CN114144521A

CN114144521A - 基于聚合物的细胞标记、条形码化和组装

Info

Publication number: CN114144521A
Application number: CN202080051275.1A
Authority: CN
Inventors: 武部贵则; A·杜恩
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2022-03-04
Also published as: US20220228211A1; EP3976781A4; AU2020282351A1; JP2022534396A; CA3141729A1; WO2020243647A1; EP3976781A1

Abstract

现有的单细胞分析技术通常是高分辨率的，但在可能的不同实验条件的数量上受限。本文公开了用于使用阳离子聚合物将核酸条形码递送至细胞群来对异质细胞群进行多路复用条形码化的组合物和方法。

Description

基于聚合物的细胞标记、条形码化和组装

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年5月31日提交的美国临时专利申请号62/855,448的优先权权益，所述申请的全部内容特此以引用方式明确并入。

对序列表的引用

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为CHMC63_022WOSeqListing.TXT的文件形式提供，所述文件的创建和最后修改日期为2020年5月29日，大小为1,305字节。电子序列表中的信息特此以引用方式整体并入。

技术领域

本公开的方面总体涉及细胞条形码化技术。这些技术使用阳离子聚合物和合成的核酸分子进行有效且廉价的多路复用条形码化。

背景技术

单细胞基因组、转录组和蛋白质组分析彻底改变了定量生物学和应用医学。高通量寡核苷酸测序的创新技术为一系列用于处理和分离特定细胞类型的创新策略及其在下游分析中的后续研究开辟了道路。在单细胞应用中，当前的方法依赖于使用抗体-寡核苷酸对进行的单细胞标记，所述抗体-寡核苷酸对用独特分子标识符对细胞群加标签，充当分子条形码。DNA寡核苷酸与特异性抗体的表面共价结合；这些抗体充当标记介质，因为寡核苷酸不主要具备靶向并结合目标细胞或蛋白质的先天能力。此外，抗体-寡核苷酸配对的每个组合都需要直接缀合。用五种不同的独特分子标识符标记相同细胞类型的五个群体将需要五个单独的缀合反应。针对每种细胞类型产生抗体-寡核苷酸对的这种必要性可能变得费力、昂贵且耗时。因此，目前需要改进的细胞标记方法。

发明内容

本公开的一些方面涉及合成加帽阳离子聚合物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体和3-氨基-1-丙醇接触，以通过迈克尔加成(Michael Addition)形成聚(乙二醇)二丙烯酸酯/3-氨基-1-丙醇阳离子聚合物，其中聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体与3-氨基-1-丙醇的摩尔比大于1，并且其中阳离子聚合物是丙烯酸酯封端的，以及使阳离子聚合物的末端丙烯酸酯基团与包含胺基团的加帽分子接触，以通过迈克尔加成形成加帽阳离子聚合物，其中加帽阳离子聚合物不包含任何丙烯酸酯基团。在一些实施方式中，进一步使步骤(a)的聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体和3-氨基-1-丙醇与二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯接触，其中二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯的添加导致形成包含多于两个末端丙烯酸酯基团的支化聚(乙二醇)二丙烯酸酯/二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯/3-氨基-1-丙醇阳离子聚合物。在一些实施方式中，加帽分子包含1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪、精胺、聚乙烯亚胺或2,2-二甲基-1,3-丙二胺中的一种或多种，或它们的任何组合。在一些实施方式中，聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体与3-氨基-1-丙醇的摩尔比为1.01:1、1.02:1、1.03:1、1.04:1、1.05:1、1.06:1、1.07:1、1.08:1、1.09:1、1.1:1、1.11:1、1.12:1、1.13:1、1.14:1或1.15:1，或约1.01:1、约1.02:1、约1.03:1、约1.04:1、约1.05:1、约1.06:1、约1.07:1、约1.08:1、约1.09:1、约1.1:1、约1.11:1、约1.12:1、约1.13:1、约1.14:1或约1.15:1，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如，1.01:1至1.15:1、1.01:1至1.1:1、1.05:1至1.1:1或1.1:1至1.15:1。在一些实施方式中，阳离子聚合物与加帽分子的质量比为100:1、100:2、100:3、100:4、100:5、100:6、100:7、100:8、100:9、100:10、100:15、100:20、100:25、100:30、100:35、100:40、100:45、100:50、100:55、100:60、100:65、100:70、100:75、100:80、100:85、100:90、100:95、100:100、100:150、100:200、100:300、100:400或100:500，或约100:1、约100:2、约100:3、约100:4、约100:5、约100:6、约100:7、约100:8、约100:9、约100:10、约100:15、约100:20、约100:25、约100:30、约100:35、约100:40、约100:45、约100:50、约100:55、约100:60、约100:65、约100:70、约100:75、约100:80、约100:85、约100:90、约100:95、约100:100、约100:150、约100:200、约100:300、约100:400或约100:500，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如，100:1至100:500、100:1至100:25、100:10至100:100，或100:100至100:500。在一些实施方式中，加帽阳离子聚合物是POLY1、POLY2、POLY3、POLY4、POLY5、POLY6、POLY7或POLY8，或它们的任何组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和加帽阳离子聚合物根据表2所示的比率和组分合成。

本公开的一些方面涉及加帽阳离子聚合物。在一些实施方式中，加帽阳离子聚合物是通过本文所述方法中的任一种合成的加帽阳离子聚合物。在一些实施方式中，加帽阳离子聚合物还包含荧光染料。在一些实施方式中，荧光染料是DyLight 488、DyLight 550或DyLight 650。

本公开的一些方面涉及标记细胞。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞与阳离子条形码接触，其中阳离子条形码包含阳离子聚合物和核酸条形码，其中阳离子聚合物允许核酸条形码进入细胞的细胞质。在一些实施方式中，核酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，核酸是单链DNA(ssDNA)。在一些实施方式中，核酸具有长10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个核苷酸的长度，或由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度，例如，长度为10至5000个核苷酸、100至1000个核苷酸、200至500个核苷酸、10至500个核苷酸，或400至5000个核苷酸。在一些实施方式中，阳离子聚合物是本文所述的阳离子聚合物中的任一种。在一些实施方式中，阳离子聚合物是通过本文所述方法中的任一种合成的阳离子聚合物。在一些实施方式中，细胞是组织、类器官(organoid)或球状体(spheroid)的一部分，或它们的任何组合。在一些实施方式中，核酸具有SEQ ID NO:2-4的序列。

本公开的一些方面涉及对细胞群进行多路复用条形码化的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞群与一个或多个阳离子条形码接触，其中阳离子条形码中的每一个包含阳离子聚合物和独特序列的核酸条形码，以及通过单细胞RNA-seq对一个或多个阳离子条形码的核酸条形码进行测序，从而通过单独细胞的核酸条形码的序列将单独细胞鉴定为属于细胞群。在一些实施方式中，阳离子聚合物是本文所述的阳离子聚合物中的任一种。在一些实施方式中，阳离子聚合物是通过本文所述方法中的任一种合成的阳离子聚合物。在一些实施方式中，核酸条形码是ssDNA条形码并且对核酸条形码进行测序包括扩增ssDNA条形码。在一些实施方式中，核酸条形码具有SEQ ID NO:2-4的序列。在一些实施方式中，细胞群是组织、类器官或球状体的一部分。在一些实施方式中，细胞群是肝脏类器官或前肠球状体的一部分。在一些实施方式中，细胞群包括两个或更多个细胞亚群，其中每个细胞亚群来自独特个体并且细胞群通过合并两个或更多个细胞亚群形成。在一些实施方式中，接触细胞群包括在通过合并两个或更多个细胞亚群形成细胞群之前，使两个或更多个细胞亚群中的每一个与独特阳离子条形码接触。在一些实施方式中，测序包括对两个或更多个细胞亚群中的每一个的独特阳离子条形码进行测序，从而通过单独细胞的核酸条形码的序列将单独细胞鉴定为属于两个或更多个细胞亚群中的一个。

本文提供的本公开的实施方式通过以下编号的替代方案描述：

1.一种用于标记细胞的方法，其包括使细胞与包含核苷酸的阳离子聚合物接触的步骤。

2.根据替代方案1所述的方法，其还包括用包含核苷酸的所述聚合物标记细胞、组织或类器官组装体。

3.根据替代方案1或2所述的方法，其中包含核苷酸的所述阳离子聚合物用伯胺、仲胺、叔胺或季铵阳离子封端。

4.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸是单链或双链的。

5.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸是单链的，并且其中包含所述核苷酸的所述聚合物用于DNA条形码化或FISH实验。

6.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸具有约50至约50,000个碱基对的长度。

7.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸是单链的。

8.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸是单链的。

9.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述阳离子聚合物整合到细胞组分中。

10.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述阳离子聚合物整合到细胞内组分中。

11.根据任何前述替代方案所述的方法，其包括通过电泳评估核苷酸结合。

12.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸用作条形码，包括通过流式细胞术、共聚焦显微术以及其组合对所述条形码在类器官、细胞或球状体内的时空分布进行量化。

13.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸用作条形码，包括扩增所述条形码，其中所述条形码包括标签。

14.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸用作用于标识一种或多种细胞类型的条形码。

15.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸用作条形码，包括使用所述条形码鉴定细胞的供体。

16.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述核苷酸用作条形码，包括使用所述条形码量化细胞的一个或多个特征。

17.根据任何前述替代方案所述的方法，其中所述方法不包括抗体的使用。

18.一种用于标记细胞的组合物，其包含由丙烯酸酯单体合成的阳离子聚合物，所述丙烯酸酯单体包括至少两个丙烯酸酯官能团和末端含胺小分子。

19.根据替代方案18所述的组合物，其中所述阳离子聚合物是支化聚合物。

20.根据替代方案18或19所述的组合物，其中所述组合物包含生物缓冲液，优选地10mM至25mM的生物缓冲液，优选地具有约7.4的pH。

21.根据替代方案20所述的组合物，其中所述生物缓冲液是HEPES。

22.根据替代方案1至17中任一项所述的方法，其中所述方法在约7至约8的pH下进行。

23.一种用于制备聚合物-核苷酸条形码的方法，其包括：

将核苷酸(“DNA条形码”)以约1μg至约25μL之间的浓度稀释于缓冲液中以形成核苷酸溶液；

向等体积的在所述稀释步骤中使用的缓冲液中提供根据任何前述替代方案所述的聚合物，以形成聚合物溶液；以及

将所述核苷酸溶液与所述聚合物溶液混合。

附图说明

除了上述特征之外，从以下对附图和示例性实施方式的描述中，另外的特征和变型将显而易见。应当理解，这些附图描绘实施方式并且不旨在限制范围。

图1A描绘合成和条形码化示意图的实施方式。

图1B描绘用于产生POLY-seq系统的试剂的实施方式。使用三种试剂生成丙烯酸酯封端的聚合物：聚(乙二醇)二丙烯酸酯M_n＝250(D8)、二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯(V5)和3-氨基-1-丙醇(S3)。然后用四种试剂(C1-C4)中的一种对聚合物加帽。

图1C描绘丙烯酸酯封端的(POLY-ac)和精胺加帽的POLY2的¹H NMR谱的实施方式，其中来自末端烯烃的共振通过虚线框突出显示。

图1D描绘与72.3iPSC一起孵育24小时的浓度为0.1-100μg/mL的POLY-seq载体针对对照载体Lipofectamine 3000和Mirus TransIT的活力筛选的实施方式。***＝p<0.001，n＝3。

图1E描绘使用ESH1和1383D6 iPSC对POLY-seq载体进行活力筛选的实施方式。

图1F描绘以指定的质量比被POLY-seq聚合物结合的ssDNA条形码的凝胶电泳的实施方式。

图2A描绘用DyLight 488或DyLight 650缀合的POLY-seq载体预先加标签的融合球状体的FACS的实施方式，展示了单重和双重标记。

图2B描绘通过FACS量化总标记和双重标记细胞的实施方式。

图2C描绘单独用DyLight缀合的POLY2加标签的混合HLO的FACS分析的实施方式。

图2D描绘通过图2C的FACS分析量化总HLO标记的实施方式。

图2E描绘加标签后三小时HLO内的溶酶体、POLY-seq载体、线粒体和用于追踪载体定位的F-肌动蛋白的共聚焦免疫荧光显微照片的实施方式。用POLY-seq荧光和F-肌动蛋白染色显示整个HLO。比例尺＝50μm。插图示出溶酶体共定位。比例尺＝10μm。

图2F描绘POLY-seq标记的前前肠(上部，较亮)和后前肠(下部，较暗)融合球状体的共聚焦成像的实施方式。

图3A描绘三个单独加标签的HLO样品中的条形码表达的UMAP分析的实施方式。

图3B描绘示出每个样品内以插入(inset)靶向准确度(94％)与三个条形码中的每一个对齐的细胞的百分比的图的实施方式。

图3C描绘高灵敏度UMAP聚类的实施方式，其示出(i)所有聚类细胞和(ii)仅包含来自POLY-seq标签化的条形码读段的聚类细胞。示出样品E2的通过聚类实现的靶向和所有聚类间的覆盖百分比。还描绘了样品E3的UMAP分析和聚类的实施方式，其示出(i)所有细胞和(ii)与条形码E3关联的所有细胞(顶部)，以及样品E4的UMAP分析和聚类的实施方式，其示出(i)所有细胞和(ii)与条形码E4关联的所有细胞(底部)。

图3D描绘在Seurat中进行的用于鉴定样品E2、E3和E4的双重、阴性和单重标记细胞并且作为所有样品的平均值的散列分析的实施方式。

图3E描绘每个细胞的独特检测基因(unique detected genes，UMI)的数量和总RNA，以及整合的阴性和单标记细胞之间的基因表达的实施方式。

图4A描绘通过基因表达鉴定的HLO肝谱系和以下各项的每个表达群体中包含的相应条形码化群体的实施方式：肝细胞(HNF4α、ASGR1、CEBPA、RBP4)、星状细胞(COL1A2、SPARC、TAGLN)和胆道细胞(KRT7、TACSTD2、SPP1)。

图4B描绘样品E2、E3和E4的胆道细胞、肝细胞和星状细胞群内的条形码表达的实施方式。

图4C描绘按独特检测基因的数量(高UMI>1350)和(低UMI<1350)分割的单重条形码化亚群的热图和UMAP聚类的实施方式，其示出两个亚群中跨聚类的条形码表示。

具体实施方式

本文公开了基于聚合物的分子条形码标记系统(称为“POLY-seq”)的实施方式，其使用能够在10分钟内结合标准散列寡核苷酸(“oligos”)的低成本的可商购获得的试剂合成。POLY-seq系统成功标记细胞群内的细胞。在一些实施方式中，细胞群是前前肠球状体群、后前肠球状体群或人肝脏类器官群。此系统使用标准散列寡核苷酸在一小时内实现功能性条形码化，在一些实施方式中，允许正确鉴定90％的源自在10x Genomics单细胞RNA-seq平台上制备的人肝脏类器官的细胞中的条形码标记，从而为以快速、成本有效的方式对汇集的异质样品进行多路复用提供了机会。

新一代测序(NGS)为深入研究转录组和基因组谱提供了强大工具。单细胞技术提供了对异质样品进行高分辨率分析的能力。然而，由于每个文库制备只有一种实验条件的警告，在制备多个文库时需要提高成本以运行多个样品。例如，单细胞RNA测序(scRNA-seq)使用双条形码化方案，使得被捕获以用于测序的每条RNA链都接收其自己的链特异性条形码，而针对单细胞捕获的所有RNA链都接收其自己的细胞特异性条形码。由于较大的测序仪具有以足够的测序深度并行运行多个单细胞实验的能力，scRNA-seq制剂通常附连第三实验特异性索引条形码，使得可汇集多个实验并且并行运行。这种多路复用允许提高通量并降低单位读段数量的成本。然而，由于附连索引在文库制备的最后步骤期间执行，因此必须单独制备样品以接收不同的索引，当足够的读取深度允许将单独的样品汇集在一起时，这可能产生高成本。在单细胞处理之前的这种样品汇集需要能够使用NGS平台可读取的条形码对样品进行异质性地加标签的方法。

细胞标记的一种常用技术采用条形码缀合的抗体。此方法利用抗体提供的特异性标记，以不仅区分靶标，而且还允许表达量化。通过源自多个样品的特异性标记的先天条形码化异质性，这进一步允许样品多路复用和超负载。配套技术采用脂肪酸的修饰，以非选择性地整合到细胞膜中。这种方法旨在以牺牲与抗体标记并列的特异性为代价来增强靶向遍在性。虽然基于抗体的条形码化方法允许量化细胞表面蛋白表达或特定亚群标签化，并且脂质方法允许更通用的条形码整合，但它们的制备在创建自定义文库时可能成本高昂或耗时。条形码直接与标记介质共价缀合，从而降低了灵活性，尤其是在自定义样品条形码化可用于标记异质群体以用于多路复用应用的情况下。其它技术依赖遗传多样性来通过生物信息学处理或从病毒文库的创建和生成中表达条形码化序列驱动多路分解(demultiplexing)。虽然病毒方法便于长期谱系追踪，但在多路复用应用中用于充分条形码表示的具有高转导效率的病毒文库的生成和应用对于短期标记而言可能是有局限性的。因此，存在开发快速、高效、遍在的样品特异性条形码化工具的机会，允许创建需要最少准备的自定义条形码化池，从而通过与每个实验一个样品的当前常见样品制备策略并列的多路复用显著提高通量并降低测序成本。

先前已经研究了基于聚合物的转染技术递送一系列编码所选序列的功能性DNA和/或RNA或改变蛋白质表达的能力。根据离子相互作用的一般原理进行操作，采用基于电荷的方法的聚合物载体依靠聚合物的阳离子电荷通过与填充核酸骨架的阴离子电荷的相互作用结合DNA/RNA并与细胞表面相互作用。正是基于这一原理，允许将聚合物从转染介质直接转移至条形码化载体，其中先前的应用侧重于追踪信息在体内的递送和分布。然而，有效的单细胞多路复用应用的配方优化尚未得到充分探索。适用于样品多路复用的用于条形码化的系统的两个限定特征是不考虑样品异质性的通用结合，以及重要的，结合保真度。在利用样品多路复用时，无论转录组或基因组的测序多么清晰，特定细胞都必须具有在下游生物信息学处理中可鉴定的限定的样品特异性条形码。在异质样品中，通用标记用于提供可用于汇集样品的无偏方法。结合保真度确保一旦用样品特异性条形码对细胞加标签，条形码化载体就将在多路复用期间保持与原始细胞结合，并且将不迁移至其它细胞，否则将降低将已测序细胞分配给特定样品的置信度。这两个参数在如本文所述的POLY-seq载体的开发过程中用作量化指标。

在以下详细描述中，参考了形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似部件。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的例示性实施方式并不意在是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可利用其它实施方式，并且可做出其它改变。应容易理解，如本文一般描述的和在附图中例示的本公开的方面可以以广泛多种不同的配置进行布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文明确设想。

除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员根据本公开阅读时通常理解的相同含义。出于本公开的目的，以下术语解释如下。

本文的公开内容使用肯定性语言描述多个实施方式。本公开还包括其中全部或部分地将主题排除在外的实施方式，所述主题诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。

冠词“一个”和“一种”在本文用于指冠词的一个/种或多于一个/种(例如，至少一个/种)语法宾语。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。

“约”是指量(quantity)、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度与参考量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相差至多10％。

在本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包括/包含(comprise、comprises和comprising)”应理解为暗指包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或要素的组。“由……组成”是指包括并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，并且不可存在其它要素。“基本上由……组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素，并且仅限于不干扰或促进在本公开中针对所列出的要素指定的活动或动作的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其它要素是任选的，并且可能存在或可能不存在，取决于它们是否对所列要素的活动或动作产生实质性影响。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”或“患者”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物，或鸟，例如鸡，以及任何其它脊椎动物或无脊椎动物。术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，它具体包括但不限于灵长类动物，包括猿猴(黑猩猩、猿、猴子)和人、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿类动物、大鼠、小鼠、豚鼠等。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指导致可观察的效果的所述组合物或化合物的量。本发明所公开的主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性组合物或化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于组合物的活性、配方、施用途径、与其它药物或治疗的组合、所治疗病状的严重程度，以及所治疗受试者的身体状况和之前病史。在一些实施方式中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量递增至最小有效量。本文设想了有效剂量的确定和调整，以及何时和如何进行这样的调整的评估。

如本文所用，术语“功能(function)”和“功能性(functional)”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指生物功能、酶促功能或治疗功能。

如本文所用，术语“抑制”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且可指生物活性的降低或防止。减少可以是为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比，或在由上述值中的任何两个限定的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指将生物事件减慢、延缓或推迟到比原本所预期的更晚的时间。延迟可以是一定百分比的延迟，所述百分比为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或由上述值中的任何两个限定的范围内的量。术语抑制和延迟不一定表示100％抑制或延迟。可实现部分抑制或延迟。

如本文所用，术语“分离的”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指物质和/或实体已经(1)与最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离，和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与等于、约、至少、至少约、不大于或不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、基本上100％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)的最初与其相关联的其它组分分离。在一些实施方式中，分离的试剂为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％(或包括和/或跨越上述值的范围)纯的。如本文所用，“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其它组分)。如本文所用，术语“分离的细胞”可指不包含在多细胞生物体或组织中的细胞。

如本文所用，“体内”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在活生物体(通常是动物、哺乳动物，包括人和植物)而不是组织提取物或死生物体内部执行方法。

如本文所用，“离体”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在自然条件几乎没有改变的情况下在活生物体外部执行方法。

如本文所用，“体外”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在生物条件外部执行方法，例如在培养皿或试管中。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、自然出现在细胞中的那些、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及通过任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由为天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合的单体组成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基替代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子上类似的结构替代，诸如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链DNA或RNA。一种或多种核酸可以包含在可以用于在各种生物系统中扩增和/或表达一种或多种核酸的核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、逆转录病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、养粒(fosmid)、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，或人类人工染色体(HAC))中。通常，载体或构建体还将包含包括但不限于以下的元件：启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标志物、抗生素选择标志物、靶向序列、肽纯化标签或附属基因，或它们的任何组合。

核酸或核酸分子可以包含一个或多个编码不同的肽、多肽或蛋白质的序列。这一个或多个序列可以相邻地接合在相同的核酸或核酸分子中，或在它们之间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或长度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基，或由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度的任何其它序列。如本文所用，术语核酸上的“下游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于先前序列的3’端之后。如本文所用，术语“上游”在核酸上具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且如果核酸是双链的，则该术语是指在含有编码序列的链(有义链)上在后续序列的5’末端之前的序列。如本文所用，术语“分组”在核酸上具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指两个或两个以上直接在附近发生或在其间具有额外核酸(例如接头、重复序列或限制酶位点)的序列，或任何其它序列，其长度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长的序列，或上述长度中任意两个所定义范围内的任何长度，但通常其间不具有可编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。

本文所述的核酸包含核碱基。主要的、规范的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其它核碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、染料标记碱基、荧光碱基或生物素标记碱基。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指由通过肽键连接的氨基酸组成的大分子。肽、多肽和蛋白质的许多功能是本领域已知的，包括但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。尽管化学合成也是可用的，但是肽、多肽和蛋白质通常(但不总是)由核糖体复合物通过使用核酸模板以生物学方式产生。通过使用核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，例如一种以上肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。一种以上肽、多肽或蛋白质的融合可以在同一分子中相邻结合，或者在其间具有额外的氨基酸(例如接头、重复序列、表位或标签)，或者任何其它序列，其长度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或上述长度中任意两个所定义范围内的任何长度。如本文所用，术语“下游”在多肽上具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指在先前序列的C-端之后的序列。如本文所用，术语“上游”在多肽上具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指在后续序列的N-端之前的序列。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期丰度的实际丰度。例如，物质、化合物或材料的纯度可能至少为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。纯度可能会受到多余杂质的影响，包括但不限于核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、载体、媒介物或污染物，或其任意组合。在一些是实施方式中，所述物质、化合物或材料基本上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒DNA、污染性病毒、蛋白酶体、宿主细胞培养物组分、过程相关组分、支原体、热原、细菌内毒素和外来物质。纯度可采用多种技术进行测量，包括但不限于电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、色谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附法(ELISA)、光谱法、紫外-可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振法、重量分析法或滴定法或其任意组合。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期总量的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量占预期重量的比例为大约、至少、至少大约、不超过或不超过大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。在生产的任何步骤中，产率可能会受到以下因素的影响：反应或过程的效率、多余的副反应、降解、输入物质、化合物或材料的质量或所需物质、化合物或材料的损失。

如本文所用，术语“w/w％”或“wt/wt％”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指以成分或试剂的重量占组合物总重量的百分比乘以100表示。如本文所用，术语“v/v％”或“vol/vol％”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指以化合物、物质、成分或药剂的液体体积占组合物总液体体积的百分比乘以100表示。

阳离子聚合物及其制备方法

如本文所用，术语“阳离子聚合物”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指在其表面上显示正(阳离子)电荷的高分子量聚合物化合物。在一些实施方式中，正电荷油阳离子聚合物上的胺基产生。阳离子聚合物可以是线性聚合物、支化聚合物、无规支化聚合物、树枝状聚合物、嵌段聚合物或接枝聚合物。在一些实施方式中，这些不同的聚合物结构改变了阳离子聚合物的性质。为了递送到细胞中，阳离子聚合物可以与核酸(例如DNA或RNA)的带负电荷的磷酸酯骨架结合，以形成聚合物/核酸复合物。阳离子聚合物还可以改变核酸的三维结构，例如，压缩核酸或使其不易被核酸酶接近。阳离子聚合物也可根据以下性质来进行选择：例如，阳离子电荷或区域的数目或密度、安全性、毒性、生物可降解性、易用性、合成难易性、核酸复合物形成效率、核酸递送效率、聚集倾向、用官能团进行额外修饰的能力或成本或其任意组合。尽管仍未完全了解，但阳离子聚合物通过电荷相互作用与细胞膜相互作用，通过内吞作用内化至细胞中，并将核酸释放至细胞质中，从而将复合核酸递送至细胞。在用于基因表达的核酸有效载荷的情况下，这些核酸可以由核糖体(如RNA)直接转译或转运至细胞核以作为附加体(如DNA)进行转录。对于条形码应用，可在此过程的任何步骤中(例如通过测序)分析核酸有效载荷。本领域已知的阳离子聚合物的实例包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-赖氨酸(PLL)、壳聚糖、DEAE-葡聚糖或聚酰胺胺(PAMAM)。一些阳离子聚合物可以与基于脂质的转染试剂结合，以增强向细胞的递送。可包含或不包含阳离子聚合物的商用转染试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、TransIT或Fugene。

本文描述了合成阳离子聚合物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使用二丙烯酸酯单体和链烷醇胺。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体的丙烯酸酯官能团和链烷醇胺的胺官能团根据迈克尔加成反应进行反应，以形成丙烯酸酯-氨基加合物。在一些实施方式中，迈克尔加成是氮杂-迈克尔加成。在一些实施方式中，所述方法包括使多种二丙烯酸酯单体和多种链烷醇胺反应，以得到二丙烯酸酯/链烷醇胺聚合物。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体是指聚(乙二醇)二丙烯酸酯(“D8”)单体或二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯(“V5”)单体，或两者。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体是线性二丙烯酸酯单体。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体具有以下结构：

在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体是支化的二丙烯酸酯单体。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体具有以下结构：

在一些实施方式中，聚(乙二醇)二丙烯酸酯是M_n＝250的聚(乙二醇)二丙烯酸酯。在一些实施方式中，烷醇胺是3-氨基-1-丙醇(“S3”)。在一些实施方式中，烷醇胺具有以下结构：

在一些实施方式中，所述方法包括使D8单体与S3单体反应，以得到D8/S3聚合物。在一些实施方式中，所述方法包括使D8和S3接触，以得到D8/S3聚合物。在一些实施方式中，D8和S3通过迈克尔加成进行反应。在一些实施方式中，使D8和S3接触并通过迈克尔加成进行反应，以产生D8/S3聚合物。在一些实施方式中，D8/S3聚合物是线性聚合物。在一些实施方式中，D8/S3聚合物包含一个或两个丙烯酸酯基团。在一些实施方式中，D8/S3聚合物是阳离子聚合物。在一些实施方式中，D8的量大于S3的量。在一些实施方式中，D8比S3更丰富。在一些实施方式中，D8是过量的。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比大于1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1.01:1、1.02:1、1.03:1、1.04:1、1.05:1、1.06:1、1.07:1、1.08:1、1.09:1、1.1:1、1.11:1、1.12:1、1.13:1、1.14:1或1.15:1或任何由上述比例中的任意两个定义的范围内的比例，例如1.01:1至1.15:1、1.01:1至1.1:1、1.05:1至1.1:1或1.1:1至1.15:1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不超过或不超多约1.05:1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不超过或不超多约1.1:1。在一些实施方式中，所述方法包括使D8单体和V5单体的混合物与S3单体反应，以得到D8/V5/S3聚合物。在一些实施方式中，所述方法包括使D8、V5和S3接触，以得到D8/V5/S3聚合物。在一些实施方式中，D8/V5/S3聚合物是阳离子聚合物。在一些实施方式中，D8/V5/S3聚合物是支化聚合物。在一些实施方式中，D8/V5/S3聚合物包含两个以上的末端丙烯酸酯基团。在一些实施方式中，D8和V5的量大于S3的量。在一些实施方式中，D8和V5比S3更丰富。在一些实施方式中，D8和V5是过量的。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比大于1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1.01:1、1.02:1、1.03:1、1.04:1、1.05:1、1.06:1、1.07:1、1.08:1、1.09:1、1.1:1、1.11:1、1.12:1、1.13:1、1.14:1或1.15:1或任何由上述比例中的任意两个定义的范围内的比例，例如1.01:1至1.15:1、1.01:1至1.1:1、1.05:1至1.1:1或1.1:1至1.15:1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不超过或不超多约1.05:1。在一些实施方式中，D8与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不超过或不超多约1.1:1。在一些实施方式中，V5与S3的摩尔比小于1。在一些实施方式中，V5与S3的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1或1:1或任何由上述比例中的任意两个定义的范围内的比例，例如0.1:1至1:1、0.5:1至0.8:1、0.1:1至0.5:1或0.5:1至1:1。在一些实施方式中，D8与V5的摩尔比大于1。在一些实施方式中，D8与V5的摩尔比是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2.0:1或任何由上述比例中的任意两个定义的范围内的比例，例如1.1:1至2.0:1、1.3:1至1.8:1、1.1:1至1.5:1或1.5:1至2.0:1。在一些实施方式中，表2提供了D8、V5和S3的摩尔比。

在一些实施方式中，通过本文所述的任何一种方法合成的阳离子聚合物是丙烯酸酯封端的，其中所述阳离子聚合物包含一个或多个丙烯酸酯官能团。在一些实施方式中，一个或多个丙烯酸酯官能团进一步反应。在一些实施方式中，阳离子聚合物与一个或多个封端分子进行反应，以形成封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物与一个或多个封端分子接触，以形成封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，一个或多个封端分子包含胺基。在一些实施方式中，一个或多个封端分子的胺基通过迈克尔加成与一个或多个丙烯酸酯官能团反应。在一些实施方式中，迈克尔加成是氮杂-迈克尔加成。在一些实施方式中，封端分子是1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪(“C1”)、精胺(“C2”)、聚乙烯亚胺(“C3”)或2,2-二甲基-1,3-丙二胺(“C4”)中的一种或多种(例如，至少1、2、3和4)，或它们的任何组合。在一些实施方式中，封端分子具有以下结构：

在一些实施方式中，阳离子聚合物和封端分子以一定的质量比进行接触。在一些实施方式中，阳离子聚合物和封端分子以大于1的质量比进行接触。在一些实施方式中，阳离子聚合物和封端分子以小于1的质量比进行接触。在一些实施方式中，阳离子聚合物和封端分子以一定的质量比接触，其中所述质量比是、约是、至少是、至少约是、不超过、或不超过约100:1、100:2、100:3、100:4、100:5、100:6、100:7、100:8、100:9、100:10、100:15、100:20、100:25、100:30、100:35、100:40、100:45、100:50、100:55、100:60、100:65、100:70、100:75、100:80、100:85、100:90、100:95、100:100、100:150、100:200、100:300、100:400或100:500或任何由上述比例中的任意两个定义的范围内的比例，例如100:1至100:500、100:1至100:25、100:1至100:100、100:10至100:100或100:100至100:500。在一些实施方式中，阳离子聚合物和封端分子以表2中提供的质量比进行接触。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物不包含任何丙烯酸酯基团。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY1、POLY2、POLY3、POLY4、POLY5、POLY6、POLY7或POLY8中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8)，或其任意组合。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY1。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY2。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY3。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY4。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY5。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY6。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY7。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY8。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是表2中所提供的封端的阳离子聚合物中的任意一种。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是一种根据表2中所提供的摩尔比或质量比合成的封端的阳离子聚合物。

在一些实施方式中，通过以下方式来合成阳离子聚合物：混合本文公开的二丙烯酸酯单体和本文公开的氨基醇(链烷醇胺)以形成未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体和氨基醇在一定温度下反应，其中所述温度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，或上述任意两个温度定义的范围内的任意温度，例如10℃至100℃、60℃至95℃、85℃至99℃、10℃至90℃或85℃至100℃。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体和氨基醇在一定温度下反应，其中所述温度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约90℃。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体和氨基醇反应数小时，其中所述小时数是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时，或由上述小时数中的任意两个定义的范围内的任意小时数，例如1至48小时、10至30小时、20至25小时、1至24小时或24至48小时。在一些实施方式中，二丙烯酸酯单体和氨基醇反应数小时，其中所述小时数是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约24小时。

在一些实施方式中，通过添加封端分子来对未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物进行封端，以形成封端的阳离子聚合物，其中所述封端分子是包含伯胺或仲胺的分子。在一些实施方式中，未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物和封端分子在一定温度下反应，其中所述温度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，或上述任意两个温度定义的范围内的任意温度，例如10℃至100℃、60℃至95℃、85℃至99℃、10℃至90℃或85℃至100℃。在一些实施方式中，未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物和封端分子在一定温度下反应，其中所述温度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约50℃。在一些实施方式中，未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物和封端分子在一定温度下反应数小时，其中所述小时数是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时，或由上述小时数中的任意两个定义的范围内的任意小时数，例如1至48小时、10至30小时、20至25小时、1至24小时或24至48小时。在一些实施方式中，未封端的丙烯酸酯封端的阳离子聚合物和封端分子在一定温度下反应数小时，其中所述小时数是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约24小时。在一些实施方式中，加帽阳离子聚合物在一定温度下储存，其中所述温度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约-20℃。

在一些实施方式中，阳离子聚合物或封端的阳离子聚合物与荧光标记缀合。在一些实施方式中，阳离子聚合物或封端的阳离子聚合物通过使用胺反应性缀合与荧光标记进行缀合。

在一些实施方式中，阳离子聚合物或封端的阳离子聚合物通过使用N-羟基琥珀酰亚胺酯缀合来进行缀合。在一些实施方式中，荧光标记包含N-羟基琥珀酰亚胺酯官能团。在一些实施方式中，荧光标记为DyLight 488、DyLight 550或DyLight 650。

本文描述的是阳离子聚合物、封端的阳离子聚合物、或两者或其组合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物是通过本文所述的任何一种方法所制备的阳离子聚合物。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是通过本文所述的任何一种方法所制备的封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY1、POLY2、POLY3、POLY4、POLY5、POLY6、POLY7或POLY8中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8)，或其任意组合。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY1。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY2。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY3。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY4。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY5。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY6。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY7。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是载体POLY8。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是表2中所提供的封端的阳离子聚合物中的任意一种。在一些实施方式中，封端的阳离子聚合物是一种根据表2中所提供的摩尔比或质量比合成的封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物或封端的阳离子聚合物或两者进一步包含荧光染料。在一些实施方式中，荧光染料为DyLight 488、DyLight 550或DyLight650，或其任意组合。

术语“条形码”和“条形编码”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指使用具有已知序列的短核酸来标记细胞或细胞组分(例如基因组DNA、RNA、mRNA、miRNA、siRNA、蛋白质、肽、多肽)并通过测序来鉴定细胞或细胞组分。在一些实施方式中，核酸是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA)。核酸包括独特的条形码序列以及一个或多个在不同核酸条形码中相同的恒定衔接子序列。通常，一个或多个恒定衔接子序列位于核酸链的相对端(即5’和3’末端)，并且位于独特条形码序列的侧翼。所述一个或多个恒定衔接子序列用作引物重组区域，以便相同引物可用于整个不同条形码组。使用引物对条形码进行扩增将导致独特条形码序列的扩增，这是使用当前方法检测独特条形码序列所必需的。可以通过某种方式(例如通过抗体)对核酸条形码进行修饰或缀合，以能够结合细胞的不同组分。对于细胞条形码应用，可以基于每个细胞中独特条形码的扩增序列，将一个细胞与细胞群或细胞混合物中的另一个细胞区分开来。如本文所用，阳离子聚合物用于将核酸条形码递送到细胞群内的细胞中。当细胞具有这些条形码时，通过单细胞测序技术(例如单细胞RNA测序(scRNA-seq))对细胞群进行分析可以识别单个细胞及其成分转录组学特征。在一些实施方式中，细胞群由两个或更多个细胞亚群组成。尽管两个或更多个亚群在样品中混合在一起，但是通过向两个或更多个细胞亚群中的每一个递送不同且独特的条形码，对条形码进行测序可以将细胞识别为属于两个或更多个细胞亚群之一。

在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码在溶液中组合，以形成阳离子条形码。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以w/w比组合，其中所述w/w比为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80的阳离子聚合物与核酸条形码的w/w比或由上述w/w比中的任何两个定义的范围内的任何w/w比，例如1至80、10至60、20至50、1至60或10至80w/w比。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以2w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以5w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以10w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以20w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以40w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码以60w/w的比例组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码在水溶液中组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码在生长培养基中组合。在一些实施方式中，阳离子聚合物和核酸条形码在mTeSR介质中组合。

本文描述了对细胞进行标记或条形编码的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使细胞与阳离子条形码进行接触。在一些实施方式中，阳离子条形码包括阳离子聚合物和核酸条形码。在一些实施方式中，阳离子聚合物允许核酸条形码进入细胞的细胞质。在一些实施方式中，核酸条形码是本文和别处所描述的核酸条形码。在一些实施方式中，核酸是DNA或RNA，或两者。在一些实施方式中，核酸是ssDNA。在一些实施方式中，核酸的长度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个核苷酸的长度，或由上述长度中的任意两个定义的范围内的任何长度，例如10至5000个核苷酸、100至1000个核苷酸、200至500个核苷酸、10至500个核苷酸或400至5000个核苷酸的长度。在一些实施方式中，核酸具有如SEQ ID NO:2-4所示的序列。在一些实施方式中，阳离子聚合物是通过本文所述的任何一种方法所制备的阳离子聚合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物是通过本文所述的任何一种方法所制备的封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，所述细胞位于细胞群内。在一些实施方式中，细胞是组织、类器官(organoid)或球状体(spheroid)的一部分，或它们的任何组合。在一些实施方式中，细胞是肝脏类器或前肠球状体的一部分。在一些实施方式中，细胞是肝脏类器的一部分。在一些实施方式中，使细胞和阳离子条形码接触达为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时的小时数，或由上述小时数中的任何两个小时数限定的范围内的任何小时数，例如1至48小时、10至30小时、20至25小时、1至24小时或24至48小时。在一些实施方式中，所述方法包括对阳离子条形码进行测序。在一些实施方式中，所述方法包括通过单细胞测序对阳离子条形码进行测序。在一些实施方式中，所述方法包括通过scRNA-seq对阳离子条形码进行测序。

本文公开了对细胞群进行多重条形编码的方法。如本文和别处所讨论的，使用条形码对测序技术进行多重复用(例如，在每次测序运行中运行多个样本)以提高数据采集的吞吐量是有利的。在一些实施方式中，所述方法包括将细胞群与一个或多个阳离子条形码进行接触。在一些实施方式中，一个或多个阳离子条形码各自包含阳离子聚合物和独特序列的核酸条形码。在一些实施方式中，阳离子聚合物是本文所述的任何阳离子聚合物，或通过本文所述的任何一种方法所合成的阳离子聚合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物是本文所述的任何封端的阳离子聚合物，或通过本文所述的任何一种方法所合成的封端的阳离子聚合物。在一些实施方式中，阳离子聚合物是本文所述的载体POLY1、POLY2、POLY3、POLY4、POLY5、POLY6、POLY7或POLY8中的一种或多种(例如，至少为1、2、3、4、5、6、7、8)，或其任意组合。在一些实施方式中，核酸条形码是DNA或RNA链。在一些实施方式中，核酸条形码是单链DNA(ssDNA)。在一些实施方式中，核酸条形码是ssDNA条形码。在一些实施方式中，核酸条形码是本领域已知的条形编码阵列的一部分。在一些实施方式中，核酸条形码是基于CITE-seq哈希低聚物阵列的。在一些实施方式中，核酸条形码具有如SEQ ID NO:2-4所示的序列。在一些实施方式中，核酸条形码是化学合成的。在一些实施方式中，核酸条形码包含如本文所述的一种或多种核酸修饰。在一些实施方式中，在使细胞群与一种或多种阳离子条形码接触后，该方法包括对该一种或多种阳离子条形码的核酸条形码进行测序。在一些实施方式中，核酸条形码的测序是通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)进行的。在一些实施方式中，核酸条形码的测序将单独细胞辨识为属于细胞群。在一些实施方式中，通过单独细胞的核酸条形码序列将所述单独细胞鉴定为属于细胞群。在一些实施方式中，核酸条形码的测序包括扩增所述核酸条形码。在核酸条形码是ssDNA条形码的一些实施方式中，对核酸条形码进行测序包括扩增ssDNA条形码。

在一些实施方式中，将加帽阳离子聚合物和核酸条形码以为、为约、至少、至少约、不大于、或不大于约1/1μg/μg、2/1μg/μg、3/1μg/μg、4/1μg/μg、5/1μg/μg、6/1μg/μg、7/1μg/μg、8/1μg/μg、9/1μg/μg、10/1μg/μg、11/1μg/μg、12/1μg/μg、13/1μg/μg、14/1μg/μg、15/1μg/μg、16/1μg/μg、17/1μg/μg、18/1μg/μg、19/1μg/μg、20/1μg/μg、21/1μg/μg、22/1μg/μg、23/1μg/μg、24/1μg/μg、25/1μg/μg、26/1μg/μg、27/1μg/μg、28/1μg/μg、29/1μg/μg或30/1μg/μg的w/w加帽阳离子聚合物:核酸条形码比率，或在由上述比率中的任何两个比率限定的范围内的任何比率，例如1/1μg/μg至30/1μg/μg、10/1μg/μg至25/1μg/μg、15/1μg/μg至20/1μg/μg、1/1μg/μg至20/1μg/μg、或15/1μg/μg至30/1μg/μg的w/w加帽阳离子聚合物:核酸条形码比率组合。在一些实施方式中，对于细胞群，使用1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、29μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42μg、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、或50μg的加帽阳离子聚合物，或由上述质量中的任何两个质量限定的范围内的任何质量，例如1μg至50μg,10μg至40μg,20μg至30μg,1μg至30μg、或20μg至50μg。在一些实施方式中，加帽阳离子聚合物和核酸条形码在生长培养基中组合。在一些实施方式中，生长培养基是HCM。在一些实施方式中，允许加帽阳离子聚合物和核酸条形码在为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟，或由上述时间中的任何两个时间限定的范围内的任何时间，例如1分钟至30分钟、10分钟至25分钟、15分钟至20分钟、1分钟至20分钟、或10分钟至30分钟的时间量内复合。在一些实施方式中，使复合的加帽阳离子聚合物和核酸条形码与细胞群接触。在一些实施方式中，细胞群是肝脏类器官。在一些实施方式中，使复合的加帽阳离子聚合物和核酸条形码与细胞群接触达为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约10小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、或120小时，或由上述时间中的任何两个时间限定的范围内的任何时间，例如10小时至120小时、30小时至100小时、20小时至50小时、10小时至30小时、或50小时至120小时的时间量。在一些实施方式中，复合的加帽阳离子聚合物和核酸的细胞缔合发生在接触后为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时，或由上述时间中的任何两个时间限定的范围内的任何时间，例如1小时至12小时、2小时至10小时、2小时至4小时、或1小时至5小时的时间量之前。在一些实施方式中，复合的加帽阳离子聚合物和核酸与细胞溶酶体共定位。在一些实施方式中，将细胞群解离成单细胞悬液。在一些实施方式中，通过单细胞测序对单细胞悬液进行测序。在一些实施方式中，通过scRNA-seq对单细胞悬液测序。

在一些实施方式中，用如本文所述的加帽阳离子聚合物对细胞群进行条形码编码导致标记是对细胞的为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或由上述百分比中的任何两个百分比限定的范围内的任何百分比，例如50％至100％、80％至95％、85％至94％、50％至90％、或80％至100％的条形码编码。在一些实施方式中，测序为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或为在由上述百分比中的任何两个百分比限定的范围内的任何百分比，例如，50％至100％、80％至95％、85％至94％、50％至90％、或80％至100％准确的。

在一些实施方式中，细胞群是从多于一个个体制备、获得或来源的。在一些实施方式中，该细胞群是“汇集群”。在一些实施方式中，细胞群是从为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的个体，或为由上述数量中的任何两个数量限定的范围内的任何数量的个体，例如1个至1000个体、10个至500个个体、50个至100个个体、1个至200个体、或50个至1000个个体制备、获得或来源的。在一些实施方式中，细胞群来源于来自多于一个个体的iPSC。在一些实施方式中，通过将来源于多于一个个体的iPSC用同步条件同步以获得同步的iPSC，来自iPSC获得细胞群。在一些实施方式中，iPSC在同步之后分化。在一些实施方式中，iPSC在同步后分化为终末内胚层、前肠球状体、类器官、或肝脏类器官，或它们的任何组合。在一些实施方式中，细胞群是组织、类器官或球状体或它们的任何组合的一部分。在一些实施方式中，细胞群是组织、类器官或球状体，或它们的任何组合。在一些实施方式中，细胞群是类器官或前肠球状体或两者的一部分。在一些实施方式中，细胞群是类器官或前肠球状体，或两者。在一些实施方式中，细胞群是肝脏类器官的一部分，或者是肝脏类器官。

在一些实施方式中，来自多于一个个体的细胞群是类器官(“汇集的类器官”)。在一些实施方式中，汇集的类器官是从为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的个体，或是由上述数量中的任何两个数量限定的范围内的任何数量的个体，例如1个至1000个体、10个至500个个体、50个至100个个体、1个至200个体、或50个至1000个个体制备、获得或来源的。在一些实施方式中，来自多于一个个体的细胞群是来源于来自多于一个个体的iPSC的类器官。在一些实施方式中，类器官是通过以下方式而来源于iPSC的：用同步条件将来自多于一个个体的iPSC进行同步以获得经同步的类器官。在一些实施方式中，类器官是肝脏类器、胃类器官、肠类器官、脑类器官、肺类器官、食道类器官、骨类器官、软骨类器官、膀胱类器官、血管类器官、内分泌类器官、或感觉类器官，或它们的任何组合。在PCT公开WO 2018/191673中探索了汇集的类器官及其制造和使用方法，该专利的全部内容以引用方式并入本文。

在一些实施方式中，细胞群包含两个或更多个细胞亚群。在一些实施方式中，两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群都来自独特的个体。在一些实施方式中，细胞群是通过组合两个或更多个细胞亚群而形成的。在一些实施方式中，两个或更多个亚群包括为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的亚群，或为由上述数量中的任何两个数量限定的范围内的任何数量的亚群，例如1个至1000个亚群、10个至500个亚群、50个至100个亚群、1个至200个亚群、或50个至1000个亚群。在一些实施方式中，两个或更多个亚群来自为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的个体，或为由上述数量中的任何两个数量限定的范围内的任何数量的个体，例如1个至1000个体、10个至500个个体、50个至100个个体、1个至200个体、或50个至1000个个体。在一些实施方式中，使细胞群与一种或多种阳离子条形码接触包括使细胞群与两种或更多种阳离子条形码接触。在一些实施方式中，使细胞群与一个或多个阳离子条形码接触包括使细胞群与同亚群数量相同数量的阳离子条形码接触。在一些实施方式中，使细胞群与至少比亚群数量多一个的数量的阳离子条形码接触。在一些实施方式中，使细胞群与为、为约、至少、至少约、不大于、或不大于约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的阳离子条形码，或在由上述数量的阳离子条形码中的任何两个数量的阳离子条形码限定的范围内的数量的阳离子条形码，例如2个至1000个阳离子条形码、10个至500个阳离子条形码、50个至100个阳离子条形码、1个至200个阳离子条形码、或50个至1000个阳离子条形码接触。在一些实施方式中，使细胞群与比亚群数量多为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个的数量的阳离子条形码，或以比亚群数量多任何数量的阳离子条形码，例如比细胞群中的亚群多1个至20个、5个至15个、10个至12个、1个至10个、或10个至20个的阳离子条形码接触。

在一些实施方式中，细胞群是通过组合两个或更多个(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、50个、100个、500个、1000个)细胞亚群而形成的。在一些实施方式中，当两个或更多个细胞亚群在单个细胞悬浮液中时，通过组合该两个或更多个细胞亚群来形成细胞群。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是单细胞悬液。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是iPSC。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是前肠球状体。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是解离的前肠球状体。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是肝脏类器官。在一些实施方式中，进行组合的两个或更多个细胞亚群是解离的肝脏类器官。在一些实施方式中，两个或更多个细胞亚群是彼此同步的细胞。在一些实施方式中，使两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群与一个或多个(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个)阳离子条形码接触。在一些实施方式中，一个或多个阳离子条形码中的每一个阳离子条形码在与相同细胞亚群接触的阳离子条形码中以及在与不同亚群接触的阳离子条形码中都是独特的。在一些实施方式中，使两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群在经组合以形成细胞群之前与一个或多个阳离子条形码接触。在一些实施方式中，使两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群在经组合以形成细胞群之前进行接触导致每个细胞亚群具有一组不同的一个或多个具有独特序列的阳离子条形码。在一些实施方式中，在两个或更多个细胞亚群已经与一个或多个独特阳离子条形码接触后，将该两个或更多个细胞亚群组合以形成细胞群。在一些实施方式中，对细胞群的两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群的一个或多个独特阳离子条形码进行测序。在一些实施方式中，对两个或更多个细胞亚群中的每一个细胞亚群的一个或多个独特阳离子条形码进行测序将单独细胞辨识为属于细胞群中的两个或更多个细胞亚群中的一个细胞亚群。在一些实施方式中，通过单独细胞的核酸条形码的序列将所述单独细胞鉴定为属于两个或更多个细胞亚群中的一个细胞亚群。

在一些实施方式中，包括两个或更多个(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、50个、100个、500个、1000个)细胞亚群的细胞群是类器官。在一些实施方式中，类器官是肝脏类器官。在一些实施方式中，包括两个或更多个(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、50个、100个、500个、1000个)细胞亚群的细胞群是肝脏类器官。在一些实施方式中，类器官由来自为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个数量的个体，或为由上述数量中的任何两个数量限定的范围内的任何数量的个体，例如1个至1000个体、10个至500个个体、50个至100个个体、1个至200个体、或50个至1000个个体的细胞形成。在一些实施方式中，类器官由iPSC、终末内胚层或前肠球状体或它们的任何组合形成。在一些实施方式中，类器官由iPSC、终末内胚层、或来自两个或更多个个体的细胞的前肠球状体形成。在一些实施方式中，类器官由两个或更多个细胞亚群形成，其中所述细胞亚群是iPSC、终末内胚层或前肠球状体。在一些实施方式中，细胞亚群是同步的。在一些实施方式中，使细胞亚群中的每个细胞亚群在汇集和形成类器官之前与一个或多个(例如至少1个、2个、3个、4个、5个)阳离子条形码接触。在一些实施方式中，类器官包含两个或更多个包含不同阳离子条形码的亚群。在一些实施方式中，对类器官的阳离子条形码进行测序将类器官的单独细胞辨识为属于两个或更多个细胞亚群中的一个细胞亚群。在一些实施方式中，在类器官是肝脏类器官的情况下，单独细胞被进一步辨识为肝细胞、星状细胞、或胆管细胞，或它们的任何组合。在一些实施方式中，基于HNF4α、ASGR1、CEBPA、RBP4、COL1A2、SPARC、TAGLN、KRT7、TACSTD2或SPPI或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1、2、3、4、5者)的表达来辨识单独细胞。

干细胞

如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为万能干细胞)具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是能够分化成胚胎细胞和胚胎外细胞类型的干细胞。这样的细胞可以构建一个完整的、有活力的有机体。这些细胞由卵和精细胞融合产生。受精卵头几次分裂产生的细胞也是全能的。

如本文所用，术语“胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)”，通常也缩写为ES细胞，具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指为多能的并且来源于胚泡(即早期胚胎)的内细胞团的细胞。为了本公开，术语“ESC”有时被广泛用来涵盖胚胎生殖细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且涵盖可分化成几乎所有身体细胞类型的任何细胞，即来源于三种胚层(生殖上皮)中的任一胚层的细胞，包括内胚层(内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨、血液、泌尿生殖)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或通过诱导非多能细胞，如成体体细胞，通过强迫某些基因表达而获得。多能干细胞可来源于任何合适的来源。多能干细胞来源的实例包括哺乳动物来源，包括人、啮齿动物、猪和牛。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)”，通常也缩写为iPS细胞，具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指通过诱导某些基因的“强迫”表达而人工衍生自通常非多能细胞如成体体细胞的多能干细胞类型。hiPSC是指人iPSC。在一些实施方式中，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞例如成体成纤维细胞中来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒进行病毒转导来实现。经转染的基因可包括主转录调节因子Oct-3/4(POU5F1)和Sox2，但是其它基因也可增强诱导效率。3-4周后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上变得与多能干细胞相似，并且通常通过形态学选择，倍增时间或通过报道基因和抗生素选择来分离。如本文所用，iPSC包括小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC，以及人类诱导的多能干细胞。在一些方法中，逆转录病毒系统用于使用四种关键基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将人成纤维细胞转化为多能干细胞。在其它方法中，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包括但不限于Oct-3/4(POU5F1)；Sox基因家族的某些成员(例如，Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、LIN28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2、或E-钙粘着蛋白，或它们的任何组合。

如本文所用，术语“前体细胞”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且涵盖可用于本文所述方法的任何细胞，通过所述方法，一个或多个前体细胞获得了更新自身或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些实施方式中，前体细胞是多能性的或具有成为多能性的能力。在一些实施方式中，对前体细胞进行外部因子(例如，生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施方式中，前体细胞可为全能(或万能)干细胞；多能干细胞(诱导的或非诱导的)；多潜能性干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施方式中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施方式中，前体细胞可以是经处理的体细胞，以便通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予其多能性。前体细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cell,EC)、和外胚层干细胞(epiblast stem cell,EpiSC)。

在一些实施方式中，一个步骤是获得为多能的或可以诱导成为多能的干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞来源于胚胎干细胞，所述胚胎干细胞继而来源于早期哺乳动物胚胎的全能细胞，并且能够在体外无限制的未分化增殖。胚胎干细胞是来源于早期胚胎的胚泡内细胞团的多能干细胞。从胚细胞获得胚胎干细胞的方法是在所属领域中是众所周知的。人类胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施例中，但是所属领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。

可用于根据本公开的实施方式中的附加干细胞包括不限于由旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国家干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novocell公司(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；胚胎干细胞国际公司(新加坡)；以色列理工学院以色列理工学院(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可用于根据本公开的实施方式中的示例性胚胎干细胞包括不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UC0l(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。示例性人多能细胞系包括但不限于TkDA3-4、1231A3、317-D6、317-A4、CDH1、5-T-3、3-34-1、NAFLD27、NAFLD77、NAFLD150、WD90、WD91、WD92、L20012、C213、1383D6、FF、ESH1、72.3、或317-12细胞。

在发育生物学中，细胞分化为较不特化的细胞变成较特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过所述过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶向细胞类型。特化靶向细胞类型的特殊性可通过可用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包括但不限于基因操纵、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。

在一些实施方式中，腺病毒可用于运输必需的四种基因，从而产生与胚胎干细胞基本上相同的iPSC。由于腺病毒不将其自身的任何基因与靶宿主结合，消除了产生肿瘤的危险。在一些实施方式中，采用基于非病毒的技术来生成iPSC。在一些实施方式中，重编程可以在根本没有任何病毒转染系统的情况下通过质粒来完成，尽管效率非常低。在其它实施方式中，蛋白质的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施方式中，使用类似的方法生成小鼠iPSC是可能的：用通过聚精氨酸锚导入细胞的某些蛋白来重复处理细胞足以诱导多能性。在一些实施方式中，多能性诱导基因的表达也可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加。

如本文所用的术语“饲养细胞”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指支持多能干细胞生长的细胞，例如通过将生长因子分泌到培养基中或展示在细胞表面上来支持多能干细胞生长的细胞。饲养细胞通常是贴壁细胞并且可能生长停滞。例如，饲养细胞因辐照(例如伽马射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲或温和的化学固定(例如用甲醛或戊二醛)而生长停滞。然而，饲养细胞不一定必须生长停滞。饲养细胞可用于诸如分泌生长因子、在细胞表面展示生长因子、使培养基解毒或合成细胞外基质蛋白等目的。在一些实施方式中，饲养细胞与所支持的靶干细胞是同种异体的或异种异体的，这可能对下游应用有影响。在一些实施方式中，饲养细胞是小鼠细胞。在一些实施方式中，饲养细胞是人类细胞。在一些实施方式中，饲养细胞是小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠STO细胞、小鼠3T3细胞、小鼠SNL 76/7细胞、人成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人真皮成纤维细胞、人脂肪间充质细胞、人骨髓间充质细胞细胞、人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞、人脐带间充质细胞、人胎儿肌细胞、人胎儿成纤维细胞、或人成体输卵管上皮细胞。在一些实施方式中，使用由饲养细胞制备的条件培养基代替饲养细胞共培养物或与饲养细胞共培养物组合。在一些实施方式中，在靶干细胞增殖期间不使用饲养细胞。

肝脏是一种重要的器官，其为生命提供许多重要的代谢功能，如外源性化合物的解毒和凝血，以及产生脂质、蛋白质、铵和胆汁。原代肝细胞是高度极化的代谢细胞类型，并形成具有微绒毛衬里通道的胆小管结构，从而将外周循环与胆汁酸分泌途径分开。体外重建患者的肝脏可以提供应用，包含再生疗法、药物发现和药物毒性研究。使用原代肝细胞的现有方法表现出极差的功能，主要是由于缺乏必要的解剖结构，这限制了它们在制药工业中的实际应用。包括具有内化微绒毛和间充质细胞的管腔结构并且表现出肝细胞类型(例如肝细胞、星状细胞、枯氏细胞和肝内皮细胞)的肝脏类器官的形成，及其制造和使用方法先前已经在PCT公布WO2018/085615、WO2018/085622、WO2018/085623及WO2018/226267中描述，这些专利中的每一个专利的全部内容都特此明确并入。

在一些实施方式中，ESC、生殖细胞或iPSC在支持干细胞生长的生长培养基中培养。在一些实施方式中，ESC、生殖细胞或iPSC在干细胞生长培养基中培养。在一些实施方式中，干细胞生长培养基是RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12、高级DMEM、肝细胞培养基(hepatocyteculture medium,HCM)、StemFit、mTeSR 1、或mTeSR Plus培养基。在一些实施方式中，干细胞生长培养基包含胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)。在一些实施方式中，干细胞生长培养基包含浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％，或为由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何百分比，例如0％至20％、0.2％至10％、2％至5％、0％至5％、或2％至20％的FBS。在一些实施方式中，干细胞生长培养基不包含异种异体组分。在一些实施方式中，生长培养基包含一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。在一些实施方式中，干细胞在饲养细胞底物上生长。在一些实施方式中，干细胞不在饲养细胞底物上生长。在一些实施方式中，干细胞在包被有层粘连蛋白的平板上生长。在一些实施方式中，干细胞在补充有FGF2或ROCK抑制剂(例如Y-27632)或两者的情况下生长。

在一些实施方式中，PSC在无饲养细胞的条件下培养。在一些实施方式中，PSC在mTeSR培养基中培养。在一些实施方式中，PSC在达到融汇时传代，该融汇为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约60％、70％、80％、90％、或100％。在一些实施方式中，PSC与ROCK抑制剂和层粘连蛋白-511一起培养。

由多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生终末内胚层(DE)的任何方法均适用于本文所述的方法。例示性方法公开于例如美国专利号9,719,068中。在一些实施方式中，iPSC用于产生终末内胚层。

在一些实施方式中，在从多能干细胞到DE细胞的分化过程中使用一种或多种生长因子。在一些实施方式中，用于分化过程的一种或多种生长因子包括来自TGF-β超家族的生长因子。在一些实施方式中，所述一种或多种生长因子包含TGF-β超家族的Nodal/活化素和/或BMP亚组。在一些实施方式中，所述一种或多种生长因子选自由以下项组成的组：Nodal、活化素A、活化素B、BMP4、或它们的任何组合。在一些实施方式中，使PSC与一种或多种生长因子接触达为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、140小时、150小时、160小时、170小时、180小时、190小时、200小时、210小时、220小时、230小时、或240小时的天数，或由上述任何天数中的任何两个天数限定的范围内的任何小时数，例如1小时至240小时、20小时至120小时、30小时至50小时、1小时至100小时、或50小时至240小时。在一些实施方式中，使PSC与浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、或1000ng/mL，或为由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度，例如10ng/mL至1000ng/mL、50ng/mL至800ng/mL、100ng/mL至500ng/mL、10ng/mL至200ng/mL、或100ng/mL至1000ng/mL的一种或多种生长因子接触。在一些实施方式中，一种或多种生长因子的浓度在整个接触时段中维持在恒定水平。在一些实施方式中，一种或多种生长因子的浓度在接触时段期间变化。在一些实施方式中，将一种或多种生长因子溶解到生长培养基中。在一些实施方式中，使用富集终末内胚层细胞的细胞群。在一些实施方式中，分离或基本上纯化终末内胚层细胞。在一些实施方式中，分离的或基本上纯化的终末内胚层细胞将SOX17、FOXA2或CXRC4标志物中的一者或多者(例如，至少1者、3者)表达至比OCT4、AFP、TM、SPARC或SOX7标志物中的一者或多者(例如至少1者、3者、5者)更大的程度。

在一些实施方式中，使终末内胚层细胞与本文所述的信号传导途径的一种或多种调节剂接触。在一些实施方式中，将终末内胚层细胞用信号传导途径的一种或多种调节剂处理达为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时，或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、或20天，或在由上述天数或小时数中的任何两个天数或小时数限定的范围内的任何小时数或天数，例如1小时至20天、20小时至10天、1小时至48小时、1天至20天、1小时至5天、或24小时至20天的天数。在一些实施方式中，信号传导途径的一种或多种调节剂的浓度在接触时段期间维持在恒定水平。在一些实施方式中，信号传导途径的一种或多种调节剂的浓度在接触时段期间是变化的。

在一些实施方式中，为了将终末内胚层分化为前肠球状体，使终末内胚层细胞与FGF途径和Wnt途径的一种或多种调节剂接触。在一些实施方式中，与Wnt和/或FGF信号传导途径相关的细胞成分，例如，所述途径的天然抑制剂、拮抗剂、激活剂或激动剂可用于导致Wnt和/或FGF信号传导途径的抑制或激活。在一些实施方式中，靶向与Wnt和/或FGF信号传导途径相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA用于抑制或激活这些途径。

成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。FGF是肝素结合蛋白，与细胞表面相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用已显示是FGF信号转导所必需的。FGF是多种细胞和组织增殖和分化过程中的关键参与者。在人类中，已鉴定出FGF家族的22个成员，所有这些成员都是结构相关的信号传导分子。成员FGF1至FGF10都与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)结合。FGF1又称酸性成纤维细胞生长因子，并且FGF2又称为碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)。成员FGF11、FGF12、FGF13和FGF14，也称为FGF同源因子1至4(FHF1至FHF4)，与FGF相比已显示为具有明显的功能差异。尽管这些因子具有非常相似的序列同源性，但是它们不与FGFR结合并且参与与FGF无关的细胞内过程。该组也称为“iFGF”。成员FGF15至FGF23是较新的并且不那么好地被表征。FGF15是人类FGF19的小鼠直系同源物(因此没有人类FGF15)。人类FGF20是基于其与非洲爪蟾FGF-20(XFGF-20)的同源性鉴定的。与其它FGF的局部活性相反，FGF15/FGF19、FGF21和FGF23具有更多的全身效应。在一些实施方式中，所用的FGF是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23中的一者或多者(例如至少1者、3者、5者)。在一些实施方式中，所用的FGF是FGF4。在一些实施方式中，使终末内胚层与浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1100ng/ml、1200ng/ml、1300ng/ml、1400ng/ml、1500ng/ml、1600ng/ml、1700ng/ml、1800ng/ml、1900ng/ml、或2000ng/mL，或由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度，例如10ng/mL至2000ng/mL、50ng/mL至1500ng/mL、500ng/mL至100ng/mL、10ng/mL至1000ng/mL、或500ng/mL至2000ng/mL的FGF接触。

在一些实施方式中，为了将终末内胚层分化为前肠球状体，使终末内胚层与Wnt蛋白或活化剂接触。在一些实施方式中，使终末内胚层与糖原合酶激酶3(glycogen synthasekinase 3,GSK3)抑制剂接触。GSK3抑制剂作用以激活Wnt途径。在一些实施方式中，使终末内胚层与GSK3抑制剂Chiron(CHIR99021)接触。在一些实施方式中，使终末内胚层与浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、或10μM的CHIR99021，或由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度的CHIR99021，例如0.1μM至10μM、0.4μM至6μM、1μM至5μM、0.1μM至1μM、或0.5μM至10μM的CHIR99021接触。

在一些实施方式中，前肠球状体分化为肝脏类器官。在一些实施方式中，通过使前肠球状体与视黄酸(retinoic acid,RA)接触，将前肠球状体分化为肝脏类器官。在一些实施方式中，使前肠球状体与浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、或10μM的RA，或由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度的RA，例如0.1μM至10μM、0.4μM至0.6μM、1μM至5μM、0.1μM至1μM、或5μM至10μM的RA接触。

在一些实施方式中，根据PCT公开WO 2018/085615、WO 2018/191673、WO 2018/226267、WO 2019/126626、WO 2020/023245、WO 2020/056158、和WO 2020/069285中所述的方法制备诱导多能干细胞、终末内胚层、前肠球状体或肝脏类器官或它们的任何组合中的一者或多者，出于产生诱导多能干细胞、终末内胚层、前肠球状体，或肝脏类器官，或它们的任何组合的目的，这些专利中每一个专利的全部内容特此以引用方式明确并入。

实施例

在以下实施例中更详细地公开了上述实施方式的一些方面，这些实施例绝不旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其它实施方式也落入本公开的范围内，如同其在本文上文和权利要求书中描述一样。

实施例1. POLY-seq聚合物的合成与表征

使用市售试剂创建一组聚合物，以研究以遍在方式用单链DNA(single-strandedDNA,ssDNA)条形码标记细胞以允许针对单细胞NGS技术实现快速、成本有效的多路复用的能力。

POLY-seq载体的合成和应用方案详述于图1A中。将与氨基醇混合的丙烯酸酯单体加热以形成未加帽的丙烯酸酯封端载体。将载体通过添加含有伯胺或仲胺的小分子进行加帽，从而赋予POLY-seq载体结合ssDNA条形码并以独立于细胞类型的方式(经标记的细胞)粘附至细胞的能力。然后可以使用标准单细胞技术处理经标记的细胞。所有相应的试剂都是可商购的(图1B)。¹H NMR证实在丙烯酸酯封端产物的产生之后存在丙烯酸酯端基；这些基团的共振峰在δ6.2-5.6处观察到，并在与加帽试剂成功结合后消失(图1C)。使用ESH1、72.3和1383D6iPSC评定对细胞活力的影响。发现包含带有加帽基团C2和C3(分别为POLY2和POLY3)的支链V5单体的聚合物的CTG发光显著降低的发生在50μg/mL处开始，p<0.001，n＝3(图1D)。概括了在ESH1和1383D6 iPSC中的结果(图1E)。为了测试加帽载体结合和保留ssDNA条形码的能力，首先将载体和条形码混合并使它们在25mM HEPES pH 7.4中结合10分钟。在结合后，将载体加载到2.5％琼脂糖凝胶中并在150V下运行。发现结合细胞散列实验中使用的单链DNA条形码的能力取决于加帽试剂和骨架结构(图1F)。发现用分子C2和C3加帽的载体在凝胶电泳期间中比用C1或C4加帽的载体更容易保留ssDNA条形码。此外，包含支化丙烯酸酯V5显著降低了观察到完全条形码保留时的质量比(w/w)(POLY2对比POLY6、POLY3对比POLY7)。

实施例2.POLY-seq载体特异性靶向细胞

虽然快速结合和保留ssDNA条形码的能力是重要特征，但是载体还必须具有靶向细胞的能力。为此，选择载体POLY1至POLY4来对细胞靶向进行定量。最初使用经标记的前肠和后肠球状体的FACS分析来测试POLY-seq载体的靶向倾向。图2A中示出了第4天分离的单细胞的门控分析。观察到总标记和双重标记程度的差异程度取决于载体配方(图2B)。在第14天观察到总靶向百分比显著降低，而在共培养的前7天内没有发现显著差异，表明标记保真度的长寿。载体POLY3提供最大程度的双重标记，并且在第一时间点开始显著高于POLY1、POLY2和POLY4(p<0.01，n＝3)(图2B)。通过共聚焦成像概括标记保真度。用POLY2标记后融合的球状体显示具有可见边界的不同标记(图2F)。使用来自混合培养物的分离单细胞的FACS分析进一步检查载体POLY2在结合人类肝脏类器官中的效用(图2C)。载体POLY2是基于条形码结合和细胞靶向方面的性能选择的。载体POLY2对从HLO培养物中分离出的细胞的总标记百分比为98.2±0.8％(图2D)。通过FACS分析发现这种混合培养物中的双标记细胞是可忽略的。为了研究与细胞结合的POLY-seq载体的空间分布，将DyLight 488缀合的载体与HLO培养物一起孵育。共聚焦分析揭示了POLY2及POLY3与溶酶体的强共定位，而POLY4在三个室中具有相对较低的内化，反映了流式细胞术发现的较弱标记(图2E)。这些结果表明每个载体结合条形码和与细胞相互作用的能力之间存在相关性。

实施例3.POLY-seq载体递送可扩增的条形码

为了测试POLY-seq载体递送条形码(其可以通过标准10x铬工作流程扩增并由常见的下一代测序仪读取)的能力，使用载体POLY2将三个HLO样本单独用三个不同的条形码标记一小时，然后在10x铬平台上运行。对包含所有经测序的条形码的条形码HLO的单细胞分析显示，三个群体的标记程度很高，总标记程度接近90％，反映了在初始FACS分析期间观察到的靶向百分比(图3A至图3B)。所有三个条形码的测序准确度为94％。重要的是，通过使用高聚类灵敏度的UMAP分析验证了多个聚类之间标记的均匀性，从而表明标记是无偏倚的。样本E2的所有细胞被分为13个簇，并与仅包含正确条形码读段的细胞并列(图3C)。对样本E3和E4的分析也类似地执行(图3C)。确认了所有三个样本跨簇的条形码编码均匀性，发现样本E2、E3和E4的每个簇的平均标记分别为89±3.4％、86±4.8％和81±5.9％(图3D)。与流式分析相比，通过单细胞测序得到的标记百分比的降低归因于单细胞制备期间使用的标记时间减少(1小时对比24小时)，并且提供了直接评定POLY2标记对通过DESeq2测量的基因表达的潜在影响的机会。使用单线态和阴性标记的细胞检查通过标记测量的转录的扰动；使用以下一系列基因对两个群体进行比较：管家(ACTB、GAPDH、PGK1)、与自噬和凋亡相关的细胞健康(CASP3、CASP9、MAPK8、TP53)、细胞周期蛋白(CCND1、CCNE1、CCNB1、CCNA2)、线粒体(MT-ATP8、MT-ND1、MT-CYB、MT-CO1)和人类肝脏类器官(ALB、RBP4、CDH1、ASGR1)。发现标记不会改变这些群体中的转录组表达(图3E，表1)。

表1：用于通过DESeq2比较经条形码编码的单线态样本对比阴性样本的所列基因的经调整的p值。通过DE处理未检测到CCNA2表达(不可检测的)

实施例4.POLY-seq条形码编码鉴定了HLO中的多个群体谱系

由于已经在HLO培养体系中证明了多细胞性，因此通过HLO谱系鉴定进一步证明了异质条形码编码潜力。由肝细胞核因子4α(HNF4α)、去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)、CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPA)和视黄醇结合蛋白4(RBP4)鉴定出的肝细胞；由1型胶原蛋白α2(COL1A2)、酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)和转凝蛋白(TAGLN)鉴定出的星状细胞；由角蛋白7(KRT7)、上皮糖蛋白-1(TACSTD2)和分泌型磷蛋白1(SPP1)鉴定出的胆管细胞在经条形码编码的群体中具有显著的代表性程度(图4A)。检查了条形码表示，发现它们在这些群体内均匀表达(图4B)。最后，POLY-seq通过广泛表达的独特基因成功对细胞进行条形码编码的能力，将单标记细胞分为高UMI级分和低UMI级分，截止值为1350，类似于以前的分析(图4C)。Seurat聚类清楚地鉴定了两个部分之间的群体。高UMI级分和低UMI级分由POLY-seq条形码高度表示，其中群体的分别平均83±4.7％和88±4.6％被鉴定为单标记细胞，反映了以前使用基于脂质的方法的条形码编码性能。

实施例5.POLY-seq技术的观察

如本文所公开，将阳离子聚合物制备为能够结合核酸以供递送的载体。聚合物是使用市售的丙烯酸酯封端的单体和链烷醇胺，通过迈克尔加成合成的。载体POLY2和POLY3显示为在24小时的时段内从50μg/mL的浓度开始CTG发光显著降低(p<0.001)，而POLY1和POLY4显在所测试的浓度内均未显示出活力的任何明显扰动(图1D、图1E)，从而充当用于了解因长期标记导致的潜在毒性的参考点。为了成功地将核酸递送到细胞中，载体必须具有以下至少两种特性：保留结合的DNA/RNA的能力和结合并保持与细胞结合达某一可观量的时间的能力。使用凝胶电泳检查了针对单细胞应用，POLY-seq载体快速结合和保留核酸(例如CITE-seq散列ssDNA条形码)的能力。那些带有分支丙烯酸酯单体(V5)并用含有高密度伯胺和仲胺的单体(C2、C3)加帽的载体最容易在生理pH下结合和保留ssDNA条形码。分别在w/w＝10和w/w＝5时观察到了载体POLY2和POLY3的完全结合的开始，如DNA迁移逆转所指示。相反，仅使用二丙烯酸酯单体D8和烷醇胺S3创建的载体(POLY5至POLY8)显示为结合活性急剧下降(图1F)。因此ssDNA结合的成功是分支架构和帽类型的组合。由于用分支丙烯酸酯创建的载体(POLY1至POLY4)显示出更大的结合ssDNA的倾向，因此选择这些变体以进一步研究细胞靶向。

使用流式细胞术跟踪模型前/后肠道边界融合系统中的经荧光标记的载体，实现了细胞靶向的定量。载体POLY1至POLY3之间的细胞标记百分比在前7天内没有显著差异，表明了结合保真度。虽然载体POLY3提供了最高程度的总标记，但是它在所有时间点都显示出与其它三个载体并列的显著程度的双重标记。有趣的是，虽然载体POLY4在进行电泳时无法保留ssDNA条形码，但是它显示出与细胞缔合的能力。基于ssDNA结合效率和细胞靶向性能，POLY2被认为是人类肝脏类器官(HLO)培养物的单细胞条形码编码应用的主要候选者。FACS分析显示，几乎所有来自HLO样本的细胞都用POLY2标记，在混合经单独标记的培养物24小时后没有可感知的双重标记。荧光缀合的POLY-seq的共聚焦分析揭示了在与培养系统一起孵育后三小时溶酶体内的配方依赖性共定位。由于溶酶体隔离通常与来自因网格蛋白依赖性、发动蛋白依赖性内吞作用或微胞饮作用运输的早期内体的晚期内体的成熟或融合有关，这表明载体POLY2和POLY3的细胞缔合很容易在该时间点之前发生。尽管内化机制在分子上未知，但是这种选择性缔合提供了研究时间依赖性内体/溶酶体细胞器运输的机会。

除了具有结合条形码和标记细胞的能力外，一些系统对ssDNA条形码的功能性递送最终依赖于通过用于使系统甚至被认为是有用的单细胞制备技术正确捕获和扩增的可读、独特的序列。本文所述的聚合物载体具有有效的条形码结合、细胞标记和保留质量，并递送可读的条形码，所述条形码可以在原位标记一小时后以高度统一的方式在scRNA-seq期间被鉴定出。将没有条形码的细胞(阴性)和单标记细胞(单线态)并置，在每个细胞的独特基因(UMI)或总RNA的数量分布以及一般转录组表达方面没有发现差异。这表明POLY-seq条形码编码不会干扰单细胞文库的制备和分析，也不会扰动转录水平的细胞生理学。此外，经POLY-seq统一标记的异质群体，量化为标记百分比和条形码表达两者。合成载体POLY2的成本估计为3美分/毫克。每个HLO样本使用10μg。POLY-seq系统具有特定的细胞内囊泡隔离、荧光标记能力以及无需共价嘴和即可快速结合和递送ssDNA条形码到细胞中的能力，提供了廉价生成用于多重应用的定制条形码池的机会，从而节省了大量时间和测序成本。

实施例6.材料和方法

合成材料：

以下材料均购自Sigma-Aldrich并无需进一步纯化即可使用：聚(乙二醇)二丙烯酸酯，M_n＝250≥92％；二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯；3-氨基-1-丙醇≥99％；1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪≥99％；精胺≥99％，聚乙烯亚胺，M_n＝600；2,2-二甲基-1,3-丙二胺≥99％；DMSO≥99％；DMSO-d₆99.9％原子％D，含有0.03％(v/v)TMS。

聚合物合成：

POLY-seq载体是使用在此列出的试剂，通过迈克尔加成以两步法合成的。最初将丙烯酸酯封端的单体、烷醇胺单体和加帽剂以200mg/mL溶解在无水DMSO中。将试剂在12×75mm玻璃培养管中按规定比例均质混合，并于90℃反应20小时以形成丙烯酸酯封端产物(POLY-ac)。使用硅油浴将温度保持恒定。在第二步骤中通过加入加帽剂来实现末端丙烯酸酯基团的胺缀合。使末端丙烯酸酯缀合于50℃持续24小时，以生成最终的POLY-seq聚合物载体(表2)。将最终产物的等分试样维持在-20℃以进行长期储存。用于应用测试的聚合物的溶解是通过将浓缩的DMSO原液直接稀释到25mM HEPES缓冲液，pH 7.4中，最终浓度为1mg/mL和10mg/mL来实现的。将所有DyLight试剂都溶解在DMSO中至最终浓度为10mg/mL。DyLight缀合是通过在涡旋下将NHS活化的DyLight荧光分子与10mg/mL POLY-seq载体混合至每1mg聚合物40μg DyLight的最终浓度来实现的。

丙烯酸酯、胺单体和加帽分子的列表：

丙烯酸酯单体：聚(乙二醇)二丙烯酸酯，M_n＝250(“D8”)；二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯(“V5”)。

烷醇胺：3-氨基-1-丙醇(“S3”)

加帽分子：1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪(“C1”)、精胺(“C2”)、M_n＝600的聚乙烯亚胺(“C3”)、2,2-二甲基-1,3-丙二胺(“C4”)。

表2：POLY-seq聚合物(载体)配方

NMR:

在Bruker Ascend 600MHz光谱仪上执行NMR。将5mg丙烯酸酯封端或加帽的载体的等分试样直接溶解在氘化DMSO-d6中以进行样本采集。在Mnova中处理自由感应衰减文件。

细胞培养/毒性：

人类胚胎干细胞克隆H1由WiCell Institute提供。iPSC克隆1383D6由京都大学(Kyoto University)赠送。iPSC克隆72.3由CCHMC Pluripotent Stem Cell Facility提供。根据本领域已知的方案稍加修改或如本文所述地维持干细胞。使用mTeSR(Stem CellTechnologies)于37℃在5％CO₂中将所有干细胞维持在无饲养细胞条件下。细胞在通过细胞消化液(Thermo Fisher)分离达到70％融汇时进行传代，并在补充有10μg/mL的Y-27632(ROCK抑制剂)和5μg/mL的层粘连蛋白-511的6孔Falcon(Corning)平板中接种过夜。补充有Y-27632/层粘连蛋白-511的mTeSR培养基在过夜附着后更换为单独的mTeSR，并且每天更换新鲜的mTeSR培养基。

在白色96孔板(Corning)中执行毒性筛选。使用细胞消化液分离来自传代板的单细胞悬液。将细胞按照维持在20,000个细胞/孔的初始浓度接种到单个孔中补充有Y-27632和层粘连蛋白-511的mTeSR中，并维持在mTeSR中直至达到80-90％融汇。将POLY-seq聚合物在mTeSR中稀释并施加至细胞达24小时。通过基于ATP的CellTiter-Glo(CTG)3D活力测定(Promega)来测定活力。

流式细胞术：

根据本领域已知的方法或如本文所述的方法培养前部和后部肠道培养物。在谱系建立之后，然后将培养物通过DyLight缀合的POLY-seq载体以20μg/mL的浓度标记过夜，前部和后部肠道培养物各自接收到了不同的DyLight颜色(前部为488nm，后部为650nm)。在标记后，将细胞在DMEM/F-12(Thermo Fisher)中洗涤两次以去除未结合的POLY-seq载体。将单细胞悬浮液分离并以每孔20,000个细胞的量接种到超低附着U型底96孔板中的补充有Y-27632和层粘连蛋白-511的mTeSR中。将平板以160x g短暂离心2分钟以沉淀细胞。使球状体形成过夜。在形成后，将用POLY-seq-DyLight 488标记的单个球状体与用POLY-seq-DyLight 650标记的单个球状体一起接种，并使其融合过夜。如前所述维持融合球状体。在融合后1天、4天、7天和14天，使用0.9x细胞消化液+1.0x TrypLE Express的混合物在37℃轻轻吹打来消化球状体。使用流式细胞术对总标记和双重标记的程度进行定量。

HLO培养

根据本领域已知的方法稍加修改或如本文所述，产生人类肝脏类器官(hepaticliver organoid,HLO)。对于内胚层建立，将iPSC接种到6孔板(Corning)中补充有Y-27632和层粘连蛋白-511的mTeSR中。在第二天将培养基更换为单独的mTeSR。在第二天将培养基改用含有100ng/mL活化素A(R&D Systems)和50ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4；R&DSystems)的RPMI-1640(Life Technologies)。这构成了分化的第1天(D1)。在第2天(D2)，将培养基改用RPMI-1640+100ng/mL活化素A+0.2％KnockOut Serum Replacement(KOSR；Thermo Fisher)。在第3天(D3)将培养基改用RPMI-1640+100ng/mL活化素A+2.0％KOSR。在第4天至第6天(D4至D6)，将培养基改用高级DMEM/F12+B27(Life Technologies)+N2(Gibco)+500ng/mL成纤维细胞生长因子4(FGF-4；R&D Systems)和3CHIR99021(R&DSystems)，每天更换。在D7使用细胞消化液分离单细胞悬液。将细胞洗涤并以50,000个细胞/50μL基质胶重悬于生长因子基质胶中。在6孔板(VWR)中接种50μL液滴。在D7至D10，将培养基改用富集培养基(EP)：高级DMEM/F12(Gibco)+2％B-27(Gibco)+1％N2(Gibco)+1％HEPES(1M,Gibco)+1％Pen/Strep(Thermo Fisher)+1％L-谷氨酰胺(Thermo Fisher)+3μMCHIR99021(R&D Systems)+5ng/mL FGF2(R&D Systems)+10ng/mL VEGF(LifeTechnologies)+20ng/mL EGF(R&D Systems)+0.5μM A83-01(Tocris)+50μg/mL抗坏血酸(Sigma)，在D7和D9更换。在D11至D14，将培养基改用高级DMEM/F12+2％B-27+1％N2+1％HEPES(1M)+1％Pen/Strep+1％L-谷氨酰胺+2μM视黄酸(Sigma)，在D11和D13更换。将培养基改用肝细胞培养基(HCM；Lonza)+10ng/mL肝细胞生长因子(HGF；Peprotech)+制瘤素M，并每隔一天更换一次。在D21至D24之间使用HLO。将HLO单独用与DyLight 488、DyLight550或DyLight 650缀合的POLY-seq载体在HCM中标记过夜，洗涤两次，并在流动分析前混合24小时。使用0.9x细胞消化液+1.0x TrypLE Express的混合物于37℃轻轻吹打来消化混合培养物。使用流式细胞术对总标记和双重标记的程度进行定量。

免疫荧光：

在实时成像之前，将HLO与在HCM中稀释的DyLight缀合的POLY-seq载体一起孵育1小时至24小时。使用SiR-肌动蛋白(Cytoskeleton,Inc.)，以250nM的浓度进行F-肌动蛋白染色三小时，或以500nM的浓度进行F-肌动蛋白染色一小时。使用浓度为1μM的四甲基罗丹明甲酯(TMRM；Thermo Fisher)对线粒体染色最少一小时。将溶酶体用LysoTracker BlueDND-22(Thermo Fisher)以1μM的浓度染色至少一小时。

用于10x Genomics测序的细胞标记：

将POLY2与由Integrated DNA Technologies合成的基于CITE-seq细胞散列寡聚体结构的10x相容DNA条形码编码寡聚体(表3)以10μg载体/1μg寡核苷酸的质量比混合。将10μg的POLY2首先在50μL HCM中稀释，并将1μg条形码编码寡核苷酸在单独的50μL等分试样中稀释。条形码编码寡核苷酸在稀释后通过直接移液到POLY2中快速混合，并静置10分钟以形成即用型POLY-seq载体；然后将载体稀释成HLO等分试样，至最终浓度为10μg载体/500μLHCM。将HLO于37℃标记一小时。将HLO洗涤两次以从上清液中去除条形码编码载体，并通过细胞消化液/TrypLE Express(Gibco)的混合物传代成单细胞。将单细胞悬液通过40μM过滤器以清除碎片，并调整至HCM中的最终浓度为1000个细胞/μL，然后装入铬芯片并根据由10xGenomics生产的铬单细胞3’试剂试剂盒v3(Chromium Single Cell 3’Reagent Kits v3)进行处理。使用具有以下序列的3’硫代磷酸酯稳定化的添加剂引物来扩增条形码：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC*T*C-3’(SEQ ID NO:1)。在cDNA扩增后，根据CITE-seq方案从全长mRNA来源的cDNA中分离条形码序列，并使用包含i7索引的标准P5/P7衔接子进行PCR扩增。将准备好的scRNA-seq文库在NovaSeq 6000系统上运行。将分离的条形码文库在NextSeq 550系统上单独运行。使用Cellranger将scRNA-seq读段与hg19人类基因组比对并整合条形码读段。在10x Genomics提供的Loupe中执行统一流形逼近和投影(Uniformmanifold approximation and projection,UMAP)创建、聚类和条形码表达。使用Seuratv3.1预过滤单元对单线态/双联体进行鉴定，以排除那些转录组由>25％线粒体计数组成的细胞，并包括具有介于100-10,000个之间的数量的唯一鉴别基因的细胞。使用DESeq2(Bioconductor v3.11)，使用log₂(1.1)倍数变化预过滤器和每个子样本1000个细胞在Seurat中计算转录组差异表达。

表3：单链DNA寡核苷酸条形码编码序列

在先前描述的实施方式中的至少一些实施方式中，一个实施方式中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一个实施方式中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对本文描述的方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求定义的主题的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，本文中可以明确地阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般而言，本文所使用的术语，尤其是在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果打算引入特定数量的权利要求引述，则在权利要求中将明确引述这样的意图，并且在没有这样的引述的情况下不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可能包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用来介绍权利要求的引用。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一”或“一个”引入权利要求引述将包含此类引入的权利要求引述的任何特定权利要求限制为仅包含一个此类引述的实施方式，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词例如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应解释为“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于用于引述权利要求的定冠词的使用。此外，即使明确记载了引入的权利要求引述的具体编号，本领域技术人员也将认识到，这种引述应被解释为表示至少所引述的编号(例如，没有其它修饰语的“两次引述”的裸述是指至少两次引述”，或两次或更多次引述”)。此外，在那些使用类似于“A、B和C等中的至少一者”的约定的情况下，一般而言，此类构造旨在在本领域技术人员将理解约定的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一这的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B、A和C、B和C，和/或A、B和C等等的系统)。此外，在那些使用类似于“A、B或C等中的至少一者”的约定的情况下，一般而言，此类构造旨在在本领域技术人员将理解约定的意义上(例如，“具有A、B或C中的至少一这的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B、A和C、B和C，和/或A、B和C等等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上任何呈现两个或更多个替代术语的分离词和/或短语，无论是在说明书、权利要求或附图中，都应被理解为考虑包括这些术语之一、不包括任一术语、或包括两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，因此也根据马库什组的任何个体成员或成员子组来描述本公开。

如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并能够将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围都可以很容易地分解分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如本文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1至3个制品的组是指具有1个、2个或3个制品的组。类似地，具有1个至5个制品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个制品等的组。

虽然本文已经公开了各个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方式是为了说明的目的而不是限制性的，真实范围和精神由以下权利要求指示。

本文引用的所有参考文献，包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和参考文献，均以引用方式整体并入本文，并特此成为本说明书的一部分。如果通过引用方式并入的出版物和专利或专利申请与包含在本说明书中的公开内容相矛盾，则该说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。

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Claims

1.一种合成加帽阳离子聚合物的方法，其包括：

(a)使聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体和3-氨基-1-丙醇接触，以通过迈克尔加成形成聚(乙二醇)二丙烯酸酯/3-氨基-1-丙醇阳离子聚合物，其中聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体与3-氨基-1-丙醇的的摩尔比大于1，并且其中所述阳离子聚合物是丙烯酸酯封端的；

(b)使所述阳离子聚合物的末端丙烯酸酯基团与包含胺基团的加帽分子接触，以通过迈克尔加成形成所述加帽阳离子聚合物，其中所述加帽阳离子聚合物不包含任何丙烯酸酯基团。

2.根据权利要求1所述的方法，其中进一步使步骤(a)的所述聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体和3-氨基-1-丙醇与二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯接触，其中二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯的添加导致形成包含多于两个末端丙烯酸酯基团的支化聚(乙二醇)二丙烯酸酯/二(三羟甲基丙烷)四丙烯酸酯/3-氨基-1-丙醇阳离子聚合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述加帽分子包含1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪、精胺、聚乙烯亚胺或2,2-二甲基-1,3-丙二胺中的一者或多者，或它们的任何组合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚(乙二醇)二丙烯酸酯单体与3-氨基-1-丙醇的摩尔比为1.01:1、1.02:1、1.03:1、1.04:1、1.05:1、1.06:1、1.07:1、1.08:1、1.09:1、1.1:1、1.11:1、1.12:1、1.13:1、1.14:1或1.15:1，或约1.01:1、约1.02:1、约1.03:1、约1.04:1、约1.05:1、约1.06:1、约1.07:1、约1.08:1、约1.09:1、约1.1:1、约1.11:1、约1.12:1、约1.13:1、约1.14:1或约1.15:1，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如，1.01:1至1.15:1、1.01:1至1.1:1、1.05:1至1.1:1或1.1:1至1.15:1。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物与所述加帽分子的质量比为100:1、100:2、100:3、100:4、100:5、100:6、100:7、100:8、100:9、100:10、100:15、100:20、100:25、100:30、100:35、100:40、100:45、100:50、100:55、100:60、100:65、100:70、100:75、100:80、100:85、100:90、100:95、100:100、100:150、100:200、100:300、100:400或100:500，或约100:1、约100:2、约100:3、约100:4、约100:5、约100:6、约100:7、约100:8、约100:9、约100:10、约100:15、约100:20、约100:25、约100:30、约100:35、约100:40、约100:45、约100:50、约100:55、约100:60、约100:65、约100:70、约100:75、约100:80、约100:85、约100:90、约100:95、约100:100、约100:150、约100:200、约100:300、约100:400或约100:500，或由上述比率中的任何两个限定的范围内的任何比率，例如，100:1至100:500、100:1至100:25、100:10至100:100，或100:100至100:500。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加帽阳离子聚合物是POLY1、POLY2、POLY3、POLY4、POLY5、POLY6、POLY7或POLY8，或它们的任何组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物和加帽阳离子聚合物根据表2所示的比率和组分合成。

8.一种加帽阳离子聚合物，其通过根据权利要求1-3中任一项所述的方法合成。

9.根据前述权利要求中任一项所述的加帽阳离子聚合物，其还包含荧光染料。

10.根据权利要求9所述的加帽阳离子聚合物，其中所述荧光染料是DyLight 488、DyLight 550或DyLight 650。

11.一种标记细胞的方法，其包括使所述细胞与阳离子条形码接触，其中所述阳离子条形码包含阳离子聚合物和核酸条形码，其中所述阳离子聚合物允许所述核酸条形码进入所述细胞的细胞质。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述核酸是单链DNA(ssDNA)。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述核酸具有长10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个核苷酸的长度，或由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度，例如，长度为10至5000个核苷酸、100至1000个核苷酸、200至500个核苷酸、10至500个核苷酸，或400至5000个核苷酸。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物是根据权利要求1-10中任一项所述的方法的所述加帽阳离子聚合物。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述细胞是组织、类器官或球状体的一部分，或它们的任何组合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是肝脏类器官或前肠球状体的一部分。

18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO:2-4的序列。

19.一种对细胞群进行多路复用条形码化的方法，其包括：

使所述细胞群与一个或多个阳离子条形码接触，其中所述阳离子条形码中的每一个包含阳离子聚合物和独特序列的核酸条形码；以及

通过单细胞RNA-seq对所述一个或多个阳离子条形码的所述核酸条形码进行测序，从而通过单独细胞的所述核酸条形码的序列将所述单独细胞鉴定为属于所述细胞群。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述阳离子聚合物是根据权利要求1-10中任一项所述的方法的所述加帽阳离子聚合物。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述核酸条形码是ssDNA条形码并且对所述核酸条形码进行测序包括扩增所述ssDNA条形码。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述核酸条形码具有SEQ ID NO:2-4的序列。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述细胞群是组织、类器官或球状体的一部分。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞群是肝脏类器官或前肠球状体的一部分。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述细胞群包括两个或更多个细胞亚群，其中每个细胞亚群来自独特个体并且所述细胞群通过合并所述两个或更多个细胞亚群形成。

26.根据权利要求25所述的方法，其中接触所述细胞群包括在通过合并所述两个或更多个细胞亚群形成所述细胞群之前，使所述两个或更多个细胞亚群中的每一个与独特阳离子条形码接触。

27.根据权利要求26所述的方法，其中测序包括对所述两个或更多个细胞亚群中的每一个的所述独特阳离子条形码进行测序，从而通过单独细胞的所述核酸条形码的序列将所述单独细胞鉴定为属于所述两个或更多个细胞亚群中的一个。