CN114080398B

CN114080398B - 包含IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域且具有高唾液酸含量的多肽二聚体及包含其的药物组合物

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Publication number: CN114080398B
Application number: CN202080049890.9A
Authority: CN
Inventors: 张明浩; 梁甫伎; 李炅和
Original assignee: Gi Medical Micro New
Current assignee: Gi Medical Micro New
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: BR112022000246A2; EP3998279A1; CN114080398A; KR102561135B1; JP7579815B2; ZA202200738B; CA3145382A1; PE20220098A1; TWI764191B; PH12022550043A1; IL289679A; US20220257693A1; KR20210006293A; IL289679B1; TW202116799A; AU2020310003A1; EP3998279A4; JP2022539684A; WO2021006599A1; KR20230115283A

Abstract

本发明涉及经修饰的具有高唾液酸含量的IgE Fc受体和包含其的药物组合物。根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体不仅相比于常规使用的抗IgE抗体在体内具有优异的安全性和持久性，而且与IgE的结合非常强，这具有延长给药周期的优点。此外，根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体是IgE单一靶向物质，并且不同于应用IgG1的Fc的常规抗IgE抗体，该多肽二聚体不结合Fcγ受体。因此，该多肽二聚体可抑制由于与肥大细胞表面上的Fcγ受体结合而引起的介质释放，从而可使严重的副作用诸如严重过敏反应的发生概率最小化，该严重过敏反应可由IgG1和肥大细胞上的Fcγ受体III之间的结合引起。此外，该具有高唾液酸含量的多肽二聚体即使在皮下给药的情况下也能维持血液中的高浓度。因此，根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体可有效地用于预防或治疗过敏性疾病。

Description

包含IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域且具有高唾液酸含量的多肽二聚体及包含其的药物组合物

技术领域

本发明涉及包含IgE Fc受体并具有高唾液酸含量的多肽二聚体和包含该多肽二聚体的药物组合物。

背景技术

随着现代社会的工业化和饮食习惯的西方化，过敏性鼻炎、特应性皮炎和食物过敏等过敏性疾病(包括哮喘)的发病率正在增加。严重过敏反应是一种严重的过敏性疾病，其发生率也在不断上升。这些慢性免疫疾病严重损害个体的生活质量，相应地社会经济成本也急剧增加。因此，迫切需要战胜这些疾病的措施。

大多数过敏性疾病是由免疫球蛋白E(IgE)的过度免疫应答引起的。IgE是一种在正常条件下以极低浓度存在于血液中的抗体。IgE通常也是由无害抗原产生。有一种情况是IgE的数量增加而没有任何特殊的刺激物。这种情况可能导致过敏性疾病。异常增加量的IgE可结合在肥大细胞(mast cell)、嗜碱性粒细胞(basophils)等的表面上表达的高亲和性IgE Fc受体(FcεRI)。这种结合导致肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放化学介质，诸如组胺、白三烯、前列腺素、缓激肽和血小板活化因子。这些化学介质的释放导致过敏症状。特别地，由于IgE和FcεRI之间的结合，过敏性疾病可表现出恶化的症状。此外，已知在过敏性患者中表达FcεRI的细胞增加。

目前，已经提出了各种方法来治疗过敏性疾病，诸如避免过敏原、施用抗过敏药物、调节体内IgE合成和开发抗IgE抗体。然而，现有方法仍然存在许多缺点，诸如药效不足和发生严重的副作用。最近，研究了能够以高亲和力结合IgE和FcγRIIb并抑制表达膜锚定IgE的细胞的组合物。据报道，该组合物可用于治疗IgE介导的疾病，包括过敏和哮喘(KR10-1783272B)。

特别地，开发了靶向IgE抗体的Fc部分的奥马珠单抗(omalizumab)(商品名：Xolair)，用作难治性重症哮喘和难治性荨麻疹的治疗剂。然而，高剂量施用奥马珠单抗以维持治疗效果导致高成本负担并带来副作用，诸如血管性水肿和过敏反应(Journal ofClinical Research，第99卷，第5号，1997年3月，第915-925页。此外，从上市后的结果来看，已经报道了严重的不良反应，诸如过敏性肉芽肿性血管炎和特发性严重血小板减少症。

发明详述

技术问题

因此，本发明人进行了研究以开发安全有效的过敏性疾病治疗剂。结果，发现在包含两个含有IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域(FcεRIα-ECD)的单体的多肽二聚体的唾液酸含量高时，上述多肽二聚体对IgE具有优异的结合亲和力并在血液中保持高浓度。特别地，通过确定即使当具有高唾液酸含量的多肽二聚体皮下给药时，也可能有效递送到体内也，本发明得以完成。

问题的解决方案

本发明的一个方面提供了包含两个含有IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域(FcεRIα-ECD)的单体的多肽二聚体，其中唾液酸/多肽二聚体的摩尔比至少为8。

本发明的另一方面提供了预防或治疗过敏性疾病的药物组合物，该药物组合物包含具有高唾液酸含量的多肽二聚体。

本发明的另一方面提供了一种包含该药物组合物的透皮贴剂。

本发明的另一方面提供了包含该药物组合物的局部贴剂。

本发明的另一方面提供了具有高唾液酸含量的多肽二聚体用于预防或治疗过敏性疾病的用途。

发明效果

根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体不仅相比于常规使用的抗IgE抗体在体内具有优异的安全性和持久性，而且与IgE的结合非常强，这具有延长给药周期的优点。此外，根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体是IgE单一靶向物质，并且不同于应用IgG1的Fc的常规抗IgE抗体，该多肽二聚体不结合Fcγ受体。因此，该多肽二聚体可抑制由于与肥大细胞表面上的Fcγ受体结合而引起的介质释放，从而可使严重的副作用诸如严重过敏反应的发生概率最小化，该严重过敏反应可由IgG1和肥大细胞上的Fcγ受体III之间的结合引起。此外，该具有高唾液酸含量的多肽二聚体即使在皮下给药的情况下也能维持血液中的高浓度。因此，根据本发明的具有高唾液酸含量的多肽二聚体可有效地用于预防或治疗过敏性疾病。

附图说明

图1为示出通过SDS-PAGE确定在每个细胞系中产生的多肽二聚体的结果的图。

图2为示出根据一个实施方案的多肽二聚体的非还原形式和还原形式的SDS-PAGE结果的图。

图3为示出奥马珠单抗对IgE结合亲和力的图。

图4为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)对IgE的结合亲和力的图。

图5a为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗对IgGFcγ受体I(FcγRI)的结合亲和力的图。

图5b为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗对IgGFcγ受体IIA(FcγRIIA)的结合亲和力的图。

图5c为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗对IgGFcγ受体IIB(FcγRIIB)的结合亲和力的图。

图5d为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗对IgGFcγ受体IIIA(FcγRIIIA)的结合亲和力的图。

图5e为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗对IgGFcγ受体IIIB(FcγRIIIB)的结合亲和力的图。

图6为通过定量根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)或奥马珠单抗与IgG Fcγ受体之间的结合亲和力而获得的图表。

图7为示出随根据本发明的实施方案的多肽二聚体的浓度而变化的与IgE结合的程度的图。

图8为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(IgE_TRAP)和Xolair(奥马珠单抗)随其浓度而变化的对表达人FcεRI的小鼠来源的肥大细胞的活性的抑制能力之间的比较的图。

图9为通过测定食物过敏模型中腹泻的频率来确定根据本发明的实施方案的多肽二聚体的抗过敏效果的图。

图10为示出根据本发明的实施方案的多肽二聚体(SA^low、SA^medi和SA^high)的非还原形式和还原形式的SDS-PAGE结果的图。

图11为确定根据本发明的实施方案的多肽二聚体(SA^low、SA^medi和SA^high)的等电点的图。

图12为通过测定食物过敏模型中腹泻的频率来确定皮下注射根据本发明的实施方案的多肽二聚体(SA^low和SA^high)的抗过敏效果的图。

图13为通过测定食物过敏模型中血液中的IgE浓度来确定根据本发明的实施方案的多肽二聚体(SA^low和SA^high)的抗过敏效果的图。

图14为通过测定食物过敏模型中血液中的MCPT-1浓度来确定根据一个实施方案的多肽二聚体(SA^low和SA^high)的抗过敏效果的图。

图15为示出小鼠模型中根据一个实施方案的多肽二聚体在不同唾液酸含量下的药代动力学特征的分析结果的图。

图16为通过测定被动全身性严重过敏反应小鼠模型的体温来确定不同唾液酸含量下根据一个实施方案的多肽二聚体的抗过敏效果的图。

具体实施方式

本发明的一个方面提供了具有高唾液酸含量的多肽二聚体，该多肽二聚体包含两个含有IgE Fc受体的α亚基胞外结构域(FcεRIα-ECD)的单体，其中该单体包含Fc区且该Fc区和FcεRIα-ECD通过铰链(hinge)连接，并且该多肽二聚体的特征在于唾液酸/多肽二聚体的摩尔比至少为8。

如本文所用，术语“IgE”指称为免疫球蛋白E的抗体。IgE具有对肥大细胞、嗜碱性粒细胞等的亲和性。此外，IgE和与其对应的抗原(变应原)的反应引起炎症反应。此外，已知IgE是严重过敏反应的主要原因。

如本文所用，术语“IgE Fc受体”也称为Fcε受体，并且表示结合IgE的Fc部分的受体。有两种类型的受体。对IgE Fc具有高亲和力的受体称为Fcε受体I(FcεRI)。对IgE Fc具有低亲和力的受体被称为Fcε受体II(FcεRII)。FcεRI在肥大细胞和嗜碱性粒细胞中表达。在结合FcεRI的IgE抗体被多价抗原交联的情况下，肥大细胞或嗜碱性粒细胞中发生脱粒，从而释放包括组胺在内的各种化学传递物质。这种释放导致立即的过敏反应。

FcεRI是由一条α链、一条β链和通过二硫键连接的两条γ链组成的膜蛋白。在这些链中，IgE结合的部分是α链(FcεRIα)。FcεRIα的大小约为60kDa，由存在于细胞膜内部的疏水结构域和存在于细胞膜外部的亲水结构域组成。特别地，IgE结合α链的胞外结构域。FcεRIα可与IgE Fc受体的α亚基互换使用。

具体地，IgE Fc受体的α亚基可具有NP_001992.1中所示的氨基酸序列。此外，IgEFc受体的α亚基的胞外结构域(FcεRIα-ECD)可具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。FcεRIα-ECD可以是FcεRIα-ECD的片段或变体，只要该片段或变体能够结合IgE。此外，SEQ ID NO:1所示的FcεRIα-ECD可由具有SEQ ID NO:5所示的序列的多核苷酸编码。

可通过在野生型FcεRIα-ECD中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的方法来制备该变体，只要该方法不改变FcεRIα-ECD的功能。这样的变体可与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

这里，Fc区可以是野生型Fc区或经修饰的Fc区。此外，如本文所用，术语“经修饰的Fc区”是指其中抗体的Fc部分的一部分已被修饰的区域。这里，Fc区是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)但不含有免疫球蛋白的重链和轻链可变区以及轻链恒定区1(CH1)的蛋白质。特别地，可通过取代Fc区中的一些氨基酸或通过组合不同类型的Fc区来获得经修饰的Fc区。具体地，经修饰的Fc区可具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO:2所示的经修饰的Fc区可由具有SEQ ID NO:6所示的序列的多核苷酸编码。

此外，经修饰的Fc区可以是天然形式的糖链或相对于天然形式增加的糖链。可通过常规方法修饰免疫球蛋白Fc糖链，诸如化学方法、酶方法和使用微生物的基因工程方法。此外，经修饰的Fc区可以是缺乏抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的区域，因为不存在针对Fcγ受体(FcγR)或补体成分1q(C1q)的结合位点。

在一个实施方案中，经修饰的Fc区和FcεRIα-ECD可通过IgD的铰链连接。该铰链可以是来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区。天然IgD的铰链区由64个氨基酸组成。来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可由20个至60个连续氨基酸、25个至50个连续氨基酸或30个至40个氨基酸组成。这里，为了在蛋白质生产过程中使截短形式的产生最小化，可通过修饰IgD的铰链区的氨基酸序列中的一些来获得铰链变体。

在一个实施方案中，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可由30个或49个氨基酸组成。此外，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可含有至少一个半胱氨酸。

在一个实施方案中，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可含有以下序列：

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys GluGlu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(SEQ ID NO:17)，其中Xaa1可以是Lys或Gly，并且Xaa2可以是Glu、Gly或Ser。具体地，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，从而在蛋白质生产过程中使截短形式的产生最小化。

在另一个实施方案中，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可含有以下序列：

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro AlaThr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys GluGlu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro(SEQ ID NO:18)，其中Xaa3可以是Lys或Gly，并且Xaa4可以是Glu、Gly或Ser。具体地，来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区可具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，从而在蛋白质生产过程中使截短形式的产生最小化。

特别地，在来源于免疫球蛋白IgD或其变体的具有SEQ ID NO:4所示的序列的铰链区中，Thr中的至少一个可被糖基化。具体地，在SEQ ID NO:18的氨基酸中，第13位、第14位、第18位或第19位的Thr可被糖基化。优选地，所有四个Thr可被糖基化。这里，糖基化可以是O-糖基化。

糖蛋白药物上附着的糖链是决定在治疗效果、体内持久性、靶向性和免疫应答等方面发挥重要作用的质量的主要因素之一。确定的是，糖链末端未被唾液酸终止的多肽二聚体迅速从体内除去。

本发明中使用的术语“唾液酸”可包括下式1的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和下式2的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。

[式1]

在这种情况下，在一个实施方案中，具有高唾液酸含量的多肽二聚体可具有高N-乙酰神经氨酸含量。

此外，可通过纯化方法增加多肽二聚体的唾液酸含量。此外，可通过在引入了唾液酸转移酶基因的细胞中产生多肽二聚体来提高多肽二聚体的唾液酸含量。

具有高唾液酸含量的多肽二聚体的特征在于唾液酸/多肽二聚体的摩尔比为8或更大。例如，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。

在一个实施方案中，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21。此外，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是8至30或12至25。此外，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是10至25、11至24或12至23。此外，在具有高唾液酸含量的多肽二聚体中，唾液酸/多肽二聚体的摩尔比可以是13至22、14至22、15至22、16至22、17至22、18至22或19至22。这里，唾液酸可以是N-乙酰神经氨酸。

此外，唾液酸可结合单体上的8个位置，该单体包含IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域(FcεRIα-ECD)和Fc区。在这种情况下，唾液酸可结合上述位置中的至少4个或更多个位置。具体地，唾液酸可结合单体上的4个、5个、6个、7个或8个位置。

如上所述，本发明提供的具有高唾液酸含量的多肽二聚体可以是其中两个单体彼此结合的形式，并且每个单体通过IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域和经修饰的Fc区之间的结合获得。具有高唾液酸含量的多肽二聚体可以是其中相同的两个单体通过位于铰链位点的半胱氨酸彼此结合的形式。此外，具有高唾液酸含量的多肽二聚体可以是其中两个不同单体彼此结合的形式。

在这种情况下，每个多肽单体可在相同位置包含唾液酸，但也可在不同位置包含唾液酸。此外，如果唾液酸/多肽二聚体的摩尔比为8或更大，则构成二聚体的各单体可具有不同的唾液酸/多肽摩尔比。

此外，多肽二聚体可含有两个彼此不同的单体。具体地说，它可以是这样的形式，即一个单体可含有IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域，而另一个单体含有IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域的片段。在此，单体的一个实施方案可由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID No:22所示的氨基酸序列组成。

此外，本发明提供的具有高唾液酸含量的多肽二聚体表现出的对IgE的结合亲和力是奥马珠单抗(一种抗IgE抗体)的10倍至100倍、20倍至90倍、20倍至70倍、30倍至70倍或40倍至70倍，并且其表现出的对IgE的结合亲和力可优选地是奥马珠单抗的约70倍。

该多肽二聚体与上述相同。特别地，该药物组合物的特征在于可用于皮下注射。确定的是，在皮下注射后，与具有低唾液酸含量的多肽二聚体相比，具有高唾液酸含量的多肽二聚体在治疗和/或预防过敏性疾病中是有效的。

如本文所用，术语“过敏性疾病”是指由肥大细胞活化(诸如肥大细胞脱粒)介导的过敏反应所引起的病理症状。例如，此类过敏性疾病可以是选自由食物过敏、特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、慢性特发性荨麻疹和过敏性接触性皮炎组成的组中的一种，但不限于此。特别地，过敏性疾病可以是IgE介导的。

在该药物组合物中，可包含任何量(有效量)的多肽二聚体，这取决于用途、制剂、共混目的等，只要该多肽二聚体可表现出抗过敏活性。多肽二聚体的典型有效量将确定在基于组合物总重量的0.001重量％至20.0重量％的范围内。这里，有效量是指能够诱导抗过敏效果的量。这种有效量可由本领域普通技术人员确定。

该药物组合物还可包含药学上可接受的载体。具体地，该药物组合物含有药学上可接受的载体，并且可根据给药途径通过本领域已知的常规方法制成口服或肠胃外制剂。

在将本发明的药物组合物制成口服制剂的情况下，可根据本领域已知的方法将该药物组合物与合适的载体一起制成制剂，诸如粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、混悬剂和糯米纸囊剂等。这里，合适的药学上可接受的载体的示例可包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇和木糖醇；淀粉，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉和小麦淀粉；纤维素类，诸如纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；水；羟基苯甲酸甲酯；羟基苯甲酸丙酯；硬脂酸镁；矿物油；麦芽；明胶；滑石；多元醇；植物油等。在制成制剂的情况下，根据需要，可通过包含稀释剂和/或赋形剂(诸如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)来进行制备。

在将本发明的药物组合物制成肠胃外制剂的情况下，可根据本领域已知的方法将该药物组合物与合适的载体一起制成注射剂、经皮药物、鼻吸入剂和栓剂形式的药剂。在制备成注射剂的情况下，无菌水、乙醇、多元醇(诸如甘油和丙二醇)或它们的混合物可用作合适的载体。对于载体，优选使用等渗溶液，诸如林格氏溶液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液(PBS)、注射用无菌水、5％右旋糖等。

药物组合物的制备是本领域已知的，具体地可参考Remington's PharmaceuticalSciences(第19版，1995年)等。

本发明的药物组合物的优选日剂量为0.01μg/kg至10g/kg，优选0.01mg/kg至1g/kg，这取决于患者的状态、体重、性别、年龄、疾病严重程度或给药途径。当剂量高时，该药物组合物可一天一次或一天几次给药。

本发明的组合物可施用(开具处方)的对象是哺乳动物，并且可以是例如人、狗和猫，其中人是特别优选的，但不限于此。为了提高和增强抗过敏活性，该药物组合物还可包含任何化合物或天然提取物，该化合物或天然提取物的安全性已经得到证实并且已知具有抗过敏活性。

本发明人进行了研究以开发安全有效的过敏性疾病治疗剂。结果，确定的是，与具有低唾液酸含量的多肽二聚体相比，具有高唾液酸含量的多肽二聚体具有优异的对IgE的结合亲和力(表3)。此外，确定的是，在将具有高唾液酸含量的多肽二聚体皮下给药于患过敏性疾病的受试者时，相比于具有低唾液酸含量的多肽二聚体，血液中IgE和MCPT-1的浓度有效降低，并且即使经过预定时间后该效果仍持续(图13和图14)。

因此，本发明的另一方面提供了一种包含该药物组合物的透皮贴剂。此外，本发明的另一方面提供了包含该药物组合物的局部贴剂。

该具有高唾液酸含量的多肽二聚体与上述相同。此外，该具有高唾液酸含量的多肽二聚体可与适当的递送工具结合以有效递送至肠中。

此外，该食品组合物可以任何形式进行制备，并且可例如以饮料(诸如茶、果汁、碳酸饮料和离子饮料)、加工乳制品(诸如牛奶和酸奶)、健康功能性食品制剂(诸如片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、液体、粉剂、薄片、糊剂、糖浆、凝胶、果冻和棒)等形式进行制备。

该食品组合物可归入法律或功能分类中的任何产品类别，只要该食品组合物在制造和分发时符合实施规定。例如，该食品组合物可以是根据《健康功能食品法》(HealthFunctional Foods Act)的健康功能食品，或者可根据《食品卫生法的食品法典》(FoodCode of Food Sanitation Act)(食品药品监督管理局所公布的食品标准和规格)中的每种食品类型归入糖果、豆类、茶、饮料、专用食品等中。对于可包含在本发明的食品组合物中的其它食品添加剂，可参考《食品卫生法》(Food Sanitation Act)的食品法典(Food Code)或食品添加剂法典(Food Additive Code)。

本发明的另一方面提供了治疗或预防过敏性疾病的方法，该方法包括给予受试者具有高唾液酸含量的多肽二聚体的步骤。该具有高唾液酸含量的多肽二聚体与上述相同。

该受试者可以是哺乳动物，优选为人、狗和猫。这里，可口服或肠胃外给药。这里，可通过诸如皮下给药、静脉内给药、粘膜给药和肌肉给药的方法进行肠胃外给药。

过敏性疾病可以是选自由食物过敏、特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎、慢性特发性荨麻疹和过敏性接触性皮炎组成的组中的一种。

下面将参考以下实施例对本发明进行更详细的描述。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围并不仅限于此。

实施例1含有FcεRIα-ECD和Fc区的多肽的制备

根据美国专利7,867,491中公开的方法制备IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域(FcεRIα-ECD)的C-末端经修饰的多肽。

首先，为了表达蛋白质(FcεRIαECD-Fc1)、蛋白质(FcεRIαECD-Fc2)和蛋白质(FcεR1αECD-Fc3)，将通过连接编码每种蛋白质的基因获得的表达盒克隆至pAD15载体(Genexin,Inc.)中以构建FcεRIαECD-Fc蛋白质表达载体，其中在这些蛋白质中，FcεRI的α链的胞外结构域(具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)和经修饰的免疫球蛋白Fc(SEQ IDNO:2所示)分别通过SEQ ID NO:19所示的铰链、SEQ ID NO:3所示的铰链和SEQ ID NO:4所示的铰链连接。然后，将这些表达载体中的每种表达载体转导至CHO DG44细胞(来自美国哥伦比亚大学的Chasin博士)中。

这里，在转导至细胞系中时，同时转导通过将α-2,6-唾液酸转移酶基因克隆至pCIhygro载体(Invitrogen)中而获得的表达载体，以分别制备能够表达添加了唾液酸的FcεRIαECD-Fc2ST和FcεRIαECD-Fc3ST蛋白质的细胞系。

作为初步筛选程序，使用不含5-羟色胺(HT)的10％dFBS培养基(Gibco，美国，30067-334)、MEMα培养基(Gibco，12561，美国，目录号：12561-049)和HT+培养基(Gibco，美国，11067-030)来进行HT选择。然后，使用经HT选择的克隆进行甲氨蝶呤(MTX)扩增，以使用二氢叶酸还原酶(DHFR)系统扩大生产率。

MTX扩增结束后，为了评价生产率，进行约1至5次传代培养以使细胞稳定。然后，进行经MTX扩增细胞的单位生产率评价。结果示于下表1中。

[表1]

如表1所示，在2uM甲氨喋呤扩增后，FcεRIαECD-Fc3细胞系表现出16.9μg/10⁶个细胞的生产率。另一方面，在1uM甲氨蝶呤扩增后，用2,6-唾液酸转移酶共转导的FcεRIαECD-Fc3细胞系(FcεRIαECD-Fc3ST)表现出10.2μg/10⁶个细胞的生产率。此外，在0.5uM甲氨蝶呤扩增条件下，FcεRIαECD-Fc2细胞系展现出20.9μg/10⁶个细胞的生产率。此外，在0.1uM甲氨蝶呤扩增后，用2,6-唾液酸转移酶共转导的FcεRIαECD-Fc2细胞系(FcεRIαECD-Fc2ST)表现出25.1μg/10⁶个细胞的生产率。即，鉴定了在0.1μM甲氨喋呤扩增条件下选择的用2,6-唾液酸转移酶共转导的FcεRIαECD-Fc2细胞系表现出最优异的生产率。

由FcεRIαECD-Fc2细胞系产生的多肽(FcεRIαECD-Fc)称为“FcεRIαECD-Fc2”，并且由FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系产生的多肽称为“FcεRIαECD-Fc2ST”。此外，由FcεRIαECD-Fc3细胞系产生的多肽称为“FcεRIαECD-Fc3”，由FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST细胞系产生的多肽称为“FcεRIαECD-Fc3ST”。

实施例2.确定多肽(FcεRIαECD-Fc)的纯化和纯度

在上述实施例1中选择的细胞系中，i)FcεRIαECD-Fc3细胞系、ii)FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST细胞系和iii)FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系通过分批培养法以60mL规模进行培养。使用蛋白质-A亲和柱纯化所得培养物以获得FcεRIαECD-Fc，然后对纯化的FcεRIαECD-Fc进行SE-HPLC(尺寸排阻高效液相色谱)和SDS-PAGE以鉴定多肽的纯度。

具体地，SDS-PAGE在非还原条件下进行。在非还原条件下，将每种纯化的多肽与非还原样品缓冲液混合，然后使用TGS(Tris甘氨酸SDS)缓冲液在200V条件下，于Mini-Protean TGX^TM凝胶(Bio-Rad)中电泳30分钟。电泳后，用考马斯亮蓝溶液将蛋白质染色。结果示于下表2和图1中：

[表2]

如上表2所示，确定的是，通过SE-HPLC方法纯化的每种多肽的纯度为93％或更高。确定的是，在非还原条件下，没有出现杂质(诸如截短形式)，特别是纯度为93％或更高，并且甚至在解冻/冷冻过程之后也没有杂质。

实验例1.多肽(FcεRIαECD-Fc)的二聚体形成的确定

在上述实施例1中选择的细胞系中，i)FcεRIαECD-Fc3细胞系、ii)FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST细胞系和iii)FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系通过分批培养法以60mL规模进行培养。然后，对使用培养上清液和蛋白A亲和柱纯化多肽获得的纯化产物进行SE-HPLC和SDS-PAGE。在这种情况下，分别在非还原条件和还原条件下对培养上清液和纯化产物进行这些操作。

以与实施例2相同的方式执行非还原条件。另一方面，在还原条件下，将各纯化的多肽与包含2-巯基乙醇的还原样品缓冲液混合，然后在100℃的温度下变性5分钟。然后，使用TGS缓冲液在200V条件下，于Mini-Protean TGX^TM凝胶(Bio-Rad)中电泳30分钟。电泳后，用考马斯亮蓝溶液将蛋白质染色。

结果，在非还原条件下检测到大小为约150kDa的多肽，在还原条件下检测到大小为约75kDa的多肽。由此，确定的是，多肽形成了二聚体(图2)。特别地，确定的是，甚至在与输入量相应的培养上清液中多肽二聚体的纯度也高，并且在通过将培养上清液通过亲和柱而获得的样品(FT；流穿液)中没有检测到多肽，但是在洗脱的样品中检测到了多肽。此外，即使将由于洗脱样品的低pH而立即用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和的样品(洗脱物_N)与未中和的样品(洗脱物)进行比较，也没有观察到显著差异(图2)。

此外，经鉴定，不仅纯化了具有非常高纯度(98％或更高)的多肽，而且甚至在培养上清液中也以非常高的纯度表达多肽。这表明在将在正在讨论的所述细胞系中表达的多肽开发成医药产品时，可简化工艺开发步骤，结果是非常可能显著降低医药产品的开发成本。

实验例2.多肽二聚体对IgE结合亲和力的确定

以比较的方式测定通过上述实施例2的方法纯化实施例1中产生的多肽i)FcεRIαECD-Fc2、ii)FcεRIαECD-Fc2ST、iii)FcεRIαECD-Fc3和iv)FcεRIαECD-Fc3ST获得的纯化产物以及市售抗IgE抗体奥马珠单抗(商品名：Xolair)对IgE的结合亲和力。

具体地，通过将IgE包被在蛋白质GLC传感器芯片(伯乐生命医学产品公司(Bio-Rad)，目录号：176-5011)上并使奥马珠单抗或不同浓度的各FcεR1αECD-Fc蛋白质以30μL每分钟的速度流动，从而测定对IgE的结合亲和力。这里，通过使用25mM NaOH作为再生缓冲液鉴定零碱基然后重复上述步骤来进行实验。然后，使用蛋白质结合分析仪(ProteOn XPR36，Bio-Rad，美国)鉴定结合曲线。结果示于表3中。

[表3]

如表3所示，根据本发明实施方案的多肽二聚体对IgE的结合率(ka)值经测定低于奥马珠单抗1.5倍至2.0倍。即，发现该多肽二聚体对除IgE外的物质的结合亲和力低于奥马珠单抗1.5倍至2.0倍。此外，根据本发明的实施方案的多肽二聚体的解离速率(kd)值经测定高于奥马珠单抗40倍至106倍。结果，确定的是，根据本发明实施方案的多肽二聚体的平衡解离常数(KD<kd/ka>)值高于奥马珠单抗22倍至69倍。由此，经鉴定，根据本发明实施方案的多肽二聚体与奥马珠单抗相比具有显著增加的对IgE的结合亲和力。特别地，经鉴定，添加了唾液酸的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST)表现出最高的IgE结合亲和力，高于奥马珠单抗69倍。

此外，如图3和图4所示，确定的是，当结合后经过一段时间，奥马珠单抗丧失其与IgE的结合，而根据本发明实施方案的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST，IgE_TRAP)一旦与IgE结合就不会与该IgE分离。即确定的是，根据本发明实施方案的多肽二聚体不容易与IgE分离，并且具有比奥马珠单抗好得多的保持其结合状态的能力。

实验例3.多肽二聚体对IgG受体结合亲和力的确定

使用Octet RED384系统(Pall ForteBio，CA，USA)确定根据本发明实施方案的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST，IgE_TRAP)或奥马珠单抗(Xolair)对IgG的Fcγ受体的结合亲和力。

具体地，将Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和FcγRIIIB重组蛋白(R&DSystems公司，5μg/mL))固定在活化的AR2G生物传感器上的300mM醋酸盐缓冲液(pH5)中。使用含有0.1％ Tween-20和1％胎牛血清的PBS作为运行缓冲液。所有测定均在30℃下用样品板摇床以1000rpm的速率进行。结果示于图5a至图5e中，并且对奥马珠单抗和多肽二聚体对IgG Fcγ受体的结合亲和力的进行了定量，结果示于图6中。

结果，确定的是，奥马珠单抗对IgG的Fcγ受体显示了高结合亲和力，而该多肽二聚体对IgG的Fcγ受体具有显著低的结合亲和力。由此，确定的是，该多肽二聚体不与IgG的Fcγ受体结合。

实验例4.通过在来源于小鼠骨髓的肥大细胞中进行β-氨基己糖苷酶测定来确定多肽二聚体的活性

执行β-氨基己糖苷酶测定以进行根据本发明的实施方案的多肽二聚体的体外活性分析。

具体地，将根据本发明的实施方案的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2)以各个浓度与IgE(1μg/mL)混合，并在20℃孵育30分钟以制备样品。用Hank's平衡盐溶液(HBSS)缓冲液洗涤被培养以激活肥大细胞的来源于小鼠骨髓的肥大细胞，从而除去培养基，测定细胞数目，然后将5×10⁵个细胞重浮在40μL HBSS缓冲液中。

将50μL如此制备的样品加入到激活的肥大细胞中。然后，将所得物在5％ CO₂培养箱中于37℃下孵育30分钟。随后，在每加入10μL的DNP(2,4-二硝基苯酚，100ng/mL，其为外源抗原)后，在5％ CO₂中于37℃下再次孵育30分钟，然后分离30μL的上清液。

将30μL分离的上清液和30μL底物(4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，5.84mM)充分混合，然后在5％ CO₂中于37℃下孵育20分钟。然后，加入140μL 0.1M碳酸钠缓冲液(pH 10)作为终止液以终止反应。然后，测定405nm处的吸光度以鉴定激活的肥大细胞中由外源抗原分泌的β-氨基己糖苷酶的分泌量。结果示于图7中。

如图7所示，确定的是，在IgE与本发明的多肽二聚体的浓度比为1:1的情况下，IgE的活性被显著抑制。即确定的是，根据本发明的实施方案的多肽二聚体即使在其浓度与IgE的浓度相同时也发生反应。

实验例5.在表达人FcεRI的来源于小鼠骨髓的肥大细胞中使用β-氨基己糖苷酶测定来比较多肽二聚体和人抗IgE抗体的活性

为了比较根据本发明的实施方案的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST，IgE_TRAP)和人抗IgE抗体Xolair(奥马珠单抗)的活性，进行β-氨基己糖苷酶分析。

制备各浓度的各多肽二聚体和Xolair，然后与人IgE(1μg/mL)混合。然后，在室温下孵育30分钟以制备样品。此外，制备来源于小鼠骨髓并从中分化的肥大细胞，其中已导入人FcεRI基因并已移除小鼠FcεRI基因。用HBSS缓冲液洗涤制备的肥大细胞，然后将5×10⁵个细胞重浮在60μL HBSS缓冲液中。

然后，将20μL如此制备的样品加入肥大细胞中，然后在5％ CO₂培养箱中于37℃下孵育30分钟。随后，在加入20μL人抗IgE抗体(BioLegend，货号325502，0.5μg/mL)后，将所得物再次在5％ CO₂培养箱中于37℃下孵育30分钟。然后，在4℃下以1500rpm离心后，分离30μL上清液。将30μL分离的上清液和30μL底物(4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，5.84mM)充分混合，然后在5％ CO₂培养箱中于37℃下孵育25分钟。然后，加入140μL0.1M碳酸钠缓冲液(pH 10)终止反应。然后，测定405nm处的吸光度以比较分泌的β-氨基己糖苷酶的相对量，并鉴定在样品的各浓度下对肥大细胞的抑制效果。结果示于图8中。

如图8所示，多肽二聚体的IC₅₀经测定为约11.16ng/mL，Xolair的IC₅₀经测定为约649.8ng/mL。因此，经鉴定，该多肽二聚体对肥大细胞活性的抑制能力高于Xolair58倍。

实验例6.通过食物过敏模型中的体内测定确定多肽二聚体的活性

将50μg卵清蛋白(OVA)和1mg明矾腹膜内两次给药至Balb/c小鼠(Orientbio公司)，给药间隔为14天，以诱导致敏。然后，在第28天、30天、32天、34天和36天，口服给药50mgOVA五次，以诱导肠内食物过敏。

OVA口服给药两次后，即在第31天，将小鼠分成三组，每组7只小鼠。三个分组如下：组1接受高浓度(200μg)的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST)，组2接受低浓度(20μg)的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST)，组3不接受任何东西。

当口服给药OVA时，观察是否由于食物过敏诱导而发生腹泻。此外，在第37天处死小鼠，分析各组中小鼠的小肠中肥大细胞的数量、血液中IgE的浓度和血液中肥大细胞脱粒酶(肥大细胞蛋白酶-1(MCPT-1))的浓度。

结果，如图9所示，第二次口服给药OVA后，组3的小鼠发生腹泻。另一方面，在第三次口服给药OVA后，组1和组2的小鼠发生腹泻。特别地，组1的小鼠腹泻的频率低于组2的小鼠腹泻的频率。由此，确定的是，对食物过敏的效果与多肽二聚体的浓度成比例地提高。

实验例7.多肽二聚体的唾液酸含量的分析

基于以下方面，即来自上述实施例1中制备的FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系所产生的多肽的生产率最高以及实验例4至6中多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST)的抗过敏功效极好，对多肽二聚体的唾液酸含量进行分析，以研究不同唾液酸含量下多肽二聚体的抗过敏效果。

具体地，为了测定上述实施例1中制备的FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系所产生的多肽二聚体(FcεRIαECD-Fc2ST)的糖型结构中所含的唾液酸含量，首先经唾液酸酶处理分离唾液酸，唾液酸酶是一种与唾液酸分解代谢相关的酶。然后，分离出唾液酸，进行检测，并用HPLC(Waters，alliance e2659)定量。

根据pH梯度将多肽二聚体分成三个样品并进行分离和纯化。将三个样品放在AmiconUltra 10K(Millipore，UFC501096)过滤器中，在13000rpm、4℃温度的条件下离心10分钟，重复5次，将浓缩物用去离子水进行置换并浓缩。在280nm波长下测定的样品浓度为10mg/mL以上。

然后，取0.5mg的各样品并放入EP管中，加入1μL的唾液酸酶(Roche，10 269 611001)和40μL浓度为10mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，然后加入去离子水，使最终体积为100μL。取2μL各样品，测定280nm波长处的浓度，将所确定的浓度值作为最终分析浓度。

将样品在37℃培养箱中反应18小时，然后置于AmiconUltra 10K过滤器中，在13000rpm、4℃的条件下离心15分钟，将通过过滤器的滤液用于分析。HPLC分析条件示于下表4中。

[表4]

用于计算唾液酸含量的标准物质是N-乙酰神经氨酸(以下称为NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(以下称为NGNA)的混合物。获得标准曲线的线性回归方程，以计算分析物中NGNA和NANA的摩尔浓度。所用混合物示于下表5中。

[表5]

混合物	1	2	3	4	5
						NANA(μM)	2000	1000	500	300	200
NGNA(μM)	40	20	10	6	4

使用NANA含量计算样品中NANA唾液酸含量。样品中的唾液酸含量以唾液酸/样品的摩尔比(mol/mol)表示。

[等式1]

样品的唾液酸含量＝(样品中NANA的摩尔浓度)/(样品的摩尔浓度)

此外，使用NGNA含量计算样品中NGNA的含量。样品中NGNA的含量以NGNA/分析物的摩尔比(mol/mol)表示。

[等式2]

样品的NGNA含量＝(分析物中NGNA摩尔浓度)/(分析物的摩尔浓度)

结果示于下表6中。

[表6]

如表6所示，根据pH梯度将其分成三个样品并进行分离和纯化，对样品中的唾液酸含量进行不同的测定。为了根据唾液酸含量比较抗过敏功效，多肽二聚体按唾液酸含量依次称为“SA^low”、“SA^medi”和“SA^high”。

实验例8.确定多肽的二聚体形成基于唾液酸含量的变化

为了确定多肽的二聚体形成是否基于唾液酸含量而变化，将实施例9中分离的SA^low、SA^medi和SA^high以与实验例1相同的方式在非还原条件和还原条件下进行SDS-PAGE分析。

结果，在所有SA^low、SA^medi和SA^high中，在非还原条件下检测到大小为约150kDa的多肽，在还原条件下检测到大小为约75kDa的多肽。由此，确定的是，多肽形成了二聚体(图10)。

实验例9.确定多肽二聚体的基于唾液酸含量的等电点

为了确定多肽二聚体的等电点是否基于唾液酸含量而变化，将实验例7中分离的SA^low、SA^medi和SA^high与IEF样品溶液混合，然后上样到pH 3-7的IEF凝胶(Invitrogen)中，依次在100V条件下电泳1小时、在200V条件下电泳1小时以及在500V条件下电泳30分钟。电泳结束后，使凝胶在含有12％三氯乙酸和3.5％磺基水杨酸的固定液中反应30分钟，然后用蒸馏水洗涤。用考马斯亮蓝溶液将蛋白质染色。

结果，SA^low、SA^medi和SA^high的等电点基于唾液酸含量稍有不同，发现分别为约5.3、4.9和4.7(图11)。

实验例10.确定食物过敏动物模型中多肽二聚体的基于唾液酸含量的抗过敏活性：腹泻频率的测定

为了证实多肽二聚体的活性是否基于唾液酸含量而变化，通过对于Balb/c小鼠(Orient Bio)两次腹膜内给药50μg OVA和1mg明矾来诱导致敏，给药间隔为14天。此后，在第28天、30天、32天、34天、36天、38天、40天，共7次通过口服给药50mg OVA来诱导食物过敏。在这种情况下，在禁食4小时后进行OVA的口服给药。

OVA口服给药两次，然后在第40天，将小鼠分为3组，每组7只小鼠。将小鼠分成组1(该组中以高浓度(200μg)皮下给药具有高唾液酸含量的多肽二聚体(SA^high))、组2(该组中以高浓度(200μg)皮下给药具有低唾液酸含量的多肽二聚体(SA^low))和组3(该组中皮下给药PBS)。确定在口服给药OVA时是否随食物过敏的诱导而发生腹泻。

结果，在第四次口服给药OVA后，组3的小鼠发生腹泻。在第五次口服给药OVA后，组2的小鼠发生腹泻。特别地，在第六次口服给药OVA后，组2的小鼠的腹泻频率迅速增加。另一方面，在第六次口服给药OVA后，组1的小鼠发生腹泻，但是即使在第七次口服给药OVA后，组1的小鼠中腹泻的频率仍保持不变而没有增加(图12)。由此，确定的是，具有高唾液酸含量的多肽二聚体(SA^high)与具有低唾液酸含量的多肽二聚体(SA^low)相比，具有优异的抗过敏效果。

实验例11.确定食物过敏动物模型中多肽二聚体的基于唾液酸含量的抗过敏活性：血液中IgE浓度的测定

通过眼窝取样法从每组小鼠中采集血液，在这些组中进行了实验例10的OVA的第七次口服给药。在环境温度下反应30分钟后，在4℃、13000rpm的条件下离心15分钟分离血清。为了测定血液中游离IgE的浓度，使用小鼠总IgE ELISA试剂盒(BioLegend)。在这种情况下，除了使用根据本发明的实施方案的多肽二聚体(SA^low和SA^high)代替抗IgE抗体作为包被在96孔板上的物质，其余则根据制造商的方案进行ELISA操作。

具体地，用PBS稀释的多肽二聚体(SA^low和SA^high)包被96孔板，在4℃下反应过夜。第二天用含有0.05％ Tween20的PBS(下文中称为洗涤缓冲液)洗涤后，加入封闭缓冲液(测定稀释液)并反应1小时。然后，用洗涤缓冲液洗板，然后将待用作标准溶液的小鼠IgE和小鼠血清样品在1×测定稀释液中稀释，然后放入板中并反应2小时。

再次用洗涤缓冲液洗涤后，加入生物素标记的小鼠抗IgE抗体并反应1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗生物素蛋白(抗生物素蛋白-HRP)并反应30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，加入底物溶液，避光反应20分钟，然后加入终止液(1MH₂SO₄)终止反应。然后，用酶标仪(Epoch微孔板分光光度计)在450nm波长处测量吸光度值并计算浓度。

结果，对于皮下给药PBS的组3小鼠，计算的血液中的IgE浓度为约8000ng/mL。此外，对于皮下给药具有低唾液酸含量的多肽二聚体(SA^low)的组2小鼠，计算的血液中的IgE浓度为约7000ng/mL。另一方面，对于皮下给药具有高唾液酸含量的多肽二聚体(SA^high)的组1小鼠，计算的血液中的IgE浓度为约4900ng/mL，这与组2以及组3小鼠之间血液中IgE浓度值存在显著差异(图13)。

从这些结果发现，当皮下给药具有高唾液酸含量的多肽二聚体时，血液中IgE含量降低。此外，基于血液中IgE的这种降低，预计具有高唾液酸含量的多肽二聚体在治疗过敏反应中是有效的。

实验例12.确定食物过敏动物模型中多肽二聚体的基于唾液酸含量的抗过敏活性：血液中MCPT-1浓度的测定

在完成食物过敏实验后2天，通过从每组小鼠中采血来制备血清。为了测定血液中MCPT-1(肥大细胞蛋白酶-1)的浓度，使用MCPT-1ELISA试剂盒(Invitrogen)按照制造商的方案执行操作。

具体地，用小鼠抗MCPT-1抗体包被96孔免疫板，在4℃反应过夜。第二天，用含有0.05％ Tween20的PBS(下文中称为洗涤缓冲液)洗涤后，加入含有1％ BSA(胎牛血清蛋白)的PBS(下文中称为封闭缓冲液、测定稀释液)，并反应1小时。然后，用洗涤缓冲液洗板，然后将待用作标准溶液的MCPT-1和小鼠血清样品在1×测定稀释液中稀释，然后放入板中并反应2小时。

2小时后，加入生物素标记的小鼠抗MCPT-1抗体并反应1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗生物素蛋白(抗生物素蛋白-HRP)并反应30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，加入底物溶液，避光反应20分钟，然后加入终止液(1MH₂SO₄)终止反应。然后，用酶标仪(Epoch微孔板分光光度计)测定从450nm波长处测定的吸光度值减去570nm波长处测定的吸光度值而得到的吸光度值并计算浓度。

结果，对于皮下给药PBS的组3小鼠，计算的血液中的MCPT-1浓度为约4000ng/mL。此外，对于皮下给药具有低唾液酸含量的多肽二聚体(SA^low)的组2小鼠，计算的血液中的MCPT-1浓度为约4200ng/mL。另一方面，对于皮下给药具有高唾液酸含量的多肽二聚体(SA^high)的组1小鼠，计算的血液中的MCPT-1浓度为约2800ng/mL，这与组2以及组3小鼠之间血液中MCPT-1浓度值存在显著差异(图14)。

实施例3.通过纯化制备具有高唾液酸含量的多肽二聚体

为了确定多肽二聚体基于唾液酸含量的物理性质，获得了含有宽范围唾液酸的多肽二聚体。具体地，使用亲和层析和阴离子交换层析纯化从FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST细胞系获得的多肽二聚体。

首先，对细胞培养液进行亲和层析以从该培养液中除去主要杂质。使用填充有Amsphere^TMA3树脂的Amsphere^TMA3预填充柱(床高5cm，体积5mL)和液相层析系统AKTAAvant 25设备进行亲和层析。这里，使用pH 3.3的100mM甘氨酸作为洗脱缓冲液进行操作。

然后，使用填充有Q Sepharose Fast Flow树脂的Hiscreen QFF(床高10cm，体积5mL)和液相层析系统AKTA Avant 25设备进行阴离子交换层析。使用pH 3.5的20mM磷酸柠檬酸盐作为洗脱缓冲液。在这种情况下，调节作为洗涤缓冲液的pH 4.0的20mM磷酸柠檬酸盐的浓度，获得了具有不同唾液酸含量的二聚体。按照实验例7中使用的分析方法对唾液酸含量进行分析。由此，获得了具有7.0mol/mol、10.3mol/mol、12.9mol/mol、14.9mol/mol和21.4mol/mol唾液酸含量的多肽二聚体。

实验例13.小鼠模型中基于唾液酸含量的多肽二聚体的药代动力学分析

为了基于多肽二聚体的唾液酸含量进行药代动力学分析，将实施例3中制备的具有7.0mol/mol、10.3mol/mol、12.9mol/mol、14.9mol/mol和21.4mol/mol唾液酸含量的多肽二聚体分别以10mg/kg的浓度皮下注射至小鼠中。为了分析多肽二聚体的药代动力学，在施用物质后的0小时、3小时、10小时、24小时、72小时、168小时和240小时采集血液并按以下方式分析。

将抗FcεRI抗体(Invitrogen)在1×PBS(Welgene)中稀释成0.5μg/mL的浓度，然后加入免疫板(Thermo)，在4℃的条件下反应过夜。反应完成后，用1×PBST洗涤免疫板，每孔加入封闭溶液I-Block溶液(Invitrogen)并在环境温度下反应1小时。在封闭期间，制备标准品和分析样品。将多肽二聚体在含有小鼠空白血清的1％ BSA/PBS中稀释成0.19ng/mL至200ng/mL的浓度以制备标准物质，并且还使用含有空白血清的1％BSA/PBS进行1/20-1/300稀释以制备分析样品。

封闭完成后，用1×PBST洗板，每孔加入制备的标准品和分析样品，然后在环境温度下反应1小时。然后，用1×PBST洗板，加入稀释至1:10000的抗人IgG4-HRP(SouthernBiotech)，然后在环境温度下反应1小时。反应完成后，用1×PBST洗板，并向孔中加入TMB溶液(Thermo)并反应。当使用酶标仪(Molecular Devices)测量650nm波长处的吸光度值在0.8-1.0范围内时，每孔加入终止液(Sigma)终止反应。反应终止后，在5分钟内在板中测量450nm波长处的吸光度并分析数值。所得的多肽二聚体的基于唾液酸含量的药代动力学图和药代动力学参数示于图15和表7中。

结果，如表7所示，确定的是给予小鼠的多肽二聚体中唾液酸含量越高，血液中的浓度越高。

[表7]

实验例14.确定被动全身性严重过敏反应小鼠模型中多肽二聚体的基于唾液酸含量的功效

为了确定多肽二聚体的基于唾液酸含量的体内抗过敏效果的差异，采用文献中公开的方法以如下方式诱导小鼠的被动全身性严重过敏反应(PSA)(Methods andProtocols，Methods in Molecular Biology，第1032卷，DOI 10.1007/978-1-62703-496-8_10)。已知肥大细胞通过诱导严重过敏反应而被激活，并且体温通过增加肥大细胞而降低。在使用该方法诱导小鼠PSA时，给予具有相应唾液酸含量的多肽二聚体，然后测量体温以比较抗过敏效果。

测量插入应答器的Balb/c小鼠(Orient Bio)的体温，然后腹膜内给药20μg含有0.9％NaCl的抗DNP IgE(Sigma)，然后分别以10mg/kg皮下给药具有不同唾液酸含量的多肽二聚体。24小时后，在给药含有0.9％ NaCl的DNP-HAS(Sigma，一种外源抗原)之前，测量小鼠的体温。然后，静脉内给予1mg抗原。给药后，使用远程体温计(Bio Medic Data Systems)以10分钟的间隔测量小鼠的体温，持续1小时。实验结果如图16所示。

结果，确定的是，在给予溶媒和具有10.3mol/mol唾液酸含量的多肽二聚体的组中，小鼠的体温降低；在给予具有14.9mol/mol或更高唾液酸含量的多肽二聚体的组中，小鼠的体温没有降低。由此，确定的是，具有高唾液酸含量的多肽二聚体与具有低唾液酸含量的多肽二聚体相比，具有降低被动全身性严重过敏反应的诱导的优异效果。

SEQUENCE LISTING

<110> GI医诺微新

<120> 包含IgE

Fc受体的α亚基的胞外结构域且具有高唾液酸含量的多肽二聚体及包含其的

药物组合物

<130> P21119970WP

<150> KR 10-2019-0082217

<151> 2019-07-08

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 180

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FCeRI1 ECD

<400> 1

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln

180

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 经修饰的Fc

<400> 2

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体

<400> 3

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 49

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体

<400> 4

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro

<210> 5

<211> 540

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FCeRI1 ECD的核苷酸序列

<400> 5

gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag 60

aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc 120

cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc 180

gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac 240

ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc 300

cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac 360

tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac 420

gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac 480

gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag 540

540

<210> 6

<211> 561

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 经修饰的Fc的核苷酸序列

<400> 6

tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat 60

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac 120

agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 180

tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa 240

ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag 300

aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 360

tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc 420

gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc 480

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc 540

ctgtccctga gcctgggcaa g 561

<210> 7

<211> 174

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体的核苷酸序列

<400> 7

aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag 60

gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg 120

ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc 174

<210> 8

<211> 231

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体的核苷酸序列

<400> 8

gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg 60

aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa 120

agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc 180

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c 231

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽

<400> 9

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 信号肽的核苷酸序列

<400> 10

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgcc 75

<210> 11

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc2

<400> 11

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr

195 200 205

Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln

210 215 220

Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro

225 230 235 240

Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 12

<211> 1350

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc2的核苷酸序列

<400> 12

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga 120

atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc 180

agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc 240

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag 300

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag 360

gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg 420

tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac 480

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg 540

tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag 600

aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag 660

aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc 720

ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780

gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg 840

tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac 900

tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc 1020

aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag 1080

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg 1200

ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg 1260

caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag 1350

<210> 13

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc3

<400> 13

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro

195 200 205

Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr

210 215 220

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys

225 230 235 240

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

245 250 255

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

340 345 350

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Gly Lys

465

<210> 14

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc3的核苷酸序列

<400> 14

atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga 120

atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc 180

agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc 240

gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag 300

agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag 360

gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg 420

tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac 480

atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg 540

tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag 600

aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct 660

cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag 720

gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg 780

ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840

gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac 900

gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc 960

acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa 1080

gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg 1140

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg 1260

gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag 1320

gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag 1380

aagagcctgt ccctgagcct gggcaag 1407

<210> 15

<211> 406

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人a-2,6-唾液酸转移酶

<400> 15

Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu

35 40 45

Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser

50 55 60

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser

65 70 75 80

Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp

85 90 95

Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile

100 105 110

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly

115 120 125

Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu

130 135 140

Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe

145 150 155 160

Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr

165 170 175

Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val

195 200 205

Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly

210 215 220

Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu

225 230 235 240

Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val

245 250 255

Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn

260 265 270

Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His

275 280 285

Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu

290 295 300

Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro

305 310 315 320

Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp

325 330 335

Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val

340 345 350

Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala

355 360 365

Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln

370 375 380

Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly

385 390 395 400

Phe Arg Thr Ile His Cys

405

<210> 16

<211> 1218

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人a-2,6-唾液酸转移酶的核苷酸序列

<400> 16

atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc 60

gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg 120

cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc 180

cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc 240

ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc 300

agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac 360

aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg 420

aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc 480

aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc 540

tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga 600

gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag 660

caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag 720

aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc 780

gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac 840

tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg 900

ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct 960

ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc 1020

tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc 1080

gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag 1140

cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc 1200

ttcagaacca tccactgc 1218

<210> 17

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> X可为任意天然氨基酸

<400> 17

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 18

<211> 49

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链变体

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(32)

<223> X可为任意天然氨基酸

<400> 18

Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgD铰链

<400> 19

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

20 25 30

<210> 20

<211> 425

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc1

<400> 20

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

180 185 190

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

195 200 205

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

370 375 380

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

385 390 395 400

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425

<210> 21

<211> 425

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc2

<400> 21

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly

180 185 190

Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

195 200 205

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

210 215 220

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

225 230 235 240

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

245 250 255

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

260 265 270

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

275 280 285

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

290 295 300

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

305 310 315 320

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

325 330 335

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

355 360 365

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

370 375 380

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

385 390 395 400

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

405 410 415

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

420 425

<210> 22

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FceRIa ECD-hinge-Fc3

<400> 22

Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile

1 5 10 15

Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe

20 25 30

Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu

35 40 45

Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val

85 90 95

Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn

100 105 110

Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys

115 120 125

Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu

130 135 140

Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys

165 170 175

Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala

180 185 190

Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu

195 200 205

Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys

210 215 220

Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

Claims

1.一种具有高唾液酸含量的多肽二聚体，由两个单体组成，所述两个单体中的每个单体由IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域（FcεRIα-ECD）、Fc区和铰链组成，

其中所述IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，并且

所述Fc区和所述FcεRIα-ECD通过所述铰链连接，

其中所述Fc区位于所述FcεRIα-ECD的C-末端，

其中所述Fc区具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，

其中所述铰链为来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区，

其中所述来源于免疫球蛋白IgD或其变体的铰链区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4，

其中所述多肽二聚体中唾液酸/多肽二聚体的摩尔比为12至25。

2.根据权利要求1所述的具有高唾液酸含量的多肽二聚体，

其中所述唾液酸是N-乙酰神经氨酸。

3.一种用于治疗或预防过敏性疾病的药物组合物，包含根据权利要求1或2所述的具有高唾液酸含量的多肽二聚体。

4.根据权利要求3所述的用于治疗或预防过敏性疾病的药物组合物，其中所述药物组合物用于皮下注射。

5.根据权利要求3所述的用于治疗或预防过敏性疾病的药物组合物，其中所述过敏性疾病是选自由哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮炎和慢性特发性荨麻疹组成的组的任一种。

6.根据权利要求5所述的用于治疗或预防过敏性疾病的药物组合物，其中所述过敏性皮炎为过敏性接触性皮炎或特应性皮炎。

7.一种透皮贴剂，包含根据权利要求3所述的药物组合物。

8.一种局部贴剂，包含根据权利要求3所述的药物组合物。

9.根据权利要求1或2所述的具有高唾液酸含量的多肽二聚体在制备用于预防或治疗过敏性疾病的药物中的用途。