CN114174313A - 采用狄尔斯-阿尔德环加成反应的通用型肽和蛋白质的大环化和多聚化 - Google Patents
采用狄尔斯-阿尔德环加成反应的通用型肽和蛋白质的大环化和多聚化 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了具有比相应的非环肽稳定的二级结构的大环和大双环肽。所述大环和大双环肽由具有形成加合物的互补反应性侧链部分的肽形成。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2019年4月9日递交的美国临时专利申请第62/831,484号和2019年8月30日递交的美国临时专利申请第62/894,478号的权益，其各自通过引用整体并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的第GM008720号和第GM128199号基金的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
电子递交材料通过引用并入
通过引用整体并入本文的是与本文一起递交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并将其标识如下：创建于2020年4月9日的一个名为“749097SequenceListing.TXT”的5112字节ASCII(文本)文件。
发明背景
肽代表了开发生物活性配体的有力起始点。短线性肽序列通过采用多种二级结构(包括螺旋、折叠、环状和转角基序)介导蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。从它们的天然蛋白质环境中移除通常会消除结构刚性，导致结合亲和力和药理学性质降低。
已经开发了许多化学策略来合成性地稳定肽二级结构并保留或增强药理学效用。这些化学反应中的大多数利用了天然存在的亲核残基(如半胱氨酸和赖氨酸)的烷基化或酰化反应；这些方法已被用于稳定螺旋、环和折叠基序。许多这些化学反应的关键限制是它们与分层的多种稳定化学反应不兼容。
合成具有稳定二级结构的肽的一种策略涉及使用使得能够形成金属催化键的非天然氨基酸。这些策略中研究最充分的包括含有末端烯烃的基团的烯烃复分解以及炔烃/叠氮化物对的[3+2]Huisgen连接。这些‘装订(stapled)’的肽显示出增加的有利性质，其包括结构稳定性、结合亲和力、细胞摄取以及用于直接或变构靶向PPI的体内药代动力学。虽然这些化学物质可以成功地稳定肽二级结构，但它们通常与不同的结构不相容，并且其他天然和非天然的功能和水性条件对于特定的肽和蛋白质支架的正确折叠是必要的。
已得到广泛合成应用的著名的碳-碳键形成反应是狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)[4+2]环加成反应。1928年被首次报道，自然界和化学家都利用这个反应来构建复杂的分子。这种转变的几个方面使其对合成具有吸引力，包括范围广泛的二烯-亲二烯体对、在许多应用中的高区域选择性和化学选择性、同时引入多个立体中心以及与一系列反应条件的兼容性。开创性研究表明，水性条件不仅可被耐受，而且还可以提高反应速率。虽然这些特性与生物分子选择性修饰所期望的那些特性重叠，但该化学反应尚未被应用于肽或蛋白质的位点特异性稳定。
控制二级和三级结构的新策略，理想情况下具有广泛的官能团和反应条件耐受性，将大大扩展用于开发基于肽的化学探针的合成库。
发明概述
本发明的发明人发现了针对互补的反应性官能团的肽环化策略，其可有效改善化学探针或治疗剂所期望的性质。本文所公开的结果建立了通过将氨基酸与包括互补的加合物形成部分的反应性官能团掺入提供的几种新的和改善的能力。可以使反应性官能团与氨基酸侧链共轭，或与氨基酸的任何其他部分(包括氨基、羧基或α碳)共轭。在一些实施方案中，本文所公开的大环肽通过互补的反应性官能团的分子内反应形成，所述反应产生稳定的环、螺旋和其他期望的肽折叠。在一些方面，肽包括两组或更多组正交的互补反应性官能团，其能够形成双环或更高阶的环化肽。在一些实施方案中，反应性官能团被引入到较大的肽和蛋白质中，以在二级结构和三级结构元件之间形成分子内交联。
本公开的一些实施方案涉及式(I)的大环化合物，其中A、A1和A2为氨基酸，每个n独立地为0至600的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50(除了与X连接的位置，其中n至少为1)，并且X为反应性官能团之间的加合物。
在一些实施方案中，X为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。在一些方面，至少一种氨基酸为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。在一些方面，反应性官能团各自独立地与氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。在一些方面，X与一个氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合以及与相同化合物内不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合，以提供环状结构。在一些实施方案中，大环化合物由肽形成，其中一个反应性官能团包括二烯，并且不同的反应性官能团包括亲二烯体。互补的二烯和亲二烯体对可以通过分子内狄尔斯-阿尔德反应、反应形成大环肽。在一些方面，X为与化合物中任意两个不同氨基酸结合的反应性官能团之间的加合物。也就是说，反应性官能团可以各自独立地与末端氨基酸或内部氨基酸共轭。在一些实施方案中，A1和A2中的一个为半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，并且另一个为赖氨酸或赖氨酸衍生物。在一些方面，半胱氨酸和/或赖氨酸被衍生化而形成二烯或亲二烯体。在一些实施方案中，X由己二烯基与马来酰亚胺基、马来酰亚胺基与呋喃基、环戊二烯基与另一环戊二烯基、环戊二烯基与马来酰亚胺基，或环戊二烯基与脂肪族烯烃(例如，用作肽钉的脂肪族烯烃)之间的反应形成。在一些方面，X为狄尔斯-阿尔德加合物中的一种：
在一些方面，X为图23C-23E中所示的加合物中的任一种。
预期式I的化合物的不同排列，其中反应性官能团与化合物内不同的氨基酸和氨基酸官能团结合。反应性官能团可以各自独立地与氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。式I化合物的不同排列的非限制性实例包括：
在具体的实施方案中，式I的化合物被进一步限定为以下中的一种：
图23C-23E示出了cpd加合物另外的可能加合物和另外的异构体。
本公开的一些方面涉及合成大环或交联的化合物的方法，包括合成式(II)的肽，其中A、A1和A2为氨基酸，每个n独立地为0至600的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50(除了与Y或Z连接的位置，其中n至少为1)，Y和Z为能够进行Y-Z共轭反应以及使所述化合物经受驱动Y-Z共轭反应的条件以形成分子内Y-Z交联部分的反应性部分。
在一些方面，Y和Z独立地与化合物内不同氨基酸的侧链、氨基、羧基或α碳结合。在一些实施方案中，至少一个氨基酸为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，Y-Z共轭反应为环加成反应。在一些方面，Y-Z共轭反应为狄尔斯-阿尔德反应或烯烃-烯烃复分解反应。在一些方面，Y为共轭二烯，且Z为亲二烯体。在实施方案中，A1和A2中的一种为半胱氨酸，且另一个为赖氨酸，并且半胱氨酸和/或赖氨酸可被进一步衍生化以形成二烯或亲二烯体。Y可以为任意共轭二烯，其包括但不限于以线性或环状结构存在的共轭二烯、2,4-己二烯或其衍生物、呋喃或其衍生物、噻吩或其衍生物，或者环戊二烯或其衍生物。二烯衍生物官能团的非限制性实例包括供电子基团，诸如烷基、酯、酰胺、烷氧基、羟基、胺和甲硅烷基醚。在一些方面，供电子基团结合至烯烃碳原子，其为共轭二烯系统的一部分。Z可以为任何亲二烯体，其包括但不限于顺丁烯二酸酐或其衍生物、苯炔或其衍生物、醌或其衍生物、N-亚磺酰基衍生物、硫二亚胺衍生物、亚胺衍生物、亚硝基衍生物、硫代亚硝基衍生物、丙烯酸酯或其衍生物，或者巴豆酸酯或其衍生物。亲二烯体衍生物官能团的非限制性实例包括吸电子基团，诸如酯、酰胺、硝基、砜、羰基、氰基或卤代烷部分。在一些实施方案中，亲二烯体衍生物官能团与亲二烯体二烯的碳原子结合。在上述式(I)和(II)中，A1或A2可以为N-末端氨基酸。在一些实施方案中，Y和Z各自独立地连接至肽中任意两个不同氨基酸的侧链、胺、羧基或α碳。在一些方面，式(II)的肽被进一步限定为以下中的一种：
对于cpd，环戊二烯的任何异构体都是可能的，例如，具有连接在环的任何碳位置处的环戊二烯：
本公开的一些实施方案涉及式(III)的双环或更高阶环状化合物，其中A、A1、A2、A3和A4为氨基酸，每个n独立地为0至600的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50(所有n的总和至少为2)，B为在互补反应性官能团之间形成的加合物，C为在互补反应性官能团之间形成的加合物。用于形成B和C加合物的反应性官能团各自与不同的氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。在一些方面，用于形成B加合物的反应性官能团与用于形成C加合物的反应性官能团正交。在一些方面，B或C中的一种为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成；并且B或C中的另一个为产生自以下不同的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。在一些实施方案中，B加合物和C加合物使用不同高的反应类型形成，例如，一种加合物通过狄尔斯-阿尔德反应形成，且另一种加合物通过烯烃复分解反应形成。
在一些实施方案中，如式(III)中所示的，用于形成C加合物的反应性官能团与位于与用于所述B加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。在一些实施方案中，如式(IV)中所示的，用于形成所述B加合物的反应性官能团与位于与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。
在一些实施方案中，如式(V)中所示的，用于形成所述B加合物的反应性官能团与与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的氨基酸呈交错关系的氨基酸结合。
在一些实施方案中，如式(IIIa)、式(IIIb)、式(IVa)、式(IVb)或式(Va)中所示的，加合物B和C彼此结合，以形成更高阶环状化合物。
例如，B的形成可以是通过烯烃复分解反应、产生互补的反应性基团以与二烯反应、产生另一大环C。
在一些实施方案中，至少一种氨基酸为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
本公开的一些方面涉及合成双环或更高阶环状化合物的方法，其包括利用能够进行D-E共轭反应的互补反应性官能团D和E，和能够进行F-G共轭反应的互补反应性官能团F和G合成式(VI)的肽，使所述肽经受驱动D-E共轭反应的条件，以形成分子内D-E交联部分，以及使所述肽经受驱动F-G共轭反应的条件，以形成分子内F-G交联部分，其中A、A1、A2、A3和A4为氨基酸，并且每个n独立地为0至600的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50(其中所有n的总和至少为2)。
在一些方面，反应性官能团D、E、F和G各自独立地与任意氨基酸A1至A不同的氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。在一些实施方案中，反应性官能团D、E、F和G中的至少一个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。在一些方面，反应性官能团D、E、F和G中的每个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。
在一些实施方案中，如式(VI)中所示的，反应性官能团F和互补反应性官能团G与位于与官能团D和互补反应性官能团E结合的氨基酸内侧的氨基酸结合。在其他实施方案中，如式(VII)中所示的，反应性官能团D和互补反应性官能团E与位于与官能团F和互补反应性官能团G结合的氨基酸内侧的氨基酸结合。
在一些实施方案中，如式(VIII)和(IX)中所示的，反应性官能团D和互补反应性官能团E与与反应性官能团F和互补反应性官能团G结合的氨基酸呈交错关系的氨基酸结合。
在一些方面，D-E共轭反应或F-G共轭反应为狄尔斯-阿尔德反应。在一些实施方案中，D-E共轭反应或F-G共轭反应为闭环复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、巯烯反应或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。在一些实施方案中，D-E和F-G共轭反应中的一种为狄尔斯-阿尔德反应、并且另一共轭反应为闭环复分解反应。在上述所描绘的式(III)-(IX)中，A1或A可以为N-末端氨基酸。在一些方面，式(III)-(IX)的分子包括由相应数量的加合物形成反应形成的3个或更多个大环。例如，三环化合物可以包括加合物H、I和J，其中的每一个通过互补反应性官能团对之间的反应形成。如本文所公开的双环或更高阶环状化合物可以使用彼此正交的互补反应性官能团对构建，可以采用利用保护/去保护化学反应、和/或可以使用在化合物合成不同阶段安装的反应性官能团对构建，以便避免某些反应性官能团之间不期望的交叉反应。
本公开的一些实施方案涉及式(X)的多肽：
(A1)n–R1–(A2)m (X)
其中A1和A2为氨基酸；n和m各自独立地为2至600的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50；A1的氨基酸为N-末端至C-末端，并且A2的氨基酸为C-末端至N-末端；并且R1为由环戊二烯基与另一环戊二烯基之间的反应形成的加合物。在一些实施方案中，R1为
在一些实施方案中，式(X)的多肽被进一步限定为(A1)n-1–Lys–R1–Lys–(A2)m-1。
本公开的一些实施方案涉及连接肽或多肽的方法，所述方法包括使第一肽或多肽与第二肽或多肽反应、其中所述第一肽或多肽以及所述第二肽或多肽各自包含环戊二烯基，并且其中反应后在所述第一肽或多肽的环戊二烯基与所述第二肽或多肽的环戊二烯基之间形成加合物。在一些实施方案中，所述加合物为
在一些实施方案中，所述第一和第二肽或多肽为相同的并且被同源二聚化。在一些实施方案中，所述方法可以被用于连接多于两个肽或多肽。
术语“正交”是指能与互补反应性伴侣发生反应、但不与其他反应性官能团发生反应、或表现出与其他反应性官能团降低的反应性的官能团。如本文中所用的，术语“或”和“和/或”被用于描述相互组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”，或“x或y或z”。特别考虑到可以从实施方案具体地排除x、y或z。在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的简单和普通含义使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
与“包括(including)”、“包含(containing)”或“特征在于(characterized by)”同义的术语“包含(comprising)”为包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。短语“由……组成”不包括未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将所述主题的范围限制为指定的材料或步骤，以及不会对其基本和新颖特性产生实质性影响的那些材料或步骤。预期在术语“包含”的上下文中所描述的实施方案也可以在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上下文中实施。
具体考虑的是，关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制都可以适用于本发明的任意其他实施方案。此外，本发明的任意组合物都可用于本发明的任意方法中，并且本发明的任意方法都可以被用于产生或利用本发明的任意组合物。实施例中阐述的实施方案的方面也为可以在不同实施例中其他地方或本申请中其他地方所讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案，诸如在发明概述、实施方案详述、权利要求和图例说明。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文所提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1狄尔斯-阿尔德环化(DAC)肽官能化的示意图。
图2树脂上合成DAC肽的合成方案。
图3合成Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH的合成方案。
图4用HeLa细胞进行划伤测定的0-16hr时间点的代表性图。处理条件包括DMSO对照、野生型和DAC RGD肽1wt和1a。每条水平线代表伤口距离的单一量度。在每种条件的两个生物学重复中，每个视图进行五次测量。通过从0hr距离中减去16hr距离来计算迁移距离，平均，并归一化到DMSO迁移距离。
图5A-5B图5A用RGD化合物1支架进行指定的官能化和反应时间后粗制肽的吸光度(215nm)和提取离子色谱图(EIC)LC-MS迹线(trace)。图5B量化1向环化1a/1b异构体转化的代表性反应时程。
图6A-6C粗制2、3和4前体肽(每个图中的顶部迹线)、己二烯-烷基化中间体(从每个图中从顶部的第二迹线)、酰化后的马来酰亚胺官能化的肽(从每个图中从顶部的第三迹线)和纯化的内型立体异构体4a(图6C的底部迹线)的EIC LC-MS迹线。每个化合物编号代表未环化的(X)和环化的异构体(Xa、Xb…)，按通过在LC-MS上分离确定的环状产物的相对强度顺序报告字母。
图7用马来酰亚胺甘氨酸(Mal)、丙烯酸(Acr)或巴豆酸(Cro)对3hex进行树脂上赖氨酸酰化并过夜孵育后，粗产物特性的定量。
图8A-8B切割(10％ACN/H2O，0.1％TFA)后，于DMF(底部迹线)或水性溶液(顶部迹线)中，在树脂上孵育16hr后，化合物3的狄尔斯-阿尔德环化的215nm吸光度(图8A)和EICLC-MS(图8B)迹线。
图9A-9B用(图9A)或不用(图9B)βME处理的粗产物1和1a/1b的EIC和215nm吸光度LC-MS迹线，其显示了1转化为相应的βME捕获的种类(m/z＝914.3)。
图10A-10C图10A于水性缓冲液中用βME孵育的HPLC纯化的1a的扩展时程，证实了环加合物稳定性(βME捕获的种类m/z＝914.3)。图10B 1a相对于线性类似物1wt，以及4a和线性类似物4wt分别的体外胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抗性测定。图10C比较通过10和20μMRGD肽1wt和1a相对于DMSO对照的伤口闭合的减少的细胞迁移模型划伤测定。数据代表来自两次生物重复的图像的距离测量的平均值±s.d.，每个测量5个距离。n.s.＝不显著；*＝P<0.05；**＝P<0.0005；学生t检验。
图11转角和环基序DAC肽及其前体的化合物列表和数据。
图12A-12B图12A乙烯(～6-5p.p.m.)区中4wt、4hex和4a的1H-NMR谱。图12B 4a环加合物的模型，其描绘了通过TOCSY和NOESY确定的环加合物质子之间的通过键和通过空间相互作用。
图13A-13C图13A研究的3种肽的每个残基的3JH-N-Cα-Hα耦合常数值。图13B 4wt和4a在50ns模拟上的肽主链比对。图13C 4wt和4a肽主链和所有原子(不包括氢)的RMSD值。
图14A-14B图14A DAC-p53肽合成的示意图。图14B转化5为环化异构体5a-c的280nm吸光度HPLC迹线和所得的水性溶液反应时程。
图15A-15B图15A于水性缓冲液中孵育DAC-p53肽5混合物与βME的280nm吸光度LC-MS迹线，证实了线性前体5的Michael加成和环化异构体的稳定性。图15B线性类似物5wt和5a-c的CD谱。
图16于水性缓冲液中在有或没有过量βME的情况下孵育DAC-p53肽5混合物的LC-MS EIC迹线，证实了线性前体5的Michael加成和环化异构体的非反应性。
图17A-17D图17A用作支架的具有保守LXXLL基序的SRC2野生型肽的序列；DAC-SRC2肽6a-b和7a以及双装订的8a的钉放置和结构。图17B于DMSO中在树脂上加热4hr后使用的前体肽的215nm吸光度HPLC迹线和化合物7所得的环化产物图谱。图17C与未修饰的野生型序列相比的分离的DAC-SRC2肽的CD谱。图17D用于合成双装订的SRC2肽8a的分层闭环复分解和狄尔斯-阿尔德环化的合成方案。
图18A-18C图18A前体肽8pre、闭环复分解产物8rcm、狄尔斯-阿尔德功能化肽8和完全DAC-SRC2双装订肽8a的215nm吸光度HPLC迹线。图18A螺旋化合物8a的CD谱。图18C归一化FP测定结果，其显示了有效竞争掉来自野生型ERα的荧光素标记的野生型SRC肽的DAC-SRC2肽的剂量范围。每个数据点代表以一式三份运行两次独立实验运行的测量值，±s.e.m。剂量-反应曲线与Prism 5绘图软件中的四个参数对数(抑制剂)相对于反应方程相吻合。
图19螺旋基序DAC肽、其前体和相关的类似物的化合物列表和数据。
图20双装订的RCM稳定的和DAC肽8a的乙烯区的代表性1H-NMR谱。
图21A-21C图21A与雌激素受体-α(PDB:6PIT)结合的狄尔斯-阿尔德环化SRC2肽6a的X射线晶体结构。与位于AF2裂隙中的雌二醇和6a结合的ERαY537S突变蛋白质的LBD。图21B具有与来自解析的晶体学数据(调型(contoured)至1σ的2mFo-DFc图)的电子密度图(网格)叠加的内型立体化学的DAC-SRC2肽6a环加合物的结构的两张视图。图21C结合在AF2结合袋中的6a的背面(顶部)和轴向(底部)视图。根据SRC2序列编号的相关残基被突出显示，以及狄尔斯-阿尔德环化部分以黄色显示。具有低电子密度的结构的柔性部分被省略。
图22A-22C图22A与雌激素受体α结合的狄尔斯-阿尔德环化SRC2肽6a的X射线晶体结构结果细节。DAC装订的肽6a与包含来自与ERα(PDB 1GWR)21结合的转录中间因子2(TIF2)肽的肽的相似LxxLL基序重叠。图22B邻近AF2裂隙的ERα中内型狄尔斯-阿尔德环加合物与疏水架残基的相互作用。图22C ERα中E542之间形成的螺旋加帽氢键代表N-末端电荷要求，与为C-末端加帽的肽分子内氢键偶联。
图23A和23B DAC-ANP肽的代表性氨基酸侧链。X＝C、O、S、NH，并且Y＝0、1、2、3、4，(或其他支链/环状烷基片段)。
图23C-23E合成的DAC肽交联结构。
图24合成DAC-ANP-1的合成方案。
图25DAC-ANP-1的还原和氧化形式的比较。DAC-ANP-1(还原的)：主要观察离子：1217.8；树脂上环化的(DMSO，45℃，2hr)，HPLC纯化的。DAC-ANP-1(氧化的)：主要观察离子：1216.9；溶液中氧化的(0.1M乙酸铵，5％DMSO，pH 7.6，室温)。
图26A-26C图26A DAC-ANP-1的HPLC图。图26B DAC-ANP-1的提取的离子色谱图(24hr ox为完全氧化的)。图26C还原和氧化的DAC-ANP-1的主要产物质谱。
图27还原和氧化形式的ANP-WT的比较。ANP-WT(还原的)：主要观察离子：1102.9；ANP-WT(氧化的)主要观察离子：1101.4。
图28A-28C图28A ANP-WT的HPLC图。图28B ANP-WT的提取的离子色谱图(24hr ox为60％氧化的)。图28C还原和氧化的ANP-WT的主要产物质谱。
图29 Lys-环戊二烯的合成方案。
图30包含游离氨基酸的游离赖氨酸-环戊二烯的LCMS色谱图和迹线。
图31 RTD8二聚物的合成方案。
图32 RTD8的结构。
图33A-33F图33A Max-WT-cpd的HPLC图。图33B Max-WT-cpd的提取的离子色谱图。图33C Max-WT-cpd的主要产物质谱。图33D RTD8-cpd的HPLC图。图33E RTD8-cpd的提取的离子色谱图。图33F RTD8-cpd的主要产物质谱。
图34环戊二烯和闭环复分解钉之间的狄尔斯-阿尔德反应的合成方案。
图35 cpd-StAx32.5R和DA交联的StAx32.5R的化学结构。
图36于DMSO中进行树脂上加热前后cpd-StAx32.5R的LCMS分析。
图37 RAB25内的TAG位点。
详述
如本文中所用的，“蛋白质”或“多肽”是指包含至少四个氨基酸残基的分子。如本文中所用的，术语“野生型”是指在生物体中天然存在的分子的内源形式。在一些实施方案中，采用了野生型形式的蛋白质或多肽，然而，在本公开的许多实施方案中，采用了修饰的蛋白质或多肽来产生免疫反应。上述术语可以互换使用。“修饰的蛋白质”或“修饰的多肽”或“变体”是指这蛋白质或多肽，其化学结构，特别为其氨基酸序列，相对于野生型蛋白质或多肽发生了改变。在一些实施方案中，修饰的/变体蛋白质或多肽至少具有一种修饰的活性或功能(识别可能具有多种活性或功能的蛋白质或多肽)。具体考虑的为，修饰/变异蛋白质或多肽可能相对于一种活性或功能发生了改变，但在其他方面(如免疫原性)保留了野生型活性或功能。
在本文中具体提及蛋白质的情况下，它通常是指天然(野生型)或重组(修饰)的蛋白质，或者任选地，其中任何信号序列已被去除的蛋白质。蛋白质可从其天然生物体直接分离，通过重组DNA/外源表达方法产生，或通过固相肽合成(SPPS)或其他体外方法产生。在具体实施方案中，存在分离的核酸片段和并入编码多肽(例如，抗体或其片段)的核酸序列的重组载体。术语“重组的”可以与多肽或特定多肽的名称结合使用，并且这通常是指从已进行体外操作或作为此类分子的复制产物的核酸分子产生的多肽。
氨基酸为一类有机酸，其包含羧基官能团(-COOH)、胺官能团(-NH2)、侧链和氢原子，它们都与中心碳原子结合。天然氨基酸为20种遗传编码的α-氨基酸中的一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。如本文中所用的，非天然氨基酸是指除硒代半胱氨酸和以下20种遗传编码的α-氨基酸以外的任意氨基酸、修饰的氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。如本文中所用的，氨基酸衍生物是指已官能化的氨基酸，使得氨基酸衍生物结构不同于前体氨基酸结构。
大环化可以通过分子拓扑结构的预组织改善生物活性肽配体，从而提高药理特性，如结合亲和力、细胞渗透性和代谢稳定性。例如，狄尔斯-阿尔德[4+2]环加成可以被用于一系列肽支架和化学环境内的肽大环化和稳定。不同二烯-亲二烯体反应对的狄尔斯-阿尔德环化进行迅速，产率高，并且在固相上或在水性溶液中具有可调谐的立体化学偏好。这种反应可以单独应用或与其他稳定化学反应(如闭环烯烃复分解)协同应用，以稳定环、转角和α-螺旋二级结构基序。
模式环肽的NMR和分子动力学研究证实了内型环加合物立体化学的优先形成，赋予了肽主链显著的结构刚性，其导致了狄尔斯-阿尔德环化(DAC)RGD肽的蛋白酶抗性提高和生物活性增加。这种反应还可以促进来源于ERα结合蛋白质SRC2的DACα-螺旋肽的稳定性。与ERα结合的DAC螺旋肽的
共晶结构，明确证实了所得狄尔斯-阿尔德加合物的内型立体化学，并证实了利用该化学反应形成的稳定基序的独特结构可以直接促进靶标结合。这些数据确立了狄尔斯-阿尔德环化作为在一系列化学环境下稳定不同蛋白质结构基序的通用方法。
以下包括本发明的某些方面。
1.下式的大环化合物：
其中A、A1和A2为氨基酸；每个n独立地为0至600的整数(除了与X连接的位置，其中n至少为1)；并且X为反应性官能团之间的加合物。
2.如第1方面所述的大环化合物，其中X与一个氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合以及与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
3.如第1或2方面所述的大环化合物，其中所述加合物为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
4.如第1-3方面中任一项所述的大环化合物，其中A1和A2中的一个为半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，并且另一个为赖氨酸或赖氨酸衍生物。
5.如第1-4方面中任一项的大环化合物，其中X由己二烯基与马来酰亚胺基、马来酰亚胺基与呋喃基、环戊二烯基与另一环戊二烯基、环戊二烯基与马来酰亚胺基，或环戊二烯基与脂肪族烯烃之间的反应形成。
6.如第1-5方面中任一项所述的大环化合物，其中X为以下中的一种：
7.如第1-6方面中任一项所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为：
8.如第1-6中方面任一项所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为：
9.如第1-8方面中任一项所述的大环化合物，其中至少一种氨基酸A为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
10.如第1-9方面中任一项所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为以下中的一种：
11.如第1-10方面中任一项所述的大环化合物，其中X为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成，并且所述加合物在与所述化合物中任意两种不同的氨基酸结合的反应性官能团之间形成。
12.合成大环化合物的方法，所述方法包括：
合成式(II)的肽，其包含能够进行Y-Z共轭反应的反应性官能团Y和Z；和
使所述肽经受驱动Y-Z共轭反应的条件，以形成分子内Y-Z交联部分；
其中A、A1和A2为氨基酸；并且每个n独立地为0至600的整数(除了与Y或Z连接的位置，其中n至少为1)。
13.如第12方面所述的方法，其中Y和Z各自独立地与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
14.如第12或13方面所述的方法，其中所述Y-Z共轭反应为环加成反应。
15.如第12或13方面所述的方法，其中所述Y-Z共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、巯烯反应或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
16.如第12-15方面中任一项所述的方法，其中至少一个氨基酸A为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
17.如第12-16方面中任一项所述的方法，其中A1和A2中的一个为半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，并且另一个为赖氨酸或赖氨酸衍生物。
18.如第12-17方面中任一项所述的方法，其中Y为共轭二烯。
19.如第18方面所述的方法，其中所述共轭二烯为线性或环状结构的一部分。
20.如第18方面所述的方法，其中所述共轭二烯为2,4-己二烯、呋喃、噻吩、环戊二烯或它们的衍生物。
21.如第18-20方面中任一项所述的方法，其中所述共轭二烯或其衍生物包括供电子基团部分。
22.如第21方面所述的方法，其中所述供电子基团选自：烷基、酯、酰胺、烷氧基、羟基、胺和甲硅烷基醚。
23.如第12-22方面中任一项所述的方法，其中Z为亲二烯体。
24.如第23方面所述的方法，其中所述亲二烯体为顺丁烯二酸酐或其衍生物、苯炔或其衍生物、醌或其衍生物、N-亚磺酰基衍生物、硫二亚胺衍生物、亚胺衍生物、亚硝基衍生物、硫代亚硝基衍生物、丙烯酸酯或其衍生物，或巴豆酸酯或其衍生物。
25.如第23或24方面所述的方法，其中所述亲二烯体包括吸电子基团部分。
26.如第25方面所述的方法，其中所述吸电子基团选自：酯、酰胺、硝基、砜、羰基、氰基和卤代烷部分。
27.如第12-26方面中任一项所述的方法，其中反应性官能团Y和Z各自独立地与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
28.如第14-27方面中任一项所述的方法，其中式(II)的肽被进一步限定为以下中的一种：
29.下式的双环或更高阶环状化合物：
其中A、A1、A2、A3和A4为氨基酸；每个n独立地为1至600的整数；B为与任意两个氨基酸结合的互补反应性官能团之间的加合物；C为与不结合至B结合的任意两个氨基酸结合的互补反应性官能团之间的加合物。
30.如第29方面所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团和用于形成所述C加合物的反应性官能团彼此正交。
31.如第29或30方面所述的双环或更高阶环状化合物，其中加合物B或C中的一种为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
32.如第31方面所述的双环或更高阶环状化合物，其中加合物B或C中的另一种为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
33.如第29-32方面中任一项所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述C加合物的反应性官能团与位于与用于形成所述B加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。
34.如第29-32方面中任一项所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团与位于与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。
35.如第29-32方面中任一项所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团与与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的氨基酸呈交错关系的氨基酸结合。
36.如第29-35方面中任一项所述的双环或更高阶环状化合物，其中至少一种氨基酸为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
37.合成双环或更高阶环状化合物的方法，所述方法包括：
合成式(VI)的肽，其包含：i)能够进行D-E共轭反应的反应性部分D和E，和ii)能够进行F-G共轭反应的反应性部分F和G；
使所述肽经受驱动D-E共轭反应的条件，以形成分子内D-E交联部分；
使所述肽经受驱动F-G共轭反应的条件，以形成分子内F-G交联部分；
其中A、A1、A2、A3和A4为氨基酸；并且每个n独立地为1至600的整数。
38.如第37方面所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G各自独立地与任意氨基酸A1至An的不同的氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。
39.如第37或38方面所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G中的至少一个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。
40.如第37或38方面所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G中的每一个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。
41.如第37-40方面中任一项所述的方法，其中反应性官能团F和互补反应性官能团G与位于与官能团D和互补反应性官能团E结合的反应性氨基酸内侧的氨基酸结合。
42.如第37-40方面中任一项所述的方法，其中反应性官能团D和互补反应性官能团E与位于与官能团F和互补反应性官能团G结合的反应性氨基酸内侧的氨基酸结合。
43.如第37-40方面中任一项所述的方法，其中与反应性官能团E的结合氨基酸以及与反应性官能团F结合的氨基酸位于与反应性官能团D结合的氨基酸以及与反应性官能团G结合的氨基酸的内侧。
44.如第37-40方面中任一项所述的方法，其中与反应性官能团D结合的氨基酸以及与反应性官能团G结合的氨基酸位于与反应性官能团F结合的氨基酸以及与反应性官能团E结合的氨基酸的内侧。
45.如第37-44方面中任一项所述的方法，其中所述D-E共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、闭环复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
46.如第37-44方面中任一项所述的方法，其中所述F-G共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、闭环复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
47.如第37-46方面中任一项所述的方法，其中所述D-E共轭反应和所述F-G共轭反应为不同的反应类型。
48.式(X)的多肽：(A1)n–R1–(A2)m (X)
其中A1和A2为氨基酸；n和m各自独立地为2至600的整数；A1的氨基酸为N-末端至C-末端，并且A2的氨基酸为C-末端至N-末端；并且
R1为从环戊二烯基与另一环戊二烯基之间的反应形成的加合物。
49.如第48方面所述的多肽，其中R1为
50.如第48或49方面所述的多肽，其中式(X)的多肽被进一步限定为(A1)n-1–Lys–R1–Lys–(A2)m-1。
51.连接肽或多肽的方法，所述方法包括使第一肽或多肽与第二肽或多肽反应、其中所述第一肽或多肽以及所述第二肽或多肽各自包含环戊二烯基，并且其中反应后在所述第一肽或多肽的环戊二烯基与所述第二肽或多肽的环戊二烯基之间形成加合物。
52.如第51方面所述的方法，其中所述加合物为
53.如第51或52方面所述的方法，其中所述第一和第二肽或多肽为相同的，并且被同源二聚化。
包括以下实施例以展示本公开的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中所公开的技术代表了本发明发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1
A.狄尔斯-阿尔德环化肽
合成了一系列具有转角和环基序的狄尔斯-阿尔德环化(DAC)肽，包括抗迁移RGD肽，其类似物正在肿瘤学中接受临床测试。合成了各种长度和序列的模式肽，其包含受正交保护的半胱氨酸(tBuS-)和赖氨酸(Mmt-)侧链，前者总为在i位置，且后者在i+4、i+5和i+7位置。利用1-溴-2,4-己二烯定量进行了连续的树脂上半胱氨酸去保护和己二烯烷基化(图1、图2、图5A)。还合成了相应的含有二烯的氨基酸Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH，其与通过SPPS直接掺入相容(图1、图3)。随后利用N-马来酰亚胺-甘氨酸在RGD模式肽上进行的树脂上赖氨酸去保护和酰化导致在LC-MS上形成两个不同的峰(1和1a)，其质量相同，且保留时间迁移为～1分钟，这表明形成在C18柱上更早洗脱的环化产物(图1、图5A)。该产品出现的很快，在亲二烯体引入后5分钟内1a与1的比例为约2:1；在树脂上延长孵育(16hr，图5A)后观察到几乎完全转化为1a。动力学反应监测证实了稍后洗脱的1到1a以及次要产物1b的快速转化，在1小时内形成了近95％(图5B)。这种模式在不同的中间序列和二烯-亲二烯体间距中观察到(表1、图11)，转化为较早洗脱的可能为环化物质的得率高达～85-95％。在研究的每种支架中，在线性肽前～4分钟观察到额外的较早洗脱的次要异构体物质(相对于主要产物≤10％)(图5B、图6)。
表1狄尔斯-阿尔德环化环肽和前体
*报告为主产物：副产物的比例通过整合的LC-MS峰面积进行定量。转化百分比(％转化)是指从非环化到环化产物的得率百分比。
有限的反应条件筛选揭示，在DMSO中在树脂上的温和加热实现了环状转化，但也导致主要与次要异构产物的比例增加(表2)，这可能为由于受保护的树脂上肽的解聚。发现其他反应性较低的亲二烯体(如丙烯酰基和巴豆酰基)与己二烯反应的产率与马来酰亚胺相当(图7)。这些可行的可替代亲二烯体也与SPPS期间的直接掺入相兼容，并提供增加的环状结构多样性。对于通过树脂上二烯掺入或直接使用Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH以及在肽切割后于水性溶液中孵育后产生的肽，观察到类似的反应图谱(图8)。这些数据证实了狄尔斯-阿尔德肽环化在不同有机和水性化学环境中的相容性。
表2来自化合物1的树脂上环化条件筛选的结果
| 溶剂 | 温度(℃) | 转化％* | 主要：次要 |
| 对照 | n/a | 77.4 | 12.3 |
| H<sub>2</sub>O | 25 | 81.9 | 11.8 |
| DMF | 25 | 85.3 | 9.9 |
| H<sub>2</sub>O | 45 | 89 | 15.2 |
| DMF | 45 | 88.2 | 23.5 |
| DMSO | 45 | 92.2 | 50.2 |
*反应进行2小时，然后从树脂标准切割。对于具有扩展加热的许多化合物，可见到增加的转化和主产物富集。
B.狄尔斯-阿尔德环加成形成具有增强的蛋白酶抗性和生物活性的化学稳定的肽大环
进行实验以验证1和1a代表非环化和环化产物。将1和1a粗混合物与过量的2-巯基乙醇(βME)在树脂上孵育，后者应仅与线性含马来酰亚胺的肽反应，导致1完全消耗，产生具有βME共轭加成产物质量的种类(图9)。相比之下，1a水平保持不变，这与狄尔斯-阿尔德环化后α,β-不饱和亲电子试剂的损失一致。同样，纯化的1a长时间暴露于βME不会产生任何另外的产物，这表明形成了稳定的DAC-RGD肽大环(图10A)。
RGD基序作为一种靶向侵袭性癌症的抗迁移剂已经取得了相当大的治疗进展。与其他肽一样，由于循环蛋白酶的切割作用，天然RGD的体内使用显示有限的功效，而头对尾的环化类似物则表现出增加的蛋白酶抗性和体内活性。为了测试DAC肽是否类似地显示出不同的蛋白酶敏感性，将环状类似物1a和线性类似物1wt暴露于体外胰蛋白酶敏感性测定中。天然肽1wt在两小时内迅速降解(图10B)，而DAC 1a显示延长的半衰期，4小时后仍有30％保持完整。为了确定这种效应是否适用于其他支架和蛋白酶，对i、i+7DAC 4a和线性类似物4wt的主要环状异构体进行胰凝乳蛋白酶处理。与RGD支架一样，线性物质4wt比4a降解得更快(图10B)。与环化RGD类似物增加的稳定性一致，相对于线性对照肽1wt，化合物1a在阻断伤口闭合方面明显更有效，这为一种整合素介导的表型(图4、图10C)。综上所述，这些结果证实了狄尔斯-阿尔德环化可以影响环肽配体的结构和生物学功能。
C.狄尔斯-阿尔德环加合物优先以内型立体化学形成并稳定肽构型
为了表征推定的狄尔斯-阿尔德环加合物及其对肽构型产生的影响，对4a和前体肽4wt和4hex进行了一系列NMR实验。4a的1H-NMR证实存在两个乙烯基质子，在4wt中不存在，且与4hex(图12A)或α,β-不饱和马来酰亚胺质子中二烯的那些不同。在4a中观察到的乙烯基质子的双重三峰模式为由不饱和系统的小3J和4J耦合常数引起的，表明相邻乙烯基质子和烯丙基质子之间的二面角接近90°。TOCSY实验允许完全分配环化和非环化肽。在推定的环加合物内，在4a乙烯基质子和所有质子之间观察到直接的通过键耦合，支持融合的双环加合物的形成。TOCSY和NOESY实验的组合解决了4a中环加合物的连通性，并揭示了其质子之间的广泛通过空间相互作用(图12B)。最值得注意的为，H3/H6烯丙基质子和H4/H5琥珀酰亚胺桥头质子之间的相互作用表明4a中的环加合物为内型立体异构体(图12B)。
NMR结果进一步揭示了环状4a结构相对于线性类似物的大量扰动。在己二烯掺入之后，仅观察到半胱氨酸和附近残基的化学位移发生了适度的变化，而主链酰胺和α质子之间的3J耦合常数几乎没有变化(图13A)。相反，4a显示出几个残基的化学位移和主链3J耦合常数的显著变化，最显著的为与环化残基相邻的酪氨酸和丙氨酸(图13A)。这些改变可能为由于环化引起的自由度限制，以及出现的分子内相互作用(如环加合物和肽上发现的酰胺和羰基氧原子之间的氢键结合)。
为了进一步研究i、i+7DAC肽的结构，对4wt和4a进行了分子动力学(MD)研究。简而言之，模型在MOE中构建并在NAMD2模拟包中运行。使用VMD的轨迹分析揭示，线性4wt没有显示出持久结构，而环化4a在50ns模拟中显示出高度稳定的扩展环结构(图13B)。各主链的RMSD测量证实了相对于线性4wt的4a构型柔性大幅降低(图13C；平均主链分别为
和
)，其也转化为4a侧链动力学的运动减少(图13C)。
D.狄尔斯-阿尔德肽环加成在水性溶液中操作并稳定α-螺旋
螺旋肽代表了介导生物分子相互作用的主要结构特征。检测了狄尔斯-阿尔德环化策略稳定来自不同肽序列的α-螺旋肽构型的能力。进行了实验以确定构型限制性和反应性较低的呋喃二烯是否可以在p53衍生的螺旋序列上环化。与Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH一样，Fmoc保护的(2-呋喃基)丙氨酸(表示为AFur)在SPPS期间直接掺入(图14A、图14B)。值得注意的是，在先前建立的p53衍生序列中的i、i+7位置处使用AFur和KMal的狄尔斯-阿尔德环化反应在固体支持物上缓慢进行，产生了可以通过HPLC纯化的占优势的线性种类(图14A、图14B)。然而，在生理PBS缓冲液中孵育分离的线性肽5会导致较早洗脱的环化种类和少部分的肽二聚体的快速出现(图14B)。Michael加成捕获实验证实，推定的环化化合物5a、5b和5c缺乏反应性马来酰亚胺，这与分离的线性肽5形成对比(图15A、图16)。线性对照p53序列和所有三种可分离环化种类的圆二向色光谱证实，相对于次要产物5b和5c，主要DAC肽5a的α-螺旋特征增加(图15B)。这些数据与报道立体化学产率与肽折叠的总体稳定性相关的其他研究报告相关联，这里表明水性化学环境可能有助于选择促进总体螺旋稳定的有利加合物。
E.狄尔斯-阿尔德环加合物几何学，单独或与其他化学反应协同，差异性地影响肽螺旋性和活性
为了进一步探索稳定多种螺旋构构型的潜力，合成了一系列来源于共活化剂蛋白质SRC2的狄尔斯-阿尔德稳定的α-螺旋肽。在该蛋白质内的一个短螺旋段包含一个保守的LXXLL(SEQ ID NO:5)基序，它与雌激素受体-α(ERα；图17A)中的疏水沟相接合。合成了几种i、i+4‘DAC装订’的肽，它们在SPPS期间可以耐受直接2-呋喃基丙氨酸掺入。与p53衍生序列不同，SRC2肽6和7均在马来酰亚胺掺入后快速在树脂上环化且产率较高(图17B、图19)。两种可分离的环化种类6a和6b，以及一种主要的化合物7a通过CD光谱表征。主要种类6a和7a的螺旋显著高于未修饰的野生型SRC2肽或次要6b化合物(图17C)。先前稳定SRC2 LXXLL(SEQ ID NO:5)基序的尝试已经表明，与ERα接合的疏水残基可以被碳氢化合物钉取代，而不会显著损失结合亲和力。因此，进行了实验以测试是否可以合成包含通过包含与二烯-亲二烯体对的狄尔斯-阿尔德环化一致的氨基酸的烯烃的闭环复分解安装的碳氢化合物钉的双装订SRC2配体。直接掺入含烯烃的S5氨基酸和呋喃产生了一种干净的肽前体8pre，其很容易被Grubbs-I催化剂(8rcm；图17C、图18A)环化。随后引入的马来酰亚胺亲二烯体导致较早洗脱的串联装订肽立即出现，其为在树脂上温和加热4hr后的化学计量产物(图18A、图19)。这种双环肽8a的CD表征揭示了208和222nm处的经典α-螺旋最小值(图18B)。1H-NMR分析证实了所有主要DAC SRC2肽产物中狄尔斯-阿尔德环加合物乙烯质子和单个烯丙基质子的存在，并且在8a的情况下，观察到对应于RCM烯烃产物的峰(图20)。
为了探测这些DAC-SRC2肽的结构活性关系，用ERα进行了竞争性荧光偏振结合测定。单个DAC装订的7a和串联装订的8a肽均与ERα的荧光素连接的SRC2肽竞争，IC50分别为大约0.5和2.5μM(图18C、表3)。有趣的是，与较少螺旋的次要产物6b相比，主要的、更多螺旋的异构体6a的活性显示提高了4倍(图18C、表3)。这些结果与对p53序列观察到的结果相呼应，其中立体化学产率与整体肽折叠稳定性相关，并且在SRC2的情况下提高了生化效力。
表3从靶向ERα的DAC-SRC2肽的竞争性FP测定计算的IC50和Ki值。
| μM(±s.e.m.) | 6a | 6b | 7a | 8a |
| IC<sub>50</sub> | 2.74(0.095) | 10.6(0.160) | 0.48(0.004) | 2.56(0.100) |
| K<sub>i</sub> | 1.19(0.041) | 4.61(0.068) | 0.21(0.001) | 1.12(0.045) |
F.DAC装订的SRC2肽-ERα复合物的X射线晶体结构证明了环加合物立体化学且有助于靶标结合
为确定6a中狄尔斯-阿尔德加合物的结构及其在促进与ERα相互作用中的作用，解析了与ERα配体结合域(LBD)的第300-500位残基共结晶的6a和雌二醇在
分辨率下的X射线结构(图21A)。使用了ERα的Y537S突变体，因为它稳定了受体的激动剂构型并有助于晶体的形成。使用野生型SRC2结合的ERα的FO-Fc差异图证实了在LBD核心中明确存在雌二醇结合，并且DAC装订的6a结合在ERα的典型激活功能2(AF2)裂隙中(图21A、图22A、图22B)。狄尔斯-阿尔德加合物为高度有序的，并允许明确确认在SRC2背景下更稳定和主要的立体化学产物为内型异构体的那些(图21B)。内型双环呈现出凸出的疏水表面，其直接接触ERα残基Val355、Ile358和Leu539，它们形成与结合LXXLL(SEQ ID NO:5)基序的裂隙相邻的疏水架(图21C)。来源于SRC2中Leu690和Leu694的6a中的残基保留了它们的典型接触并与AF2沟中的疏水残基网络深度接合(图21C)。另外的定向接触由His691介导到与狄尔斯-阿尔德加合物相对的边缘，以及为肽螺旋的N-末端加帽的ERα的Glu542之间的保守氢键(图22C)。在C-末端，DAC-肽结构中存在的最后排序的残基Q695，折叠回到肽上，以满足与i-2酰胺羰基的氢键，有效地为螺旋加帽(图22C)。综上所述，这些结构数据证实，独特的狄尔斯-阿尔德化学和立体化学组成可以稳定活跃的螺旋构型，并直接促进靶标接合，正如本文通过在ERαAF2裂隙的核心和边缘周围形成分子“扣环”所证明的那样。
G.材料和方法
DAC肽合成、纯化和分析。通过基于Fmoc的固相肽合成(SPPS)合成肽，进行闭环复分解(适当时)，并通过反相HPLC利用C18柱纯化。以类似的方式在树脂上掺入Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH和Fmoc-(2-呋喃基)丙氨酸-OH。通过LC-MS，使用C18反相柱(Phenomenex，5.0×50mm，孔径
粒径5μm)；缓冲液A(5/95/0.1％ACN/H2O/TFA)和缓冲液B(95:5:0.1％ACN/H2O/TFA)分析肽；利用以下梯度的20min方法(流速0.5mL/min):0％缓冲液B，3min；0–65％缓冲液B，15min；65–100％缓冲液B，1min；100–0％缓冲液B，1min。将纯化的肽在配衡的低保留微量离心管中冻干，通过质量和相关的UV吸光度进行量化，并进一步用于结构表征或溶解在DMSO中作为10mM储备液，并储存在-20℃下以备后用。
N-(9-芴甲氧羰基)-L-半胱氨酸。向50mL二氯甲烷中的1.76g N-(9-芴甲氧羰基)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(3mmol)的悬浮液中加入3mL三异丙基硅烷(14.6mmol)，然后加入10mL三氟乙酸(131mmol)。将所得混合物在室温下搅拌10分钟，直至其变为无色。减压下除去溶剂，并将残余混合物用己烷研磨，得到1.03g白色固体(定量)，其无需进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(9-芴甲氧羰基)-S-(反,反-2,4-己二烯基)-L-半胱氨酸。在氮气下保护于50mLN,N-二甲基甲酰胺中的1.03g N-(9-芴甲氧羰基)-L-半胱氨酸(3mmol)和0.83g碳酸钾(6mmol)的溶液，并冷却至0℃。加入0.58g反,反-2,4-己二烯基溴化物(3.6mmol)，并在0℃和氮气下将反应混合物搅拌1小时。通过TLC监测反应完成后，加入50mL水，并用1N HCl将混合物酸化至pH 2。将混合物用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。然后合并有机层，用5％LiCl(25mL×4)、盐水(50mL×2)洗涤，并在硫酸钠上干燥。减压下除去溶剂，并将粗制混合物通过快速色谱纯化，以得到0.77g灰白色固体(61％)，Rf＝0.15(9:1二氯甲烷/甲醇)。
DAC肽官能化。在SPPS和N-末端乙酰化后，在30μmol MBHA rink酰胺(0.86mmol/g)或NOVAPEG(0.31mmol/g)树脂上进行DAC肽官能化。必要时，通过在3mL 20/10/70％βME/DIPEA/DMF中用N2鼓泡，2×2hr，实现Cys-StBu去保护。如通过LC-MS分析监测的，在用DMF和DCM大量洗涤后，进行Cys烷基化以在室温下，于3mL DMF中4hr，用19mg溴己二烯(4eq；120μmol)和41μL DIPEA(8eq；240μmol)完成。用DMF和DCM洗涤后，通过在3mL 1％TFA/DCM中用N2鼓泡5×2min来实现Lys-Mmt去保护。在用DCM和DMF大量洗涤后，首先在0.5mL DMF中，用37mg HCTU(3eq；90μmol)将4.65mg N-马来酰亚胺甘氨酸(3eq；90μmol)预活化10min来进行Lys酰化。然后利用1mL DMF和16μL DIPEA(3eq；90μmol)将溶液与含游离胺的肽一起添加到树脂上，并用N2鼓泡5-10min。在大量洗涤和干燥树脂和肽切割后，通过LC-MS分析完全的马来酰亚胺掺入和大环化。遵循类似的程序将丙烯酰和巴豆酰官能团掺入到树脂上的游离Lys上。
DAC肽1环化时程。根据上述方案利用N-马来酰亚胺甘氨酸亲二烯体对Cys烷基化的1hex进行赖氨酸官能化。然后干燥树脂。保留一个样品以用于在4℃下进行分析，并且剩余的树脂分成4个样品。将这些样品置于DMF中，并在室温下以1,000rpm的速度搅拌30min、1hr、2hr和6hr。在每个时间点，通过过滤去除溶剂，干燥树脂，切割肽，并通过LC-MS分析和定量产物特性。
DAC肽反应条件的优化。如上所述，在RGD肽1hex的N-马来酰亚胺甘氨酸酰化后立即进行树脂上反应条件筛选。简而言之，将干树脂(～2-5μmol)分装在微量离心管中，并加入500μL指定的溶剂，并在室温或45℃下孵育2hr。肽切割后，通过LC-MS分析每个反应特征。所有未来的树脂上环化反应均在DMSO中进行，并在45℃下加热2-6hr，如通过LC-MS观察到的DAC肽转化特征根据经验确定的。
DAC肽马来酰亚胺捕获和环化实验。根据上述方案，利用N-马来酰亚胺甘氨酸亲二烯体对Cys烷基的1hex进行赖氨酸官能化。然后将树脂拆分并在DMF或20％βME/DMF中孵育2hr。大量洗涤后，通过过滤除去溶剂，干燥树脂，切割肽，并通过LC-MS分析产物特征。
DAC肽环加合物化学稳定性测定。将纯化的冷冻肽1a(1eq)或环状和线性肽5(1eq)的混合物溶解于pH 8.0的PBS中。加入βME(20eq)，并将溶液在37℃、1,000rpm下孵育。将2hr、6hr和24hr时间点冷冻并冻干(单个2hr时间点取5个)。将冻干样品溶解在0.1％TFA/H2O中并通过LC-MS进行分析。
DAC蛋白酶稳定性测定。利用于PBS或TBS中的Thermo PierceTM MS级胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，用5mM DTT和2mM CaCl2确定DAC肽蛋白酶降解动力学。将蛋白酶(1eq)添加到缓冲液中，最终测定浓度为10μg/mL胰蛋白酶或0.5μg/mL胰凝乳蛋白酶。然后将每个各自的反应混合物加入到1wt和1a(2000eq)或4wt和4a(10,000eq)中。然后将样品在37℃、1,000rpm下孵育。将5min、10min、30min、2hr和4hr时间点在冰上于等体积的2％TFA/H2O中淬灭。5min后，将样品以17,000rcf离心2min以沉淀淬灭的胰蛋白酶。然后对上清液溶液进行分析，并通过LC-MS或Q-TOF对完整的肽进行定量。
DAC划伤测定。在24孔板的每个孔中，将100,000个HeLa细胞接种于1mL补充有10％FBS的RPMI(GIBCO)中。将细胞在37℃、5％CO2下孵育，并在24hr内达到～70％汇合。将每个孔的单层细胞用无菌的200μL移液器吸头刮擦，吸出培养基和碎屑，用PBS洗涤孔，然后加入含有DMSO、10μM或20μM化合物1wt或1a的新鲜RPMI。在受伤后(时间＝0hr)和与化合物一起孵育过夜(时间＝16hr)后立即拍摄每个孔伤口的明场显微镜图像。对每个条件进行两次生物学重复，并从每张图像中至少测量5个伤口距离测量值，平均，并相对于DMSO对照中伤口闭合的距离进行归一化。
NMR波谱学。将～2-4mg肽溶解于400μL d6-DMSO中，以进行NMR实验。所有实验均在Bruker AVANCE II+500MHz NMR(1a、2a、3a、4wt、4hex、6a、7a、8a)或Bruker AVANCE IIIHD600MHz NMR(4a)上进行，使用标准采集参数，经验确定90度脉冲宽度，利用内部方法进行4a谱的溶剂抑制。在Bruker Topspin 3.5和MestReNova 11.0.2中处理和绘制数据。
分子模拟。使用分子操作环境(Molecular Operating Environment)分子建模包构建了4a的结构模型。根据NMR分析，加强狄尔斯-阿尔德加合物的内型配置，并根据测得的J耦合常数手动调整主链的扭转角。为共价连接子分配了缺失的原子名称，并使用PDB格式导出最终结构。将共价连接子的自限定拓扑文件用于使用VMD的PSFGEN插件以CHARMM格式(PSF+PDB)重建分子系统。使用定制的补丁协议来在计算机中制备环状肽，并使用N-末端乙酰基和C-末端酰胺补丁来匹配合成的化学结构。使用SOLVATE插件来生成
TIP3P7水箱，并使用AUTOIONIZE插件来使盐浓度达到0.1M NaCl。溶剂化系统总计约～9.3K个原子。除了缺少共价连接子外，使用相同的方法构建线性肽。使用NAMD 2.12软件包来进行分子动力学模拟。使用CHARMM36m力场来描述肽和离子。通过来自CHARM36m和CGENFF参数集的比拟分配共价连接子所需的参数。所有模拟均在通过Nosé-Hoover恒温器和Langevin活塞维持的298K的靶标温度和1atm的压力下进行。应用周期性边界条件，使用粒子网格Ewald(PME)方法计算全系统周期静电，网格间距设置为
并使用使用指数开关函数，利用
的开关距离和
的截止值，处理非结合相互作用。将溶剂化和电离系统能量最小化(20ps)，并引入速度，为肽的所有非氢原子设置了2的谐波约束缩放因子。在1ns的平衡之后，谐波约束被移除，并将生产模拟额外运行50ns。模拟轨迹文件被降低采样到10ps/帧以进行分析。将模拟轨迹与相应生产运行的第一框架的肽主链比对，并使用VMD中的RMSD轨迹工具找到主链或非氢原子的RMSD。使用GraphPad PRISM绘制输出RMSD值。针对图13B中显示的图像，以250ps间隔生成肽主链叠加。
DAC肽5在溶液中的环化时程。利用N-马来酰亚胺甘氨酸亲二烯体对含呋喃的肽5pre进行赖氨酸官能化，干燥树脂，然后根据上述方案切割肽。然后对所得粗制肽进行HPLC纯化，并分离主要的线性异构体5，并冻干过夜。然后将线性物质溶解在PBS中，并在室温下孵育。在0、2、12、24和48hr移除时间点，在该点通过LC-MS分析产物特征。
圆二色性(CD)光谱。CD光谱实验为在Jasco J-170上使用石英比色皿(路径长度：0.1cm)进行的。在室温下，在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中将肽溶解至50μM，并在190-260nm之间以0.5nm增量记录CD测量值。
竞争性荧光偏振(FP)测定。在黑色96孔板(Corning)中，于Synergy Neo读板器(BioTek)上进行FP实验。将3倍稀释系列的DAC肽6a、6b、7a和8a接种在60μL FP缓冲液(20mMTris-HCl,pH 7.5,50mM NaCl,0.01％NP-40)中，并通过向每孔中加入30μL FP缓冲液，其包含750nM野生型ERα野生型蛋白质、3.75μM雌二醇(E2)和10nM FITC-SRC1-BoxII肽(终体积90μL；终浓度：250nM ERα、1.25μM E2和3.3nM示踪肽)。将平板在4℃下孵育1hr，在30℃下使用标准FP测定设置成像，并按如前所述分析数据。
蛋白质表达和纯化。在如同所述的大肠杆菌BL21(DE3)中表达野生型和pET21a(+)中的Y537S 6×His-TEV-ERα(第300-550位残基)。将细胞重新悬浮在由20mM HEPES pH8.0、500mM NaCl、40mM咪唑pH 8.0、5％甘油、15mMβ-巯基乙醇(BME)、Sigma-FAST蛋白酶抑制剂混合物组成的裂解缓冲液中，并使用超声裂解。通过在4℃下以22,000g离心30分钟去除细胞碎片。将可溶性级分置于带有Ni-NTA树脂的柱子上，该树脂已用20mM HEPES pH8.0、500mM NaCl、40mM咪唑pH8.0、15mM BME和5％甘油(洗涤缓冲液)进行预平衡。用10倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子，并用缓冲液加500mM咪唑pH 8.0洗脱蛋白质。通过与1:15w/w比例的6x-His-Tev蛋白酶：ERαLBD一起在4L洗涤缓冲液中于4℃孵育过夜，然后通过Ni-NTA树脂以捕获His标签和TEV蛋白酶，来去除His标签。使用旋转浓缩器在4℃下将蛋白质浓缩至5mL，然后在用20mM pH 8.0、150mM NaCl、15mM BME和5％甘油平衡的Superdex 200HiLoad 200 16/600尺寸排阻柱上进一步纯化。在色谱图上观察到一个单一的峰，并且将与该峰对应的级份合并并浓缩至10mg/mL。将等分试样快速冷冻并储存在-80℃。
与雌二醇和6a复合的Y537S ERαLBD的共结晶和X射线数据收集。将纯化的Y537SERαLBD与1mM雌二醇(E2)一起以1.025mM 6a在4℃下孵育过夜，然后在4℃下以20,000g离心30分钟以去除不溶性配体。使用悬滴蒸气扩散产生共晶，其中将1μL蛋白质复合物与1μL孔溶液混合。在室温下1周后，在20mM Tris pH 8.0、15％PEG 3,350、200mM MgCl2中出现透明的矩形晶体。在paratone-N中低温保护晶体。在Advanced Photon Source,ArgonneNational Laboratories,Argonne,Illinois，以SBC 19-BM射束线
收集衍射数据。使用HKL-300016对数据进行索引、缩放和合并。使用PDB:6CBZ作为搜索模型在Phenix中进行分子置换，其中去除了配体和肽。使用迭代轮次的Phenix Refine和Coot手动检查来改进模型。使用Elbow生成6a的配体约束。分辨率较差的原子/残基未包括在最终模型中。该结构以登录号6PIT存储在蛋白质数据库中。所有x射线晶体结构图像均使用Pymol生成。图21B显示了与蛋白质链A对应的6a的加合物的电子密度图。
H.光谱数据
Fmoc-Cys(2,4-己二烯)-OH-1H-NMR(500MHz,CDCl3-d1)δ7.75(d,2H,Ar CH),7.60(t,2H,Ar CH),7.39(t,2H,Ar CH),7.31(t,2H,Ar CH),6.33(br d,1H,NH),5.97–6.08(m,2H,C＝CH),5.62–5.68(m,1H,C＝CH),5.42-5.47(m,1H,C＝CH),4.60(m,1H,α-H),4.41(d,2H,Fmoc CH2),4.23(t,1H,Fmoc CH),3.16(d,2H,β-H),2.98(d,2H,S-CH 2),1.70(d,3H,CH3)。
4wt(Ac-CAVPAVYK)-1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.19(s,1H),8.20(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.1,1H),8.09(d,J＝7.2Hz,1H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝8.17Hz,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,3H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(s,1H),7.07(s,1H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),6.62(dd,J＝8.3Hz,2H),4.44(q,1H),4.38(q,1H),4.31(m,3H-重叠),4.25(m,1H),4.14(q,1H),4.09(q,1H),3.68(d,1H),3.56(d,1H),2.91(dd,J＝14.3,4.7Hz,1H),2.74(m,3H-重叠),2.66(m,2H),2.38(t,J＝8.5Hz,1H),2.01(m,1H),1.94(m,1H),1.9(m,1H),1.87(s,3H),1.86(m,1H),1.80(m,2H),1.66(m,1H),1.51(m,J＝8.2Hz,3H),1.27(m,2H),1.19(m,6H-重叠),0.91(d,3H),0.87(d,3H),0.75(d,6H)。
4hex(Ac-ChexAVPAVYK)-1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.19(s,1H),8.26(d,J＝7.4Hz,1H),8.16(d,J＝8.3Hz,1H),8.09(d,J＝7.1Hz,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.89(d,J＝8.1Hz,1H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),7.72(s,3H),7.62(d,J＝8.6Hz,1H),7.15(s,1H),7.07(s,1H),7.01(d,2H),6.62(d,2H),6.12(dd,J＝14.7,10.6Hz,1H),6.04(dd,J＝14.9,10.5,1H),5.66(dq,J＝13.7,6.7Hz,1H),5.49(dt,J＝14.8,7.5Hz,1H),4.44(m,2H-重叠),4.33(m,3H-重叠),4.25(q,1H),4.14(q,1H),4.09(q,1H),3.70(m,1H),3.56(m,1H),3.19(dd,J＝7.6,2.6Hz,2H),2.92(d,1H),2.75(m,2H),2.70(m,2H),2.55(d,1H),2.01(dt,1H),1.91(m,3H–重叠),1.85(s,3H),1.81(m,2H-重叠),1.71(d,3H),1.66(m,1H),1.51(m,3H-重叠),1.27(m,2H),1.19(t,6H-重叠),0.91(d,3H),0.86(d,3H),0.75(d,6H)。
4a(Ac-CHexAVPAVYKMal–内型加合物离体化学)-1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.14(s,1H),8.58(d,J＝8.1Hz,1H),8.17(d,J＝8.2Hz,1H),8.03(t,J＝5.6Hz,1H),7.91(d,J＝7.2Hz,1H),7.84(d,J＝6.9Hz,1H),7.79(d,J＝8.6Hz,1H),7.46(d,J＝8.9Hz,1H),7.22(d,J＝8.46Hz,1H),7.04(d,J＝8.5Hz,2H),6.97(s,1H),6.90(s,1H),6.63(d,J＝8.4Hz,2H),5.77(dt,J＝9.1,3.1,2.9Hz,1H),5.66(dt,J＝9.1,3.1,3.0Hz,1H),4.40(m,1H),4.35(m,2H-重叠),4.30(dd,1H),4.2(m,2H-重叠),4.14(m,2H-重叠),3.87(d,J＝6.7Hz,2H),3.63(m,1H),3.55(m,1H),3.07(m,3H-重叠),2.99(m,2H-重叠),2.90-2.85(m,2H-重叠),2.70-2.63(m,3H-重叠),(2.47–通过DMSO信号重叠),2.08-1.96(m,4H-重叠),1.95(m,1H),1.84(s,4H-重叠),1.66(m,1H),1.46(m,2H-重叠),1.32-1.23(m,8H-重叠),1.18(m,1H),1.09(d,3H),0.96(d,3H),0.88(d,3H),0.75(d,3H),0.70(d,3H)。
实施例2
本实施例证明了狄尔斯-阿尔德环化兼容且有助于分子内二硫键稳定。
心房钠尿肽(ANP)为一种由心房细胞释放的肽激素，以响应调节钠水平和血容量。ANP具有的药理稳定性低，限制了其使用。最近的证据表明，它可在临床上用于抑制CAR-T治疗癌症期间的细胞因子释放综合征。
ANP序列和潜在的DAC设计：
ANP-WT:SCFGGRMDRIGAQSGLGCNSF(SEQ ID NO:6)，其可在N-末端丝氨酸上被乙酰化
DAC-ANP:SCFGGRX1DRIGAQX2GLGCNSF(SEQ ID NO:7)，其可在N-末端丝氨酸上被乙酰化
X1/X2＝K(mal)/K(acr)/K(cpd)…(亲二烯体)
C(hex)/S(hex)/C(cpd)/A(fur)…(二烯)
图23A和图23B显示了利用二烯和亲二烯体官能化的代表性氨基酸侧链、N-末端或C-末端。一些或全部可根据固相肽合成或在亲核氨基酸侧链选择性去保护后掺入。另外，ANP中的二硫键(对于其他激素或其他肽)可被狄尔斯-阿尔德对替代。图23C-图23E显示了另外的DAC交联结构。
DAC-ANP-1的合成。通过固相肽合成制得初始肽，掺入了Mmt保护的赖氨酸和2,4-己二烯官能化的半胱氨酸：Cys(hex)。在Mmt去保护(1％TFA/DCM)和树脂洗涤后，将4当量甘氨酰马来酰亚胺、4当量的HCTU和4当量的DIPEA添加到树脂中，并在氮气下鼓泡15min。在DMSO中加热以促进狄尔斯-阿尔德反应后，从树脂上切割肽，并对DAC还原的肽进行HPLC纯化，以用于随后的氧化。最终的肽为Ac-SCFGGRK(mal)DRIGAQC(hex)GLGCNSF(SEQ ID NO:8)。参见图24。
包含K(mal)和C(hex)的DAC-ANP1的狄尔斯-阿尔德环化，在树脂上快速发生，主要产生可分离的环状种类：DAC-ANP1(还原的)；如通过LC-MS测定的>55％粗产率。将纯化的DAC肽模板化，用于在室温下于<24hr内快速形成二硫化物；如通过LC-MS测定的定量产率。HPLC纯化的DAC-ANP1(还原的)在0.1M乙酸铵、5％DMSO、pH 7.6中于室温下的孵育，导致通过保留时间偏移和通过LCMS的2Da的损失(主要还原离子：1217.8；主要氧化离子：1216.9)观察到的完全转化为氧化产物。参见图25和图26A-图26C。
ANP-WT的合成。使用标准固相肽合成合成野生型肽ANP-WT，去保护，并切割掉树脂，并进行HPLC纯化，以进行随后的溶解状态下氧化。参见图27。
与DAC-ANP-1相比，在本文使用的氧化条件下(在0.1M醋酸铵、5％DMSO、pH 7.6、室温下孵育)，纯化的ANP-WT肽在24hr内未完全氧化(主要还原离子：1102.9；主要氧化离子：1101.4)。少量还原的起始物质被保留，并且发现发生明显的分子间二硫键形成和可能的甲硫氨酸氧化的副反应。参见图28A-图28C。增加的稀释或替代氧化条件可能有助于提高产物产量。
狄尔斯-阿尔德环化可以被用于取代、增加和以分子内二硫键环化为模板。心房利钠肽(ANP)的狄尔斯-阿尔德环化以肽为模板，以用于快速和高产的二硫键形成，并且可用于并行以多个二硫键为模板。这可能会增强活性和蛋白水解稳定性(ANP-WT具有<5min的循环半衰期)。
实施例3
本实施例证明了Lys(cpd)的合成。
用具有1当量的DIPEA的1.5当量的环戊二烯NHS酯，通过酰化受保护的赖氨酸合成包含赖氨酸氨基酸的环戊二烯，然后用于DMF中的25％哌啶对Fmoc基团去保护。参见图29和图30。
实施例4
本实施例证明了狄尔斯-阿尔德肽二聚化。
为了研究狄尔斯-阿尔德化学在较大的蛋白质结构上的应用，包括那些具有稳定二级和三级结构域的结构，靶向了Max/Max转录因子复合物的同型二聚体模拟物。
在MaxWT序列固相肽合成和合成DNA结合域RTD8(和RTD8的闭环复分解肽装订)后，用1％的TFA对Mmt-赖氨酸进行去保护。然后通过在NMP中鼓泡5当量(1-2x,2h r)，实现了通过环戊二烯(cpd)NHS-酯选择性酰化游离赖氨酸。
如通过LCMS所检测到的，从树脂上切割后，随后在浓缩的DMSO储备液(～5mM)中加热，导致DA连接的二聚体复合物快速形成。
前体和包含cpd的肽的序列示出如下(*＝S5；b＝β-Ala)。
MaxWT:KRAHHNALERKRRDHIKDSFHbK(Mmt)W(SEQ ID NO:9)
RTD8:KR*HHN*LERKRRDHIKDSbK(Mmt)(SEQ ID NO:10)
MaxWT-cpd:KRAHHNALERKRRDHIKDSFHbK(cpd)W(SEQ ID NO:11)
RTD8-cpd:KR*HHN*LERKRRDHIKDSbK(cpd)(SEQ ID NO:12)
RTD8-二聚体合成方案和结构显示在图31和图32中。实验结果参见图33A-图33F。
实施例5
本实施例证明了环戊二烯和闭环复分解钉之间的狄尔斯-阿尔德反应。
为了评估环戊二烯与通过闭环复分解肽装订产生的应变烯烃反应的能力，测试了紧邻StAx32.5R(靶向β-连环蛋白的肽的优化类似物)的钉交联掺入的cpd。
在利用包含2个双烷基化戊烯基的氨基酸(S5,*)的掺入的标准固相肽合成后，将Grubbs I催化剂用于闭环复分解，产生钉交联。
显示了StAx32.5R的Fmoc保护的前体肽(未装订的和装订的)和包含cpd的肽(*＝S5；β＝β-Ala)(图35)的序列和合成方案(图34)。
在Fmoc去保护和肽N-末端掺入环戊二烯后，观察到m/z与预期分子量相对应的具有m/z的2个峰。在DMSO中于45℃下在树脂上孵育16hr后，仅观察到一个较早的洗脱峰；还生成了游离N-末端起始物质。参见图36。
实施例6
本实施例证明了DAC蛋白质或如DA低聚化蛋白质的狄尔斯-阿尔德相容的氨基酸的非经典氨基酸(ncAA)掺入。
环戊二烯赖氨酸氨基酸(cpdLys或Lys(cpd))与吡咯赖氨酸RNA合成酶(PylRS)的天然和改造变体所使用的天然存在的氨基酸吡咯赖氨酸足够相似。这种酶将利用氨基酸充电tRNA分子，允许核糖体将其掺入到蛋白质中，其中TAG琥珀终止密码子被编码。因此，cpdLys或其他狄尔斯-阿尔德相容的氨基酸，可被插入到无细胞、噬菌体、细菌或哺乳动物表达系统中的任意蛋白质序列中。
通过将一个TAG位点编码到蛋白质中，可以插入单个cpdLys，允许经由狄尔斯-阿尔德化学缀合或蛋白质二聚化。
如果掺入两个TAG位点以使得所得的氨基酸可以非常接近，则可以经由狄尔斯-阿尔德反应选择性地分子内交联蛋白质。
GTP酶RAB25为一种小球状哺乳动物蛋白质，适合在大肠杆菌BL21表达系统中重组表达和折叠。折叠时，RAB25的N-末端和C-末端非常接近。制备了两种编码RAB25的质粒，一种将单个N-末端残基替换为TAG位点(1xTAG)，且另一种替换相同的残基，并用TAG位点(2xTAG)替换第二C-末端残基(图37)，两者都具有多组氨酸标签。通过测序确认了TAG位点的掺入。将两种质粒转化到化学感受态BL21+chPylRS细胞中(kan/chlor res.)，并接种过夜(LB+kan/chlor)。将接种培养物的100x稀释液用于表达培养物(生长至OD600＝0.5)。用1mM IPTG和1mM cpdLys进行诱导，并将培养物在37℃和225rpm下培养16hr。为了收获细胞，将细胞沉淀(4000g,4℃,5min)，并在500μL PBS+蛋白酶抑制剂中裂解，并使用超声处理(2秒，30％振幅，5秒关闭，总共2min)。澄清裂解物(17000g,4℃,10min)。使用标准的富集、洗涤和洗脱程序对His6-RAB25细胞进行Ni-NTA富集。结果通过SDS-PAGE分析。
分别在稍高和稍低的表观分子量下观察1xTAG和2xTAG RAB25蛋白质。由于ncAA掺入，1xTAG具有更高的分子量。由于多肽链的共价交联导致的迁移效率的变化，2xTAG具有明显较低的重量。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文中，其程度就如同每篇参考文献被单独且具体地指示为通过引用并入本文中，并在本文中完整阐述一样。
在描述本发明的上下文中(尤其为在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”和“至少一个”以及类似参照对象的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)将被解释为意指从所列项目(A或B)中选择的一个项目，或所列项目(A和B)中的两个或更多个的任意组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践为必不可少的。
根据本公开，本文所公开和要求保护的所有方法都可以在没有过度实验的情况下制定和执行。本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。通过阅读前述描述，那些优选实施方案的变化对于本领域的普通技术人员来说可变得显而易见。发明人期望技术人员适当地采用这种变化，并且发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。
序列表
<110> 芝加哥大学(The University of Chicago)
<120> 采用狄尔斯-阿尔德环加成反应的通用型肽和蛋白质的大环化和多聚化
<130> 749097
<150> 62/831,484
<151> 2019-04-09
<150> 62/894,478
<151> 2019-08-30
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为C(hex)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为K(mal)
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Xaa Arg Gly Asp Xaa
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<212> PRT
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<223> 合成的序列
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<222> (1)..(1)
<223> Xaa为C(hex)
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<222> (6)..(6)
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<212> PRT
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<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
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Leu Xaa Xaa Leu Leu
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<212> PRT
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<223> 合成的序列
<400> 6
Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu
1 5 10 15
Gly Cys Asn Ser Phe
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<212> PRT
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<223> Xaa为具有亲二烯体的AA
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<222> (14)..(14)
<223> Xaa为具有二烯的AA
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Gly Cys Asn Ser Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<222> (22)..(22)
<223> Xaa为β-丙氨酸
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<223> Xaa为K(mmt)
<400> 9
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Lys Asp Ser Phe His Xaa Xaa Trp
20
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的序列
<220>
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa为S5
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<222> (7)..(7)
<223> Xaa为S5
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<223> Xaa为β-丙氨酸
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<223> Xaa为K(mmt)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的序列
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<222> (22)..(22)
<223> Xaa为β-丙氨酸
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<223> Xaa为K(cpd)
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<212> PRT
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<222> (3)..(3)
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<222> (7)..(7)
<223> Xaa为S5
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<223> Xaa为β-丙氨酸
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<223> Xaa为K(cpd)
<400> 12
Lys Arg Xaa His His Asn Xaa Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asp His Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ser Xaa Xaa
20
Claims (53)
1.下式的大环化合物：
其中
A、A1和A2为氨基酸；
每个n独立地为0至600的整数，除了与X连接的位置，其中n至少为1；并且
X为反应性官能团之间的加合物。
2.如权利要求1所述的大环化合物，其中X与一个氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合以及与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
3.如权利要求1所述的大环化合物，其中所述加合物为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
4.如权利要求1所述的大环化合物，其中A1和A2中的一个为半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，并且另一个为赖氨酸或赖氨酸衍生物。
5.如权利要求1所述的大环化合物，其中X由己二烯基与马来酰亚胺基、马来酰亚胺基与呋喃基、环戊二烯基与另一环戊二烯基、环戊二烯基与马来酰亚胺基，或环戊二烯基与脂肪族烯烃之间的反应形成。
6.如权利要求1所述的大环化合物，其中X为以下中的一种：
7.如权利要求1所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为：
8.如权利要求1所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为：
9.如权利要求1所述的大环化合物，其中至少一个氨基酸A为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
10.如权利要求1所述的大环化合物，其中式(I)的化合物被进一步限定为以下中的一种：
11.如权利要求1所述的大环化合物，其中X为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成，并且所述加合物在与所述化合物中任意两种不同的氨基酸结合的反应性官能团之间形成。
12.合成大环化合物的方法，所述方法包括：
合成式(II)的肽，其包含能够进行Y-Z共轭反应的反应性官能团Y和Z；和
使所述肽经受驱动所述Y-Z共轭反应的条件，以形成分子内Y-Z交联部分；
其中
A、A1和A2为氨基酸；并且
每个n独立地为0至600的整数，除了与Y或Z连接的位置，其中n至少为1。
13.如权利要求12所述的方法，其中Y和Z中各自独立地与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述Y-Z共轭反应为环加成反应。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述Y-Z共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联形成、硫醇烯反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥形成。
16.如权利要求12所述的方法，其中至少一个氨基酸A为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
17.如权利要求12所述的方法，其中A1和A2中的一个为半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，并且另一个为赖氨酸或赖氨酸衍生物。
18.如权利要求12所述的方法，其中Y为共轭二烯。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述共轭二烯为线性或环状结构的一部分。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述共轭二烯为2,4-己二烯、呋喃、噻吩、环戊二烯或它们的衍生物。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述共轭二烯或其衍生物包括供电子基团部分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述供电子基团选自：烷基、酯、酰胺、烷氧基、羟基、胺和甲硅烷基醚。
23.如权利要求12所述的方法，其中Z为亲二烯体。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述亲二烯体为顺丁烯二酸酐或其衍生物、苯炔或其衍生物、醌或其衍生物、N-亚磺酰基衍生物、硫二亚胺衍生物、亚氨基衍生物、亚硝基衍生物、硫代亚硝基衍生物、丙烯酸酯或其衍生物，或者巴豆酸酯或其衍生物。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述亲二烯体包括吸电子基团部分。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述吸电子基团选自：酯、酰胺、硝基、砜、羰基、氰基和卤代烷部分。
27.如权利要求12所述的方法，其中反应性官能团Y和Z各自独立地与不同氨基酸的侧链、胺基、羧基或α碳结合。
28.如权利要求12所述的方法，其中式(II)的肽被进一步限定为以下中的一种：
29.下式的双环或更高阶环状化合物：
其中
A、A1、A2、A3和A4为氨基酸；
每个n独立地为1至600的整数；
B为与任意两个氨基酸结合的互补反应性官能团之间的加合物；
C为与不结合至B结合的任意两个氨基酸结合的互补反应性官能团之间的加合物。
30.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团和用于形成所述C加合物的反应性官能团彼此正交。
31.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中加合物B或C中的一种为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
32.如权利要求31所述的双环或更高阶环状化合物，其中加合物B或C中的另一种为产生自以下的加合物：狄尔斯-阿尔德反应、烯烃复分解反应、铜催化的叠氮炔点击化学、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯化学反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
33.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述C加合物的反应性官能团与位于与用于形成所述B加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。
34.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团与位于与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的两个氨基酸内侧的氨基酸结合。
35.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中用于形成所述B加合物的反应性官能团与与用于形成所述C加合物的反应性官能团结合的氨基酸呈交错关系的氨基酸结合。
36.如权利要求29所述的双环或更高阶环状化合物，其中至少一种氨基酸为非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
37.合成双环或更高阶环状化合物的方法，所述方法包括：
合成式(VI)的肽，其包含：i)能够进行D-E共轭反应的反应性部分D和E，和ii)能够进行F-G共轭反应的反应性部分F和G；
使所述肽经受驱动所述D-E共轭反应的条件，以形成分子内D-E交联部分；
使所述肽经受驱动所述F-G共轭反应的条件，以形成分子内F-G交联部分；
其中
A、A1、A2、A3和A4为氨基酸；并且
每个n独立地为1至600的整数。
38.如权利要求37所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G各自独立地与任意氨基酸A1至An的不同的氨基酸侧链、氨基酸氨基、氨基酸羧基或氨基酸α碳结合。
39.如权利要求37所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G中的至少一个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。
40.如权利要求37所述的方法，其中反应性官能团D、E、F和G中的每一个与非天然氨基酸或氨基酸衍生物结合。
41.如权利要求37所述的方法，其中反应性官能团F和互补反应性官能团G与位于与官能团D和互补反应性官能团E结合的反应性氨基酸内侧的氨基酸结合。
42.如权利要求37所述的方法，其中反应性官能团D和互补反应性官能团E与位于与官能团F和互补反应性官能团G结合的反应性氨基酸内侧的氨基酸结合。
43.如权利要求37所述的方法，其中与反应性官能团E的结合氨基酸以及与反应性官能团F结合的氨基酸位于与反应性官能团D结合的氨基酸以及与反应性官能团G结合的氨基酸的内侧。
44.如权利要求37所述的方法，其中与反应性官能团D结合的氨基酸以及与反应性官能团G结合的氨基酸位于与反应性官能团F结合的氨基酸以及与反应性官能团E结合的氨基酸的内侧。
45.如权利要求37所述的方法，其中所述D-E共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、闭环复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述F-G共轭反应选自：狄尔斯-阿尔德反应、闭环复分解反应、铜催化的叠氮炔点击反应、经由两个半胱氨酸残基氧化的胱氨酸的形成、经由一个或多个半胱氨酸残基烷基化的交联的形成、硫醇烯反应、或N-末端或C-末端和/或残基侧链之间的内酰胺桥的形成。
47.如权利要求37所述的方法，其中所述D-E共轭反应和所述F-G共轭反应为不同的反应类型。
48.式(X)的多肽：(A1)n–R1–(A2)m (X)
其中A1和A2为氨基酸；
n和m各自独立地为2至600的整数；
A1的氨基酸为N-末端至C-末端，并且A2的氨基酸为C-末端至N-末端；并且
R1为从环戊二烯基与另一环戊二烯基之间的反应形成的加合物。
49.如权利要求48所述的多肽，其中R1为
50.如权利要求48所述的多肽，其中式(X)的多肽被进一步限定为(A1)n-1–Lys–R1–Lys–(A2)m-1。
51.连接肽或多肽的方法，所述方法包括使第一肽或多肽与第二肽或多肽反应、其中所述第一肽或多肽以及所述第二肽或多肽各自包含环戊二烯基，并且其中反应后在所述第一肽或多肽的环戊二烯基与所述第二肽或多肽的环戊二烯基之间形成加合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述加合物为
53.如权利要求51所述的方法，其中所述第一和第二肽或多肽是相同的，并且被同源二聚化。
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