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CN114107339B - 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用 - Google Patents

泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN114107339B CN202111501439.9A CN202111501439A CN114107339B CN 114107339 B CN114107339 B CN 114107339B CN 202111501439 A CN202111501439 A CN 202111501439A CN 114107339 B CN114107339 B CN 114107339B
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Abstract

本发明提供了泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因的扩增引物，扩增获得了两种基因型；构建了泡桐丛枝植原体胸苷激酶的原核表达载体，诱导表达并纯化获得了6×His/PaWB TDK‑1融合蛋白和6×His/PaWB TDK‑2融合蛋白；以融合蛋白为免疫原免疫兔获得了兔多克隆抗体；该多克隆抗体与PaWB TDK‑1蛋白和PaWB TDK‑2蛋白均可发生免疫反应；借助免疫印迹法、免疫荧光显微镜法、免疫电子显微镜法，证明该多克隆抗体可较好地用于泡桐丛枝植原体及其胸苷激酶表达的检测。本发明为进一步研究植原体增殖致病机理奠定了基础，也为农林生产中检测泡桐丛枝植原体提供了新的技术手段。

Description

泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆 抗体及其应用
技术领域
本发明涉及泡桐丛枝植原体检测技术领域，具体地说，是泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用。
背景技术
泡桐丛枝病(Paulownia Witches’-Broom，简称PaWB)俗称泡桐的“癌症”或“艾滋病”，是由泡桐丛枝植原体导致的一种系统性侵染病害，主要引起丛枝、小叶、花器变态等病状，破坏了树势和树形，影响木材的产量与质量，严重时导致树木死亡。泡桐丛枝病在我国分布极其广泛，几乎遍布于泡桐分布区。尤其在我国的河南、山东、陕西等泡桐中心产区，该病害发病率和死亡率高，给泡桐生产造成重大危害。因此，对该病害基础理论、检测、防控等技术的研究具有重要意义。
虽然抗病育种、化学防治、物理防治和田间综合防控等措施可对泡桐丛枝病起到一定的效果，但目前依然无法根治该病害。研究表明，寄主植物中的植原体增殖到一定浓度是该病害发生的前提，因此对植原体增殖机理的深入研究可为从根源上防治该病害提供策略。植原体的增殖离不开其DNA的合成，DNA合成需要dTTP等四种脱氧核糖核苷酸参与。植原体细胞内，dTTP需由多种酶催化合成，其中胸苷激酶(Thymidine kinase，简写为TDK)是该合成途径中的关键限速酶。因此，对该酶的深入研究可为控制植原体增殖提供策略。
目前现有技术中，未见有泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因型、胸苷激酶融合蛋白、利用融合蛋白制备多克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因的两种基因型及用于该基因扩增的引物，制备了泡桐丛枝植原体胸苷激酶融合蛋白，利用该融合蛋白制备多克隆抗体。
所述的泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因有两种基因型，简称PaWB tdk-1基因型和PaWB tdk-2基因型，所述PaWB tdk-1基因型的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PaWBtdk-2基因型的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
用于泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因扩增的引物，包括正向引物PaWBtdkupF和反向引物PaWBtdkdnR，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。引物PaWBtdkupF/PaWBtdkdnR可扩增PaWB tdk基因ORF全长及上游81bp和下游82bp的序列。
PaWB tdk-1基因型ORF编码的胸苷激酶PaWB TDK-1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，PaWB tdk-2基因型ORF编码的胸苷激酶PaWB TDK-2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明还提供了泡桐丛枝植原体胸苷激酶融合蛋白，即6×His/PaWB TDK-1融合蛋白和6×His/PaWB TDK-2融合蛋白。6×His/PaWB TDK-1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，其是在PaWB TDK-1蛋白的N端融合6×His标签肽段获得。6×His/PaWB TDK-2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其是在PaWB TDK-2蛋白的N端融合6×His标签肽段获得。
所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)将所述泡桐丛枝植原体胸苷激酶的基因重组于pET-28a载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组载体；用于构建重组载体的正向引物为tdkF-BamHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物为tdkR-XhoI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
(2)将步骤(1)制备的重组载体转入菌株Escherichia coli BL21(DE3)中，得到重组菌株；
(3)培养步骤(2)制备的重组菌株，通过IPTG诱导表达；
(4)目标蛋白的检测与纯化。
本发明还提供了泡桐丛枝植原体胸苷激酶多克隆抗体，其是以6×His/PaWB TDK-1融合蛋白和6×His/PaWB TDK-2融合蛋白为免疫原免疫兔获得。进一步地，所述的免疫原与佐剂混合乳化后进行免疫。所述多克隆抗体与PaWB TDK-1蛋白和PaWB TDK-2蛋白均可发生免疫反应。
所述多克隆抗体在泡桐丛枝植原体检测或植原体胸苷激酶检测中的应用，检测的方法为蛋白质免疫印记法、免疫荧光显微镜法或免疫电子显微镜法。
上述多克隆抗体可制备成检测产品，形式不限于试剂盒、试纸等。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的PaWB tdk基因扩增引物和基因型可为泡桐丛枝植原体的分类提供分子依据，也为后续研究PaWB tdk基因型与植原体增殖致病的关系奠定基础。
2、本发明提供了泡桐丛枝植原体胸苷激酶融合蛋白，利用该融合蛋白可制备多克隆抗体；提供的PaWB TDK兔多克隆抗体可较好的用于泡桐丛枝植原体胸苷激酶表达的检测，也可直接用于泡桐丛枝植原体的检测；本发明为深入研究胸苷激酶在植原体增殖致病中的作用机理提供了抗体并为进一步研究奠定了基础，也为农林生产中检测泡桐丛枝病提供了新的技术手段。
附图说明
附图1：引物PaWBtdkupF设计示意图。
附图2：引物PaWBtdkdnR设计示意图。
附图3：6×His/PaWB TDK-1融合蛋白诱导表达结果；箭头所示为6×His/PaWBTDK-1融合蛋白。
附图4：6×His/PaWB TDK-1融合蛋白Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化结果；1为诱导表达菌体的裂解液上清，2为纯化的6×His/PaWB TDK-1融合蛋白。
附图5：用PaWB TDK抗体WB检测6×His/PaWB TDK融合蛋白结果；1和2均为纯化的6×His/PaWB TDK-1融合蛋白，3和4均为纯化的6×His/PaWB TDK-2融合蛋白。
附图6：用6×His标签抗体WB检测6×His/PaWB TDK融合蛋白结果，各泳道样品同附图5。
附图7：用PaWB TDK抗体WB检测泡桐丛枝病样品结果；1、2、3、4泳道分别为轻度、健康、中度、重度泡桐丛枝病组培苗蛋白样品。
附图8：用PaWB TDK抗体进行的免疫荧光显微镜结果；A为健康泡桐切片，B为丛枝病泡桐切片。
附图9：用PaWB TDK抗体进行的免疫电子显微镜结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。提供这些实施例是为了技术人员能够更透彻的理解本发明，并且能将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。若无特别说明，实施例中所用技术手段和方法为本领域的常用技术手段和方法。如无特别说明，实施例中采用的试剂与耗材均易于购得。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pLB零背景载体、E.coli DH5α感受态细胞、E.coliBL21(DE3)感受态细胞、2×Taq Mix购自天根生化科技(北京)有限公司。
限制性内切酶BamHI和XhoI、T4 DNA连接酶、pET-28a载体购自宝生物工程(大连)有限公司。
6×His标签鼠单克隆抗体、AP标记的羊抗鼠IgG二抗、AP标记的羊抗兔IgG二抗、FITC标记的羊抗兔IgG二抗、100×Protease Inhibitor Cocktail(EDTA free)、DNase I、RNase A、BCIP/NBT显色试剂盒、溶菌酶、引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
由于PaWB TDK-1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)和PaWB TDK-2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)之间仅有1个氨基酸的差异，以6×His/PaWB TDK-1融合蛋白和6×His/PaWB TDK-2融合蛋白为免疫原制备抗体采用完全相同的步骤和检测方法，实质上制备的抗体具有相同的应用效果。为避免重复叙述，以下实施例中仅叙述以6×His/PaWBTDK-1融合蛋白为免疫原免疫动物制备PaWB TDK蛋白的多克隆抗体。
实施例1：泡桐丛枝植原体PaWB tdk基因扩增引物设计
在洋葱黄化植原体(OY-M，Genbank AP00628)、翠菊黄化植原体(AYWB，GenbankCP000061)、玉米丛矮植原体(M3，Genbank CP015149)基因组序列中，分别截取tdk基因及其上下游部分序列后进行多序列比对，在tdk基因ORF上游81bp处(见图1)和下游82bp(见图2)处设计上下游引物。
上游引物PaWBtdkupF的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)：5’-AAGTTCTTTTGGACCAACTATCAC-3’；
下游引物PaWBtdkdnR的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)：5’-ATATGTTGTTGGTTGTTATTTTCC-3’。
实施例2：PaWB tdk-1基因型和PaWB tdk-2基因型的获得
以泡桐丛枝病样品DNA为模板，利用引物PaWBtdkupF/PaWBtdkdnR进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PaWBtdkupF 0.5μL，反向引物PaWBtdkdnR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
PCR扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，50℃30秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；10℃保温。
利用引物PaWBtdkupF/PaWBtdkdnR对PCR产物进行测序。
在采集的我国87份泡桐丛枝病样品中，鉴定到两种PaWB tdk基因型，命名为PaWBtdk-1基因型和PaWB tdk-2基因型。序列分析表明，PaWB tdk-1和tdk-2ORF长度均为630bp，两基因型间仅有6个碱基差异。
PaWB tdk-1基因型ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
PaWB tdk-2基因型ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3：PaWB tdk-1/pLB中间克隆载体的构建
根据PaWB tdk-1和PaWB tdk-2基因型的ORF核苷酸序列设计特异性引物tdkF-BamHI/tdkR-XhoI。
正向引物tdkF-BamHI的核苷酸序列(SEQ ID NO.9所示)为：5’-CGCGGATCCATGACCCAAAAAGAACAAGGG-3’；
反向引物tdkR-XhoI的核苷酸序列(SEQ ID NO.10所示)为：5’-CCGCTCGAGTTATTTAGATTGGTTGGTGAAG-3’。
以PaWB316基因组DNA为模板，利用引物tdkF-BamHI/tdkR-XhoI进行PCR扩增。
PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物tdkF-BamHI 0.5μL，反向引物tdkR-XhoI 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
PCR扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，58℃30秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；10℃保温。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的DNA片段。
将纯化回收的目的DNA片段连接到克隆载体，优选的为无BamHI和XhoI酶切位点的克隆载体，本实施例使用天根生化科技(北京)有限公司pLB零背景载体。
上述连接反应产物热击转化E.coli DH5α感受态细胞，Amp抗性LB平板中37℃培养16小时，挑取单菌落摇菌后测序，测序结果与PaWB tdk-1基因型核苷酸序列完全一致。
提取PaWB tdk-1/pLB质粒，质粒保存于-20℃备用。
实施例4：PaWB tdk-1/pET-28a原核表达载体的构建
利用BamHI和XholI分别双酶切pET-28a空载体和PaWB tdk-1/pLB质粒。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收pET-28a线性化载体片段和PaWB tdk-1片段。
利用T4 DNA连接酶连接回收的pET-28a线性化载体片段和PaWB tdk-1片段。
上述BamHI和XhoI双酶切反应体系为：BamHI 1μL，XholI 1μL，10×K buffer 2μL，质粒DNA 10μL，ddH2O 6μL。酶切反应条件为37℃水浴2-6小时。
上述T4 DNA连接酶连接反应体系为：T4 DNA Ligase 0.5μL，10×T4 Ligasebuffer 1.0μL，PaWB tdk-1片段3.5μL，pET-28a线性化载体片段5.0μL。连接反应条件为16℃约12-16小时。
上述10μL的连接产物全部转化E.coli DH5α感受态细胞，Kan抗性LB平板上37℃培养12-16小时，挑取单菌落摇菌后测序验证，测序结果须与PaWB tdk-1基因型核苷酸序列完全一致。
提取PaWB tdk-1/pET-28a质粒，质粒保存于-20℃备用。
实施例5：6×His/PaWB TDK-1融合蛋白的原核表达
将PaWB tdk-1/pET-28a质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，Kan抗性的LB平板上37℃培养12-16小时，单菌落37℃200转/分钟摇菌至OD600为0.6-0.8。
取1mL菌液于含Kan的1L LB液体培养基中37℃200转/分钟摇菌培养，待OD600为0.4左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃140转/分钟摇菌培养至OD600为0.8-1.0。
取1mL诱导表达的菌液用于检测目标蛋白表达情况，其余菌液收集到多个50mL离心管中，每个50mL离心管收集100mL菌液中的菌体。
将上述1mL菌液提取蛋白后进行SDS-PAGE电泳检测，如图3所示，6×His/PaWBTDK-1融合蛋白被成功诱导表达，图3中箭头所示为6×His/PaWB TDK-1融合蛋白。
实施例6：6×His/PaWB TDK-1融合蛋白的纯化
A液：50mM Tris-HCl、0.5M NaCl、5％Glycerol、10mM Imidazole、1％NP-40、0.25％Tween-20，pH＝7.5-8.0。
B液：50mM Tris-HCl、0.5M NaCl、5％Glycerol、150mM Imidazole、0.25％Tween-20，pH＝7.5-8.0。
纯化实验步骤为：
(1)0.5g菌体中加入A液40mL，吹吸混匀；
(2)加入40μL 100×Protease Inhibitor Cocktail(EDTA free)，加入RNase A至终浓度2.5μg/mL，加入DNase I至终浓度10μg/mL，加入40mg溶菌酶，吹吸混匀；
(3)冰浴2小时，期间可多次吹吸混匀；
(4)4℃12000rpm 30min，转上清，冰浴放置备用；
(5)蛋白上清液过2mL Ni-NTA琼脂糖柱；
(6)30倍柱体积A液过柱清洗杂蛋白；
(7)2mL B液过柱洗脱目的蛋白。
上述溶液过柱时流速不能快，控制在1滴/秒左右。
如图4中泳道2所示，通过上述方法获得了纯净的6×His/PaWB TDK-1融合蛋白。
用实施例3至实施例6中的方法，同时构建了PaWB tdk-2/pLB中间载体、PaWB tdk-2/pET-28a质粒；获得了转化有PaWB tdk-2/pET-28a质粒的E.coli BL21(DE3)菌株；成功制备了6×His/PaWB TDK-2融合蛋白。
PaWB tdk-1基因型ORF编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6×His/PaWB TDK-1融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
PaWB tdk-2基因型ORF编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6×His/PaWB TDK-2融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例7：PaWB TDK多克隆抗体的制备与效价检测
(一)PaWB TDK多克隆抗体的制备
免疫动物为健康雌性新西兰大白兔，两只，4月龄，2.1Kg。
抗原蛋白为纯化的6×His/PaWB TDK-1融合蛋白。
分别在第1天、第21天和第35天进行免疫，初次免疫抗原为弗氏完全佐剂+蛋白抗原，后两次免疫抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原，第57天终放血。
利用蛋白抗原纯化抗血清中的抗体，即为PaWB TDK兔多克隆抗体。
(二)效价检测
(Ⅰ)间接ELISA检测多克隆抗体效价
(1)将抗原用0.05M碳酸盐(pH＝9.6)按0.2μg/孔包板，100μL/孔，4℃孵育过夜；
(2)0.05％PBST洗涤三次，3分钟/次；
(3)每孔加入150μL的5％脱脂奶粉封闭液，37℃封闭60分钟；
(4)用0.05％PBST洗涤三次，3分钟/次；
(5)抗血清和抗体分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，37℃孵育1小时；
(6)0.05％PBST洗涤三次，3分钟/次；
(7)1:8000稀释辣根酶标记山羊抗兔IgG，37℃孵育45分钟；
(8)0.05％PBST洗涤五次，3分钟/次；
(9)加底物溶液TMB 100μL/孔，反应15分钟，最后加入100μL 2M硫酸终止反应；
(10)用酶标仪在450nm波长下测定OD值。
PaWB TDK多克隆抗体效价间接ELISA显色时各孔OD450读值如下表1所示，兔A抗体效价≥256K，兔B抗体效价≥512K，多克隆抗体制备成功。
表1 PaWB TDK多克隆抗体效价间接ELISA检测的OD450值
(Ⅱ)Western Blot检测多克隆抗体效果
为进一步明确PaWB TDK多克隆抗体效果，利用PaWB TDK多克隆抗体为一抗，AP标记的羊抗兔IgG为二抗进行WB检测；同时进行对照WB实验，6×His鼠单克隆抗体为一抗，AP标记的羊抗鼠IgG为二抗。
(1)6×His/PaWB TDK融合蛋白稀释100倍后取20μL上样；
(2)5％浓缩胶和12％分离胶中SDS-PAGE电泳；
(3)电转膜90min；
(4)4℃过夜封闭；
(5)TBST洗膜3次，每次15min；
(6)TBST 1:200稀释一抗，25℃孵育90min；
(7)TBST洗膜3次，每次15min；
(8)TBST 1:1000稀释二抗，25℃孵育90min；；
(9)TBST洗膜3次，每次15min；
(10)BCIP/NBT显色缓冲液显色。
以6×His/PaWB TDK-1融合蛋白和6×His/PaWB TDK-2融合蛋白为样品，PaWB TDK多克隆抗体为一抗的WB结果如图5所示；6×His标签抗体为一抗的WB结果如图6所示，两种一抗都检测到大小一致的目标蛋白。该WB结果表明成功制备了PaWB TDK多克隆抗体。
实施例8：PaWB TDK多克隆抗体的应用
(一)利用Western Blot技术检测PaWB TDK蛋白表达
液氮研磨样品，称取0.2g粉末提取总蛋白，后续参照实施例7中WB实验步骤进行。
如图7所示，轻度、中度、重度泡桐丛枝病组培苗样品均出现目标大小的条带，而健康样品未出现该条带，随着病状程度加重，条带颜色变深，表明PaWB TDK蛋白在植原体中表达，PaWB TDK多克隆抗体可用于Western Blot免疫印记实验。
(二)利用免疫荧光显微镜技术检测PaWB TDK蛋白表达
(1)茎段徒手横切片，厚度100-500μM；
(2)95％乙醇固定；
(3)0.02M PBS-NaCl漂洗3次，每次10min；
(4)生理盐水1:200稀释PaWB TDK一抗，37℃孵育1h；
(5)PBST漂洗3次，每次10min；
(6)PBST 1:200稀释FITC标记的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1h；
(7)PBST漂洗3次，每次10min；；
(8)OLYMPUS IX73显微镜观察FITC荧光，FITC最大吸收光谱为490-495nm发射广谱为520-530nm；
如图8所示，泡桐丛枝病茎段韧皮部出现绿色荧光，而健康泡桐茎段未出现绿色荧光，表明PaWB TDK蛋白在植原体中表达，PaWB TDK多克隆抗体可用于免疫荧光显微镜实验。
(三)利用免疫胶体金技术检测PaWB TDK蛋白表达
(1)培养40-50天的泡桐丛枝病组培苗茎段长约3mm，2％戊二醛和1％锇酸固定；
(2)酒精系列脱水；
(3)Epon812树脂包埋；
(4)超薄切片，切片挑到覆Formvar膜的直径3mm的镍网上；
(5)PBS-Glycine液滴上洗2次，每次15分钟；
(6)PBST 1:800稀释PaWB TDK一抗，一抗液滴上4℃过夜；
(7)热纯净水冲洗镍网，PBST液滴上5min×6次，每次之间热水冲洗；
(8)PBST 1:20倍稀释胶体金标记的羊抗兔IgG二抗，二抗液滴上孵育90min；
(9)PBGT液滴，5min×2次，每次之间热水冲洗；
(10)PBS-Glycine液滴，5min×2次，每次之间热水冲洗；
(11)双蒸水液滴，5min×2次，每次之间热水冲洗；
(12)增感液液滴，避光增感15min，热水冲洗；
(13)双蒸水液滴，5min×6次，每次之间热水冲洗；
(14)醋酸双氧铀液滴，染色15min，热水冲洗；
(15)双蒸水液滴，5min×6次，每次之间热水冲洗；
(16)吸干镍网上的水，样品面朝上放于滤纸上；
(17)日立Hitachi New-Bio TEM H-7500电子显微镜下观察拍照。
如图9所示，植原体细胞中出现典型的金颗粒，表明PaWB TDK多克隆抗体可用于免疫胶体金实验。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 菏泽学院
<120> 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用
<130> /
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 正向引物()
<400> 1
aagttctttt ggaccaacta tcac 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向引物()
<400> 2
atatgttgtt ggttgttatt ttcc 24
<210> 3
<211> 630
<212> DNA
<213> 泡桐丛枝植原体(Paulownia witches phytoplasma)
<400> 3
atgagccaaa aagaacaagg gcaaggtttt attgaagttg tttgtggacc aatgtttgca 60
ggcaaaacag aagcattaat tcaacgcagt aatcaagcat tacaactcaa caaaaaaatt 120
ttatccttta aaccacaaat agatgaccgt tattctgtta aagaagaaat agtttctcac 180
aatcaaaaca ctattcctgc tattttaatt gacaaaagca aagacattct cccgtttatt 240
actcccgaaa ttaatgttgt cataatagat gaagcccaat ttttagataa cgacattgtc 300
gctattgtag attatttagc taactgcaat attgaagtta ttatatcagg tttagaactt 360
gatttttgcg gaaaaccatt cggaccaatg ccttatttat tagcaattgc agacaccgtt 420
actaaattaa cttcaatttg tgctatcagt ggtaaaaaag ccaaccgcac tcaaagatta 480
attgacggca aacctgctca aagcaatgaa cctgttgttt tggtaggcgg aaaagaatac 540
cacgaacctc gttgtcgcaa acaccattgt ttagcagata ttgacaaaac aaaaattaac 600
tggcaaaact tcaccaacca atctaaataa 630
<210> 4
<211> 630
<212> DNA
<213> 泡桐丛枝植原体(Paulownia witches phytoplasma)
<400> 4
atgacccaaa aagaacaagg gcaagggttt attgaagttg tttgtggacc aatgtttgca 60
ggtaaaacag aagcattaat tcaacgcagt aatcaagcat tacaactcaa caaaaaaatt 120
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tggcaaaact tcaccaacca atctaaataa 630
<210> 5
<211> 209
<212> PRT
<213> 泡桐丛枝植原体(Paulownia witches phytoplasma)
<400> 5
Met Thr Gln Lys Glu Gln Gly Gln Gly Phe Ile Glu Val Val Cys Gly
1 5 10 15
Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Glu Ala Leu Ile Gln Arg Ser Asn Gln
20 25 30
Ala Leu Gln Leu Asn Lys Lys Ile Leu Ser Phe Lys Pro Gln Ile Asp
35 40 45
Asp Arg Tyr Ser Val Lys Glu Glu Ile Val Ser His Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Ile Pro Ala Ile Leu Ile Asp Lys Ser Lys Asp Ile Leu Pro Phe Ile
65 70 75 80
Thr Pro Glu Ile Asn Val Val Ile Ile Asp Glu Ala Gln Phe Leu Asp
85 90 95
Asn Asp Ile Val Ala Ile Val Asp Tyr Leu Ala Asn Cys Asn Ile Glu
100 105 110
Val Ile Ile Ser Gly Leu Glu Leu Asp Phe Cys Gly Lys Pro Phe Gly
115 120 125
Pro Met Pro Tyr Leu Leu Ala Ile Ala Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr
130 135 140
Ser Ile Cys Ala Ile Ser Gly Lys Lys Ala Asn Arg Thr Gln Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gly Lys Pro Ala Gln Ser Asn Glu Pro Val Val Leu Val Gly
165 170 175
Gly Lys Glu Tyr His Glu Pro Arg Cys Arg Lys His His Cys Leu Ala
180 185 190
Asp Ile Asp Lys Thr Lys Ile Asn Trp Gln Asn Phe Thr Asn Gln Ser
195 200 205
Lys
<210> 6
<211> 209
<212> PRT
<213> 泡桐丛枝植原体(Paulownia witches phytoplasma)
<400> 6
Met Ser Gln Lys Glu Gln Gly Gln Gly Phe Ile Glu Val Val Cys Gly
1 5 10 15
Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Glu Ala Leu Ile Gln Arg Ser Asn Gln
20 25 30
Ala Leu Gln Leu Asn Lys Lys Ile Leu Ser Phe Lys Pro Gln Ile Asp
35 40 45
Asp Arg Tyr Ser Val Lys Glu Glu Ile Val Ser His Asn Gln Asn Thr
50 55 60
Ile Pro Ala Ile Leu Ile Asp Lys Ser Lys Asp Ile Leu Pro Phe Ile
65 70 75 80
Thr Pro Glu Ile Asn Val Val Ile Ile Asp Glu Ala Gln Phe Leu Asp
85 90 95
Asn Asp Ile Val Ala Ile Val Asp Tyr Leu Ala Asn Cys Asn Ile Glu
100 105 110
Val Ile Ile Ser Gly Leu Glu Leu Asp Phe Cys Gly Lys Pro Phe Gly
115 120 125
Pro Met Pro Tyr Leu Leu Ala Ile Ala Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr
130 135 140
Ser Ile Cys Ala Ile Ser Gly Lys Lys Ala Asn Arg Thr Gln Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gly Lys Pro Ala Gln Ser Asn Glu Pro Val Val Leu Val Gly
165 170 175
Gly Lys Glu Tyr His Glu Pro Arg Cys Arg Lys His His Cys Leu Ala
180 185 190
Asp Ile Asp Lys Thr Lys Ile Asn Trp Gln Asn Phe Thr Asn Gln Ser
195 200 205
Lys
<210> 7
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Met Thr Gln Lys Glu Gln Gly Gln Gly Phe Ile Glu Val Val
35 40 45
Cys Gly Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Glu Ala Leu Ile Gln Arg Ser
50 55 60
Asn Gln Ala Leu Gln Leu Asn Lys Lys Ile Leu Ser Phe Lys Pro Gln
65 70 75 80
Ile Asp Asp Arg Tyr Ser Val Lys Glu Glu Ile Val Ser His Asn Gln
85 90 95
Asn Thr Ile Pro Ala Ile Leu Ile Asp Lys Ser Lys Asp Ile Leu Pro
100 105 110
Phe Ile Thr Pro Glu Ile Asn Val Val Ile Ile Asp Glu Ala Gln Phe
115 120 125
Leu Asp Asn Asp Ile Val Ala Ile Val Asp Tyr Leu Ala Asn Cys Asn
130 135 140
Ile Glu Val Ile Ile Ser Gly Leu Glu Leu Asp Phe Cys Gly Lys Pro
145 150 155 160
Phe Gly Pro Met Pro Tyr Leu Leu Ala Ile Ala Asp Thr Val Thr Lys
165 170 175
Leu Thr Ser Ile Cys Ala Ile Ser Gly Lys Lys Ala Asn Arg Thr Gln
180 185 190
Arg Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ala Gln Ser Asn Glu Pro Val Val Leu
195 200 205
Val Gly Gly Lys Glu Tyr His Glu Pro Arg Cys Arg Lys His His Cys
210 215 220
Leu Ala Asp Ile Asp Lys Thr Lys Ile Asn Trp Gln Asn Phe Thr Asn
225 230 235 240
Gln Ser Lys
<210> 8
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Met Ser Gln Lys Glu Gln Gly Gln Gly Phe Ile Glu Val Val
35 40 45
Cys Gly Pro Met Phe Ala Gly Lys Thr Glu Ala Leu Ile Gln Arg Ser
50 55 60
Asn Gln Ala Leu Gln Leu Asn Lys Lys Ile Leu Ser Phe Lys Pro Gln
65 70 75 80
Ile Asp Asp Arg Tyr Ser Val Lys Glu Glu Ile Val Ser His Asn Gln
85 90 95
Asn Thr Ile Pro Ala Ile Leu Ile Asp Lys Ser Lys Asp Ile Leu Pro
100 105 110
Phe Ile Thr Pro Glu Ile Asn Val Val Ile Ile Asp Glu Ala Gln Phe
115 120 125
Leu Asp Asn Asp Ile Val Ala Ile Val Asp Tyr Leu Ala Asn Cys Asn
130 135 140
Ile Glu Val Ile Ile Ser Gly Leu Glu Leu Asp Phe Cys Gly Lys Pro
145 150 155 160
Phe Gly Pro Met Pro Tyr Leu Leu Ala Ile Ala Asp Thr Val Thr Lys
165 170 175
Leu Thr Ser Ile Cys Ala Ile Ser Gly Lys Lys Ala Asn Arg Thr Gln
180 185 190
Arg Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ala Gln Ser Asn Glu Pro Val Val Leu
195 200 205
Val Gly Gly Lys Glu Tyr His Glu Pro Arg Cys Arg Lys His His Cys
210 215 220
Leu Ala Asp Ile Asp Lys Thr Lys Ile Asn Trp Gln Asn Phe Thr Asn
225 230 235 240
Gln Ser Lys
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 正向引物()
<400> 9
cgcggatcca tgacccaaaa agaacaaggg 30
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 反向引物()
<400> 10
ccgctcgagt tatttagatt ggttggtgaa g 31

Claims (4)

1.泡桐丛枝植原体胸苷激酶多克隆抗体，其特征在于，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的融合蛋白为免疫原免疫兔获得；所述的免疫原与佐剂混合乳化后进行免疫，分别在第1天、第21天和第35天进行免疫，初次免疫抗原为弗氏完全佐剂+蛋白抗原，后两次免疫抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；
所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
（1）将如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的泡桐丛枝植原体胸苷激酶的基因重组于pET-28a载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组载体；
（2）将步骤（1）制备的重组载体转入菌株Escherichia coli BL21(DE3)中，得到重组菌株；
（3）培养步骤（2）制备的重组菌株，通过IPTG诱导表达；
（4）目标蛋白的检测与纯化，纯化步骤用到的菌体裂解液和杂蛋白清洗液中加入1%NP-40和0.25% Tween-20。
2.根据权利要求1所述的泡桐丛枝植原体胸苷激酶多克隆抗体，其特征在于，所述的融合蛋白制备方法中用于构建步骤（1）中所述的重组载体的正向引物为tdkF-BamHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物为tdkR-XhoI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.权利要求1-2任一所述的泡桐丛枝植原体胸苷激酶多克隆抗体在泡桐丛枝植原体检测或植原体胸苷激酶检测中的应用。
4.一种泡桐丛枝植原体或植原体胸苷激酶的检测产品，其特征在于，所述的产品含有权利要求1-2任一所述的泡桐丛枝植原体胸苷激酶多克隆抗体，检测的方法为蛋白质免疫印记法、免疫荧光显微镜法或免疫电子显微镜法。
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