CN114097768A - 一种骨髓干细胞用保护液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓干细胞用保护液，由以下原料组成：0.9%氯化钠注射液、酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2。本发明提供的骨髓干细胞用保护液，添加酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素协同作用，实现了骨髓干细胞在4‑6℃保存72h，细胞活率在89%以上，可以满足科研和临床的使用需求，为骨髓干细胞的临时保存及运输提供便利。采用本发明保护液保存的骨髓干细胞增殖能力不受影响，保存的细胞可以继续用于增殖分化等。本发明还提供了上述骨髓干细胞保护液的制备方法，过程简单，易于操作，便于产品商业化。本发明还提供了上述保护液的应用，将其用于骨髓干细胞的保存中，安全无毒，方便保存运输，为骨髓干细胞的临床应用提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种骨髓干细胞用保护液及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。 MSCs广泛存在于骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水和脐带等组织或器官中，具有强大的增殖能力和分化能力，且免疫源性低，具有广阔的应用前景。
骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向诱导分化能力，具有来源广泛、获取简单、易于培养、体外增殖能力强和自体移植无排斥反应等特点，广泛应用于组织工程及再生医学领域，被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。
在临床应用中，由于种种原因制备的骨髓间充质干细胞不能立即应用，需要在保护液中暂存。液氮中超低温冻存可以保证细胞活性，但是低温冻存操作复杂，在临床应用中有诸多不便。对于只需要短时间保存的细胞操作成本较高。对于有运输要求的骨髓干细胞采用液氮超低温保存对运输设备要求较好，不易实现骨髓干细胞的快速转运。近年来各种可在低温下实现骨髓干细胞保存的保存液也陆续出现，但是普遍存在各种各样的问题，如保存时间短，细胞存活率低等，限制了骨髓干细胞的应用。
因此，有必要研究一种新的保存液，实现骨髓干细胞在4-6℃下的保存，并且保证细胞的存活率，为骨髓干细胞的短时间保存及运输提供便利。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种骨髓干细胞用保护液，无需液氮冻存，可以保证骨髓干细胞在短时间内的活性，为骨髓干细胞的临时保存及运输提供便利。
本发明的目的之二在于提供一种骨髓干细胞用保护液的制备方法。
本发明的目的之二在于提供一种骨髓干细胞保护液的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种骨髓干细胞用保护液，由以下原料组成：0.9%氯化钠注射液、酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2。
进一步地，各组分用量的重量份为：0.9%氯化钠注射液75-85份、酸枣仁皂甙A1-2.5份、葡甲胺2-4份、虫草素1-5份、透明质酸钠5-8份、维生素B2 0.5-0.8份。
进一步地，各组分用量的重量份为：0.9%氯化钠注射液80份、酸枣仁皂甙A1.5份、葡甲胺3份、虫草素2份、透明质酸钠6份、维生素B2 0.7份。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述骨髓干细胞用保护液的制备方法，包括以下步骤：将酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2加入到0.9%氯化钠注射液中，混合均匀，经0.22µm滤膜过滤，即得。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述保护液的应用，将保护液用于骨髓干细胞的保存中。
进一步地，上述应用包括将保护液预冷至4-6℃，加入骨髓干细胞，然后在4-6℃的条件下保存。
进一步地，所述骨髓干细胞在保护液中的浓度为1-5×106个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种骨髓干细胞用保护液，添加酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素协同作用，实现了骨髓干细胞在4-6℃保存72h，细胞活率在89%以上，可以满足科研和临床的使用需求，为骨髓干细胞的临时保存及运输提供便利。采用本发明保护液保存的骨髓干细胞增殖能力不受影响，保存的细胞可以继续用于增殖分化等。
2、本发明提供的保护液成分简单，性能稳定，不添加成分复杂的培养基及DMSO等有安全隐患的成分，有效保护骨髓干细胞的活性，避免细胞凋亡。
3、本发明还提供了上述骨髓干细胞保护液的制备方法，过程简单，易于操作，便于产品商业化。
4、本发明还提供了上述保护液的应用，将其用于骨髓干细胞的保存中，安全无毒，方便保存运输，为骨髓干细胞的临床应用提供保障。
附图说明
图1为本发明实施例1中保存72h的骨髓干细胞和对照组未经保存的骨髓干细胞的增殖曲线。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1至3中所用骨髓干细胞的制备过程如下：使用颈椎脱臼法将6-8周的SD大鼠处死后取股骨和胫骨，用PBS冲洗骨髓腔，收集骨髓液，将收集的骨髓液经过滤，1200r/min离心5min，弃去上清，加入红细胞裂解液10ml，裂解5min，加入等量的PBS1000r/min离心10min，去上清，以1×106/mL的密度接种到完全培养基中，于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，2d 后换液，取P3代骨髓干细胞用于后续实验。
实施例1
一种骨髓干细胞用保护液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：0.9%氯化钠注射液80份、酸枣仁皂甙A1.5份、葡甲胺3份、虫草素2份、透明质酸钠6份、维生素B2 0.7份。
上述骨髓干细胞用保护液的制备方法，包括以下步骤：将酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2加入到0.9%氯化钠注射液中，混合均匀，经0.22µm滤膜过滤，即得。
上述骨髓干细胞保护液的应用，将保护液分装在无菌管中在冰箱中预冷至4℃，然后加入P3代骨髓干细胞，细胞密度为1×106个/mL，继续放在4℃的冰箱中保存72h。
实施例2
一种骨髓干细胞用保护液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：0.9%氯化钠注射液75份、酸枣仁皂甙A 1份、葡甲胺2份、虫草素1份、透明质酸钠5份、维生素B2 0.5份。
上述骨髓干细胞用保护液的制备方法，包括以下步骤：将酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2加入到0.9%氯化钠注射液中，混合均匀，经0.22µm滤膜过滤，即得。
上述骨髓干细胞保护液的应用，将保护液分装在无菌管中在冰箱中预冷至6℃，然后加入P3代骨髓干细胞，细胞密度为3×106个/mL，继续放6℃的冰箱中保存72h。
实施例3
一种骨髓干细胞用保护液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：0.9%氯化钠注射液85份、酸枣仁皂甙A 2.5份、葡甲胺4份、虫草素5份、透明质酸钠8份、维生素B2 0.8份。
上述骨髓干细胞用保护液的制备方法，包括以下步骤：将酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2加入到0.9%氯化钠注射液中，混合均匀，经0.22µm滤膜过滤，即得。
上述骨髓干细胞保护液的应用，将保护液分装在无菌管中在冰箱中预冷至6℃，然后加入P3代骨髓干细胞，细胞密度为5×106个/mL，继续放在4℃的冰箱中保存72h。
对比例1
对比例1提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：省去酸枣仁皂甙A，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：省去酸枣仁皂甙A，将葡甲胺的用量调整为4.5份，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：省去葡甲胺，将酸枣仁皂甙A的用量调整为4.5份，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：将葡甲胺替换为山梨醇，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：省去虫草素，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种骨髓干细胞保护液，和实施例1的区别为：将虫草素替换为腺苷，其余均和实施例1相同。
在实施例1至3，对比例1至6中骨髓干细胞保存过程中，分别在保存24h、48h和72h取样，加入0.4%的台盼蓝进行染色，采用细胞计数器统计活细胞和死亡细胞的数量，计算细胞的存活率，结果如表1所示。
表1
| 样品 | 保存24h细胞存活率 | 保存48h细胞存活率 | 保存72h细胞存活率 |
| 实施例1 | 98.45% | 94.03% | 90.43% |
| 实施例2 | 97.67% | 93.92% | 89.25% |
| 实施例3 | 97.70% | 93.88% | 89.32% |
| 对比例1 | 78.92% | 52.59% | 35.49% |
| 对比例2 | 85.74% | 68.49% | 52.37% |
| 对比例3 | 88.93% | 75.49% | 61.01% |
| 对比例4 | 86.79% | 71.28% | 54.32% |
| 对比例5 | 82.43% | 62.91% | 40.29% |
| 对比例6 | 89.75% | 77.59% | 62.21% |
由表1可以看出：实施例1至3中骨髓干细胞随着保存时间的延长，细胞的存活率有轻微下降，在保存72h后细胞存活率在89%以上，可以满足实验和临床的需求。对比例1至6中调整了保护液的成分，经保存后的细胞存活率下降显著。
对比例1中省去了酸枣仁皂甙A，制备的保护液在用于骨髓干细胞的保存，随着保存时间的延长，细胞的存活率下降明显，在保存72h后细胞的存活率仅为35.49%，说明保护液中的酸枣仁皂甙A对维持细胞活性，避免细胞死亡发挥重要作用。
对比例2中省去了酸枣仁皂甙A，并调整了葡甲胺的用量，对比例3中省去了葡甲胺，调整了酸枣仁皂甙A的用量，对比例4中将葡甲胺替换为山梨醇，保存液中的细胞存活率和实施例1相比仍然较低，说明葡甲胺可以和酸枣仁皂甙A协同发挥作用，为细胞的保存提供稳定的外环境，保证细胞的存活率。
对比例5中省去了虫草素，对比例6中将虫草素替换为腺苷，对比例6和对比例5相比细胞的存活率有一定程度的提高，但是，对比例6在保存72h后细胞的存活率还是下降至62.21%，不能满足骨髓干细胞的使用需求。
综上，可知本发明的保护液中通过添加添加酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素协同作用，实现了骨髓干细胞在4-6℃保存72h，细胞活率还在89%以上，满足科研和临床的使用需求，为骨髓干细胞的临时保存及运输提供便利。
取实施例1中保存72h后的骨髓干细胞，将未经保存的P3代骨髓干细胞作为对照组，接种在含有10%FBS，1%双抗的DMEM/F12培养基中，细胞密度为1×104个/mL，将接种细胞的12孔板放入37℃，5%CO2的培养箱中培养7天，每天统计骨髓干细胞的数量，绘制细胞生长曲线，结果如图1所示。
由图1可以看出经过本发明保护液保存后的骨髓干细胞和未经保存的骨髓干细胞相比增殖速度和增殖数量相差不大，说明本发明提供的保护液能有效维持骨髓干细胞的增殖活性，充分满足骨髓干细胞的应用需求。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种骨髓干细胞用保护液，其特征在于，由以下原料组成：0.9%氯化钠注射液、酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2。
2.根据权利要求1所述骨髓干细胞用保护液，其特征在于，各组分用量的重量份为：0.9%氯化钠注射液75-85份、酸枣仁皂甙A1-2.5份、葡甲胺2-4份、虫草素1-5份、透明质酸钠5-8份、维生素B2 0.5-0.8份。
3.根据权利要求2所述骨髓干细胞用保护液，其特征在于，各组分用量的重量份为：0.9%氯化钠注射液80份、酸枣仁皂甙A1.5份、葡甲胺3份、虫草素2份、透明质酸钠6份、维生素B2 0.7份。
4.如权利要求1至3任一项所述骨髓干细胞用保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将酸枣仁皂甙A、葡甲胺、虫草素、透明质酸钠、维生素B2加入到0.9%氯化钠注射液中，混合均匀，经0.22µm滤膜过滤，即得。
5.如权利要求1至4任一项所述保护液的应用，其特征在于，将保护液用于骨髓干细胞的保存中。
6.根据权利要求5所述保护液的应用，其特征在于，将保护液预冷至4-6℃，加入骨髓干细胞，然后在4-6℃的条件下保存。
7.根据权利要求6所述保护液的应用，其特征在于，所述骨髓干细胞在保护液中的浓度为1-5×106个/mL。
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- 2021-11-24 CN CN202111404794.4A patent/CN114097768A/zh active Pending
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