CN114149936B - 一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其保藏号为CGMCC NO.8333；其合成的胞外多糖的平均重量分子量为300,800～451,200道尔顿，为由葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖以摩尔比1.55～1.60:1:1.63～1.72组成的酸性杂多糖；该胞外多糖的主链由1,3‑连接的葡萄糖残基、1,3‑连接的岩藻糖残基、1,3,4‑连接的岩藻糖残基和1,4‑连接的葡萄糖醛酸残基构成，分支点位于1,3,4‑连接的岩藻糖残基O‑4位，支链由末端连接的葡萄糖醛酸残基构成，由式I所示的重复结构单元组成；此外，该胞外多糖还有一定的免疫调节作用，在食品、医药和相关领域具有良好的应用前景。

Description

一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的菌株

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的菌株。

背景技术

20世纪60年代以来，多糖被认为是一种广谱的非特异性的免疫促进剂，可增强宿主细胞的细胞免疫和体液免疫功能，如激活巨噬细胞、T细胞、B 细胞和NK细胞等，激活补体及诱导产生干扰素等，其作用将是激活人体的非特异性防御机能，在抗病毒、抗肿瘤、抗辐射等方面有很好的疗效。

根据来源的不同，多糖可分为动物多糖、植物多糖和微生物多糖，其中，微生物多糖由微生物代谢碳水化合物产生，通常，代谢的基料是人工合成的，如MRS、TYC等，而有关采用天然基料，尤其是农业加工副产品(如小麦麸皮等)来合成微生物多糖的研究相对较少。此外，就发酵菌种而言，有关可发酵麸皮合成胞外多糖的菌株研究也相对贫乏。

因此，有必要开发一种以小麦麸皮为发酵介质的菌株，一方面提高农副产品的利用率，降低微生物胞外多糖的制备成本，另一方面，可获得新的胞外多糖以满足研究的需要，同时，也丰富性能优良、用途广泛的微生物胞外多糖的种类。

发明内容

本发明的目的是提供一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的菌株。该菌株能够发酵小麦麸皮生产胞外多糖，胞外多糖具有多种生物学效应，在食品、医药和相关领域具有良好的应用前景。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的类芽孢杆菌 (Paenibacillussp.)，该菌株的保藏号为CGMCC NO.8333。该菌株于2013年 10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

优选的，所述菌株可以发酵小麦麸皮合成胞外多糖。

优选的，所述菌株合成的胞外多糖的平均重量分子量为300,800～451,200 道尔顿。

优选的，所述菌株合成的胞外多糖为由葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖以摩尔比1.55～1.60:1:1.63～1.72组成的酸性杂多糖。

优选的，所述菌株合成的胞外多糖的主链由1,3-连接的葡萄糖残基、1,3- 连接的岩藻糖残基、1,3,4-连接的岩藻糖残基和1,4-连接的葡萄糖醛酸残基构成，分支点位于1,3,4-连接的岩藻糖残基O-4位，支链由末端连接的葡萄糖醛酸残基构成。

优选的，所述菌株合成的胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成。

本发明还提供了一种类芽孢杆菌合成的胞外多糖在食品、医药领域中的应用。

本发明还提供了一种类芽孢杆菌合成的胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。

优选的，所述菌株合成的胞外多糖浓度低于100μg/mL。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明技术方案首次披露了一株可发酵小麦麸皮合成胞外多糖的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)菌株，其合成的胞外多糖结构明确且特殊，不但安全，而且具有多种生物学效应，如增强巨噬细胞的吞噬功能、促进巨噬细胞释放细胞因子，使其作为微生物产生的高分子物质具有显著的技术优势，因而在食品、医药和相关领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为CGMCC No.8333胞外多糖粗品的凝胶层析洗脱曲线图

图2为CGMCC No.8333胞外多糖的高效凝胶过滤色谱图

图3为CGMCC No.8333胞外多糖的1H-NMR色谱图

图4为CGMCC No.8333胞外多糖的13C-NMR色谱图

图5为CGMCC No.8333胞外多糖的H-H COSY色谱图

图6为CGMCC No.8333胞外多糖的HSQC色谱图

图7为CGMCC No.8333胞外多糖的TOCSY色谱图

图8为CGMCC No.8333胞外多糖的HMBC色谱图1

图9为CGMCC No.8333胞外多糖的HMBC色谱图2

图10为CGMCC No.8333胞外多糖的NOESY色谱图

图11为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞的影响

图12为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

图13为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞释放NO的影响

图14为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

图15为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响

图16为CGMCC No.8333胞外多糖对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响

具体实施方式

一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，该菌株的保藏号为CGMCC NO.8333。

本发明类芽孢杆菌从开菲尔中分离获得，在中国科学院微生物研究所进行了鉴定，细胞形态及理化实验结果如下表所示：

16SrRNA基因序列测定结果如下：

TGCAGTCGAGCGGAGTTGATAGAGTGCTTGCACTCTTGAGACTTAGCG GCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCCTCAGACTGGGAT AACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCGGATAATCGTTTTCTTCTCCTGA AGAGACCGGGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTGAGGGATGGGCCTGC GGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACG AAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATC GTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTCTAGAGTAACTGCTAGA AGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCG TAAAGCGCGCGCAGGCGGTCATTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAAGC TCAACTTCGGGTCGCATCGGAAACTGGATGACTTGAGTGCAGAAGAG GAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGG AACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGG CGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGC CGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAC TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATG TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCT GAATGACCGGTGCAGAGATGTACCTTTTCTTCGGAACATTCAAGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCACATCATGGTG GGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACA ATGGTCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCGAATCCTA AAAAGCCGATCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAA GTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACC CGAAGTCGGTGGGGTAACCCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGTC AGT

该菌株于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明提供的类芽孢杆菌可以发酵小麦麸皮合成胞外多糖。目前，微生物多糖由微生物代谢碳水化合物产生，通常其代谢的基料是人工合成的，如 MRS、TYC等，而有关采用天然基料，尤其是农业加工副产品(如小麦麸皮等)来合成微生物多糖的研究相对较少。此外，就发酵菌种而言，有关可发酵麸皮合成胞外多糖的菌株研究也相对贫乏。本发明中，所述类芽孢杆菌不仅能够发酵小麦麸皮，而且能够合成胞外多糖，且该胞外多糖结构明确且特殊。

本发明的类芽孢杆菌CGMCC NO.8333合成的胞外多糖的平均重量分子量为300,800～451,200道尔顿，为由葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖以摩尔比1.55～1.60:1:1.63～1.72组成的酸性杂多糖。该胞外多糖的主链由1,3-连接的葡萄糖残基、1,3-连接的岩藻糖残基、1,3,4-连接的岩藻糖残基和1,4-连接的葡萄糖醛酸残基构成，分支点位于1,3,4-连接的岩藻糖残基O-4位，支链由末端连接的葡萄糖醛酸残基构成，由式I所示的重复结构单元组成。

本发明还提供了类芽孢杆菌合成的胞外多糖在食品、医药领域中的应用。研究表明，微生物胞外多糖具有生物活性，如免疫活性、抗肿瘤、抗氧化和抗肿瘤以及调节肠道菌群等，可应用于食品医药等领域。免疫调节作为多糖最重要的生物活性之一，是一类非特异性免疫调节剂。免疫系统是机体抵御病原微生物的入侵和清除机体内变异细胞的保卫系统，主要由免疫器官、免疫细胞及免疫分子组成。正常机体内，免疫系统维持一个动态平衡，使机体维持稳定。然而，当免疫系统紊乱时会诱发一系列疾病，使机体正常生理功能受损。研究发现，胞外多糖对机体的免疫调节作用主要包括激活巨噬细胞，激活B细胞和T细胞等免疫细胞，通过细胞表面受体识别，进入细胞，提高细胞的吞噬及分泌能力，激活补体，激活网状内皮系统，促进免疫器官发育。本发明中，类芽孢杆菌CGMCC NO.8333合成的胞外多糖在浓度低于 100μg/mL时无细胞毒性，可活化RAW264.7细胞，增强其吞噬能力，通过激活RAW264.7细胞，提高NO、TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的表达，具有良好的免疫调节作用。

本发明还提供了一种类芽孢杆菌合成的胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。

下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，所有原料均为市售，并均符合相关的国家标准。

实施例1类芽孢杆菌胞外多糖的制备

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含脱脂乳1％(w/w)、琼脂1.5％(w/v)(购自国药集团，中国)的固体培养基上，30℃好氧培养48 h取出，用接种环挑取单菌落接种于10mL含脱脂乳10％(w/w)的液体培养基中，30℃、180rpm振荡培养24h，即得发酵用的种子。

(b)小麦麸皮培养基的制备：向250mL三角瓶中加入1.8g小麦麸皮 (市售)与58.2mL蒸馏水混匀，加热煮沸后，再置于110℃灭菌15min，冷却至室温，即得所需小麦麸皮培养基。

2、类芽孢杆菌胞外多糖粗品的制备

将类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于上述小麦麸皮培养基中，26℃、180rpm 振荡培养48h得发酵液。将发酵液15,000rpm离心10min取上清，加热煮沸10min，冷却至室温，缓慢加入三倍体积的无水乙醇(购自国药集团，中国)，冷藏静置24h取出，15,000rpm离心10min取沉淀，用少量蒸馏水完全复溶后，经冷冻干燥即得类芽孢杆菌胞外多糖粗品A。

3、类芽孢杆菌胞外多糖(单一组分)的制备

取250mg类芽孢杆菌胞外多糖粗品A溶解于25mL Tris-HCl缓冲液 (50mM、pH7.6)(购自国药集团，中国)中，用恒流泵上样于预装且平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow(购自GE公司，美国)层析柱上，依次用 Tris-HCl缓冲液(50mM、pH7.6)、含0.2mol/LNaCl和0.4mol/LNaCl的缓冲溶液进行等度洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，用自动部分收集器(购自上海青浦沪西仪器厂，中国)收集洗脱液(每管收集8mL)。

用硫酸-苯酚法检测各管洗脱液中的多糖含量，合并收集第三个组分峰 (图1中185-205管，图1中横坐标为管的编号，纵坐标为光吸收值)，装入截留分子量为14,000道尔顿的透析袋内，用去离子水透析72h以去除缓冲盐，每12h换水一次，经冷冻干燥后即得单一组分的多糖，即本发明所述的类芽孢杆菌胞外多糖，称为EPS-1。

实施例2类芽孢杆菌胞外多糖的制备

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)小麦麸皮培养基的制备：向250mL三角瓶中加入0.6g小麦麸皮与59.4mL蒸馏水混匀，加热煮沸后，再置于125℃灭菌5min，冷却至室温，即得所需小麦麸皮培养基。

2、类芽孢杆菌胞外多糖粗品的制备

将类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量5％无菌接种于上述小麦麸皮培养基中，37℃、300rpm振荡培养12h得发酵液。将发酵液15,000rpm 离心10min取上清，加热煮沸10min，冷却至室温，缓慢加入三倍体积的无水乙醇，冷藏静置24h取出，15,000rpm离心10min取沉淀，用少量蒸馏水完全复溶后，经冷冻干燥即得类芽孢杆菌胞外多糖粗品B。

3、牛类芽孢杆菌胞外多糖(单一组分)的制备

参考实施例1所述方法对类芽孢杆菌胞外多糖粗品B进行分离，得类芽孢杆菌单一组分的胞外多糖EPS-2。

实施例3类芽孢杆菌胞外多糖的制备

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)小麦麸皮培养基的制备：向250mL三角瓶中加入3g小麦麸皮与 57mL蒸馏水混匀，加热煮沸后，再置于95℃灭菌25min，冷却至室温，即得所需小麦麸皮培养基。

2、类芽孢杆菌胞外多糖粗品的制备

将类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％无菌接种于上述小麦麸皮培养基中，20℃、100rpm振荡培养72h得发酵液。将发酵液15,000rpm 离心10min取上清，加热煮沸10min，冷却至室温，缓慢加入三倍体积的无水乙醇，冷藏静置24h取出，15,000rpm离心10min取沉淀，用少量蒸馏水完全复溶后，经冷冻干燥即得类芽孢杆菌胞外多糖粗品C。

3、类芽孢杆菌胞外多糖(单一组分)的制备

参考实施例1所述方法对类芽孢杆菌胞外多糖粗品C进行分离，得类芽孢杆菌单一组分的胞外多糖EPS-3。

实施例4类芽孢杆菌胞外多糖单一性的验证

称取5mg EPS-1、EPS-2和EPS-3样品分别溶于5mL超纯水，配制成1mg/mL的多糖溶液，过0.45μm滤膜后进样于Agilent 1100高效液相色谱仪 (购自安捷伦公司，美国)进行分析，色谱条件：RID检测器，色谱柱为 TSK-Gel G6000PWXL(购自东曹(上海)生物科技有限公司，日本)，流动相为0.1mol/LNaNO₃溶液。设定流速为0.6mL/min，柱温35℃，进样量20μL，根据峰型判断其纯度(单一性)。

其中，EPS-1样品的高效凝胶过滤色谱图如图2所示(EPS-2和EPS-3 的色谱图与之类似)，在保留时间14-15min呈现一个对称的色谱峰，21min 的色谱峰为流动相峰，上述结果表明EPS-1、EPS-2和EPS-3样品皆为均一多糖组分。

实施例5类芽孢杆菌胞外多糖分子量的测定

以不同分子量的葡聚糖为标准品：STD-1(Mw＝5,000)， STD-2(Mw＝12,000)，STD-3(Mw＝50,000)，STD-4(Mw＝270,000)， STD-5(Mw＝670,000)。分别将上述系列标准多糖及EPS-1、EPS-2和EPS-3 样品溶于流动相(0.1mol/LNaNO₃溶液)得到1mg/mL的溶液，分别经0.45 μm滤膜过滤后经Agilent 1100高效液相色谱仪进行分析，色谱条件同实施例 4。以标准多糖的分子量的对数LgMw为横坐标，保留时间tR为纵坐标绘制标准曲线，得到分子量的对数与保留时间的线性回归方程。根据回归方程可计算样品的分子量，结果如下表所示。

表1类芽孢杆菌胞外多糖分子量测定

结论：类芽孢杆菌胞外多糖的平均重量分子量为300,800～451,200道尔顿。

实施例6类芽孢杆菌胞外多糖的单糖组成的测定

(1)多糖样品的水解

取2.0mg EPS-1、EPS-2和EPS-3样品分别置于安瓿瓶中，加入2mol/L 三氟乙酸(TFA)3mL，封口后110℃下水解5h。水解液冷却后在45℃下减压旋蒸至干，加入甲醇继续旋蒸，重复若干次除去过量TFA，得到EPS水解产物。

(2)水解样品和混合单糖标样的衍生

上述EPS水解产物溶解于1mL水得待衍生的样品溶液。取1mL前述样品溶液或9种单糖混合标准溶液(0.5mg/mL，鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、木糖)，加入0.6 mol/LNaOH溶液1mL和0.5mol/L的PMP甲醇溶液1mL，混合均匀使固体产物完全溶解，置于70℃烘箱反应100min。冷却至室温后逐滴加入0.3 mol/L HCl调节至中性，三氯甲烷萃取3次后收集水相，将水相用0.45μm滤膜过滤后供HPLC进样分析。

(3)色谱条件

采用Agilent 1260高效液相色谱仪(购自安捷伦公司，美国)，配备DAD 检测器，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(购自安捷伦公司，美国)。设定柱温30℃，进样量20μL，流动相乙腈∶0.1mol/L磷酸盐缓冲液 (pH6.8)＝16:84(V/V)，检测波长250nm。

(4)数据分析

参照根据不同单糖标样(购自sigma公司，美国)的保留时间，确定多糖样品的单糖组成的种类。再根据各单糖组成的峰面积比例，确定多糖样品中各单糖的摩尔比。结果如表2所示。

表2类芽孢杆菌胞外多糖的单糖摩尔比

	葡萄糖醛酸	葡萄糖	岩藻糖
				EPS-1(以摩尔比计)	1.58	1	1.66
EPS-2(以摩尔比计)	1.55	1	1.63
				EPS-3(以摩尔比计)	1.60	1	1.72

结论：类芽孢杆菌的胞外多糖为由葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖以摩尔比1.55～1.60:1:1.63～1.72组成的酸性杂多糖。

实施例7类芽孢杆菌胞外多糖连接方式的测定

(1)甲基化分析

糖醛酸还原：采用碳化二亚胺-硼氢化钠法(EDC-NaBH₄)还原糖醛酸，反应分两个阶段，第一阶段：取50mg EPS-1样品溶于6mL超纯水中，搅拌至全部溶解。将500mg EDC分两次加入溶液中，间隔时间30min，并用 0.1mol/L HCl控制pH始终处于4.5～4.8之间，整个反应过程需3h。第二阶段：40min内在上述体系中滴加8mL 2mol/LNaBH₄，并控制体系pH在7.0左右，滴加结束后继续反应1h，产物置于透析袋(截留分子量为3500Da) 中流水透析24h。上述步骤重复4次，通过PMP-HPLC检测糖醛酸是否还原完全。

甲基化：取上述糖醛酸还原完全的干燥多糖样品20mg，置于10mL反应瓶中，室温下快速加入无水二甲基亚砜3mL，密闭，磁力搅拌30min并用超声辅助使样品溶解，然后快速加入干燥的NaOH粉末50mg，密闭搅拌至大部分NaOH溶解之后冰浴5min，在30min内缓慢逐滴加入1mL碘甲烷，室温避光搅拌继续反应30min，最后加入1mL超纯水反应终止。产物置于透析袋中流水透析24h，旋蒸至干后重复上述步骤。多次进行甲基化后，取少量样品进行红外光谱检测，如果多糖样品在3400-3000cm-1的O-H伸缩振动吸收峰消失，表明多糖样品己经完全甲基化；如果样品还未完全甲基化，则需再继续进行反应至样品完全甲基化为止。

水解及乙酰化：将完全甲基化的EPS-1样品2mg置于安瓿瓶中，加入3mL 2mol/LTFA并封口，在110℃密闭水解4h后，加甲醇减压旋蒸若干次，以彻底除去TFA。旋干后加3mL超纯水溶解，加入50mg NaBH₄，在室温下磁力搅拌反应3h。反应结束后加入乙酸至溶液呈弱酸性(pH＝5)，加甲醇并旋转蒸干，重复若干次，充分除去硼酸。得到的固体在100℃烘箱中干燥10min，加乙酸酐3mL，100℃反应100min，反应结束后加甲苯(3mL)多次共蒸除去过量的乙酸酐。产物溶于三氯甲烷(5mL)，用超纯水(5mL×3)萃取3次，回收三氯甲烷层，加无水硫酸钠粉末除水，静置30min，减压蒸发至干，加入0.5mL三氯甲烷溶解，经0.22μm有机滤膜过滤后进行GC-MS分析。

GC-MS条件：仪器型号：Agilent 7820A/5977GC-MS(购自安捷伦公司，美国)；色谱柱型号：HP-5毛细管柱；程序升温：初始温度120℃，保持2min后升温至250℃，升温速率5℃/min，保持10min；进样口采用分流模式，分流比为3:1；进样量为1μL。质谱离子源为EI源，离子源的电压70eV，温度180℃。

数据分析：将GC-MS获得的EI-MS图谱与标准PMAA图谱进行比对，并结合单糖组成的结果，可以确定还原后EPS-1各糖残基的连接方式为1,3-连接的岩藻糖残基、1,3,4-连接的岩藻糖残基、1,3-连接的葡萄糖残基和1,4-连接的葡萄糖醛酸残基，末端连接的葡萄糖醛酸残基。

(2)核磁共振波谱分析

取EPS-1样品20mg，用0.5mL D₂O溶解，转移至干净的核磁管中，在600MHz核磁共振仪(购自Bruker公司，瑞士)上进行色谱分析。

对¹H-NMR(图3)、¹³C-NMR(图4)、H-H COSY(图5)、HSQC (图6)、TOCSY(图7)、HMBC(图8、图9)和NOESY(图10)的色谱综合分析后发现，EPS-1主链由1,3-连接的葡萄糖残基、1,3-连接的岩藻糖残基、1,3,4-连接的岩藻糖残基和1,4-连接的葡萄糖醛酸残基构成，分支点位于1,3,4-连接的岩藻糖残基O-4位，支链由末端连接的葡萄糖醛酸残基构成。

综上所述，类芽孢杆菌胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成。

效果实施例1类芽孢杆菌胞外多糖对细胞生长的影响

将RAW264.7细胞浓度调整至1×10⁴个/mL，于96孔细胞培养板内接种，200μL/孔，37℃，5％CO₂条件下进行培养。待细胞贴壁后，弃去培养液，每孔中分别加入不同浓度的EPS-1溶液(0、6.25、12.5、25、 50、100、200、400、600μg/mL)，并以LPS(1μg/mL)作为阳性对照， 200μL/孔，每个浓度设置5个平行孔。培养24h后吸出孔板内液体，向每孔中加30μL除菌后的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后吸出孔板内液体，向每孔中加入200μL DMSO，振荡使孔板内紫色晶体充分溶解后，在492nm下用酶标仪(购自Molecular Devices公司，美国)测定吸光度(optical density，OD)并通过以下公式计算细胞在给药条件下的存活率，结果如图11所示。

存活率％＝OD_实验组/OD_对照组×100％

当EPS-1的浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μg/mL时，RAW264.7 细胞存活率均高于空白对照组，分别为120.92±1.73％、120.637±3.80％、 121.15±2.37％、116.05±3.24％和109.70±3.16％；当给药浓度增加到200 μg/mL时，RAW264.7细胞存活率有所下降，且低于空白对照组；当给药浓度达到最大浓度，即600μg/mL时，RAW264.7细胞存活率明显低于空白对照组，仅为62.74±2.94％。上述实验结果表明EPS-1在6.25～100μg/mL 范围，对RAW264.7细胞无细胞毒性。

结论：当浓度低于100μg/mL时，类芽孢杆菌胞外多糖对细胞的安全。

效果实施例2类芽孢杆菌胞外多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

将RAW264.7细胞浓度调整至1×10⁴个/mL，于96孔细胞培养板内接种，200μL/孔，37℃，5％CO₂条件下进行培养，待细胞贴壁后弃去培养液，每孔加入不同浓度的EPS-1溶液(0、6.25、12.5、25、50、100μg/mL) 和LPS(1μg/mL)各100μL，每个浓度设置5个平行孔。培养24h后加入0.08％现配的中性红溶液，培养箱孵育1h，取出后吸出液体，并用PBS 润洗2次，加入裂解液(冰醋酸：乙醇＝1：1)裂解1h，在492nm下用酶标仪测定吸光度，并通过以下公式计算各组吞噬率，结果如图12所示。

细胞吞噬率％＝OD_实验组/OD_对照组×100％

当EPS-1的浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μg/mL时，各给药处理组的吞噬率分别为105.63±2.17％、109.11±2.43％、109.91±2.75％、 119.42±1.84％和126.25±2.77％，均高于空白对照组并呈显著性差异。在上述浓度范围，随着给药浓度的增加，RAW264.7细胞的吞噬能力逐渐增强，且在给药浓度为100μg/mL时细胞的吞噬率接近阳性对照组 (129.03±3.13％)。

结论：类芽孢杆菌胞外多糖在6.25～100μg/mL之间，均可活化 RAW264.7细胞，增强其吞噬能力。

效果实施例3类芽孢杆菌胞外多糖对RAW264.7细胞释放细胞因子的影响

将RAW264.7细胞浓度调整至5×10⁵/mL，于96孔细胞培养板内接种， 200μL/孔，37℃，5％CO₂条件下进行培养。待细胞贴壁后，弃去培养液，每孔中分别加入不同浓度的EPS-1溶液(0、6.25、12.5、25、50、100、 200、400、600μg/mL)和LPS(1μg/mL)各100μL培养24h，每个浓度设2个平行孔。每孔收集50μL细胞上清液，分别用NO试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒、IL-1βELISA试剂盒和IL-6ELISA试剂盒(购自ELISA 公司，美国)检测对应的细胞因子。

结果如图13(NO)、图14(TNF-α)、图15(IL-1β)和图16(IL-6) 所示，加入不同浓度的EPS-1培养一段时间后RAW264.7的NO、TNF-α、 IL-1β和IL-6分泌水平呈剂量依赖地增加，表明类芽孢杆菌胞外多糖可激活RAW264.7细胞，提高上述细胞因子的表达，从而促进其发挥免疫调节作用。

以上对本发明所提供的可发酵小麦麸皮合成胞外多糖的菌株进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.一株发酵小麦麸皮合成胞外多糖的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)在制备胞外多糖中的应用，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC NO.8333；所述菌株可以发酵小麦麸皮合成胞外多糖；

所述胞外多糖由式I所示的重复结构单元组成，

所述胞外多糖的平均重量分子量为300,800～451,200道尔顿，为由葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖以摩尔比1.55～1.60:1:1.63～1.72组成的酸性杂多糖；

所述胞外多糖的主链由1,3-连接的葡萄糖残基、1,3-连接的岩藻糖残基、1,3,4-连接的岩藻糖残基和1,4-连接的葡萄糖醛酸残基构成，分支点位于1,3,4-连接的岩藻糖残基O—4位，支链由末端连接的葡萄糖醛酸残基构成。

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