CN114099530B

CN114099530B - 2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷的新用途

Info

Publication number: CN114099530B
Application number: CN202111455707.8A
Authority: CN
Inventors: 赵行; 尹一佳; 王峥; 韩向龙; 陈谦明
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: CN114099530A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及2‑氨基‑2'‑氟‑2'‑脱氧腺苷的新用途。本发明首次提出将2‑氨基‑2'‑氟‑2'‑脱氧腺苷或其形成的水凝胶用于制备拔牙创填塞材料。2‑氨基‑2'‑氟‑2'‑脱氧腺苷或其形成的水凝胶具有快速降解、抑制巨噬细胞和破骨细胞的活动以及抗菌特性，因而其能够促进拔牙创口的愈合。本发明的2‑氨基‑2'‑氟‑2'‑脱氧腺苷水凝胶可用于制备拔牙创填塞材料，具有很好的应用前景。

Description

2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷的新用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷的新用途。

背景技术

牙拔除术是口腔颌面外科重要的手术之一，其主要是预防或治疗目的拔除阻生牙、牙体牙髓牙周疾病患牙及正畸牙等。阻生牙为最常见适应症，其中，第三磨牙阻生的发病率高大18％-32％。然而，拔牙术后常出现一些并发症，包括干槽症(发生率0.5％-32.5％)、拔牙创感染(发病率0.9％-4.2％) 和出血(发病率0.2％-1.5％)。

目前，临床常用的拔牙创填塞材料包括明胶海绵和氧化纤维素。二者均有促进血凝块形成，加速止血的作用。然而，这些填塞材料不具有抗菌性能，不能防止拔牙创术后感染。不仅如此，明胶海绵和氧化纤维素在体内降解慢，残留的材料常会引起异物反应，延缓拔牙创愈合。因此，目前本领域的研究聚焦于开发新型的拔牙创填塞材料。理想的拔牙创填塞材料必须具有以下特点：高强度、可注射、生物相容性、抗菌性、止血性以及促进拔牙创愈合的能力。

水凝胶是一类软湿材料。由于其结构和组成与天然细胞外基质相似，已广泛应用于生物医学工程领域。兼具高强度和可注射性的水凝胶是在承重组织的微创或无创治疗的理想候选材料，比如软骨组织工程和骨缺损治疗。因而水凝胶也是一种很有潜力的拔牙创填塞材料。然而，迄今为止开发的大多数高强度水凝胶在剪切过程中出现的不可逆键的断裂，使得他们的剪切稀化和可注射性差。因此开发一种兼具高机械强度和优良剪切稀化可注射性的水凝胶是一项艰巨挑战。

2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷是一种抗病毒感染化合物2’-氟-2’-脱氧鸟苷的前体其结构式如下：

目前，对于2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷在拔牙创填塞材料中的用途尚未见到相关报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷及其水凝胶在制备拔牙创填塞材料中的新用途。

本发明提供2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷在制备拔牙创填塞材料中的用途。

本发明还提供2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷水凝胶在制备拔牙创填塞材料中的用途。

优选的，所述水凝胶中，2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷的浓度为质量百分数 1.7-5.0％。

优选的，所述水凝胶是方法通过如下方法制备得到：将2-氨基-2’-氟-2’- 脱氧腺苷溶解在水中制成水溶液，加热，然后自然冷却，即得。

优选的，所述加热的温度为80-100℃。

本发明还提供一种拔牙创填塞材料，它是以2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷或 2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷的水凝胶为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。

优选的，所述拔牙创填塞材料的剂型为注射剂。

优选的，所述加热的温度为80-100℃。

本发明首次提出将2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷或其形成的水凝胶用于制备拔牙创填塞材料。实验发现，2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷水凝胶具有足够强的机械强度和可注射性，使得其能够通过注射填充拔牙后的拔牙创。同时，动物实验证明，2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷水凝胶相比阳性对照明胶海绵具有快速降解、抑制巨噬细胞和破骨细胞的活动的特性，可更好地促进拔牙创愈合，显示出作为拔牙创愈合生物材料的良好前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1中制备的2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷水凝胶的照片和性能测试结果，其中，a)不同浓度2-FA在PBS中溶解组装的水凝胶照片(浓度分别为1.7wt％,2.5wt％,5.0wt％)。b)2-FA形成长时间稳定的超分子水凝胶，浓度为5.0wt％。c)2-FA的CD图像；d)不同浓度的2-FA制备的水凝胶的SEM和AFM图像。e,f,g)不同浓度的2-FA在PBS中的机械性能，h)5.0wt％的2-FA水凝胶加入ThT或甲基蓝，i)5.0wt％的2-FA水凝胶，厚度约为1cm。

图2为实施例2中的可注射性测试实验，其中，a,b)2-FA在PBS中不同浓度(a,2.5wt％；b,5.0wt％)的循环应变时间扫描流变学结果，等待时间分别为30min，5min。c)流变曲线，剪切率0.1-100s^-1，25℃。d)可注射性模式图。e)剪切稀化注射性凝胶的照片，良好的书写能力。f,g)用注射器注射2.5wt％f)和5.0wt％g)水凝胶的可注射性测试。

图3为实施例3中2-FA与MC3T3-E1和RAW 264.7的体外生物相容性，其中，a)用梯度浓度的2-FA培养MC3T3-E1和RAW 264.7，显示活细胞(绿色)和死细胞(红色)。b)通过alarma Blue检测法对MC3T3-E1和RAW 264.7 与梯度浓度的2-FA培养1、2、3天的细胞增殖情况进行定量分析。比例尺＝500μm。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.001。

图4为实施例4中体内注射2-FA水凝胶可促进大鼠第一磨牙拔牙模型的牙槽骨愈合情况，其中，a)实验性小鼠拔牙模型。4周大的SD大鼠麻醉后固定下颌骨，拔除双侧上颌第一磨牙。在拔牙窝内局部注射2-FA水凝胶 (2.5wt％)作为实验组。明胶海绵作为阳性对照，PBS作为阴性对照。b) 石蜡包埋的上颌骨经H&E染色后进行切片。黑色星形符号：炎症层。白色星形符号：血凝块。红色星形符号：肉芽组织。黄色星形符号：编织骨。黑色箭头：明胶海绵。黄色箭头：临时基质。Clot：血凝块。GT：肉芽组织。 IL：炎症层。PCT：临时基质。MB：矿化骨。BM：骨髓。*P<0.05.比例尺＝100μm。

图5为实施例4中2-FA水凝胶调控拔牙创愈合过程的研究，其中，a)上颌骨切片进行TRAP染色。b)测量TRAP⁺多核破骨细胞数量(N.Oc/BS)； c)石蜡包埋的上颌骨切片进行CD68染色。d)石蜡包埋的上颌骨切片进行 CD31染色。e)定量分析CD68⁺细胞数量。f)定量分析CD31⁺血管的相对面积。黑色箭头：明胶海绵。蓝色箭头。CD68⁺细胞。*P<0.05.比例尺＝100 μm。

具体实施方式

以下实施例中未特别说明的试剂或材料均为市售品。

实施例1 2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷(2-FA)水凝胶的制备及其机械强度本实施例通过如下方法制备2-FA水凝胶：

步骤1、配制1.7wt％、2.5wt％、5.0wt％的2-FA水溶液；

步骤2、加热至100℃，得到澄清透明的溶液；

步骤3、将所述溶液室温下自然冷却可得到乳白色的2-FA水凝胶。制成的2-FA水凝胶外观如图1h-i所示(其中图1h的样品为了方便观察，在步骤 1中还加入了ThT或甲基蓝)。

将装有上述2-FA水凝胶的小瓶倒置观察其流动性，结果如图1a-b所示，不同浓度的2-FA可自组装形成超分子水凝胶，从而不具有流动性。其中，5 wt％浓度的2-FA在10个月仍保持稳定的固态。

圆二色谱如图1c所示，从图中可以看到水凝胶二级结构的形成，并且将溶剂从dH2O改为磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered salin，PBS)并不影响超分子结构的手性，表明离子环境对其微观结构影响很小。

扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)和原子力显微镜(atomic forcemicroscopy，AFM)如图1d所示，从图中可以看到，水凝胶的三维多孔网络是由包含众多纳米纤维的树枝状或网状结构组成的光滑成员状结构形成的。此外，交联密度随着浓度的增加而增加，导致孔径的减少。这一结果证实了2-FA水凝胶中纤维结构的存在。

流变学测试如图1e-f，结果表明2-FA水凝胶具有很高的模量，在浓度为 2.5wt.％时大于0.1MPa，在5.0wt.％时大于1MPa。2-FA水凝胶的压缩应力 -应变曲线如图1g所示，从图中看到2-FA水凝胶能够承受压缩而不断裂，且随着浓度的增加，可以抵抗更高的压缩应力。

以上结果表明，本发明的2-FA水凝胶可以快速自组装成高强度和稳定的水凝胶，并具有塑形能力。

实施例2 2-FA水凝胶的剪切稀化可注射性

本实施例采用流变测试评估实施例1制备的2-FA水凝胶的自愈能力，从而研究其可注射性。

图2a-b展示了在交替应变变化中，2-FA水凝胶模量的变化情况。可以看到，随着交替应变的变化，2-FA水凝胶模量始终可回复其初始值。同时，该水凝胶显示了良好的剪切稀化性能(图2c)。

图2d-g展示了在体外进行可注射实验时，水凝胶在针管内成胶，通过针头注射剪切稀化为液体后具有可书写性。同时，注射入小瓶内，2.5wt％水凝胶在18min后能成胶，5.0wt％水凝胶则可立即成胶(图2e-g)。

以上结果表明，2-FA水凝胶可剪切稀化，且能够快速地自愈，在被剪切后可以快速且完全恢复其原始模量。因而，2-FA水凝胶适合作为注射剂使用。

实施例3 2-FA体外生物相容性

本实施例采用活/死细胞染色和alarma Blue检测评估实施例1制备的 2-FA水凝胶应用于拔牙创的生物相容性。

具体方法为：消化、重悬、计数后，将5×10⁴个/mL MC3T3-E1或RAW 264.7细胞分别接种于24孔板，每孔接种1mL。在细胞贴壁生长后，每孔分别加入对照组和实验组液体。设置PBS为对照组，0.05mM、0.1mM、1mM、 2.5mM、5mM 2-FA为实验组，上述细胞在1培养1、2、3天时收样，进行活/死细胞染色和alarma Blue检测。活/死细胞染色采用活/死细胞染色试剂盒 (Calcein AM，PI法)。按照试剂说明书，两种广泛常用的荧光探针Calcein AM和PI染色细胞。活细胞可被Calcein AM染为绿色，而死细胞则被PI染为红色。染色后与荧光显微镜下采图。alarma Blue检测采用alarma Blue试剂盒，按照试剂说明书，将上述细胞在培养1、2、3天后使用含10％alarma Blue 的染液孵育1小时，使用酶标仪测定荧光OD值(激发光和发射光分别是560 nm和590nm)。

结果如图3所示，2-FA浓度超过1mM对两种类型的细胞都有毒性。此外，Raw264.7细胞对2-FA更敏感，因为在浓度等于或高于1mM时，它们的增殖率与阴性对照的增殖率相比，在共培养3天后被强烈抑制到55.77％以下。在浓度低于1mM时，在两个细胞系中只检测到少量的死细胞，它们的增殖率不受影响，这表明在2-FA浓度低于1mM时具有良好的生物相容性。

实施例4 2-FA体内应用促进拔牙创愈合

为进一步确定2-FA体内生物学应用，本实施例进行动物实验。

一、实验方法

建立了上颌第一磨牙(M1)拔牙大鼠模型。如图4a所示，M1拔除后，立即在拔牙窝内注射实施例1制备的2.5wt％的2-FA水凝胶(2-FA凝胶组)。对照组大鼠注射相同体积的PBS(NC组)或用明胶海绵填充(明胶海绵组)。在术后1、3、14、21天收样，每组3只。大鼠过量麻醉处死后，取大鼠双侧上颌骨，固定、脱钙、脱水后石蜡包埋切片。对石蜡切片行H&E染色、Movat Pentachrome染色、Trap染色、IHC染色。并对染色结果进行定量分析。

H&E染色：对石蜡切片行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化处理后，使用苏木精染液染色10s后流水冲洗10min。再使用伊红染液染色1min后冲洗30s。最后梯度酒精脱水后，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜采图扫描分析。

Movat Pentachrome染色：对石蜡切片行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化处理后，阿利新蓝染色(切片入1％阿利新蓝溶液染色15min)，分化(切片入提前在60℃预热30min的碱性乙醇中3-5s，自来水洗，镜检至阳性部位呈蓝色背景近乎无色即可，或者无阳性时，组织无蓝色着色)；EVG染色(免疫组化笔画圈圈住组织，滴加EVG染色液染色5min，用盛装自来水的洗瓶轻轻冲洗组织，洗净染液，切片入5％FeCl3溶液中快速分化2s，自来水洗终止分化，反复分化水洗和镜检，至弹力纤维呈黑色且清晰，背景近无色)；番红O/酸性品红染色(切片入番红O/酸性品红工作液染色4min，自来水洗 10s)，分化：1％磷钼酸染2min，切片不水洗直接入1％的冰醋酸分化4min；天狼猩红染色(自来水稍洗10s，切片入天狼猩红染液染色2min)；最后梯度酒精脱水后，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜采图扫描分析。

Trap染色：对石蜡切片行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化处理后，使用Trap 染色液(配置50mM酒石酸钠与0.1M醋酸钠缓冲液，调节pH＝5；使用N,N- 二甲基甲酰胺溶解萘酚AS-TR磷酸酯40mg/mL；将1mL萘酚AS-TR磷酸酯加入200mL 50mM酒石酸钠与0.1M醋酸钠缓冲液，再加入60mg固红紫色LB盐，充分溶解后获得)常温染色切片，显微镜下观察，直至出现紫红色的Trap阳性信号，自来水清洗切片30s后，使用甲基绿染液染色1min，自来水洗净染液，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜采图扫描分析。

IHC染色：对石蜡切片行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化处理后，根据条件使用酸性或碱性抗原修复液进行微波抗原修复，10％过氧化氢溶液孵育30 min灭活内源性过氧化氢酶，含10％FBS的PBS作为封闭液进行封闭，含 CD31或CD68一抗的(1：1000)的封闭液4℃孵育过夜，二抗孵育60min 后DAB显色；最后梯度酒精脱水后，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜采图扫描分析。

二、实验结果

在拔牙后的21天(PED21)，观察三个实验组大鼠的创口表面，如图 4b所示，可以看到三组的创口表面都有完整和健康的结缔组织和上皮组织，也能看到一些免疫细胞的浸润。然而，2-FA凝胶组的矿化骨(即编织骨)的比例最高，临时结缔组织(PCT)的比例最低。PCT是富含间质细胞的结缔组织。大部分PCT会矿化成编织骨。2-FA水凝胶组的拔牙窝由92.9％的编织骨(黄色星型)和6.9％的PCT(黄色箭头)组成，而NC组和明胶海绵组的编织骨比例仅为83.7％和72.8％。这些结果表明，注射水凝胶后可以实现更完整的骨愈合。

此外，从图4b、d中可以看到，2-FA凝胶组和NC组的提取窝内主要是血凝块(白色星型；58.7％)和一层炎症细胞(黑色星型；分别为26.0％和 27.1％)，而在明胶海绵组，明胶海绵(黑色箭头；57.1％)充满了提取窝，血细胞更加分散。在PED3，肉芽组织(GT)，即含有免疫细胞的高度血管化组织，部分取代了三组的血块(红色星型)。然而，在海绵组的拔牙窝中仍有一些残留的明胶海绵(黑色箭头；19.1％)。Movat染色可区分不同的组织类型。Movat染色的结果与HE染色的结果一致(图4c)。值得注意的是， 2-FA凝胶组观察到大面积血凝块内的几个水凝胶碎片(染色为浅黄绿色，红色箭头)(PED1为0.7％，PED3为0.5％)，而PED1和PED3的拔牙窝内仍有大量的明胶海绵(染色为黑色)(黑色箭头；PED1为57.1％，PED3为 19.1％)。含有生长因子和细胞因子的血凝块在骨再生中起着重要作用。拔牙后初始阶段的血凝块部分或全部丢失是导致牙槽骨炎的一个主要原因。明胶海绵填充物在愈合过程的初始阶段降低了细胞密度和生长因子及细胞因子的浓度，阻碍了愈合。而本发明的2-FA水凝胶则没有这样的问题。

根据图5a-b所示的结果，在PED1时，三组的破骨细胞数量相似(绿色箭头)。然而，在PED3和PED21，与NC组和明胶海绵组相比，2-FA凝胶组的成骨细胞数量明显减少。值得注意的是，在PED21，2-FA凝胶组的拔牙窝周围几乎没有Trap⁺细胞，证实了骨的完全愈合。作为促进骨重塑和完全骨愈合的一种手段，将克洛膦酸盐应用于拔牙窝后，克洛膦酸钠可以消耗巨噬细胞，由于Trap⁺破骨细胞的减少，导致小梁骨体积分数的增加。2-FA可能对巨噬细胞有类似的作用，导致更彻底的拔牙窝愈合。

最后，2-FA可能会损害牙槽愈合的炎症过程。在PED3时，2-FA凝胶组的炎症层比例明显较少(1.9％，其他组为22.4％)。CD68是M1巨噬细胞的表面标记，用于进一步评估拔牙窝的炎症情况。CD68⁺细胞参与炎症浸润，并对骨质平衡有积极的调节作用。NC组和2-FA凝胶组的CD68+细胞的数量显示出类似的趋势，即CD68的表达在拔牙后的早期阶段增加，在完全愈合后减少(图5c，e)。然而，与NC组相比，2-FA凝胶组在PED1和PED3 表现出明显较高的CD68激活，而在PED21表现出较低的CD68激活，这与破骨细胞活性结果一致(图5e，f)。这可能是因为2-FA对巨噬细胞和破骨细胞都有抑制作用。因此，较少的CD68⁺巨噬细胞会导致更快的愈合过程和更完整的骨愈合。值得注意的是，在明胶海绵组中观察到几个CD68⁺细胞，围绕着明胶海绵的残余物(黑色箭头)，这表明残余物可能影响拔牙窝内炎症细胞的消除，从而阻止其愈合(蓝色箭头)。因此，2-FA可以在一定程度上保护拔牙窝免受感染，并促进骨愈合。此外，CD31是血管内皮细胞的表面标志物。三组都表现出相似CD31⁺区域(图5g，f)。因此，拔牙窝愈合期间的血管生成过程不受明胶海绵或2-FA水凝胶的影响。

通过本实施例的实验可以看到，2-FA水凝胶具有快速降解、抑制巨噬细胞和破骨细胞的活动，能够促进拔牙创口的愈合，且其效果优于阳性对照明胶海绵。

通过上述实施例可以看到，2-氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷可形成具有良好机械性能和可注射性的水凝胶，且该水凝胶具有快速降解、抑制巨噬细胞和破骨细胞的活动以及抗菌特性，因而其能够促进拔牙创口的愈合。本发明的2- 氨基-2’-氟-2’-脱氧腺苷水凝胶可用于制备拔牙创填塞材料，具有很好的应用前景。

Claims

1.2-氨基-2'-氟-2'-脱氧腺苷水凝胶在制备拔牙创填塞材料中的用途。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述水凝胶中，2-氨基-2'-氟-2'-脱氧腺苷的浓度为质量百分数1.7-5.0 %。

3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述水凝胶是通过如下方法制备得到：将2-氨基-2'-氟-2'-脱氧腺苷溶解在水中制成水溶液，加热，然后自然冷却，即得。

4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于：所述加热的温度为80-100 ℃。