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CN114107392A - 一种cvb5病毒类病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

一种cvb5病毒类病毒样颗粒的制备方法 Download PDF

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CN114107392A
CN114107392A CN202111385032.4A CN202111385032A CN114107392A CN 114107392 A CN114107392 A CN 114107392A CN 202111385032 A CN202111385032 A CN 202111385032A CN 114107392 A CN114107392 A CN 114107392A
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pfast
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滕培英
李金伟
杨帆
李静
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Abstract

本发明公开了一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：步骤1，由CVB5基因组扩增获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast‑Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast‑BacDual‑3CD；步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast‑Bac Dual‑3CD质粒，制备得到质粒pFast‑Bac Dual‑3CD‑P1；步骤3，利用构建融合CVB5的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得阳性克隆，提取重组杆状病毒基因组DNA。本发明的CVB5的融合有外源肽段的3CD蛋白切割P1蛋白形成VLP，进而自组成大小均一的CVB5类病毒样颗粒。

Description

一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，尤其涉及一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法。
背景技术
手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease,HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的儿童急性传染病。多数幼儿患者发病突然，以发热和手足、口腔等部位皮疹、疱疹、溃疡为主要症状，少数患儿可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性痹、神经源性肺水肿和心肌炎严重并发症，个别重症患儿病情进展迅速，可导致死亡。近年来全球各地出现了爆发和流行，重症率和死亡率都直线上升，对幼儿健康造成严重威胁，且造成巨大的经济损失。HFMD的病原体为小核糖核酸病毒科，主要包括肠道病毒71型、柯萨奇病毒A群和B群以及埃可病毒等。近些年越来越多研究证据显示，柯萨奇病毒B组5型(简称CVB5)是手足口病的重要病原体之一。
CVB5为无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24-30nm。CVB5基因组全长约7,400bp，由一个开放阅读框及两个非翻译区。CVB5基因组开放阅读框可编码2,194个氨基酸的多聚蛋白前体，被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为三个前体蛋白(P1、P2、P3)。P1前体蛋白基因编码四种结构蛋白—VP1、VP2、VP3和VP4，其中，VP1、VP2和VP3三个多肽呈现在病毒衣壳的表面，中和抗体主要针对VP1产生作用；VP4与病毒核心紧密相连，包埋在病毒内侧。P2和P3基因区编码七种非结构蛋白—2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其中3CD蛋白酶的主要作用是对P1进行切割并组装成病毒的衣壳。VLP是由病毒外壳蛋白质所组成的不含遗传物质的壳状结构。由于其没有病毒的核酸，不能自主复制，且与其他抗原成分相比，更接近天然构象，能够更有效地引起机体产生免疫反应，为疫苗研究提供了新思路。
杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个特点是其具有两种不同的病毒粒子形态：一种为出芽型的病毒粒子(budded virus,BV)，主要介导细胞与细胞之间的系统感染，入侵细胞是通过受体介导的内吞作用；另一种为包埋型的病毒粒子(Occlusion-derivedvirus,ODV)，在病毒的口服感染过程中，节肢动物肠道碱性环境使包埋型的病毒粒子外壳脱落，萌发成具有侵染能力的病毒并感染肠道细胞达到病毒传播。E.coli-昆虫细胞穿梭载体(Bacmid)是最为方便的重组杆状病毒筛选系统。Bacmid既能在E.coli中复制，也能感染昆虫细胞。重组Bacmid转染昆虫细胞，包装出重组杆状病毒,同时表达外源基因。
发明内容
(一)发明目的
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，通过融合CVB5的外源肽段的P1蛋白和3CD蛋白酶，能够获得高纯度、形态均一的类病毒样颗粒，用于手足口疫苗的制备。
(二)技术方案
为达到上述技术目的：
一方面，我们提供一种表达CVB5型病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其含有分别受polyhedrin启动子调控的P1蛋白表达序列和受p10启动子调控的非结构蛋白表达序列。
优选的，所述蛋白表达序列为3CD蛋白表达序列。
优选的，所述CVB5类病毒样颗粒是融合有外源肽段的P1蛋白与3CD蛋白的穿梭表达载体。
另一方面，我们提供一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，由CVB5基因组反转录和PCR扩增，获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast-Bac Dual-3CD；
步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual-3CD质粒，制备得到质粒pFast-Bac Dual-3CD-P1。
优选的，还包括以下步骤：
步骤3，利用构建融合CVB5的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得阳性克隆，提取重组杆状病毒基因组DNA；
步骤4，将上述步骤3制备的重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞sf9，收获细胞培养上清，保存第一代病毒液。
步骤5，将上述步骤4获得的第一代病毒液感染昆虫细胞sf9，以此类推，得到高滴度的第六代病毒液。
优选的，所述转染细胞为昆虫草地贪夜蛾sf9细胞，sf9细胞大小均一，方便操作，且对杆状病毒敏感，通常作为昆虫表达细胞，易于产生高水平蛋白表达量。
优选的，将融合有外源片段的3CD蛋白酶切割P1蛋白形成VLP，为CVB5类病毒样颗粒疫苗研究打下基础。
从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：
本发明的CVB5的融合有外源肽段的3CD蛋白切割P1蛋白形成VLP，进而自组成大小均一的CVB5类病毒样颗粒。
本发明开发了一种结构上类似于CVB5的类病毒样颗粒作为疫苗抗原，在电镜下观察到颗粒状重复性结构，颗粒状的抗原一般具有较强的免疫原性。
本发明的制备的疫苗抗原不含有病毒遗传物质，不会有潜在的感染可能性，更适合疫苗候选抗原。
本发明的CVB5类病毒样颗粒，获得高纯度、形态均一的病毒样颗粒，对于基于类病毒样颗粒的疫苗来说，诱导的免疫应答程度接近，同时也便于后续的抗原含量测定。
本发明能够获得高纯度、形态均一的病毒样颗粒，并用于手足口疫苗的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1：pFastBac Dual质粒图谱。
图2：pFastBac Dual-3CD酶切鉴定图。
图3：pFastBac Dual-P1酶切鉴定图。
图4：重组Bacmid-3CD-P1杆状病毒基因组PCR检测图。
图5：重组CVB5病毒样颗粒纯化前SDS-PAGA检测结果图。
图6：重组CVB5病毒样颗粒纯化后SDS-PAGA检测结果图
图7：重组CVB5病毒样颗粒颗粒电镜观察图。
图2中：1：DL5000Marker 2：3CD-pFastBacDual双酶切前图谱
3:3CD-pFastBacDual双酶切图谱。
图3中：1：DL5000Marker 2：P1-pFastBacDual双酶切前图谱；
3-5:分别为P1-pFastBacDual 3个单菌落双酶切图谱。
图4中：1：DL5000Marker 2：P1-pFastBacDual双酶切前；
3-6:分别为Bacmid-3CD-P1杆状病毒基因组3CD验证；
7-10：分别为Bacmid-3CD-P1杆状病毒基因组P1验证。
具体实施方式
下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。应当理解，在所有这些附图中，相同或相似的附图标记指示相同的或相似的零件及特征。各个附图仅示意性地表示了本公开的实施方式的构思和原理，并不一定示出了本公开各个实施方式的具体尺寸及其比例。在特定的附图中的特定部分可能采用夸张的方式来图示本公开的实施方式的相关细节或结构。
参照图1-7：
实施例一
一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其含有分别受polyhedrin启动子调控的P1蛋白表达序列和受p10启动子调控的非结构蛋白表达序列。
其中，非结构蛋白表达序列为3CD蛋白表达序列。
另外，CVB5类病毒样颗粒是融合CVB5外源肽段的P1蛋白与3CD蛋白的穿梭表达载体。
实施例二
一种CVB5类病毒类病毒样颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，由CVB5基因RNA反转录和PCR扩增,获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast-Bac Dual-3CD；
步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual-3CD质粒，制备得到质粒pFast-Bac Dual-3CD-P1。
具体的，实验室保存的CVB5病毒液使用Trizol法提取CVB5 RNA，反转为cDNA，通过PCR扩增，获得P1和3CD基因片段，其中，P1带有Xba I、Not I酶切位点和3CD基因片段带有Xho I、Sph I酶切位点。
P1扩增引物
上游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGGGAGCTCAAGTATCAACAC-3’
下游引物：5’-TGCTCTAGATTAGGTGGTCTGCATGGTTGTTAT-3’
3CD扩增引物
上游引物：5’-CCGCTCGAGATGGGTCCCGCTTTTGAGTTTGCT-3’
下游引物：5’-ACATGCATGCTTAAAAGGAGTCCAGCCATTTCCT-3’。
还包括以下步骤：
步骤3，利用构建的融合CVB5的融合有外源肽段的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得重组杆状病毒基因组DNA；
步骤4，将上述步骤3制备的重组杆状病毒基因组DNA转染细胞，收获细胞,培养上清，保存病毒液。
具体的，利用载有CVB5的融合有外源肽段的3CD和P1蛋白序列的质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选阳性克隆。提取重组菌基因组DNA，转染昆虫草地贪夜蛾sf9细胞，5-7天收获细胞培养上清，保存第一代病毒液。sf9细胞大小均一，方便操作，且对杆状病毒敏感，通常作为昆虫表达细胞，易于产生高水平蛋白表达量。
步骤5，将上述步骤4获得的第一代病毒液感染昆虫细胞sf9，以此类推，得到高滴度的第六代病毒液。
需要说明的是，本发明实例中CVB5病毒，pFast Bac Dual载体，DH10Bac感受态细胞和草地贪夜蛾细胞细胞为自行保存，无血清培养基购自Hyclone公司，胎牛血为AusGeneX澳洲胎牛血清。
将融合有外源片段的3CD蛋白酶切割P1蛋白形成VLP，为CVB5类病毒样颗粒疫苗研究打下基础。
为了获取大量蛋白，将收获的含有重组杆状病毒的上清继续感染高密度的草地贪夜蛾细胞细胞，收获下一代病毒液保存，同时收取细胞，按此方法收获第六代病毒液保存。通过氯化铯密度梯度离心纯化目的蛋白。
具体步骤如下：将收取的细胞-80℃反复冻融三次裂解蛋白，在4℃下10000rpm离心5分钟，去除细胞碎片，收集上清液。以每4mL上清液加入1.85g氯化铯粉末比例充分混匀，4℃下36000rpm超速离心16h，离心结束后，从上往下按0.5mL为一个组分取八份。随后将各组分在4℃下运用1×PBS，3kD透析袋透析3次，每次2小时，最后4℃条件下使用聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩，收集浓缩液，使用NanoDrop 2000测定蛋白浓度，变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-Blot测定纯化蛋白的完整性和纯度。
用制备纯化的CVB5 VLP免疫小鼠，可产生特异性血清抗体，同时对CVB5感染的乳鼠具有保护作用。CVB5 VLP与铝佐剂混合，通过腹腔注射，分别在0,1和2周免疫6-8周龄Balb/C小鼠6只。第4周采集小鼠血清样本。随后，采用主动免疫的方式对出生1日龄小鼠接种CVB5 VLP，1日后，攻毒CVB5。与对照组相比，攻毒15天后，接种CVB5 VLP小鼠存活率可达60％以上。
上文中参照优选的实施例详细描述了本公开所提供的方案的示范性实施方式，然而本领域技术人员可理解的是，在不背离本公开理念的前提下，可以对上述具体实施例做出多种变型和改型，且可以对本公开提供的各种技术特征、结构进行多种组合，而不超出本公开的保护范围，本公开的保护范围由所附的权利要求确定。

Claims (7)

1.一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，其含有分别受polyhedrin启动子调控的P1蛋白表达序列和受p10启动子调控的非结构蛋白表达序列。
2.根据权利要求1所述的一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述非结构蛋白表达序列为3CD蛋白表达序列。
3.根据权利要求1或2所述的一种表达CVB5类病毒样颗粒的多顺反子真核表达载体，其特征在于，所述CVB5类病毒样颗粒是融合CVB5外源肽段的P1蛋白与3CD蛋白的穿梭表达载体。
4.一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1，由CVB5基因RNA反转录和PCR扩增，获得P1与3CD基因片段，3CD基因5’端和3’端分别带有Xho I和Sph I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的p10启动子下游，构建获得pFast-Bac Dual-3CD；
步骤2，P1基因5’端和3’端分别带有Not I和Xba I酶切位点，将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual-3CD质粒，制备得到质粒pFast-BacDual-3CD-P1。
5.根据权利要求4所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤3，利用构建的融合CVB5的3CD和P1蛋白序列的穿梭表达载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，获得阳性克隆，提取重组杆状病毒基因组DNA；
步骤4，将上述步骤3制备的重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞sf9，收获细胞培养上清，保存第一代病毒液。
步骤5，将上述步骤4获得的第一代病毒液感染昆虫细胞sf9，以此类推，得到高滴度的第六代病毒液。
6.根据权利要求4所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述转染细胞为昆虫草地贪夜蛾sf9细胞，sf9细胞大小均一，方便操作，且对杆状病毒敏感，通常作为昆虫表达细胞，易于产生高水平蛋白表达量。
7.根据权利要求5所述的一种CVB5病毒类病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，将融合有外源片段的3CD蛋白酶切割P1蛋白形成VLP。
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Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
WO2006027698A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg. Decreasing potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines
WO2008144584A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Cysteic acid derivatives of anti-viral peptides
CN103320394A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 胡育诚 病毒样颗粒的制备方法及其使用的重组杆状病毒
CN103525855A (zh) * 2013-10-12 2014-01-22 上海博唯生物科技有限公司 一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法
CN103710384A (zh) * 2013-12-18 2014-04-09 广东华南联合疫苗开发院有限公司 小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途
CN103740758A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途
CN104093420A (zh) * 2011-11-03 2014-10-08 森提耐斯特治疗公司 针对人肠道病毒的抗原及疫苗
AU2013281395A1 (en) * 2012-06-26 2015-02-05 Biovalence Sdn. Bhd. Dosage regime of fusion compounds
US20150056244A1 (en) * 2013-08-25 2015-02-26 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses
CN106884017A (zh) * 2016-12-28 2017-06-23 中国食品药品检定研究院 用于包装柯萨奇病毒b5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法
CN107475257A (zh) * 2017-08-21 2017-12-15 昆明理工大学 高效启动表达外源蛋白的启动子样基因及其应用
CN107603979A (zh) * 2017-08-04 2018-01-19 昆明理工大学 一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用
US20190359964A1 (en) * 2018-05-22 2019-11-28 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Homeland Securit Modified picornavirus 3c proteases and methods thereof
CN112048004A (zh) * 2020-07-14 2020-12-08 桂林医学院 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
WO2006027698A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg. Decreasing potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines
WO2008144584A2 (en) * 2007-05-16 2008-11-27 Conjuchem Biotechnologies Inc. Cysteic acid derivatives of anti-viral peptides
CN104093420A (zh) * 2011-11-03 2014-10-08 森提耐斯特治疗公司 针对人肠道病毒的抗原及疫苗
CN103320394A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 胡育诚 病毒样颗粒的制备方法及其使用的重组杆状病毒
AU2013281395A1 (en) * 2012-06-26 2015-02-05 Biovalence Sdn. Bhd. Dosage regime of fusion compounds
US20150056244A1 (en) * 2013-08-25 2015-02-26 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Antigens and Vaccines Directed Against Human Enteroviruses
CN103525855A (zh) * 2013-10-12 2014-01-22 上海博唯生物科技有限公司 一种制备重组肠道病毒ev71型病毒样颗粒的方法
CN103740758A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途
CN103710384A (zh) * 2013-12-18 2014-04-09 广东华南联合疫苗开发院有限公司 小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途
CN106884017A (zh) * 2016-12-28 2017-06-23 中国食品药品检定研究院 用于包装柯萨奇病毒b5假病毒的重组表达质粒、假病毒、试剂盒和方法
CN107603979A (zh) * 2017-08-04 2018-01-19 昆明理工大学 一种高效表达外源蛋白的启动子样基因及其应用
CN107475257A (zh) * 2017-08-21 2017-12-15 昆明理工大学 高效启动表达外源蛋白的启动子样基因及其应用
US20190359964A1 (en) * 2018-05-22 2019-11-28 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Homeland Securit Modified picornavirus 3c proteases and methods thereof
CN112048004A (zh) * 2020-07-14 2020-12-08 桂林医学院 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NING ZHANG等: "Coxsackievirus B5 virus-like particle vaccine exhibits greater immunogenicity and immunoprotection than its inactivated counterpart in mice", VACCINE, vol. 39, pages 5699 - 5705, XP086777992, DOI: 10.1016/j.vaccine.2021.07.095 *
卞莲莲;姚昕;高帆;孙世洋;毛群颖;杨晓明;梁争论;: "江苏省2013―2014年3株柯萨奇病毒B组5型流行株全基因组序列分析", 微生物学免疫学进展, no. 02, pages 1 - 5 *

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