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CN114127562B - 一种肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法 - Google Patents

一种肿瘤细胞表面标志分子pd-l1的检测方法 Download PDF

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CN114127562B CN202080043604.8A CN202080043604A CN114127562B CN 114127562 B CN114127562 B CN 114127562B CN 202080043604 A CN202080043604 A CN 202080043604A CN 114127562 B CN114127562 B CN 114127562B
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Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞表面标志分子PD‑L1的检测方法，包括如下步骤：A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；D、依次采用PD‑L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD‑L1二抗溶液、pan‑CK‑AlexaFluor488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。本发明的检测方法与现有方法相比可以提高检测准确性并且操作更为简便。

Description

一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法。
背景技术
程序性死亡受体-1(PD-1)是主要的免疫检查点受体，通过结合其配体程序性死亡配体-1(PD-L1)，使T细胞效应功能的下调，从而有助于维持对肿瘤细胞的耐受性。目前市场上针对PD-1和PD-L1的抑制剂主要有三种，pembrolizumab(商品名：Keytruda)、Nibolumab(商品名：Opdivo)和Atezolizumab(商品名：Tecentriq)，可用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种癌症的治疗。但是，并不是所有患者都能从PD-1/PD-L1抑制剂治疗过程中受益，PD-1/PD-L1抑制剂目前只在少部分的癌症病人身上可以产生持久控制肿瘤的效果。因此，检测病人是否有PD-L1阳性表达，能够有效帮助病人选择合适的药物用于治疗。目前，PD-1/PD-L1的检测方法主要是基于细胞蛋白水平的检测，在临床中，主要采用免疫组化的方法，利用手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色。免疫组化的结果与病理医师的经验密切相关。因此，我们迫切需要一种新的无创的评价方法和标准、较为稳定的PD-L1检测方法。
循环肿瘤细胞是由原发灶脱落，进入血循环后，在远处器官或原发脏器定居，形成转移灶。循环肿瘤细胞CTC检测作为液体活检的热门领域，在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现已逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。因此，若能提供一种检测循环肿瘤细胞等肿瘤细胞表面PD-L1的方法，将具有非常重要的意义。
如中国专利CN201810312287.X公开了一种循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其包括以下步骤：(1)将全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，并用甲醛进行固定；(2)先通过肿瘤免疫荧光标志物细胞角蛋白抗体anti-CK进行阳性筛选，用PD-L1抗体孵育所有细胞，然后用标记有FITC荧光基团的PD-L1二抗孵育，再用细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞；(3)采用高通量多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色，最终实现对循环肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测。这种检测方法采用全血用红细胞裂解液处理，分离出有核细胞，未能直接分离出CTC细胞，背景细胞复杂，难以保证检测的准确性。
又如中国专利CN201610705258.0公开了一种非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PDL1基因的检测方法，其包括以下步骤：(1)对来自于非小细胞肺癌患者的外周血标本进行膜过滤，以获得外周血循环肿瘤细胞；(2)对步骤1获得的滤膜进行固定；(3)对步骤2获得的滤膜进行检测，以确定PDL1表达情况。该检测方法仅仅依靠这三个步骤是无法准确得到具有PDL1表达的CTC，其必须要结合HE染色以及专家阅片才能准确鉴定CTC。一方面，这样的步骤比较繁琐和复杂；另一方面，专家阅片不仅具有很强的主观性，影响判别结果，且具有较强的专业性，推广使用较困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其提高了检测的准确性，同时检测操作简单。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，包括如下步骤：
A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；
B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；
C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；
D、依次采用PD-L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤A中，所述网状基体包括不锈钢体以及覆盖于所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述EpCAM抗体覆设于所述保护层上。
根据本发明的一些优选实施方面，所述EpCAM抗体通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于所述保护层上。
根据本发明的一些优选实施方面，所述网状基体的尺寸为2-10mm×2-10mm，所述筛的孔为20μm-100μm。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤B中，在有核细胞流过所述捕获筛且肿瘤细胞结合至所述捕获筛上后，使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛以去除没有结合至所述捕获筛的杂物或细胞。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤B中，所述有核细胞分离自血液、尿液或腹腔液，上述的体液为血压、尿液或腹腔液。在一具体实施例中，所述有核细胞分离自全血，具体实施如下：通过红细胞裂解液或淋巴细胞分离液处理采集的全血，分离出有核细胞。
被捕获筛捕获的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)或尿肿瘤细胞(Urinary Tumor Cell,UTC)。其中，循环肿瘤细胞是指由实体瘤原发灶或转移灶脱落到血液循环中的肿瘤细胞；尿肿瘤细胞是指进入到尿液中的肿瘤细胞。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤C中，将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入4％多聚甲醛溶液中，室温固定10～60min，使用磷酸盐缓冲液清洗。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤D中的孵育具体实施如下：
按照1:(50～1000)比例加入PD-L1一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20～80min，然后使用磷酸盐缓冲液清洗；
按照1:(50～1000)比例加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液，室温孵育20～80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
按照1:(50～1000)比例加入pan-CK-FITC一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20～80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
按照1:(50～1000)比例加入CD45一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20～80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
按照1:(50～1000)比例加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液，室温孵育20～80min，使用磷酸盐缓冲液清洗。
根据本发明的一些优选实施方面，PD-L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液、CD45一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液中抗体稀释液和抗体原液的体积比分别为1:(50～1000)。
根据本发明的一些优选实施方面，所述步骤D中，用细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有细胞。
根据本发明的一些优选实施方面，所述检测方法还包括如下步骤：
E、采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行检测。
本文中，术语“室温”是指20～25℃。
本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
利用捕获筛将体液(如血液、尿液或腹腔液)中的肿瘤细胞捕获后再通过PD-L1等抗体孵育检测，有效避免了体液中的其他多种细胞、细胞因子及蛋白对PD-L1等抗体孵育检测的影响，提高了检测的准确性和可靠性，具有较好的特异性；且捕获分离后的肿瘤细胞直接以捕获筛为载体，进行孵育和检测，简便了操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a、图1b分别为FITC滤光片检测肿瘤细胞CK阳性、阴性表达的示意图；
图2a、图2b分别为PD-L1(一抗)-Alexa Fluor 647(二抗)滤光片检测肿瘤细胞PD-L1阳性、阴性表达的示意图；
图3a、图3b分别为PE滤光片检测肿瘤细胞CD45阴性表达的示意图；
图4a、图4b分别为DAPI滤光片检测肿瘤细胞是有核细胞的示意图；
图5a、图5b分别为四种滤光片合并检测肿瘤细胞PD-L1阳性、阴性表达的示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以互相结合。
实施例1
本实施例对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行了检测，具体实施如下。
(1)提供捕获筛
捕获筛包括不锈钢体和覆盖于不锈钢体表面上的保护层。保护层的材料为金或金合金(如，AuPd)，并且其上覆设有EpCAM抗体。保护层为采用磁控溅射或电化学方法沉积在不锈钢体上的AuPd层。EpCAM抗体通过traut’s试剂连接在保护层上，带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替换traut’s试剂。
上述捕获筛的具体制备过程如下：
筛的选择：不锈钢和金筛：选择51μm孔并且采用磁控溅射包覆AuPd，筛的尺寸为2×2mm2。
预功能化：在功能化之前采用了多种清洗方法来制备筛，包括高压蒸汽灭菌法、氧等离子清洗以及在多种溶液中超声清洗，包括食人鱼溶液(piranha solutions)、氨水-双氧水混合液。例如，在洗涤剂中超声处理15分钟，冲洗，在70％～99％乙醇溶液中超声处理15分钟，冲洗，高纯水5分钟。
EpCAM抗体：取2～10μl EpCAM抗体并冷冻，其后用其制备反应混合物(即，EpCAM抗体+具有EDTA的PBS)。
Traut’s试剂：购买后迅速冷冻。Traut’s试剂和EpCAM抗体的体积比为10～20:1。其它方法如带有生物素-亲和素的硫醇盐分子可替代Traut’s试剂来连接至筛以形成所述捕获筛。
具有抗体的Traut’s试剂的孵育时间：最佳反应时间为1小时。
筛在上述溶液中孵育：在10分钟至12小时内并4℃、室温或37℃下采用上述孵育后的含抗体的Traut’s试剂对筛进行孵育，使EpCAM抗体连接到筛上。
(2)采集病人外周血，使用红细胞裂解液或淋巴细胞分离液，分离出有核细胞；
使有核细胞一次或反复多次流过捕获筛，在该过程中，肿瘤细胞被结合至捕获筛上的EpCAM抗体上，从而被捕获；
使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛，将没有和捕获筛上的EpCAM抗体特异性结合的其他杂物或细胞等洗脱去除，只有特异性结合至EpCAM抗体的肿瘤细胞被留在捕获筛上。
(3)将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入500μL 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；
(4)加入PD-L1一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200μL磷酸盐缓冲液清洗2次；
(5)加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；
(6)加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液200uL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次；
(7)加入CD45一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次；
(8)加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；
(9)然后用200μL细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有细胞。
(10)采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行检测：
pan-CK滤光片(绿色)、PD-L1(一抗)-Alexa Fluor 647(二抗)滤光片(红色)、CD45(一抗)-Alexa Fluor 568(二抗)滤光片(红色)、DAPI滤光片(蓝色)及四者合并检测肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的阳性、阴性表达结果分别如图1a至图5a、图1b至图5b所示。
孵育顺序对检测准确性的影响实验：
1.检测样本：采集4mL健康人外周血，向其中加入约200个转染后的NCI-H226参考品细胞系的细胞，使用淋巴细胞分离液，分离出有核细胞PBMC，使用该有核细胞PBMC作为检测样本。
2.实验过程
实验组：根据本申请的检测方法实施检测(孵育顺序依次为：PD-L1+二抗、pan-CK、CD45+二抗、DAPI的染色)，具体过程如下：
(1)准备捕获筛；捕获筛的制备参考实施例1中对应的步骤(1)；
(2)细胞捕获：采集4mL健康人外周血，向其中加入约200个转染后的NCI-H226参考品细胞系的细胞，使用淋巴细胞分离液，分离出有核细胞PBMC。将有核细胞PBMC一次或反复多次流过捕获筛，在该过程中，肿瘤细胞被结合至捕获筛上的EpCAM抗体上，捕获MCF-7细胞，最后，使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛，将没有和捕获筛上的EpCAM抗体特异性结合的其他杂物或细胞等洗脱去除，只有特异性结合至EpCAM抗体的肿瘤细胞被留在捕获筛上。
(3)固定细胞：将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入500μL 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次；
(4)加入PD-L1一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200μL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(5)加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(6)加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液200uL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(7)加入CD45一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(8)加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(9)然后用200μL细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有细胞。
(10)采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色。
对照组1：在本申请的检测方法基础上，改变孵育顺序(依次为CD45+二抗、PD-L1+二抗、pan-CK、DAPI的染色)，具体实施如下：
(1)提供捕获筛：同实验组；
(2)捕获细胞：同实验组：
(3)固定细胞：同实验组；
(4)加入CD45一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(5)加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(6)加入PD-L1一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200μL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(7)加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(8)加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液200uL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(9)然后用200μL细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有细胞。
(10)采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行检测。该步骤也与实验组中相同。
对照组2：在本申请的检测方法基础上，改变孵育顺序(依次为CD45+二抗、pan-CK、PD-L1+二抗、DAPI的染色)，具体实施如下：
(1)提供捕获筛：同实验组；
(2)捕获细胞：同实验组：
(3)固定细胞：同实验组；
(4)加入CD45一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上的细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(5)加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(6)加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液200uL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育所述捕获筛上细胞60min，然后使用200uL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(7)加入PD-L1一抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:200)，25℃孵育所述捕获筛上固定的细胞60min，然后使用200μL磷酸盐缓冲液清洗2次。
(8)加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液200μL(其中抗体原液和PBS的体积比为1:100)，25℃孵育60min，使用磷酸盐缓冲液清洗2次。
(9)用200μL细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有细胞。
(10)采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察通道表面荧光颜色，对肿瘤细胞表面标志分子PD-L1进行检测。该步骤也与实验组中相同。
3.结果与分析
CTC的判别标准：对于同一位置的细胞，保持捕获筛样本不动，切换显微镜的滤光片，分别观察细胞在不同染料染色后的荧光效果，需切换顺序分别为绿色荧光(CK)、蓝色荧光(DAPI)、红色荧光(CD45)、洋红色荧光(PD-L1)。若芯片上捕获的细胞荧光具有CK阳性、DAPI阳性、CD45阴性(能够有效剔除假阳性的情况)，即可判别为CTC。
PD-L1表达的判别标准是：在确定细胞为CTC后，对具有CTC的位置进行PD-L1染色荧光进行识别，若该CTC上有PD-L1表达(即洋红色荧光)，则该CTC有PD-L1表达；若没有洋红色荧光，则该CTC没有PD-L1表达。
依据上述标准，根据各组实验情况，将检测结果汇总如表1所示。
表1实验组和对照组的荧光检测结果
注：上述表格中的CTC细胞个数对应的是捕获筛上某一区域内的CTC细胞个数，并不是检测样本中所有的CTC细胞；同一组实验在染色荧光前后选取的区域是相同的。
从上表中的结果可以看出，对照组1和对照组2中有PD-L1表达的CTC个数的占比明显低于实验组中的结果，表明了对照组1和对照组2中有部分PD-L1表达的CTC没有被检测到。说明采用对照组1和对照组2中的染色顺序，部分CTC的PD-L1的荧光较弱，有的甚至没有PD-L1表达，即有PD-L1表达阳性的细胞没有被染色。分析产生这样结果的原因可能在于：采用对照组1和对照组2中的染色顺序，AlexaFluor 647标记的PD-L1二抗与CD45一抗结合，降低了PD-L1一抗与AlexaFluor 647标记的二抗结合效率，从而导致有PD-L1表达的CTC的检测不准确，降低PD-L1的表达效率。
本申请的实施例中采用连接有EpCAM抗体的捕获筛，通过微流体控制体系流速，对有核细胞中的肿瘤细胞进行特异性捕获；之后将捕获有肿瘤细胞的捕获筛采用PD-L1抗体溶液并结合使用DAPI、CK、CD45三种荧光抗体鉴别出有PD-L1表达的CTC。即实施例只需要采用捕获筛特异性捕获细胞后，只进行孵育和结合免疫荧光分析的二步就能够准确识别出有PD-L1表达的CTC。
通过本申请实施例的技术方案，除了能够达到上述染色顺序带来的优异效果之外，还具有以下的优点：
1.本申请采用物理+抗原抗体结合的方法，能够特异性地将肿瘤细胞化学的结合在网状基体上，通过微流体控制体系流速，对有核细胞中的肿瘤细胞进行特异性捕获且捕获彻底，属于微流控产品，捕获的准确率高，不会出现滤膜过滤截留方案中因为细胞的尺寸而漏补或多补，不会在最终检测环节中出现背景细胞复杂的情况，保证了检测和鉴定的准确性。
2.本申请中采用的染色方法为原位染色方法，以捕获有肿瘤细胞的捕获筛为载体，不需要将捕获的细胞转移，只需在载体表面原位采用PD-L1抗体溶液并结合使用DAPI、CK、CD45三种荧光抗体，能够准确识别有PD-L1表达的CTC，有效排除假阳性的情况，如血源性细胞干扰或存在非特异性吸附干扰。
a.先采用PD-L1一抗溶液和标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液，将有PD-L1表达的位点原位标记出来；
b.接着用pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液将CTC(循环肿瘤细胞)标记出来；
c.之后采用CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的二抗溶液将白细胞标记，以去除白细胞的干扰，排除假阳性；
d.最后采用细胞核荧光染料(DAPI)将有核细胞标记；
通过上述几种荧光抗体组合才能实现准确鉴别有PD-L1表达的CTC，缺少其中任意一种荧光抗体得到的结果都不准确，并且由于同时标记出了总CTC以及具有PD-L1表达的CTC，所以能够得到PD-L1表达的CTC占总CTC的比例。
3.本申请实施例中以特异性捕获有肿瘤细胞的捕获筛为载体，原位进行检测和孵育，捕获的肿瘤细胞在捕获筛上的位置固定不动，且捕获筛的位置也可以保持不变，采用微流控体系使抗体溶液流动至捕获筛位置进行孵育，即使抗体溶液在捕获筛中上下流动也不会造成捕获的肿瘤细胞掉落；在进行PD-L1鉴别时，也只需将捕获装置直接放置在显微镜观察；在保证检测准确性的同时简化了操作流程，降低了操作的复杂度。
4.本申请实施例中在孵育和检测时无需将捕获筛取出并利用粘接剂固定在其他载体上，不会对已经捕获的细胞造成影响，且简化了操作流程。
5.pan-CK包括了很多种CK抗体，本申请中采用pan-CK-AlexaFluor488抗体作为肿瘤标志物进行阳性筛选，具有高的富集效率和富集准确性，避免了不同分化阶段中肿瘤细胞的遗漏，提高了检测的准确性。
6.正常情况下检测样本出现假阳性的占比会大于10％。而采用本申请中的孵育鉴定方法能够准确判断出假阳性样本，从而将假阳性的样本从样本总数中剔除，以得到更加准确的鉴别结果。
7.本申请实施例中肿瘤细胞从开始的捕获到后续的孵育、检测，始终都是一个完整的细胞，不存在对细胞进行通透的步骤，不会破坏细胞形态结构的完整性。
8.本申请实施例中检测的样本为使用红细胞裂解液或淋巴细胞分离液分离外周血后得到的有核细胞，能够进一步避免体液中的其他多种细胞、细胞因子及蛋白对PD-L1抗体孵育检测的影响，提高了检测的准确性和可靠性。
9.本申请中的基于捕获筛和微流控体系的技术方案更加容易实现自动化，可以将捕获筛固定在特定的装置，将抗体溶液吸入装置中进行孵育、检测等步骤。
10.采用本申请中的技术方案得到的检测结果，能够有效避免传统HE染色结合专家阅片方法中人为主观因素的干扰，准确率更高，更具推广性。
本申请的检测方法，主要应用于非诊断目的PD-L1检测，但同样也可用于以诊断为目的的检测用途。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种肿瘤细胞表面标志分子PD-L1的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；
使待测样本流过所述捕获筛，以使待测样本中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；其中，将采集的体液用红细胞裂解液或淋巴细胞分离液分离出有核细胞，将分离出的有核细胞作为所述待测样本；
将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；
依次采用PD-L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞；
对于同一位置的细胞，保持捕获筛样本不动，切换显微镜的滤光片，分别观察细胞在不同染料染色后的荧光效果，滤光片的切换顺序依次为绿色荧光、蓝色荧光、红色荧光、洋红色荧光；
其中，所述孵育进一步包括：
加入PD-L1一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80 min，然后使用磷酸盐缓冲液清洗；
加入标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
加入CD45一抗溶液，室温孵育所述捕获筛上固定的细胞20~80 min，使用磷酸盐缓冲液清洗；
加入标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液，室温孵育20~80min，使用磷酸盐缓冲液清洗。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，进行所述孵育时，以固定有肿瘤细胞的捕获筛整体为载体进行孵育。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，孵育步骤中，采用细胞核荧光染料DAPI标记出所述捕获筛上的所有有核细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，其中，
采用CY5、FITC、PE和DAPI的滤光片通过高通量多色成像分析，观察细胞在不同染料染色后的荧光效果。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述网状基体的尺寸为2-10 mm×2-10 mm，所述捕获筛的孔为20 µm-100 µm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述网状基体包括不锈钢体以及覆盖于所述不锈钢体表面的保护层，所述保护层由贵金属或其合金制成，所述EpCAM抗体覆设于所述保护层上。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述保护层为采用磁控溅射或电化学方法沉积在不锈钢体上的AuPd层。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述EpCAM抗体通过traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接于所述保护层上。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有核细胞为使用红细胞裂解液或淋巴细胞分离液分离外周血后得到。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在有核细胞流过所述捕获筛且肿瘤细胞结合至所述捕获筛上后，使用细胞清洗液冲洗所述捕获筛以去除没有结合至所述捕获筛的杂物或细胞。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述体液为血液、尿液或腹腔液。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，通过将结合有肿瘤细胞的捕获筛放入4%多聚甲醛溶液中，室温维持10~60min，之后使用磷酸盐缓冲液清洗，以实现将所述捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括：
A、提供捕获筛，所述捕获筛包括网状基体及孵育形成在所述网状基体上的EpCAM抗体；
B、使分离自体液的有核细胞流过所述捕获筛，以使有核细胞中的肿瘤细胞结合至所述捕获筛上；
C、用甲醛将捕获的肿瘤细胞固定在所述捕获筛上；
D、依次采用PD-L1一抗溶液、标记有荧光基团AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor488一抗溶液、CD45一抗溶液及标记有荧光基团AlexaFluor 568的CD45二抗溶液对所述捕获筛上固定的细胞进行孵育，然后用细胞核荧光染料标记出所述捕获筛上的所有细胞。
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