和素(BD Pharmingen，型号554061)在冰上孵育20分钟。清洗细胞后，使用流式细胞术对生物素标记的克隆PD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)的结合量进行了评价。其结果如图19所示。
PD1-5(Bi)抑制了克隆PD1-1(Bi)～PD1-4(Bi)对PD-1的结合，该克隆表现出了对克隆PD1-1(Bi)～PD1-4(Bi)与PD-1的结合的交叉竞合。
实施例16：人外周血单核细胞移植超免疫缺陷小鼠中的PD-1/CD3双特异性单克隆 抗体的体内作用
对移植了人外周血单核细胞(PBMC)的超免疫缺陷小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，以下，称为NSG小鼠)，投药本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体，对体内情况下对T细胞增殖的作用进行了评价。
对于每一只小鼠进行以下操作：将1×107个人类PBMC(LONZA，型号CC-2702)悬浮至DPBS中，移植至NSG小鼠的腹腔内。分别对该NSG小鼠各4例，使用对照抗体或PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)，在移植后第3、7、10、14和17天，进行1天1次的腹腔内投药。在移植后第14或21天使该NSG小鼠吸入异氟醚进行麻醉，取出了脾脏。使用70μm的细胞过滤器(BD Falcon)从脾脏中纯化细胞。向制备的细胞悬浮液中添加以APC-Cy7进行了荧光标记的抗CD4抗体(Biolegend，型号300518)或以FITC进行了荧光标记的抗CD8抗体(Biolegend，型号301006)，使用流式细胞仪(BD Biosciences，机种BD LSR Fortessa X-20)和解析软件FlowJo(Biolegend，型号300518社)，对人类CD4阳性细胞数和人类CD8阳性细胞数进行了测定。图20中表示了该评价的结果。
无论在人类PBMC移植后第14还是21天，与对照抗体投药组相比，PD1-5(Bi)投药组的脾脏中的人类CD4阳性细胞数和人类CD8阳性细胞数都显著减少，克隆PD1-5(Bi)表现出了对这些细胞的细胞数增加的抑制作用。
实施例17：小鼠抗体产生模型中的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的体内作用
对实施例13中制备的人类CD3ε/人类PD-1敲入C57BL/6小鼠，投药本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体，评价了体内情况下对抗体产生的作用。
将钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)(Thermo Scienctific，型号77600，以下称为KLH)溶解在DPBS中制备了200μg/mL的KLH溶液，进一步将其与等量的ALUM(Cosmo bio，型号LG-6000)在室温下混合30分钟，以此作为引发剂。对该小鼠，使用该引发剂200μL，进行腹腔内投药以进行免疫处理。使用对照抗体或PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)，在免疫后第7和8天，进行1天1次的腹腔内投药。在免疫后第7～374天，从小鼠尾静脉中采集血液50～80μL，并制备血清。用ELISA法测定血清中的抗KLH抗体(IgG1)效价。即，将KLH固相化，作为与KLH结合的抗KLH抗体，使用HRP标识抗小鼠IgG1抗体(BethylLaboratories，型号A90-105P-38)进行了检测。图21中表示了该评价的结果。
对于该小鼠的抗KLH抗体产生，PD1-5(Bi)表现出了抑制效果。此外，显著的抑制效果持续到了免疫后第360天。
实施例18：自然发病糖尿病模型小鼠中的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体的体内作 用
向自然发病糖尿病的人类CD3ε/人类PD-1敲入NOD小鼠中，投药本发明的PD-1/CD3双特异性单克隆抗体，评价了体内情况下对血糖值变化的作用。
对于该NOD小鼠，从16周龄开始，每周1次，用剃刀割伤尾静脉以采集5～10μL的血液，使用Accucua Aviva(注册商标)(Roche)测定了血液中的葡萄糖浓度。将血中葡萄糖浓度连续2次显示为200mg/dL以上(高血糖域)的小鼠认定为糖尿病发病。对被认定发病的个体各7例，使用对照抗体或PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)，进行2天的腹腔内投药。投药开始后，以每周1次的频率进行采血，对血中葡萄糖浓度进行了测定。以血中葡萄糖浓度不足200mg/dL的范围为正常血糖区域。图22表示了该评价的结果。需要说明的是，该NOD小鼠是通过使实施例13中分别制备的人类CD3ε敲入小鼠、人类PD-1敲入小鼠以及NOD/ShiJcl小鼠以公知的方法进行交配而制备的。
在投药开始后第7、8周的时间点，PD1-5(Bi)投药组与对照抗体投药组相比，正常血糖域的例数显著地更多，表现出了PD1-5(Bi)在糖尿病发病后的投药的治疗效果。
实施例19：对人类FcRn结合部位的氨基酸导入了变异的PD-1/CD3双特异性单克隆 抗体的制备和FcRn结合性评价
使用参照氨基酸置换的公知技术的方法，制备了将PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆PD1-5(Bi)的重链恒定区域中的EU编号系统中的第252号的蛋氨酸分别置换为谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸的抗体克隆Mut1、Mut2、Mut3和Mut4。并且，使用同样的方法分别制备了该克隆PD1-5(Bi)的重链恒定区域中的EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换的抗体克隆Mut5，第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换的抗体克隆Mut6。
接下来，使用表面等离子体共振评价了这些抗体克隆针对人类FcRn或小鼠FcRn的结合亲和性。在Biacore T200(GE healthcare)中设置Biotin CAPtur e Kit(GEhealthcare，型号28-9202-34)的Series S Sensor Chip CAP，分别使Human FcRn-humanB2M(Immunitrack，型号ITF01)和Murine FcRn-murine B2M(Immunitrack，型号ITF07)固定化。在pH6.0的条件下分别对PD1-5(Bi)和Mut1～Mut6的结合性进行了评价。针对人类FcRn的结合性实验结果如图23和24所示，针对小鼠FcRn的结合性实验结果如图25所示。
Mut1～Mut6针对人类FcRn的各亲和性，与PD1-5(Bi)(解离定数(KD值)：2.75×10- 8M)相比有所降低，特别是，Mut4和Mut2显著降低。Mut1和Mut4针对小鼠FcRn的各亲和性与PD1-5(Bi)(KD值：1.61×10-8M)相比有所降低(Mu t1的KD值：4.67×10-8M)，特别是，Mut4显著降低。
实施例20：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆Mut4的血中动态
使用实施例13中制备的人类CD3ε/人类PD-1敲入C57BL/6小鼠，对克隆Mut4的体内血中动态进行评价。
将该克隆投药至该C57BL/6小鼠的尾部静脉内，之后在30分钟以及1、2、4、8、24和288小时的时间点，用剪刀剪伤小鼠尾静脉的一部分，采集约40μL的血液，装入肝素处理后的离心管。将采集的血液进行离心分离以制备血浆，使用电化学发光(ECL)法测定了该克隆的血浆中浓度。根据血浆中浓度的推移，计算出其血中半衰期。
测定的结果，该克隆的血中半衰期为8.0小时，与原来的PD1-5(Bi)的血中半衰期约160小时相比有所缩短。
实施例21：PD-1/CD3双特异性单克隆抗体克隆Mut4的EAE模型中的体内作用
在依照实施例13记载的方法制备的EAE模型中，对体内情况下的克隆Mut4的作用进行了评价。
对该EAE模型小鼠各8例，在免疫后第6～10天的5天内，使用对照抗体或克隆Mut4，进行1天1次的腹腔内投药。对于免疫处理日之后的该小鼠的神经症状，依照大贯等的方法(Onuki M，et al.,Microsc Res Tech 2001；52:731-9.)以实施例13记载的方法进行评价，统计了免疫处理日到免疫后第30天的观察期间的累积神经症状分值。图26表示了该评价的结果。
克隆Mut4显著地抑制了EAE模型中的神经症状。
工业实用性
本发明的PD-1/CD3双特异性抗体或其抗体片段在自身免疫疾病等的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗中是有用的。
序列表
<110> ONO PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> 双特异性抗体
<130> P20-110WO
<150> JP 2019-139751
<151> 2019-07-30
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
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115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 智人
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
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<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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<400> 30
cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
ggt ttg cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg ctc aac acc aac act gag aac cca acg ttt gcc cag ggc ttc 192
Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe
50 55 60
aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atc agc agc ctg aag gct gag gac act gcc gta tat tac tgt 288
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336
Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His
100 105 110
ttc atg gac gtc tgg ggc aac ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt 381
Phe Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 31
cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gtc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Val
1 5 10 15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
ggt tta cat tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg atc aac acc aac act ggg aac cca acg tat gcc cag ggc ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atc agc agc cta aag gct gaa gac act gcc gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg gat tta gta gta cca act act ata tgg aac tac tac cac 336
Ala Arg Gly Asp Leu Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr His
100 105 110
tac atg gag gtc tgg ggc aaa ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt 381
Tyr Met Glu Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg atg gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96
Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
gct ttg cat tgg gtg cgc cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg ctc aat acc aac act gag aat cca acg tat gcc cag ggc ttc 192
Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
aca gga cgg ttt gtc ttc tcc ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atc aac agc cta aag gct gag gac act gcc gtg tat tac tgt 288
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga ggg gat atg gta gta cca act act ata tgg aac tac tac tac 336
Ala Arg Gly Asp Met Val Val Pro Thr Thr Ile Trp Asn Tyr Tyr Tyr
100 105 110
tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agt 381
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg tct gag ttg aag cag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
gct ttg cat tgg ttg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg ctc aac acc aac act gag aac cca acg ttt gcc cag ggc ttc 192
Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Glu Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe
50 55 60
aca gga cgt ttt gtc ttc tct ttg gac acc tct gtc acc acg gca tat 240
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atc agc agc ctg aag gct gag gac act gcc gta tat tac tgt 288
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336
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100 105 110
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<213> 智人
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<221> CDS
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Pro Gly Ala
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tca gtg aag gtt tcc tgt aag gct tct gga tac acc ttc act cac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
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gct ttg cat tgg ttg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144
Ala Leu His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
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Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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gcg aga ggg gat atg gta gta ccg act act ata tgg aac tac tac cac 336
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
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gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
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1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 智人
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Gln Ile Trp Tyr Asn Ala Arg Lys Gln Glu Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Arg Gly Thr Gly Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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<213> 智人
<400> 37
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1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Gln Ile Trp Tyr Asn Ala Arg Lys Gln Glu Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 智人
<400> 39
Gly Thr Gly Tyr Asn Trp Phe Asp Pro
1 5
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<213> 智人
<220>
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cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc ggc gga gtg gtg cag ccc ggc aga 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
agc ctg aga ctg agc tgc gtg gcc agc ggc ttc acc ttc agc agc tac 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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ggc atg cac tgg gtc cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Ala Gln Ile Trp Tyr Asn Ala Arg Lys Gln Glu Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Gly Thr Gly Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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<210> 43
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<212> PRT
<213> 智人
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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325
<210> 44
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asp Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 46
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Leu His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 47
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr
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260 265 270
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Glu Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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195 200 205
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<213> 智人
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Pro Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 51
<211> 329
<212> PRT
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<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asp Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 52
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Gly Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Leu His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 53
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Glu Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325

Claims (39)

1.一种双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂包含选自下述(A)～(E)中的任一种VH和下述(F)表示的VL：
(A)具有(a)包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(B)具有(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(C)具有(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(D)具有(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(E)具有(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(F)具有(a)包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2、和
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL，
与CD3特异性结合的第二臂包含下述(A)表示的VH和下述(B)表示的VL：
(A)具有(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(B)具有(a)包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2、和
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL，
此处，该IgG1抗体的2个重链恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换，
并且，与PD-1特异性结合的第一臂中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的任意一个或多个CDR中，各自任意1～5个氨基酸残基可以被保守氨基酸置换；和/或与CD3特异性结合的第二臂中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3中的任意一个或多个CDR中，各自任意1～5个氨基酸残基可以被保守氨基酸置换。
2.如权利要求1所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂包含选自下述(A)～(E)中的任一种VH和下述(F)表示的VL：
(A)具有(a)包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(B)具有(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(C)具有(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(D)具有(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(E)具有(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(F)具有(a)包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2、和
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL，
与CD3特异性结合的第二臂包含下述(A)表示的VH和下述(B)表示的VL：
(A)具有(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；
(B)具有(a)包含序列编号26的氨基酸序列的VL-CDR1、
(b)包含序列编号27的氨基酸序列的VL-CDR2、和
(c)包含序列编号28的氨基酸序列的VL-CDR3的VL。
3.如权利要求1或2所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号6的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号7的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号8的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
4.如权利要求1或2所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号9的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号10的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号11的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
5.如权利要求1或2所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号12的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号13的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号14的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
6.如权利要求1或2所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号15的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号16的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号17的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
7.如权利要求1或2所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
(i)与PD-1特异性结合的第一臂的VH具有：
(a)包含序列编号18的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号19的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号20的氨基酸序列的VH-CDR3，
(ii)与CD3特异性结合的第二臂的VH具有：
(a)包含序列编号37的氨基酸序列的VH-CDR1、
(b)包含序列编号38的氨基酸序列的VH-CDR2、和
(c)包含序列编号39的氨基酸序列的VH-CDR3。
8.如权利要求1～7中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH的FR1、FR2和FR3区域分别与生殖细胞系列型V基因IGHV7-4-1的发生了体细胞突变的该基因所编码的氨基酸序列对应，框架4区域包含生殖细胞系列型J基因JH6c的发生了体细胞突变的该基因所编码的氨基酸序列，其中，VH-CDR3区域中包含的氨基酸序列除外。
9.如权利要求1～8中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含：选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
10.如权利要求1～9中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含：序列编号36的氨基酸序列或与该VH的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂的VH包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
12.如权利要求1或3所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号1的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
13.如权利要求1或4所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号2的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
14.如权利要求1或5所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号3的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
15.如权利要求1或6所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号4的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
16.如权利要求1或7所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂中的VH包含序列编号5的氨基酸序列，
与CD3特异性结合的第二臂中的VH包含序列编号36的氨基酸序列。
17.如权利要求1～16中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂和/或与CD3特异性结合的第二臂分别具有包含序列编号25的氨基酸序列的VL。
18.一种双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
(A)与PD-1特异性结合的第一臂具有包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL；以及
(B)与CD3特异性结合的第二臂具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL，该IgG1抗体的2个重链恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换。
19.一种双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
该与PD-1特异性结合的第一臂与下述(1)或(2)所述的结合发生交叉竞合：
(1)具有包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与PD-1特异性结合的第一臂对PD-1的结合；
(2)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域对PD-1的结合，
该IgG1抗体的2个重链恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换。
20.一种双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
该与PD-1特异性结合的第一臂对PD-1的结合通过下述(1)或(2)发生交叉竞合：
(1)具有包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任何一种氨基酸序列的VH以及包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与PD-1特异性结合的第一臂；
(2)包含该VH和VL的与PD-1特异性结合的单克隆抗体的可变区域，
该IgG1抗体的2个重链恒定区域中的(1)EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被谷氨酸、脯氨酸、精氨酸或天冬氨酸置换、(2)EU编号系统中的第434号的天冬酰胺被亮氨酸置换、和/或(3)EU编号系统中的第438号的谷氨酰胺被谷氨酸置换。
21.如权利要求19或20所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
该与CD3特异性结合的第二臂与下述(1)或(2)所述的结合发生交叉竞合：
(1)具有包含序列编号36的氨基酸序列的VH和包含序列编号25的氨基酸序列的VL的与CD3特异性结合的第二臂对CD3的结合；
(2)包含该VH和VL的与CD3特异性结合的单克隆抗体的可变区域对CD3的结合。
22.如权利要求1～21中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
与PD-1特异性结合的第一臂允许PD-1和PD-L1间的相互作用。
23.如权利要求1～22中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
投药过程中或投药后24小时以内的细胞因子产生得到充分减少。
24.如权利要求23所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
细胞因子至少为IL-2、IFN-γ或TNF-α。
25.如权利要求1～24中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
该双特异性IgG1抗体对Fc受体的结合已消失或已减弱。
26.如权利要求25所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
该IgG1抗体的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第235号的亮氨酸分别被甘氨酸置换和/或第236号的甘氨酸分别被精氨酸置换。
27.如权利要求1～26中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，并且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换。
28.如权利要求1～26中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链上的恒定区域中的EU编号系统中的第351号的亮氨酸被天冬氨酸置换，并且第368号的亮氨酸被谷氨酸置换，具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链上的恒定区域中的第351号的亮氨酸被赖氨酸置换，并且第366号的苏氨酸被赖氨酸置换。
29.如权利要求1～28中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
该双特异性IgG1抗体的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第447号的赖氨酸分别缺失。
30.如权利要求1～29中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
该IgG1抗体中的2个重链恒定区域中的EU编号系统中的第252号的蛋氨酸被天冬氨酸置换。
31.如权利要求1～30中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其对新生儿Fc受体的结合已消失或已减弱。
32.如权利要求1～31中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
权利要求1～31中任一项所述的IgG1抗体在血液中的半衰期与该氨基酸未被置换的原来的抗体相比有所缩短。
33.如权利要求1～32中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
权利要求1～32中任一项所述的IgG1抗体在血液中的半衰期与该氨基酸未被置换的原来的抗体相比，缩短至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
34.如权利要求1～33中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链含有：包含选自序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46和序列编号47中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域。
35.如权利要求1～34中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链含有：包含选自序列编号48、序列编号49、序列编号50、序列编号51、序列编号52和序列编号53中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域。
36.如权利要求1～35中任一项所述的双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其中，
具有与PD-1特异性结合的第一臂的VL的轻链和/或具有与CD3特异性结合的第二臂的VL的轻链含有：包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
37.一种双特异性IgG1抗体或其抗体片段，其具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂，其中，
(A)具有与PD-1特异性结合的第一臂的VH的重链含有：包含选自序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4和序列编号5中的任意一个氨基酸序列的VH以及包含选自序列编号42、序列编号43、序列编号44、序列编号45、序列编号46和序列编号47中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域；
(B)具有与PD-1特异性结合的第一臂的VL的轻链含有：包含序列编号25的氨基酸序列的VL和包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域；
(C)具有与CD3特异性结合的第二臂的VH的重链含有：包含序列编号36的氨基酸序列的VH以及包含选自序列编号48、序列编号49、序列编号50、序列编号51、序列编号52和序列编号53中的任意一个氨基酸序列的重链恒定区域；和
(D)具有与CD3特异性结合的第二臂的VL的轻链含有：包含序列编号25的氨基酸序列的VL和包含序列编号29的氨基酸序列的轻链恒定区域。
38.一种药物组合物，其包含权利要求1～37中任一项所述的具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂的双特异性IgG1抗体或其抗体片段和药学上允许的载体。
39.一种自身免疫疾病的预防、症状进展抑制、再发抑制和/或治疗剂，其包含权利要求1～37中任一项所述的具有与PD-1特异性结合的第一臂和与CD3特异性结合的第二臂的双特异性IgG1抗体或其抗体片段作为有效成分。
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