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CN114072512A - 不育基因及其相关构建体和应用 - Google Patents

不育基因及其相关构建体和应用 Download PDF

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CN114072512A
CN114072512A CN201980098218.6A CN201980098218A CN114072512A CN 114072512 A CN114072512 A CN 114072512A CN 201980098218 A CN201980098218 A CN 201980098218A CN 114072512 A CN114072512 A CN 114072512A
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吕贵华
毛冠凡
王国奎
王伟
丁欢欢
郑玉珍
M·C·阿尔贝特森
T·福克斯
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Sinobioway Bio Agriculture Group Co Ltd
Pioneer Overseas Corp
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Abstract

本公开发明提供了用于调控植物不育的分离的多核苷酸、多肽和重组DNA构建体，还提供了利用这些重组DNA构建体的方法。本文进一步提供了含有这些重组DNA构建体或改良的内源性不育基因的组合物。

Description

不育基因及其相关构建体和应用
技术领域
本发明涉及植物有性繁殖、遗传学和育种领域，尤其涉及用于调节植物不育性的重组DNA构建体，以及培育不育植物的方法。
发明背景
杂交水稻对全球水稻生产力的提高做出了巨大贡献。基于水稻细胞质型雄性不育系(CMS)的三系杂交系统和基于水稻光温敏型核雄性不育系(PTGMS)的两系杂交系统用于商业杂交水稻生产(Chang等人，《国家科学院学报》，113(49)：14145-14150(2016))。
植物雄性生殖发育涉及一系列事件，从雄蕊分生组织特化到花粉粒形成和授粉。将可育的转基因植株与非转基因雄性不育植株异花授粉，繁殖出高纯度的雄性不育种子。花粉育性受日长的调节。例如，在长日照条件下生长的水稻可能完全不育，而在短日照条件下生长的水稻花粉育性会不同。
雌性器官的发育主要是指胚珠发育和胚囊形成的过程。如果雌性器官发育缺失或停滞，植物将表现出雌性不育。Ling等人(1991)将雌性不育分为三类：1)雌蕊发育缺陷，没有花柱和柱头，只有干瘪的子房；2)雌性器官不分化或不具雄蕊；3)雌蕊外观正常，但子房发育异常。雌性不育通常伴随着雄性不育。
对两种远缘的双子叶植物，拟南芥和金鱼草的研究，已经鉴定出三类同源异型基因，它们单独或联合作用以决定花器官的特性(Bowman等人，Development，112:1(1991)；Carpenter和Coen，Genes Devl.，4:1483(1990)；Schwarz-Sommer等人，Science，250:931(1990))。其中一些基因是转录因子，其保守的DNA结合域被指定为MADS盒(Schwarz-Sommer等人，同上)。
控制花分生组织特性的早期作用基因也已被鉴定。拟南芥和金鱼草的花分生组织来源于花序分生组织。已知有两个因子控制分生组织细胞发育成花。在拟南芥中，这些因子是LEAFY基因(Weige等人，Cell,69:843(1992))和APETALA1基因(Mandel等人，Nature,360:273(1992))的产物。当这些基因中的任何一个因突变而失活时，包括花和花序的特殊结构就会形成(Weigel等，见前文；Irish和Sussex，Plant Cell，2:741(1990))。在金鱼草中，拟南芥LEAFY基因的同源物是FLORICAULA(Coen等人，Cell，63:1311(1990))，APETALA1基因的同源物是SQUAMOSA(Huijser等人，EMBO J.，11:1239(1992))。后一对包含MADS盒域。
许多雄性不育基因已被报道。然而，关于雌性不育基因的报道并不多。最近，在利用雄性不育基因开发杂交种子生产技术方面取得了巨大进展(Wu等人，PlantBiotechno.J.doi：10.1111/pbi.12477(2015))。
因此，需要开发新的成分和方法来改变目标植物的不育特性。本发明提供了此类组合物和方法。
发明概述
在一个实施例中，本公开发明包括一个分离的多核苷酸调控植物不育的性状，所述多核苷酸包含：(a)一种多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中增加的多核苷酸的表达能使植物不育。
在某些实施例中，所述多核苷酸包含的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:51。
在某些实施例中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50或SEQ ID NO:52。
另一方面，本公开发明提供了利用植物中分离的调控不育性状的多核苷酸来调节不育性状，其中所述分离的多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。某些实施例提供了使用植物中分离的多核苷酸，通过增加该多核苷酸的表达来使植物不育。
另一方面，本公开发明包括一种重组DNA构建体，其包含所述分离的不育性状调节多核苷酸可操作地连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸包含(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。在某些实施例中，所述的至少一个调控元件是植物中功能性的启动子。在某些实施例中，所述的至少一个调控元件对于所述多核苷酸来说是异源的。
另一方面，本公开发明包含一种能增加多核苷酸表达的改良植物、植物细胞或种子，所述多核苷酸能编码不育调节多肽ZOS3-17、DnaK或PPT1-1，其中所述植物在相同条件下种植时，与对照植物相比较，都表现出不育性状。
在某些实施例中，所述植物、植物细胞或种子经过改良，具有增加的不育性状调节基因的表达，其中所述植物或由所述植物细胞或种子产生的植物，在和不具有所述表达增加的对照植物相比较时，具有不育性状。在某些实施例中，所述改良的植物、植物细胞或种子包含有一个重组DNA构建体，该重组DNA构建体含有的不育性状多核苷酸可操作地连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸包含(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。从而增加改良植物、植物细胞或种子中上述多核苷酸的表达。在某些实施例中，所述植物含有一种修饰调控元件，其中所述修饰调控元件能增加一种内源多核苷酸的表达，所述内源多核苷酸包含(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全场互补序列。
在某些实施例中，用于本文提供的组合物和方法的植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
另一方面，提供了一种水稻株系，所述水稻植株包含有修饰的基因位点，其中一种内源多核苷酸的表达是增加的，该内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6或9相比较时至少有90％的序列一致性。
另一方面，还提供了一种玉米株系，所述玉米植株包含有修饰的基因位点，其中一种内源多核苷酸的表达是增加的，该内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:28、37或46相比较时有至少90％的序列一致性。
另一方面，还提供了一种小麦株系，该小麦植株包含有一种修饰的基因位点，其中一种内源多核苷酸的表达是增加的，该内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:30、32、34、39、41、43、48、50或52相比较时至少有90％的序列一致性。
另一方面，提供了一种调控植物不育性状的方法，包括增加植物中(比如水稻、玉米或小麦)编码ZOS3-17、DnaK或PPT1-1多肽的多核苷酸的表达或功能，导致所述植物不育。其中所述多核苷酸包含：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；和(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性。
另一方面，提供了一种鉴定植物中一个或多个(如水稻、玉米、小麦)不育性状的相关等位基因的方法，其中所述方法包括的步骤有：(a)检测植物群体的一个或多个多态性(i)在编码多肽的基因组区域或(ii)控制所述多肽表达的调控区域，其中所述多肽含有的氨基酸序列来自SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52等序列，或与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％一致性的序列。其中在编码多肽的基因组区域或控制多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与不育性状有关；和(b)在与不育性状相关的一个或多个多态性上鉴别一个或多个等位基因。其中所述一个或多个与不育性状相关的等位基因被用于标记辅助选择具有不育性状的植物。
附图简述和序列表
通过以下详细说明以及构成本申请一部分的附图和序列表，可以更全面地理解本公开文件。
图1是实时PCR分析OsZOS3-17基因在不同转基因水稻株系(DP0640)叶片中的相对表达水平。ZH11-TC中的基本表达水平设为1.00，与ZH11-TC水稻相比，图中柱子顶部的数字是表达倍数的变化。
图2是实时PCR分析OsDnaK基因在不同转基因水稻株系(DP1673)叶片中的相对表达水平。ZH11-TC中的基本表达水平设为1.00，与ZH11-TC水稻相比，图中柱子顶部的数字是表达倍数的变化。
图3是实时PCR分析OsPPT1-1基因在不同转基因水稻株系(DP1675)叶片中的相对表达水平。ZH11-TC中的基本表达水平设为1.00，与ZH11-TC水稻相比，图中柱子顶部的数字是表达倍数的变化。
图4是DP0640转基因水稻植株的花粉染色结果。I2K-染色显示DP0640株系的花粉是可育的。
图5是DP0640转基因水稻种子的形态学。
图6是DP0640转基因杂交水稻F1代的PCR扩增结果。
图7是DP1673转基因水稻植株的花粉染色结果。通过I2K-染色显示DP1673株系的花粉是可育的。
图8是DP1673植株的雌蕊发育状态。DP1673植株通常在授粉前发育明显，但是，它们的子房和柱头在授粉后会萎缩死亡。
图9是DP1675转基因水稻植株的花粉染色结果。通过I2K-染色显示DP1673株系的花粉是可育的。
图10是DP1675转基因杂交水稻F1代的PCR扩增结果。
表1.本文提供的核苷酸和氨基酸序列在序列表中的SEQ ID NO
Figure BDA0003456330840000041
Figure BDA0003456330840000051
随附的图表说明和序列列表符合37C.F.R.§1.821 1.825中规定的专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列披露规则。序列列表包含核苷酸序列字符的一个字母代码和氨基酸的三个字母代码，如《Nucleic Acids Res.》13:3021-3030(1985)和《Biochemical J.》219(2)：345-373(1984)中所述的IUPAC-IUBMB标准所定义，通过引用将其并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37 C.F.R.§1.822中规定的规则。
详细说明
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。
如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本文所述：
“OsZOS3-17”是指在表达改变时赋予不育表型的水稻多肽。OsZOS3-17多肽(SEQID NO:3)由水稻基因位点LOC_Os03g50850.1处的编码序列(CDS)(SEQID NO:2)或核苷酸序列(SEQ ID NO:1)编码，该基因位点在TIGR的注释为“ZOS3-17-C2H2锌指蛋白，表达”。“ZOS3-17多肽”在本文中是指OsZOS3-17多肽及其来自其他生物体的同源物或同系物，例如玉米(例如，由SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:26编码的SEQ ID NO:28)或小麦(例如，由SEQ IDNO:29编码的SEQ IDNO:30；由SEQ ID NO:31编码的SEQ ID NO:32；由SEQ ID NO:33编码的SEQID NO:34)。
“OsDnaK”是指在表达改变时赋予不育性状的水稻多肽。OsDnaK多肽(SEQ ID NO:6)由水稻基因位点LOC_Os03g16920.1处的编码序列(CDS)(SEQ ID NO:5)或核苷酸序列(SEQ ID NO:4)编码，该基因位点在TIGR的注释为“DnaK家族蛋白，推测，表达”。“DnaK多肽”在本文中是指OsDnaK多肽及其来自其他生物体的同源物或同系物，例如玉米(例如，由SEQID NO:36或SEQ ID NO:35编码的SEQ ID NO:37)或小麦(例如，由SEQ ID NO:38编码的SEQID NO:39；由SEQ ID NO:40编码的SEQ ID NO:41；由SEQ ID NO:42编码的SEQ ID NO:43)。
“OsPT1-1”是指在表达改变时赋予不育表型的水稻多肽。OsPT1-1多肽(SEQ IDNO:9)由水稻基因位点LOC_Os08g43540.1处的编码序列(CDS)(SEQ ID NO:8)或核苷酸序列(SEQ ID NO:7)编码，在TIGR的被注释为“肽酶，T1家族，推测，表达”。“PPT1-1多肽”在本文中是指来自其他生物体的OSPT1-1多肽及其同源物或同系物，例如玉米(例如，由SEQ IDNO:45或SEQ ID NO:44编码的SEQ ID NO:46)或小麦(例如，由SEQ ID NO:47编码的SEQ IDNO:48；由SEQ ID NO:49编码的SEQ ID NO:50；由SEQ ID NO:51编码的SEQ ID NO:52)。
术语“单子叶”和“单子叶植物”在本文中可互换使用。单子叶在本公开文件中包括禾本科。
术语“双子叶”和“双子叶植物”在本文中可互换使用。双子叶在本公开文件中包括以下植物科属：芸苔科、豆科和茄科。
如本文所用，术语“小麦”是指小麦属的任何物种，包括其祖先，以及通过与其他物种杂交产生的后代。小麦包括由42条染色体组成的具有AABBDD基因组组织的“六倍体小麦”，以及由28条染色体组成的具有AABB基因组组织的“四倍体小麦”。六倍体小麦包括普通小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.mocha)、密穗小麦(T.compactum)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)及其种间杂交品种。四倍体小麦包括硬粒小麦(T.durum)(也称为硬粒小麦或膨胀小麦)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)及其种间杂交。此外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦的可能祖先，例如A基因组的乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦(T.monocococum)或野生一粒小麦(T.boeoticum)、B基因组的拟斯贝尔托山羊草(Aegilops speltoides)和D基因组的节节麦(T.tauschii)(也称为粗山羊草(Aegilops squarrosa)或Aegilops tauschii)。本发明中使用的小麦品种属于但不限于上述任何一种。还包括通过常规技术生产的植物，这些植物使用小麦作为与非小麦物种(如黑麦)进行有性杂交的亲本，包括但不限于小麦。在一些实施例中，小麦植株适合于谷物的商业生产，例如具有本领域技术人员已知的适宜农艺特性的六倍体小麦或硬粒小麦的商业品种。
术语“不育”和“不育性”是指植物不能产生种子。包括但不限于，花粉育性率或结实率低于20％，雌性器官发育缺失或停滞。所述雌性器官包括但不限于胚珠、雌蕊、花柱、柱头等。
术语“半不育”和“半不育性”是指植物不能正常产生种子和/或花粉。包括但不限于，花粉育性率或结实率低于80％但高于20％。
术语“可育”和“可育性”是指植物能够正常产生种子。包括但不限于花粉育性率或结实率在80％以上，且能正常萌发生长。
术语“雄性不育”是指植物不能产生花粉或不能产生足够的花粉，其受植物生殖发育的影响，如从雄蕊分生组织的规格到花粉粒的形成以及授粉。
术语“雌性不育”是指由于雌性器官发育异常而不能产生种子的植物。上述雌性器官的异常发育，包括但不限于胚珠的发育和胚囊形成的过程。
术语“全互补”和“全长互补”在本文中可以互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
术语“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。
“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色量、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、幼苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物整株。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)用于基因改变产生受测植物或细胞的具有同种基因型，用作起始材料的野生型植物或细胞；(b)具有相同基因组作为起始材料，但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。
在本公开发明中，ZH11-WT、ZH11-TC、WT和空载体植株可以被指定为对照植物。ZH11-WT代表野生型中花11；ZH11-TC代表由中花11组培再生的水稻植株；WT代表野生型植株，比如中花11、稻花香2号；空载体表示用空载体DP0158转化的植物。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
术语“基因”是指表达功能分子(例如但不限于特定蛋白质)的核酸片段，包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有自身调节序列的基因。
“突变基因”是指通过人类干预而改变的基因。这种“突变基因”的序列与相应的未突变基因的序列至少有一个核苷酸的添加、删除或替换不同。突变或修饰的植物是包含突变基因的植物。
“靶向突变”是改变天然基因内的目标序列而在天然基因中产生的突变。靶向突变通过使用双链断裂诱导剂诱导本文公开已知的目标序列所在的DNA内双链的断裂。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
关于序列的“异源”意思是来源于外来物种的序列，或者，如果来自同一物种，在组成和/或基因组位置上通过人为干预对其天然的组成形式进行了实质性的修改。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。
术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“重组体”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然的或基因组的核酸序列相比时，具有一个或多个核酸序列改变的一种核酸分子。在一些实施例中，对于天然的或基因组的核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性导致核酸序列的改变；植物表达核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，引入至少一个氨基酸的替换、插入、删除和/或添加导致的核酸序列的改变；去除一个或多个与基因组核酸序列相关的内含子；插入一个或多个异源内含子；删除与基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调控区域；插入一个或多个异源上游或下游调控区域；删除与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非转录区域；插入一个异源5’和/或3’非转录区域；以及改良一个聚腺苷酸化位点。在某些实施例中，所述非基因组核酸分子是一种合成的核酸序列。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“基因修饰”是指由认为活动引起的植物基因组核酸核酸序列的变化或改变。
“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
在本文中“引入”是将一个核酸片段(如，一个重组DNA构建体)插入细胞，意思是“转染”或“转化”或“转导”，还包括将核酸片段并入真核或元和细胞。其中该核酸片段可并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子或瞬时表达(如转染mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“核定位信号”是一种能将蛋白导向细胞核的信号肽(Raikhel(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的基因或是转入的基因。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不特指机理并且包括但不限于反义、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，所述区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。
抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。
“共抑制”指产生正义RNA转录物可以抑制目的基因或基因产物的表达；“正义”RNA涉及RNA转录物，包括在细胞内或者生物体外翻译成蛋白质的mRNA。
另一种抑制构建体是指使用植物病毒序列直接抑制近端mRNA编码序列(1998年8月20日出版的PCT出版物编号WO 98/36083)。
RNA干扰(RNAi)是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)Nature 391：806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信PTGS转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，(1999)Trends Genet.15：358)。
现在可以通过使用在植物中产生小RNA的转基因结构来改变植物基因的基因表达。
小RNA是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。
微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA。
微RNA(miRNA)的设计用于通过结合位于由这些基因产生的转录物中的互补序列(例如通过翻译抑制和RNA切割)来调节靶基因(例如，本文公开的多核苷酸序列)。
“CRISPR-相关基因”是指编码成簇间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组合物的核苷酸序列。所述基因耦合存在，与CRISPR位点侧翼片段相关或相邻。“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，Cas3和Cas9,它们分别编码CRISPR类型I和CRISPR类型II系统中的内切酶。
“Cas内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，所述Cas蛋白能导致DNA靶序列双链断裂。所述向导多核苷酸引导Cas内切酶识别，并有选择性导致细胞基因组特定位点的双链断裂。
“向导RNA(gRNA)”是指一个crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合的杂合RNA分子，由可改变的DNA原件编码。通常，gRNA包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于Cas内切酶和CRISPR复合体结合的结合域。
“向导多核苷酸”是指一个可与Cas内切酶形成复合体、且让Cas内切酶识别和选择DNA剪切靶位点的多核苷酸序列。所述前导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，向导多核苷酸可包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2,6-二氨基嘌呤、2'-氟-A、2'-氟-U、2'-O-甲基RNA、硫代磷酸键、与胆固醇分子的连接，连接到聚乙二醇分子，连接到间隔18(六乙二醇链)分子，或5'到3'共价连接，导致循环。仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也称为“向导RNA”。
术语“向导多核苷酸/Cas内切酶体系”是指含有一个Cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致DNA靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导RNA识别靶序列，Cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列，并对DNA双链进行剪切。
“基因组靶位点”是指定位于宿主基因组的用于定点突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(PAM)。
“前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的DNA序列(12-40个核苷酸)。所述前间区是基于crRNA或sgRNA的间隔序列的碱基互补配对，以CRISPR体系内切酶而导致酶促断裂。
“前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中互换使用，包括与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列域(VT域)与目标序列之间的互补百分比至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％，96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可以至少为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任何组合组成。
术语“Cas核酸内切酶识别结构域”或引导多聚核苷酸的“CER结构域”此处可互换使用，包括与Cas核酸内切酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如引导多聚核苷酸的第二核苷酸序列)。CER结构域由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(例如此处描述的修饰)或它们的任意组合构成。
核苷酸序列连接单引导多聚核苷酸的crnucleotide和tracrnucleotide可以组成RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，核苷酸序列连接单引导多聚核苷酸的crNucleotide和tracrNucleotide组成长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100bp。在另一个实施例中，核苷酸序列连接单多聚核苷酸的crNucleotide和tracrNucleotide组成四核苷酸环序列，诸如，但不限于GAAA四核苷酸环序列。
CRISPR位点(成簇的规律间隔短回文重复，也被称作SPIDRs，间隔穿插的顺向重复)构成近来描述的DNA位点家族，CRISPR位点由短且高度保守的DNA重复(典型的24～40bp，重复1～140次，也称为CRISPR重复)组成，CRISPR位点为部分回文。重复序列(通常具有品种特异性)被固定长度(代表性的20～58bp，根据CRISPR位点而不同)的可变序列间隔开(公布与2007年3月1日的WO2007/025097)。
核酸内切酶是在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶，包括在特定位置切割DNA而不损坏碱基的限制性核酸内切酶。限制性内切酶包括I型、II型、III型和IV型内切酶，它们还包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶和限制酶活性均包含在单一复合物中。核酸内切酶还包括巨核酸酶，也称为归巢内切酶(HEases)，与限制性内切酶一样，在特定的识别位点结合和切割，但是巨核酸酶的识别位点通常较长，约18bp或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061于2012年3月22日提交)。根据保守的序列基序，巨核酸酶被分为四个家族，分别是LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His Cys-box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HEASE以其长识别位点和耐受DNA底物中的某些序列多态性而著名。
TAL效应器核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物体基因组中的特定目标序列上进行双链断裂。TAL效应子核酸酶是通过将天然或工程转录激活子样(TAL)效应子或其功能部分融合到核酸内切酶(如Foki)的催化结构域而产生的。独特的模块化TAL效应器DNA结合域允许设计具有潜在任何给定DNA识别特异性的蛋白质(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29:143-148)。锌指核酸酶(ZFNs)是由锌指DNA结合域和双链断裂诱导剂域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包括两个、三个或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的，并且已经设计。锌指结构域适于设计特异性结合选定多核苷酸识别序列的多肽。ZFN由与非特异性核酸内切酶结构域相连的工程DNA结合锌指结构域组成，例如来自l型的核酸内切酶结构域是核酸内切酶，如Fokl。其他功能可以融合到锌指结合域，包括转录激活域、转录抑制域和甲基化酶。在一些实例中，切割活性需要核酸酶结构域的二聚化。每个锌指识别目标DNA中的三个连续碱基对。例如，一个3指结构域识别9个相邻核苷酸的序列，需要核酸酶的二聚化，两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶点位点”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位点”在本文中互换使用，指基因组中的多核苷酸序列(包括叶绿体和线粒体DNA)在植物细胞基因组中由Cas内切酶诱导的双链断裂。目标位点可以是植物基因组中的内源位点，或者，目标位点可以是植物的异源位点，因此不会出现在天然的基因组中，或者与在自然界中出现的位置相比，可以在异源基因组位置找到目标位点。如本文所用，术语“内源目标序列”和“天然目标序列”在本文中可互换地用于指代植物基因组内源或天然的目标序列，并且位于该目标序列在植物基因组中的内源或天然位置。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“改变的靶点位点”、“改变的靶序列”在本文中互换使用，并指如本文所公开的靶序列，其在与未改变的靶序列相比时包括至少一个改变。例如，这种“改变”包括：(i)替换至少一个核苷酸，(ii)删除至少一个核苷酸，(iii)插入至少一个核苷酸，或(iv)任何(i)-(iii)的组合。
“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的氨基酸保守型替换。例如，利用诸如BLAST,BLAST-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)
现在转向实施例：
实施例包括用于调控植物不育性状的分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体(包括抑制构建体)，包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)。以及利用这些重组DNA构建体的方法，组合物含有不育调控基因及其启动子。
分离的多核苷酸和多肽
本公开发明包括以下分离的多核苷酸和多肽：
在某些实施例中，提供的分离的多核苷酸包含：(i)一种核酸序列，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50、或52相比较时，至少有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)(i)中核酸序列的全长互补序列，其中所述互补序列和(i)中的核酸序列由相同数量的核酸组成，且100％是互补的。在某些实施例中，这些多核苷酸表达的增加导致植物不育。任何前文提到的分离的多核苷酸可以被用于本文公开的任何重组DNA构建体。
在某些实施例中，提供的分离的多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52相比较时，至少有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在某些实施例中，提供的分离的多核苷酸包含(i)一种核酸序列，与SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51相比较时，有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)(i)中的核酸序列的互补序列。任何前文所述的分离的多核苷酸可以被用于本公开发明的任何重组DNA构建体中。在某些实施例中，这些多核苷酸表达的增加导致植物不育。
重组DNA构建体
一方面，本公开发明包括重组DNA构建体。
在一个实施例中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸可操作地连接至少一个调控序列(如，一个植物功能性的启动子)，其中所述多核苷酸包含(i)一个核酸序列，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52相比较时，至少有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)(i)中的核酸序列的互补序列。
在另一个实施例中，所述重组DNA构建体含有一个多核苷酸可操作地连接至少一个调控序列(如，一个植物功能性启动子)，其中所述多核苷酸含有(i)一个核酸序列，与SEQID NO:1、2、4、5、7、8、26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51相比，至少有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)(i)中的核酸序列的互补序列。
在另一个实施例中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸可操作地连接至少一个调控序列(如，一个植物功能性的启动子)，其中所述多核苷酸编码OsZOS3-17、DnaK或PPT1-1蛋白质。这些多肽调节不育性状，并可能来自于，例如，水稻(Oryza sativa)、澳大利亚水稻(Oryza australiensis)、短舌野稻(Oryza barthii)、光稃稻(Oryza glaberrima)(非洲稻)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄蕊野稻(Oryza longistaminata)、南方野稻(Oryza meridionalis)、药用稻(Oryza officinalis)、东非野稻(Oryza punctata)、普通野稻(Oryza rufipogon)(糙米或红米)、一年生野稻(Oryza nivara)(印度野稻)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。
如本领域技术人员理解的，本发明所涵盖的不仅仅是具体的示范性序列。核酸片段的改变导致在给定位点产生化学等效氨基酸，但不影响编码多肽的功能性质，这在本领域众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可由编码另一个疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性较大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替换另一个残基的变化，如用天冬氨酸替换谷氨酸，或一个带正电的残基替换另一个残基，如用赖氨酸替换精氨酸，也可预期产生功能等效的产物。导致多肽分子N端和C端部分改变的核苷酸变化也不会改变多肽的活性。本文所提出的每一个改良都在本领域的常规技术范围内，如同确定保留编码产物的生物活性一样。
调控元件：
本发明公开的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可以包含至少一个调控元件。
调控元件可以是启动子、增强子、5’UTR或3’UTR。
大量启动子可以被用于本发明中的重组DNA构建体。所述启动子可以根据所需结果被挑选，并包括组成型、组织特异型、诱导型或其它在宿主有机体中表达的启动子。
能够使基因在大多数时间、在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。
受35S或UBI启动子控制的候选基因的高水平、组成型表达可能(也可能不)具有多效性效应，尽管当由组成型启动子驱动时，可以估计候选基因的功效。使用组织特异性和/或胁迫特异性启动子可以消除不良影响，但保留调节植物开花时间的能力。在拟南芥中观察到这种类型的耐旱和耐寒效应(Kasuga等人，Nature Biotechnol.17:287-91(1999))。
在植物宿主细胞中使用的适合的组成型启动子包括，例如，在WO 99/43838和美国专利号6072050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子和其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等，Nature 313:810-812(1985))；水稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell.2:163-171(1990))；泛素(Christensen等人，《植物分子生物学》12:619-632(1989)和Christensen等人，《植物分子生物学》，18:675-689(1992))；pEMU(Last等人，理论应用基因81:581-588(1991))；MAS(Velten等，EMBO J.3:2723-2730(1984))；ALS促进剂(美国专利号5659026)等。其他组成型分子还包括，例如，美国专利号5608149、5608144、5604121、5569597、5466785、5399680、5268463、5608142和6177611中讨论的启动子。
在选择本发明方法中使用的启动子时，可能需要使用组织特异性或发育调节的启动子。
组织特异性或发育调控启动子是一种DNA序列，它选择性地调节对雄穗发育、结实或两者都至关重要的植物细胞/组织中DNA序列的表达，并将这种DNA序列的表达限制在植物雄穗发育或种子成熟期。可在本发明的方法中使用引起所需时间和空间表达的任何可识别的启动子。
对于多核苷酸在发育中的种子组织中的表达，特别感兴趣的启动子包括种子优选启动子，特别是早期的内核/胚胎启动子和晚期内核/胚胎启动子。授粉后的籽粒发育大致分为三个初级阶段。籽粒生长的滞后期约为0至10～12DAP(授粉后天数)。在这一阶段，内核的质量并没有显著增长，但正在发生一些重要的事件，这些事件将决定内核的活力(例如，建立的细胞数量)。线性颗粒填充阶段从大约10-12DAP开始，持续到大约40DAP。在籽粒发育的这一阶段，籽粒几乎达到其最终质量，并产生各种贮藏产品(即淀粉、蛋白质、油)。最后，成熟期从大约40DAP到收获。在内核发育的这一阶段，内核变得静止并开始干燥，为发芽前的长时间休眠做准备。如本文所定义，“早期内核/胚胎启动子”是主要在发育滞后阶段(即从约0到约12DAP)在发育种子中驱动表达的启动子。如本文所定义，“晚期内核/胚胎启动子”主要在发育中的种子从大约12DAP到成熟过程中驱动表达。在表达窗口中可能有一些重叠。启动子的选择将取决于所利用的ABA相关序列和所需的表型。
早期内核/胚胎启动子包括例如在特定组织中具有活性5DAP的Cim1(WO 00/11177)，其通过引用并入本文。其他早期内核/胚胎启动子包括种子优选启动子end1，其活性为7-10DAP；以及end2，其在整个内核中活性为9-14DAP，在胚乳和果皮中活性为10DAP(WO00/12733)，通过引用并入本文。在本发明的某些方法中使用的其他早期内核/胚胎启动子包括种子优选启动子ltp2(美国专利号5525716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6403862)；玉米nuc1c(美国专利号6407315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6921815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7122658)；玉米ESR启动子(美国专利号7276596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米促进剂eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米促进剂ADF4(美国专利申请号60/963878，2007年8月7日提交)。用于调节本发明的核苷酸序列在植物中的表达的附加启动子是茎特异性启动子。此类秸秆特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27:513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)等，通过引用并入本文。
本发明中使用的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合酶、R等位基因、血管组织首选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)，玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选启动子，如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(美国出版物2006/0156439，2006年7月13日出版)、玉米ROOTMET2启动子(WO 2005/063998，2005年7月14日出版)、CR1BIO启动子(WO 2006/055487，2006年5月26日出版)、CRWAQ81启动子(WO 2005/035770，2005年4月21日发布)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI注册号U38790；NCBI GI号1063664)。
本发明的重组DNA构建体还可包括其他调节元件，包括但不限于翻译先导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。在本发明的另一实施例中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可添加到5'非翻译区、蛋白质编码区或3'非翻译区，以增加积累在细胞质中的成熟信息量。在植物和动物表达结构的转录单元中加入可剪接内含子可以使基因mRNA和蛋白质水平的表达增加至1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.，8:4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1:1183-1200(1987))。
增强子或增强子元件是指顺式作用转录调控元件，也称顺式元件，其赋予可操作连接的多核苷酸序列的整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动转录。分离的增强子元件可与启动子融合以产生一种嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的整体调节的一个方式。本领域已知增强子，包括SV40增强子区域、CaMV 35S增强子元件等。已知一些增强子还通过例如引起调节元件来改变正常调节元件表达模式在没有增强子情况下的组成性表达，相同的调控元件仅在一个或几个特定组织中表达。复制CaMV35S启动子的上游区域已被证明可将表达增加约十倍(Kay，R.等人，(1987)Science 236:1299-1302)。
组合物：
提供了在其基因组包含有任何本文公开的重组DNA构建体的植物(例如上文中所述的任何构建体)。在某些实施例中，所述重组DNA构建体含有异源调控元件。组合物还包括所述植物的任何子代，以及从植物或其子代获得的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中含有所述DNA构建体。子代包括通过自交或杂交授粉获得的后继世代。子代还包括杂交系和自交系。
在杂交种子繁殖作物中，成熟的转基因植物可以自花授粉，以产生纯合的自交系植物。该自交系植物繁育出含有新引入的重组DNA构建体的种子。这些种子可以被种植以产生具有改变的农艺性状的植物，或者用于育种计划以产生杂交种子，这些种子可以被种植以培育出具有这种改变的农艺性状的植物。种子可以是玉米种子、小麦种子或水稻种子。
本文所述组合物的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，例如玉米杂交植物或玉米自交植物。植物也可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或小米。
重组DNA构建体稳定整合到植物基因组中。
实施例包括但不限于：
在其基因组中含有重组DNA构建体的转基因植物(例如，水稻、玉米、小麦或大豆植物)，重组DNA构建体含有一个多核苷酸可操作地连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52序列相比较时，有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。且其中所述植物表现出不育的性状。
实施例1所述的植物，其中所述多核苷酸编码ZOS3-17、DnaK或PPT1-1多肽，例如来自于水稻(Oryza sativa)、澳大利亚水稻(Oryza australiensis)、短舌野稻(Oryzabarthii)、光稃稻(非洲稻)(Oryza glaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄蕊野稻(Oryza longistaminata)、南方野稻(Oryza meridionalis)、药用稻(Oryzaofficinalis)、东非野稻(Oryza punctata)、普通野稻(糙米或红米)(Oryza rufipogon)、一年生野稻(Oryza nivara)(印度野稻)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zeamays)、大豆蛋白(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)或小麦。
实施例1至2中上述植物的任何后代，实施例1至2中上述植物的任何种子，实施例1至2中上述植物的任何后代的任何种子，以及实施例1至2中上述植物的任何细胞及其后代。
在公开发明中，任意前述实施例1-3中或任何其它实施例中，所述重组DNA构建体可以包含至少一个植物功能性的异源启动子作为一个调控元件。
下述实例描述了调控植株不育性状的一些具有代表性的协议和技术，并在该条件下观察和评估植物的农艺性状。
在重组DNA构建体为半合子的转化植物子代中，其子代会分离成包含或不包含重组DNA构建体的植物：包含重组DNA构建体的子代通常相对于不包含重组DNA构建体的子代进行测量(例如，不包含重组DNA构建体的后代为对照或参考植物)。
重组DNA构建体渗入自交品种如玉米，或渗入单系品种如大豆：所述被渗入的株系通常相对于自交的亲本或单系品种进行测量(即，亲本自交系或单系品种作为对照或参照植物)。
两个杂交系，其中第一个杂交系由两个亲本自交系产生，第二个杂交系由相同的两个亲本自交系产生，但其中一个亲本自交系包含重组DNA结构：第二个杂交系通常相对于第一个杂交系进行测量(即，第一个杂交系是对照或参照植物)。
含有重组DNA的植物：所述植物可以相对于不含有重组DNA构建体，但在其它方面与植物有相似的遗传背景的对照植物进行评价或测量。例如，与包含重组DNA构建体的植物相比，对照植物共享至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核遗传物质同一性。
方法
本发明提供了用于植物或植物细胞的基因组内目标序列的基因修饰、用于筛选植物、用于基因编辑、用于向植物基因组插入目的多核苷酸的方法。该方法使用向导RNA/Cas核酸内切酶系统，其中所述Cas核酸内切酶是由向导RNA来引导识别的，且选择性地在细胞基因组的特定目标位点引入双链断裂。所述向导RNA/Cas核酸内切酶系统提供了一种有效的系统，用于修饰植物、植物细胞或种子基因组内的靶位点。进一步还提供了使用向导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统提供用于修饰细胞基因组内目标位点和编辑细胞基因组内的核苷酸序列的有效系统的方法和组合物。一旦基因组目标位点被识别，多种方法都能够被用于进一步修饰目标位点，以使其包含多种目标多核苷酸。
在一个实施例中，用于修饰植物细胞基因组内的目标位点的方法，包括向所述植物引入一个向导RNA和一个Cas核酸内切酶，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能组成一个复合物，使得Cas核酸内切酶能在所述目标位点引入双键断裂。
进一步提供了修饰植物细胞基因组内目标位点的方法，所述方法包括：a)向植物细胞引入一个向导RNA和一个Cas核酸内切酶，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能组成一个复合物使得Cas核酸内切酶能向所述目标位点引入双链断裂；和，b)识别至少一个在所述目标位点进行修饰的植物细胞，其中所述修饰包括至少一个所述目标位点的一个或多个核苷酸的删除、插入或替换。
蛋白质可以经多种途径被改变，包括氨基酸的替换、缺失、截断和插入。这些操作的方法通常是已知的。例如，蛋白质的氨基酸序列变体可通过DNA突变制备。突变和核苷酸序列改变的方法包括，例如，Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:488-92；Kunkel等人(1987年)及其引用的参考文献。例如，在Dayhoff等人(1978)的模型《蛋白质序列和结构图谱》(Natl Biomed Res found，Washington，D.C.)中，找到了关于不可能影响蛋白质生物活性的氨基酸替代的指南。保守替换可能是优选的，例如将一种氨基酸与具有类似性质的另一种氨基酸交换。保守缺失、插入和氨基酸替换预计不会对蛋白质的特性产生根本性变化，任何替换、缺失、插入或其组合的效果都可以通过常规筛选分析进行评估。已知双链断裂诱导活性的分析，通常测量试剂在含有靶位点的DNA底物上的总体活性和特异性。
还提供了一种编辑细胞基因组核苷酸序列的方法，所述方法包括向细胞引入一个向导多核苷酸、一个Cas核酸内切酶和一个可挑选的多核苷酸修饰模板。其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能组成一个复合物使得所述Cas核酸内切酶能向所述植物基因组内的目标位点引入双链断裂。所述多核苷酸修饰模板在所述核苷酸序列中含有至少一个核苷酸修饰。细胞基因组中所述核苷酸序列选自：启动子序列、终止序列、调控元件序列、剪接位点、编码序列、多泛素化位点、内含子位点和内含子增强基序。
本发明进一步提供了一种编辑细胞基因组中启动子序列的方法，该方法包括向细胞引入一个向导多核苷酸、一个多核苷酸修饰模板和至少一个Cas核酸内切酶。所述向导RNA和Cas核酸内切酶能够合成一个复合物，是的所述Cas核酸内切酶在所述细胞基因组的目标位点上引入一个双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板含有至少一个所述核苷酸序列的核苷酸修饰。
一种产生转基因植物的方法，包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体转化的植物细胞，并从转化的植物细胞再生转基因植物。本发明还涉及通过该方法产生的转基因植物，以及由该转基因植物获得的转基因种子。
一种从细胞或细胞培养基中分离本发明的多肽的方法，其中所述细胞含有包含本发明的多核苷酸的重组DNA构建体，可操作地连接至少一个调控元件，且所述转化的宿主细胞在适合该重组DNA构建体表达的条件下生长。
一种改变宿主细胞中本发明的多肽的表达水平的方法，包括：(a)向一个宿主细胞转化本发明的重组DNA构建体；和(b)让被转化的宿主细胞在适合该重组DNA构建体表达的条件下生长。其中所述重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中产生水平改变的本发明的多肽。
一种产生改良植物的方法，包括用本发明的任何CRISPR-Cas构建体转化植物细胞，并从转化的植物细胞再生一个改良植物。其中，通过这种方法获得的改良植物和改良种子可以被用于本发明的另一种方法。
一种改变植物中本发明的多肽的表达水平的方法，包括：(a)使用本发明的CRISPR-Cas构建体转化一个可再生植物细胞；和(b)由步骤(a)的可再生植物细胞再生一个改良的植物，其中所述植物基因是被编辑的；和(c)使这个转化植物生长，其中该CRISPR-Cas构建体的表达导致转化植物中产生改变水平的本发明的多肽。
一种生产种子的方法，包括上述任何一种方法，还包括从所述子代植物获得种子。其中所述种子在它们的基因组中含有所述重组DNA构建体。
一个实施例提供了一种使植物(如水稻)不育的方法，这种方法包括提高编码多肽的多核苷酸表达，所述多肽与SEQ ID NO:3、6或9有至少90％的序列一致性。所述多核苷酸表达的增加可以通过本文描述的任何方法、使用本文描述的任何多核苷酸或组合物来介导。
在一些实施例中，本发明提供了在其基因组中含有本发明的重组DNA构建体的种子。
向植物引入本发明的重组DNA构建体可以使用任何合适的技术，包括但不限于直接DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。植物转化和再生的技术在国际公开专利WO2009/006276中已有描述，该专利通过引用并入本文。
含有编码目的蛋白的外源分离的核酸片段的植物的生长或再生在本领域内是众所周知的。所述再生植物自花授粉以提供纯合转基因植物。源自于可再生植物的花粉还可与重要的农艺株系种子植物进行杂交。或者反过来，来自于这些重要株系的花粉用于为再生植物授粉。使用领域内技术人员熟知的方法培养含有所需多肽的本发明的转基因植物。
性状的堆叠
改良植物可以含有一个或多个本文中的不育多核苷酸和一个或多个附加多核苷酸的堆叠，导致多重多核苷酸序列的产生或抑制。含有多核苷酸序列堆叠的改良植物能通过传统育种方法或转基因技术方法获得。这些方法包括，但不限于，培育含有目标多核苷酸的单个植株、基因编辑、将含有本文所公开基因的转基因植物转化为后续基因并将基因共转化为单个植物细胞。在本文中，术语“堆叠”是指包括有多重性状存在于同一个植物中(例如，两个性状都并入核基因组，一个性状并入核基因组，一个性状并入质体基因组，或者两个性状都并入质体基因组)。在一个非限制性例子中，“性状堆叠”包含一个分子堆叠，其序列在物理上彼此相邻。在本文中，性状是指源自于特定序列或一组序列的表型。所述序列的表达能够由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，能够意识到引入一个转化盒将会抑制目的多核苷酸的表达。可以与任何其他抑制盒或过表达盒的组合相结合，以产生植物中所需的性状组合。还需进一步认识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统堆叠在目标基因组位置。
实例
实例1
不育基因克隆和过表达载体的构建
使用含有四个来自花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子的多聚增强子元件的双元结构载体，并使用四个粳稻品种(中花11、超优1号、台中65和日本晴)开发水稻激活标签突变体库，按照Lin和Zhang(2005)Plant Cell Rep.23:540-547)所述，通过农杆菌介导的转化方法转化。建立转基因株系，收获转基因种子，形成水稻激活标签突变体库。
在重复的田间试验中确认不育标记株系(ATL)，并确定其T-DNA插入位点。克隆T-DNA左、右边缘附近的基因，并通过田间筛选对功能基因进行重述。此处仅显示了重述的功能基因。并基于表2所示的这些基因的LOC ID。设计引物克隆水稻不育基因OsZOS3-17、OsDnaK和OSPT1-1。
表2.水稻基因名称、基因ID(来自TIGR)和构建体ID
基因名称 LOC ID 构建体ID
OsZOS3-17 LOC_Os03g50850 DP0640
OsDnaK LOC_Os03g16920 DP1673
OsPPT1-1 LOC_Os08g43540 DP1675
在琼脂糖凝胶电泳后使用柱试剂盒提取PCR扩增产物，然后与TA克隆载体连接。序列测定证实了这些结构中的序列和方向。每个基因都被克隆到一个植物双元结构载体中。
实例2
产生基因表达增强的水稻植株
如Lin和Zhang所述(Plant Cell Rep.23:540-547(2005))通过农杆菌介导将过表达载体和空载体(DP0158)转化到中花11水稻(Oryza sativa L.)。将转化实验室产生的转基因苗(T0)移栽到田间获得T1种子。T1和T2种子储存在4℃下。过表达载体包含DsRED和HYG基因。在绿色荧光灯下呈红色的T1和T2种子为转基因种子，用于以下不育性检测。
转基因水稻植株的基因表达分析：
通过标准实时RT-PCR程序分析转基因水稻植株中的基因表达水平。以EF1α基因为内对照，表明转基因水稻样品和对照植株样品的扩增和装载相似。表达水平根据EF1αmRNA水平标准化。
使用SEQ ID NO:16和17的引物检测DP0640转基因水稻植株中的OsZOS3-17基因表达水平。从T1和T2代幼苗的叶片中提取mRNA。如图1所示，ZH11-TC水稻中的表达水平设置为1.00，并且OsZOS3-17基因在几乎所有被测转基因株系中过表达。
DP0640-F1 5’-AGGCAAAAGAACTCTGGGAG-3’(SEQ ID NO:16)
DP0640-R1 5’-CTGCAGATCAGTGTAGGTCTTC-3’(SEQ ID NO:17)
使用SEQ ID NO:18和19的引物检测DP1673转基因水稻植株中的OsDnaK基因表达水平。从T1代幼苗叶片中提取mRNA。如图2所示，ZH11-TC水稻中的表达水平设置为1.00，并且OsDnaK基因在几乎所有测试的转基因系中都过表达。
DP1673-F1 ATCGAGGATGCCATCAAGTG(SEQ ID NO:18)
DP1673-R1 CGCCCTGGTACATCTTTGAG(SEQ ID NO:19)
使用SEQ ID NO:20和21的引物检测DP1675转基因水稻植株中的OSPT1-1基因表达水平。从T1代幼苗叶片中提取mRNA。如图3所示，ZH11-TC水稻中的表达水平设置为1.00，并且OSPT1-1基因在几乎所有测试的转基因系中都过表达。
DP1675-F1 5’-GTGGCAAGAACATCGAGATTG-3’(SEQ ID NO:20)
DP1675-R1 5’-TTCAATCTCAGCCACGTACTC-3’(SEQ ID NO:21)
实例3
OsZOS3-17过表达水稻植株的不育性状
繁殖期间观察不育表型。根据花粉育性率和结实率将育性分为三个水平，如表3所示。通过花粉显微镜检查和对I2-KI溶液的反应，将花粉分为四种类型，如表4所示。
表3.根据花粉育性和结实率对植物育性的分类
Figure BDA0003456330840000191
表4.通过花粉显微镜检查和对I2-KI溶液的反应进行花粉分类
Figure BDA0003456330840000192
将OsZOS3-17转基因水稻植株种植在北京(40°13'N)以获得种子。结果如下。
T1代不育性状
表5列出了OsZOS3-17转基因水稻T1代的结实率。13个株系中有4个(DP0640.05、DP0640.06、DP0640.07、DP0640.13)是可育的。在其他9个株系中，有可育株和不育株。所有株系的可育株与不育株的比例约为3:1，表明存在潜在的隐性不育基因。
表5.DP0640在北京的T1代结实率(第一次试验)
Figure BDA0003456330840000201
为了证实观察结果，在北京再次种植了三个T1代株系。对来自转基因水稻植株的花粉进行了测试，并对同一穗套袋以测量结实率。如表6所示，T1代所有三个株系的花粉都是可育的。如表7所示，来自三个OsZOS3-17转基因水稻株系的套袋穗分别是可育、半不育和不育的；可育穗与不育穗的比例为2.4:1。如表8所示，三个OsZOS3-17转基因水稻株系为可育、半不育和不育穗；可育穗与不育穗的比例约为3:1。这些结果一致表明OsZOS3-17可能是一个隐性不育基因。
表6.DP0640在北京T1代的花粉育性(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000202
表7.DP0640在北京T1代套袋的穗结实情况(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000203
表8.DP0640在北京T1代结实情况(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000204
Figure BDA0003456330840000211
T2代不育性状
在T2代种植OsZOS3-17转基因水稻植株。对来自转基因水稻植株的花粉进行了测试，并将同一穗套袋以测量结实率。如表9所示，13个株系的花粉都是可育的。如表10所示，来自OsZOS3-17转基因水稻株系的套袋穗是可育、半不育和不育的；可育穗与不育穗的比例为3.9:1。如表11所示，13个转基因水稻株系为可育、半不育和不育穗；可育穗与不育穗的比例为3.5:1。这些结果与T1代的结果一致，表明OsZOS3-17可能是一个隐性不育基因。
表9.DP0640在北京T2代花粉育性
Figure BDA0003456330840000212
表10.DP0640在北京T2代套袋穗结实情况
Figure BDA0003456330840000213
Figure BDA0003456330840000221
表11.DP0640在北京T2代结实情况
Figure BDA0003456330840000222
在上述实验中观察到花粉和雌蕊表型。OsZOS3-17转基因水稻的花粉是可育的(图4)。OsZOS3-17转基因水稻在雌蕊中未观察到异常表型。在田间试验中，除少数单株外，大多数转基因水稻植株只有不育表型，其他表型，包括但不限于株高、生育期、产量等均正常。
OsZOS3-17转基因水稻种子表型
在T2代和T3代分别种植一行DP0640.02和一行DP0640.12.01以获得种子。然而，大多数种子是瘪粒(图5)。需要进行种子发芽试验，以验证瘪粒的不育表型。
OsZOS3-17转基因水稻种子发芽试验
对DP0640.02的一个T2代株系和DP0640.12.01的一个T3代株系进行了三次试验，每次试验种植50粒种子作为重复。ZH11-TC和DP0158用作对照。所有种子均置于42℃烘箱中72小时，以打破种子休眠。将种子均匀地放在发芽箱中，用滤纸覆盖并加入18ml水，然后在28℃的培养箱中培养8天。然后记录发芽率。
如表12所示，OsZOS3-17转基因水稻种子的发芽率低于ZH11-TC和DP0158对照。在OsZOS3-17转基因水稻植株中，纯合种子的发芽率低于杂合种子。所有干瘪的种子都没有发芽。
表12.DP0640株系T2代和T3代种子发芽率
株系ID 基因型 种子总数 发芽数 未发芽数 发芽率
ZH11-TC 150 147 3 98％
DP0158.mix 150 142 8 95％
DP0640.02-1 杂合 150 111 39 74％
DP0640.02-2 纯合 150 8 142 5％
DP0640.12.01-1 杂合 150 136 14 91％
DP0640.12.01-2 纯合 150 7 143 5％
OsZOS3-17转基因水稻种子的荧光分离比
测定了OsZOS3-17转基因水稻种子的荧光分离率。对三个株系的28株T1代种子进行了检测，每株100粒。结果表明，2800个种子中有2128个在绿色荧光下呈红色，而2800个种子中有672个不呈红色。红色种子与正常种子的比例为3.2:1。
还检查了T2代13个株系的156株植物的种子，每株植物100粒种子。共测试了15519粒种子。结果表明，11836个种子在绿色荧光下呈红色，而3683个种子不呈红色。红色种子与正常种子的比例为3.2:1。这些结果表明，OsZOS3-17转基因水稻基因组中插入了单个OsZOS3-17基因。
表13.OsZOS3-17转基因水稻种子的荧光分离比
Figure BDA0003456330840000231
OsZOS3-17转基因水稻的正交和反交试验结果
为了进一步研究OsZOS3-17基因的功能，进行了正交和反交的杂交实验，实验中仅使用纯合植物。如表14所示，来自10个植株的560个小花与来自野生型ZH11的花粉的杂交没有产生任何种子；而705个带有野生型ZH11的小花与OsZOS3-17转基因植物的杂交产生种子，部分种子在绿光下呈红色。这些数据表明OsZOS3-17是一个潜在的雌性不育基因。
表14.DP0640转基因株系正交和反交的结实情况
Figure BDA0003456330840000232
Figure BDA0003456330840000241
用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的引物通过PCR验证反交种子。PCR验证结果表明，所有反交植物均含有OsZOS3-17基因。还测量了反交植物的结实。如表15所示，所有植物都是可育的。
表15.DP0640株系反交的结实
Figure BDA0003456330840000242
实例4
OsDnaK过表达水稻植株的不育特性
实施例3说明了植物育性和花粉类型的分类。种植OsDnaK转基因水稻植物以获得种子。结果如下所示。
T0代的表型
将转化实验室产生的49株转基因幼苗(T0，DP1673)移植到海南田间(18°30'N)，10月获得T1种子。水稻植物使用常规杀虫剂和肥料进行管理。OsDnaK转基因水稻植株的株型、穗表型在整个生长期与野生型水稻植株相同。最后，从25个株系收获一些种子，但从另外的24个株系中没有获得种子。该数据表明OsDnaK基因的过表达可影响不育性状，OsDnaK是显性不育基因。
T1代的不育性状
为了进一步证实T0代的不育性状，将前15个株系的种子种植在北京田间(40°13'N)。测量OsDnaK转基因水稻植株的结实率或花粉育性。表16列出了DP1673的T1株系的结实率。15个株系中的13个表现出完全不育表型，2个株系(DP1673.06，DP1673.12)是可育的。这些数据进一步表明OsDnaK基因的过表达可影响不育性状。
表16.DP1673在北京T1代的不育表型
Figure BDA0003456330840000243
Figure BDA0003456330840000251
为了解表型是否受位置和/或环境因素的影响，OsDnaK转基因水稻的稻桩于10月从北京移栽到海南。如表17所示，几乎所有水稻植物的花粉都是可育的或半不育的。而北京和海南的6个株系(DP1673.01，DP1673.02，DP1673.05，DP1673.10，DP1673.14，DP1673.15)的种子仍然完全不育；另外6个株系(DP1673.03，DP1673.04，DP1673.07，DP1673.08，DP1673.09，DP1673.11)在北京不育，但在海南结实(半育或高不育)；其余3个株系(DP1673.06，DP1673.12，DP1673.13)在北京和海南均表现出分离的不育表型。
表17.DP1673在北京T1代的不育表型
Figure BDA0003456330840000252
有趣的是，来自同一植物的6个株系(DP1673.03，DP1673.04，DP1673.07，DP1673.08，DP1673.11，DP1673.12)的穗的结实不同。新分蘖发育的穗表现出可育的表型，而最早的和较老的穗在套袋或未套袋条件下均表现出不育表型。
北京和海南穗发育过程中的温度和日照长度不同。在北京地区，温度超过23℃，日照时间超过12小时；而在幼穗发育期间，海南田间温度低于23℃，日照长度短于12小时。这些结果表明DP1673植物的不育性受温度和日照长度的影响。
为了解这些稻桩的不育表型是否像第一次北京田间种植一样保留下来，来自海南的稻桩被移栽回北京田间。如表18所示，除了在第一次种植中观察到的DP1673.06株系之外，所有株系都表现出不育表型。这些结果进一步证实OsDnaK可能是雌性不育基因，其功能受环境因素的影响。
表18.DP1673在北京T1代的不育表型(第二次)
Figure BDA0003456330840000261
为了解DP1673植物中的转基因表达水平是否与不育表型相关，从第二次北京田间种植的稻桩植物中收集叶片样品，并进行定量RT-PCR分析。如图2所示，表现出不育表型的所有株系都有增加的OsDnaK的表达且超过200倍，而表现出可育的DP1673.06株系OsDnaK的表达仅增加21倍。这些结果表明OsDnaK转基因表达水平与不育密切相关。
T2代的不育特性
我们种植了T2代的3个株系(DP1673.04，DP1673.07和DP1673.06)。结实结果表明来自DP1673.04和DP1673.07的植物是不育的，而DP1673.06株系是可育的。此外，来自DP1673.04和DP1673.07植物的新分蘖，其经历较低温度(<20℃)以及短日照长度(<12小时)表现出可育表型。这些结果与T1代的数据一致。说明，OsDnaK可能是一种雌性不育基因，其功能受环境因素的影响。
OsDnaK转基因水稻的正交和反交结果
为了进一步研究OsDnaK基因的功能，在北京进行了正交和反交的杂交实验。如表19所示，来自野生型ZH11的花粉与7个株系的502个小花的杂交产生很少种子；5个株系中的384个小花的花粉与野生型ZH11杂交产生种子，并且一些种子在绿色荧光光下显示红色。这些数据表明OsDnaK是一个潜在的雌性不育基因。
表19.DP1673株系正交和反交的结实
Figure BDA0003456330840000262
Figure BDA0003456330840000271
OsDnaK转基因植物的雌蕊发育
为了解OsDnaK的雌性不育机制，在北京田间仔细观察了T2代DP1673.01植株的发育过程。来自DP1673植物的花粉通过I2K染色发现可育，如图7所示。来自DP1673.01植物的花粉的繁殖力超过90％。DP1673.01植物的雌蕊在授粉前明显正常生长，然而，它们的子房和柱头在授粉后枯萎并死亡，如图8所示。这些结果清楚地表明OsDnaK在授粉后阻止了雌蕊的发育。其它株系也观察到类似现象，例如DP1673.04和DP1673.07。
实例5
OsPPT1-1过表达水稻植株的不育性状
实例3说明了植物育性和花粉类型的分类。种植OsPPT1-1转基因水稻植株以获得种子。结果如下所示。
T1代的不育性状
T1代15个株系种植在北京田间(40°13'N)。表20列出了T1代OsPPT1-1转基因水稻的结实率。15个株系中的7个(DP1675.02，DP1675.04，DP1675.09，DP1675.10，DP1675.11，DP1675.14，DP1657.15)完全可育。而其他8个株系中有可育植株，也有不育植株。所有转基因植株的可育植株与不育植株的比例约为21:4，表明OsPPT1-1是潜在的隐性不育基因。
表20.DP1675在北京T1代的结实(第一次试验)
Figure BDA0003456330840000272
Figure BDA0003456330840000281
为了确认观察结果，T1代的15个株系在北京地区再次进行验证。使用显微镜观察来自转基因水稻植株的花粉，并将穗套袋以测量结实率。如表21所示，T1代所有株系的可育花粉率均为97％。这表明OsPPT1-1转基因植物的花粉育性是正常的。如表22所示，来自15个OsPPT1-1转基因水稻植物的套袋的穗是可育的，半不育的和不育的；可育穗与不育穗的比例为3.2:1。收获前，测量所有单株植株的结实率。如表23所示，15个OsPPT1-1转基因水稻株系是可育的，半不育的和不育的穗；可育穗与不育穗的比例约为3.1:1。这些结果一致表明OsPPT1-1可能是隐性不育基因。
表21.DP1675在北京T1代的花粉育性(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000282
表22.DP1675在北京T1代套袋穗的结实(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000283
Figure BDA0003456330840000291
表23.DP1675在北京T1代的结实(第二次试验)
Figure BDA0003456330840000292
在上述实验中观察到花粉和雌蕊表型。OsPPT1-1转基因水稻植株的花粉可育(图9)，OsPPT1-1转基因水稻植株未观察到雌蕊异常表型。在田间试验期间，除了少数单株植物外，大多数转基因水稻植物仅具有不育表型，并且其他表型包括但不限于株高、生长期、产量等都是正常的。
为了解表型是否受位置和/或环境因素影响，10月将OsPPT1-1转基因水稻的稻桩从北京移栽到海南。通过显微镜检查T1代11株不育植株的花粉，并对穗进行套袋以测量结实率。如表24所示，花粉是可育的和半不育的。这可能受到海南在孕穗和/或开花阶段的低温影响。除DP1675.08株系外，所有其他株系的结实率均为不育。总之，来自所有植株的花粉是可育的或半不育的，而套袋植株的结实率是不育的或高不育的。结果表明OsPPT1-1是一种雌性不育基因。
表24.DP1675在海南T1代不育表型(第三次试验)
Figure BDA0003456330840000293
Figure BDA0003456330840000301
OsPPT1-1转基因水稻种子的荧光分离比
测定OsPPT1-1转基因水稻种子的荧光分离率。使用来自每株植物的100粒种子测定T1代15个株系的165株植物的种子。结果表明，16460粒种子中有12449粒在绿色荧光灯下呈红色，而16460粒种子中有4011粒未呈红色。红色种子与正常种子的比例为3.1:1。结果表明，在OsPPT1-1转基因水稻基因组中插入了一个OsPPT1-1基因。
OsPPT1-1转基因水稻的反交结果
为了进一步研究OsPPT1-1基因的功能，进行了反交实验。用SEQ ID NO:24和SEQID NO:25的引物通过PCR验证杂交种子。PCR验证结果表明，所有杂交植株均含有OsPPT1-1基因。测量杂交植株的结实。如表25所示，所有植株都是可育的。
表25.DP1675株系的F1代反交植株的结实
Figure BDA0003456330840000302
挑选F1代绿色荧光下红色的种子种植在海南。如表26所示，杂交植株的结实率是可育的、半不育的和不育的穗；可育穗与不育穗的比例约为1.4:1。这可能受到海南在孕穗和/或开花阶段的低温影响。这些结果也表明OsPPT1-1可能是一个隐性的雌性不育基因。
表26.DP1675株系的F2代反交植株结实
Figure BDA0003456330840000303
Figure BDA0003456330840000311
序列表
<110> 未名生物农业集团有限公司
先锋海外公司
<120> 不育基因及其相关构建体和应用
<130> RTS22593Q
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gaaaaaattc ccccaaaacc ctagcggcgg cggcgcgcgc tcccctcccc acctccgccg 60
ccgcggcgtc gaggcagcac cggagggcga tggcgtcgac ggtgctggag gcgacgcggg 120
cgaagcacga ggacatggag aggctggagc ggctggcggt gcgggagctg cagcgggagc 180
ccgccaacgc gcgcgaccgc ctctaccagt cccaccgcgt gcgccacatg ctcgacctcg 240
tcatctccac ctccggcaag ctcgtggaaa tctacgagga caaggataat gctaggaagg 300
atgagatctc caaccatctt agttccacag tgcaagctga aatctttcca aagttctatg 360
acaggctcaa agagatccgt gattaccata ggcgtaatcc ttctgcccgt ttcgttagtg 420
caactgatga tttcgaagag ctactaaagg aggaaccggc tattgaattc actggagagg 480
aagcttttgg ccgatacctg gacttgcatg agctttacaa tgagttcata aattccaagt 540
ttggaactcc aatggaatac tcagcatatg ttggcacctt ttctcatgtg gagaagatgg 600
cacaaaatct gaaaacctcc aggcaataca gagaatacct ggagcatatt ttggagtatc 660
tgacatcatt tctgtatcac acagaaccat tgcaagacat tgagaagatt tttgcaaagt 720
tggaaagcga gtttgaagaa cagtggatca atggtgaagt gcctggatgg gagagcaagg 780
acccagagaa agaatctgca caagagtcag taatagacct tgattactat accactgttg 840
aagagcttgt tgagctgggc ccagaaaagt tgaaagaggc tttagctgct cgtggattaa 900
aaagtggtgg tactgttcaa cagcgtgctg agcgactttt cttgttgaag catacaccct 960
tggaacaatt ggatcgtaag cattttgcca aaggttcaca cagttctgtc tccaatgcta 1020
cttctaatgg taacaatttc aaggataatt tgaagaagga aattgcttta atggaagtaa 1080
agatgaggcg cctttgtgag ctactagatg agatcattgt acggacaaag gaaaatgcag 1140
agaagaagct gactctcaca tatgaagaaa tggaagcaga acgagaagag gaagaagtgc 1200
aagctgatag tgaaagtgat gatgaagacc aacaaatcta caatcctctt aagttgccga 1260
tgggttggga cggcaaacct ataccctatt ggctatataa gctccatggt cttggtcagg 1320
aattcaaatg tgagatatgt ggaaaccaca gctactgggg gcgacgggct tatgagcggc 1380
atttcaagga gtggcgccat cagcacggga tgcgctgtct tggaattcct aatactaaga 1440
acttcaatga aatcacatcc atccaggagg caaaagaact ctgggagaaa attcaacaac 1500
gacaagggct gaacaagtgg cggccagacc tagaagaaga gtacgaagat caggagggaa 1560
atatctacaa caagaagacc tacactgatc tgcagcgcca gggcctgatt tagaatccct 1620
gatgcgatcc taacattttg gccc 1644
<210> 2
<211> 1524
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
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cggctggcgg tgcgggagct gcagcgggag cccgccaacg cgcgcgaccg cctctaccag 120
tcccaccgcg tgcgccacat gctcgacctc gtcatctcca cctccggcaa gctcgtggaa 180
atctacgagg acaaggataa tgctaggaag gatgagatct ccaaccatct tagttccaca 240
gtgcaagctg aaatctttcc aaagttctat gacaggctca aagagatccg tgattaccat 300
aggcgtaatc cttctgcccg tttcgttagt gcaactgatg atttcgaaga gctactaaag 360
gaggaaccgg ctattgaatt cactggagag gaagcttttg gccgatacct ggacttgcat 420
gagctttaca atgagttcat aaattccaag tttggaactc caatggaata ctcagcatat 480
gttggcacct tttctcatgt ggagaagatg gcacaaaatc tgaaaacctc caggcaatac 540
agagaatacc tggagcatat tttggagtat ctgacatcat ttctgtatca cacagaacca 600
ttgcaagaca ttgagaagat ttttgcaaag ttggaaagcg agtttgaaga acagtggatc 660
aatggtgaag tgcctggatg ggagagcaag gacccagaga aagaatctgc acaagagtca 720
gtaatagacc ttgattacta taccactgtt gaagagcttg ttgagctggg cccagaaaag 780
ttgaaagagg ctttagctgc tcgtggatta aaaagtggtg gtactgttca acagcgtgct 840
gagcgacttt tcttgttgaa gcatacaccc ttggaacaat tggatcgtaa gcattttgcc 900
aaaggttcac acagttctgt ctccaatgct acttctaatg gtaacaattt caaggataat 960
ttgaagaagg aaattgcttt aatggaagta aagatgaggc gcctttgtga gctactagat 1020
gagatcattg tacggacaaa ggaaaatgca gagaagaagc tgactctcac atatgaagaa 1080
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caacaaatct acaatcctct taagttgccg atgggttggg acggcaaacc tataccctat 1200
tggctatata agctccatgg tcttggtcag gaattcaaat gtgagatatg tggaaaccac 1260
agctactggg ggcgacgggc ttatgagcgg catttcaagg agtggcgcca tcagcacggg 1320
atgcgctgtc ttggaattcc taatactaag aacttcaatg aaatcacatc catccaggag 1380
gcaaaagaac tctgggagaa aattcaacaa cgacaagggc tgaacaagtg gcggccagac 1440
ctagaagaag agtacgaaga tcaggaggga aatatctaca acaagaagac ctacactgat 1500
ctgcagcgcc agggcctgat ttag 1524
<210> 3
<211> 507
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 3
Met Ala Ser Thr Val Leu Glu Ala Thr Arg Ala Lys His Glu Asp Met
1 5 10 15
Glu Arg Leu Glu Arg Leu Ala Val Arg Glu Leu Gln Arg Glu Pro Ala
20 25 30
Asn Ala Arg Asp Arg Leu Tyr Gln Ser His Arg Val Arg His Met Leu
35 40 45
Asp Leu Val Ile Ser Thr Ser Gly Lys Leu Val Glu Ile Tyr Glu Asp
50 55 60
Lys Asp Asn Ala Arg Lys Asp Glu Ile Ser Asn His Leu Ser Ser Thr
65 70 75 80
Val Gln Ala Glu Ile Phe Pro Lys Phe Tyr Asp Arg Leu Lys Glu Ile
85 90 95
Arg Asp Tyr His Arg Arg Asn Pro Ser Ala Arg Phe Val Ser Ala Thr
100 105 110
Asp Asp Phe Glu Glu Leu Leu Lys Glu Glu Pro Ala Ile Glu Phe Thr
115 120 125
Gly Glu Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Leu Asp Leu His Glu Leu Tyr Asn
130 135 140
Glu Phe Ile Asn Ser Lys Phe Gly Thr Pro Met Glu Tyr Ser Ala Tyr
145 150 155 160
Val Gly Thr Phe Ser His Val Glu Lys Met Ala Gln Asn Leu Lys Thr
165 170 175
Ser Arg Gln Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu His Ile Leu Glu Tyr Leu Thr
180 185 190
Ser Phe Leu Tyr His Thr Glu Pro Leu Gln Asp Ile Glu Lys Ile Phe
195 200 205
Ala Lys Leu Glu Ser Glu Phe Glu Glu Gln Trp Ile Asn Gly Glu Val
210 215 220
Pro Gly Trp Glu Ser Lys Asp Pro Glu Lys Glu Ser Ala Gln Glu Ser
225 230 235 240
Val Ile Asp Leu Asp Tyr Tyr Thr Thr Val Glu Glu Leu Val Glu Leu
245 250 255
Gly Pro Glu Lys Leu Lys Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Leu Lys Ser
260 265 270
Gly Gly Thr Val Gln Gln Arg Ala Glu Arg Leu Phe Leu Leu Lys His
275 280 285
Thr Pro Leu Glu Gln Leu Asp Arg Lys His Phe Ala Lys Gly Ser His
290 295 300
Ser Ser Val Ser Asn Ala Thr Ser Asn Gly Asn Asn Phe Lys Asp Asn
305 310 315 320
Leu Lys Lys Glu Ile Ala Leu Met Glu Val Lys Met Arg Arg Leu Cys
325 330 335
Glu Leu Leu Asp Glu Ile Ile Val Arg Thr Lys Glu Asn Ala Glu Lys
340 345 350
Lys Leu Thr Leu Thr Tyr Glu Glu Met Glu Ala Glu Arg Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Val Gln Ala Asp Ser Glu Ser Asp Asp Glu Asp Gln Gln Ile Tyr
370 375 380
Asn Pro Leu Lys Leu Pro Met Gly Trp Asp Gly Lys Pro Ile Pro Tyr
385 390 395 400
Trp Leu Tyr Lys Leu His Gly Leu Gly Gln Glu Phe Lys Cys Glu Ile
405 410 415
Cys Gly Asn His Ser Tyr Trp Gly Arg Arg Ala Tyr Glu Arg His Phe
420 425 430
Lys Glu Trp Arg His Gln His Gly Met Arg Cys Leu Gly Ile Pro Asn
435 440 445
Thr Lys Asn Phe Asn Glu Ile Thr Ser Ile Gln Glu Ala Lys Glu Leu
450 455 460
Trp Glu Lys Ile Gln Gln Arg Gln Gly Leu Asn Lys Trp Arg Pro Asp
465 470 475 480
Leu Glu Glu Glu Tyr Glu Asp Gln Glu Gly Asn Ile Tyr Asn Lys Lys
485 490 495
Thr Tyr Thr Asp Leu Gln Arg Gln Gly Leu Ile
500 505
<210> 4
<211> 2071
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
ttgaacggaa gagaagaaag atggcgggca acaagggaga gggccctgcg atcggcatcg 60
acctcggcac gacctactcg tgcgtcggcg tgtggcagca tgacagggtg gagatcatcg 120
ccaacgacca gggcaaccgc accacgccgt cgtacgtggc cttcaccgac accgagaggc 180
tcatcggcga cgccgccaag aaccaggtcg ccatgaaccc caccaacacc gtctttgatg 240
caaagcggct gatcgggcgg cgcttctcgg acccgtcggt gcaggcggac atgaagatgt 300
ggccgttcaa ggtggtgcct ggcccagccg acaagccgat gatcgtggtg acgtacaagg 360
gcgaggagaa gaagttctcg gcggaggaga tctcgtccat ggtgctcacc aagatgaagg 420
agatcgccga ggccttcctc agcaccacca tcaagaacgc cgtcatcacc gtcccggcct 480
acttcaacga ctcccaacgc caggccacca aggacgccgg cgtcatctcc ggactcaacg 540
tcatgcgcat catcaacgag cccaccgccg ccgccatcgc ctacggcctc gacaagaagg 600
ccgccagcac cggcgagaag aatgtcctca tcttcgacct cggcggcggc accttcgacg 660
tctccatcct caccatcgag gagggcatct tcgaggtcaa ggccaccgcc ggcgacaccc 720
acctgggagg cgaggacttc gacaaccgga tggtgaacca cttcgtgcag gagttcaaga 780
ggaagcacaa gaaggacatc accggcaacc cgagggcgct ccggcggctg aggacggcgt 840
gcgagagggc gaagaggacg ctgtcctcca ccgcccagac caccatcgag atcgactcgc 900
tctacgaggg catcgacttc tacgccacca tcacccgcgc ccgcttcgag gagctcaaca 960
tggacctctt ccgccggtgc atggagcccg tggagaagtg cctccgcgac gccaagatgg 1020
acaaggccca gatccacgat gtcgtcctcg tcggaggctc cacccgtatc cccaaggtgc 1080
agcagctcct gcaggacttc ttcaacggga aggagctctg caagagcatc aaccccgacg 1140
aggccgtggc gtacggcgcc gccgtccagg ccgccatcct cagcggcgag ggcaaccaga 1200
gggtgcagga cctgctcctc ctcgacgtca cgccgctctc gctcgggttg gagacggccg 1260
ggggtgtcat gaccgtgctg atcccgagga acaccaccat cccaaccaag aaggagcagg 1320
tcttctccac ctactccgac aaccagcccg gcgtgctcat ccaggtgtac gagggcgaga 1380
ggacgaggac caaggacaac aacctgctcg gcaagttcga gctcaccggc atcccgccgg 1440
cgccgagggg cgtgccccag atcaacgtga cgttcgacat cgacgcgaac ggcatcctga 1500
acgtgtcggc ggaggacaag acgacgggga agaagaacaa gatcaccatc accaacgaca 1560
aggggcggct gagcaaggag gagatcgagc ggatggtgca ggaggccgag aagtacaagg 1620
ccgaggacga gcaggtgcgg cacaaggtgg aggcccgcaa cgcgctggag aactacgcgt 1680
acaacatgcg caacacggtg cgcgacgaga agatcgcctc caagctcccc gccgacgaca 1740
agaagaagat cgaggacgcc atcgaggatg ccatcaagtg gctcgacggc aaccagctcg 1800
ccgaggccga cgagttcgag gacaagatga aggagctcga gagcctctgc aatccgatca 1860
tctcaaagat gtaccagggc ggcgccggtg gtccggcggg catggacgaa gacgccccca 1920
acggcagtgc cggcaccggc ggtggcagcg gcgctggccc caagatcgag gaagtggact 1980
aagcgagtgg actgagtata tgacatgttg agcgggacga agaaggagcg atgcattctg 2040
ggacgtcatc atcatcttta gagtttcatg c 2071
<210> 5
<211> 1962
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
atggcgggca acaagggaga gggccctgcg atcggcatcg acctcggcac gacctactcg 60
tgcgtcggcg tgtggcagca tgacagggtg gagatcatcg ccaacgacca gggcaaccgc 120
accacgccgt cgtacgtggc cttcaccgac accgagaggc tcatcggcga cgccgccaag 180
aaccaggtcg ccatgaaccc caccaacacc gtctttgatg caaagcggct gatcgggcgg 240
cgcttctcgg acccgtcggt gcaggcggac atgaagatgt ggccgttcaa ggtggtgcct 300
ggcccagccg acaagccgat gatcgtggtg acgtacaagg gcgaggagaa gaagttctcg 360
gcggaggaga tctcgtccat ggtgctcacc aagatgaagg agatcgccga ggccttcctc 420
agcaccacca tcaagaacgc cgtcatcacc gtcccggcct acttcaacga ctcccaacgc 480
caggccacca aggacgccgg cgtcatctcc ggactcaacg tcatgcgcat catcaacgag 540
cccaccgccg ccgccatcgc ctacggcctc gacaagaagg ccgccagcac cggcgagaag 600
aatgtcctca tcttcgacct cggcggcggc accttcgacg tctccatcct caccatcgag 660
gagggcatct tcgaggtcaa ggccaccgcc ggcgacaccc acctgggagg cgaggacttc 720
gacaaccgga tggtgaacca cttcgtgcag gagttcaaga ggaagcacaa gaaggacatc 780
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tacgccacca tcacccgcgc ccgcttcgag gagctcaaca tggacctctt ccgccggtgc 960
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gacaagatga aggagctcga gagcctctgc aatccgatca tctcaaagat gtaccagggc 1860
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<212> PRT
<213> Oryza sativa
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1 5 10 15
Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Trp Gln His Asp Arg Val Glu Ile
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Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe
35 40 45
Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala
50 55 60
Met Asn Pro Thr Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg
65 70 75 80
Arg Phe Ser Asp Pro Ser Val Gln Ala Asp Met Lys Met Trp Pro Phe
85 90 95
Lys Val Val Pro Gly Pro Ala Asp Lys Pro Met Ile Val Val Thr Tyr
100 105 110
Lys Gly Glu Glu Lys Lys Phe Ser Ala Glu Glu Ile Ser Ser Met Val
115 120 125
Leu Thr Lys Met Lys Glu Ile Ala Glu Ala Phe Leu Ser Thr Thr Ile
130 135 140
Lys Asn Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg
145 150 155 160
Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ser Gly Leu Asn Val Met Arg
165 170 175
Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys
180 185 190
Lys Ala Ala Ser Thr Gly Glu Lys Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu Thr Ile Glu Glu Gly Ile Phe
210 215 220
Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe
225 230 235 240
Asp Asn Arg Met Val Asn His Phe Val Gln Glu Phe Lys Arg Lys His
245 250 255
Lys Lys Asp Ile Thr Gly Asn Pro Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr
260 265 270
Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg Thr Leu Ser Ser Thr Ala Gln Thr Thr
275 280 285
Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Ala Thr Ile
290 295 300
Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Arg Cys
305 310 315 320
Met Glu Pro Val Glu Lys Cys Leu Arg Asp Ala Lys Met Asp Lys Ala
325 330 335
Gln Ile His Asp Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys
340 345 350
Val Gln Gln Leu Leu Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Cys Lys
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Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala
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Ala Ile Leu Ser Gly Glu Gly Asn Gln Arg Val Gln Asp Leu Leu Leu
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Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val
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Gln Val Phe Ser Thr Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln
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Val Tyr Glu Gly Glu Arg Thr Arg Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly
450 455 460
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Ile Asn Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser
485 490 495
Ala Glu Asp Lys Thr Thr Gly Lys Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn
500 505 510
Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Gln Glu
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Ala Arg Asn Ala Leu Glu Asn Tyr Ala Tyr Asn Met Arg Asn Thr Val
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Arg Asp Glu Lys Ile Ala Ser Lys Leu Pro Ala Asp Asp Lys Lys Lys
565 570 575
Ile Glu Asp Ala Ile Glu Asp Ala Ile Lys Trp Leu Asp Gly Asn Gln
580 585 590
Leu Ala Glu Ala Asp Glu Phe Glu Asp Lys Met Lys Glu Leu Glu Ser
595 600 605
Leu Cys Asn Pro Ile Ile Ser Lys Met Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Ala Gly Pro Lys Ile Glu Glu Val Asp
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<212> DNA
<213> Oryza sativa
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aaacaaataa gctgcttgtt tgtttaggct taggcttttt ggctcataag ctagcttata 2040
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<213> Oryza sativa
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<213> Oryza sativa
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85 90 95
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Val Leu Gly Val Glu Lys Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg
115 120 125
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130 135 140
Ala Gly Leu Lys Ala Asp Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val
145 150 155 160
Glu Cys Gln Ser His Arg Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu
165 170 175
Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser
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Arg Glu Phe Leu Glu Lys Asn Tyr Lys Asp Thr Ser Gly Lys Glu Thr
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Lys Asn Ile Glu Ile Ala Val Met Thr His Lys Asp Gly Leu Arg Glu
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
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<223> Forward primer for PCR analysis of OsPPT1-1 gene
<400> 24
atttggagag gacacgctga aatcacc 27
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for PCR analysis of OsPPT1-1 gene
<400> 25
ggtggatttc ttctcgacgc 20
<210> 26
<211> 25763
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 26
cccagacggg cccaaatcta tcgcaaacag gcctcgtctc gtcctcgtcc tcgtccgccg 60
ccaaatcgaa cccccccaaa ccctagctac ccggcgcaac gtccccttcc cgcctctccg 120
cggcgctgcg tgacacccgg cctccgctac gaaacaccgg ggcgggtgta gcctagcggg 180
cgggccatgg cgtcaacggt gctggaggcg acgcgggcgg cccatgagga tctggagagg 240
ctggagcggc tcgcggtgag cgagctgcaa cgggagcccg ctaacccgcg tgaccgcctc 300
tttcagtccc accgcgtccg ccacatgctc gacctcgtcg tctccacctc cggcaagctc 360
gtacgtgcca ttcttctgct tctaaggatt cacgactcca tccacttcac ttcagtgatt 420
cgttttgctt agctgggtca ggttcgaaca cggtcgatag gattgatatt tgcagttgtt 480
tctgtcgatt tcggatgctt gtttagggtt ggcttctgag tgtatgagga attacagatc 540
cgtcttcctg gcaaattctt attacatatc aatcatgtta tgtttatctc tgaattcgat 600
ctgtgtagat ggattttgtg ctcttatttt tactgtagtt ggcagtggca ctgcctgatt 660
agtgttgttc accggaggtt ttggctagtg ttatttctgt accgttctgt ccccttcatt 720
ctcttttggt ctgagtcagt agttgacctt tagaaatctt aattttgctg tccagcgacg 780
atctcacttt tgctctggtg cttgtaactt gtttaggtgg aaatttacga ggacaaggac 840
aatgctagga aggatgagat caacactcat cttactgcac ccacgcaaag tggactgttt 900
agcaagtact atgaaaggct caaagaggta ccttacctat ctgcttgctt ggatgtgaca 960
aaagtgaaat agatgccagt actcattact cattcaccaa aggtcatgat gatgcttatc 1020
atgttctttt tagtcgagtt cttctccgct tttaagaaaa cagtaatgta cggcacaaac 1080
tatatggctg gaggtaccag tttgcaaaca caaacaaaag caaacaagaa agaattgtcc 1140
tgttacaatg aaactaaagc tctgtaatgt tcgggacagg aataggtgaa ggcctgaagt 1200
tgtccatcca gttccaagtg atcttatcca ctctaatgtg gtcttttggt tttagtagtt 1260
gtagctccat ctactgcaga aacataaaac agcacaccag aggtgtggct aggaaatttc 1320
ctctcaaatc tcatcttatt gcatgatgca tgctttccac attgacaatg ccaagtcttc 1380
aaagaaaaaa aaagtatgta cgttggggta aatttaggtt agttatagcc taacttccca 1440
tgaagtcaga tctagaaatg ggatgaaagt cccaaccaaa agcctctgta aaactgcacc 1500
atgcagatct agcaataggg catctgaact tctgaagaac atatggccta tgttctcagg 1560
ttcattagag agaacatgcc atttctgggc cccttctttt tgaaactgtt gtggcctgta 1620
atttaccata gaaaaattga taattttcat gggcgctttt gatttccaaa gttcttttgt 1680
catactgtca ctgacacctc catcagttaa aagtctatag agatttggta gtgaactgca 1740
gccatcaaat ccacccatgg attgtagtca gatgaggata gaaacccact taaatttgta 1800
ccccaatcat cttcagttca atattcaatc actgtagcat ctggttcttc acaaatccta 1860
tgtaactcag ggtactcggt ttttttgaat gcaatggtag gagctctgcc tctcaattaa 1920
gaagaataga attgacccag ttttaaggaa aaatcgggcc caaaacctaa cagagcacac 1980
aacagagtaa ccggcggaag gcccccacaa acaacctaga caacggtagc cccacactca 2040
caaaccccat ctagagtcat tgttgacaag ctcaacacaa gggatgagca ggtcccactt 2100
ctcaagacga gctgcacaca gccaaaggaa ctcgacgaca cctacaccca aataccgaca 2160
cacaaggaag aaggccgcga cacgccattg ttgccaagcc tcgacacgcc ccacgcgagg 2220
tagctccgat tcttcaccac gagcaatgtt ccacatcgcc gaacactggg agcagataga 2280
tgcctagagc gacaaaggcc caggtaccac cgagccaagc ggagtgacga aaagcctcca 2340
caacgccgac aaccacacaa aactggaggt cttccgggca acgtcttcaa ggagaaacga 2400
cgtcgagacg ccgccgtcgc ccgcctggaa caatccaagc aaagttttct ccgaagatct 2460
agcagagcaa cgttgattgc cagcaccaag gagaaaactg cagggacagc cacaccgatg 2520
tcaccccacc aagccgcccg gcgttgtctc cttctgccac ccaccgacgc accaaccctc 2580
agagcctcga cgccggccga gcaccagcga ggaaccccaa gaaggccgag gcgaggactc 2640
ccacacggag agcgagagat ctaggacgtc accctcaaca gggtaggagt ggcacccgta 2700
ggcgtcaccg acgtccgccc gtaaatgggc atcgctttcg ccggaggacc tcccaccaca 2760
tgtcccaacg gacggagcca gccagccctt cccacatcac cgaccgagaa gagaggtgga 2820
gagatggatc tggccggaga ggctcaaaat ttagcctcca accgatcgtg gagcatgatc 2880
tgaagccacg acgccgggaa ccgccgaggc tgccgtccca tgacccacca gctgcagccc 2940
tgccatattt acattgccgc tggcagctgc agtccgccgc taggccaagg cccacgcggg 3000
ccacgtcctc gacccaacca ccgtgccacg agcacggaca gggcgcaacc gccgctgtgg 3060
gctagccaca gctatgcgag ctggcatggc cgccgtcgcc aggcggccta ggccaccctc 3120
ctaggtcggc ggggagggag aggggtgggg agtggcggag cgagggggag catctcgctg 3180
ctgccgccgt ccttgcaggg cgcgcgggaa gcgccgcgtc cctgctctgg cagtggcgag 3240
gccaagtcgt ggcggggggg ggggaggcta gggttctaag cacagcgccg cgagcccata 3300
tatcttccca taaaaaaatc ttcctgctat tgcatgcctt gcaaataact ccacatttga 3360
acaaatatgt aaaacctgtg taggccctta tgtttgtaaa ctgctccacg tttgaacaga 3420
tgtttaaact tatgtacaga gaattgcctt tatgcttgga agtaaatgag ctattgctgc 3480
gtttggatgt cgatattgga gggcatggat ttgaatcggg ttgaatacca aatcagccat 3540
ggtattgaaa tgagatataa ttccaattct attgtttgga tgtcactaaa ttggagtttg 3600
gaatggtgcg gtctaattcc atgcaatacc gaggggtgag gccttgtatt gggatatgga 3660
gtttctagtt atagtccaat tccagggaat tgggtctctg atcccaaatc tcaattccac 3720
gtgcaaccaa acaacgaaat tttggaaagt tgattccaat tcgcaattct gtgctccaat 3780
atctacatcc aaacgaggta tacgagttct catttggcat gtatttggtt tgaagaattc 3840
ttaaccaagg attatttgag ccttgcacat atttccaaat ccattcataa tcttggtctc 3900
attgtcccaa gaccaccttg gtcctttggt ctgactatca ttcccaactt agccatatgt 3960
tatgttgttg aatttatctt atgcacttcg ctagaagatt tctgacctga tagagttcat 4020
cacttcatct tattgtgaac tctgctaatt gtaaaatcac actgtatcta tataggcata 4080
tgttaacctt cccaaggtta aacttttacc cttccatggg tctagcctcc tgagagcacc 4140
tagagggggg ggggtgaata ggtgatcctg aataattcaa acttatagcc acaaaaactt 4200
gttaagcgtt agcacagtta atgccaagtg gctagagcga agatcaatat gataatcaca 4260
aagagttcaa cacagagaag acacagtgat ttatcccgtg gttcggccaa gtacaaaact 4320
tgcctactcc acgttgtggc gtcccaacgg acgagagttg cactcaactc ctcaagtgat 4380
ccaatgatca acttgaatac cacagtgtta tgcttttctt ttcttatcgc gtttgtgagg 4440
aatctccaca acttggagtc tctcaccctt acacttgaag ttcacaaaga agcacggagt 4500
aagggagaga agcaacacac acaaatccac agcaaaatgc gcgcacacac ggccaagaat 4560
cgagctcaaa agactatctc aaagttctca ctagaacgga gctcgaatca ctgagaatga 4620
caaacgaatg cgcaaagact gagtgtggat gatcaagaat gctctaaggt tgcttggtct 4680
cttcctccat gcgcctaggg gtccctttta tagccccaag gcagctagga gccgttgaga 4740
gtaaaactgg aaggctgatc ttgccttctg tcgactggtg caccggacag tccggtgcac 4800
accggacact gtccggtgcc cgatttcttt ccttaaatgg cgcagtcgac cgttgcagat 4860
ctgggagccg ttggcgcacc ggacatgtcc ggtgcacacc ggacagtccg gtgccccctt 4920
ccgaccgttg gctcggccac gtgtcccgcg cagattgcgc ggccgaccgt tggctcaccg 4980
gacagtccgg tgcacaccgg acagtccggt gaattatagc cgtacgccgt cggcgaaatc 5040
ccgagagcgg ccacttcatg ccgagtcagc ctggcgcacc ggacactgtc cggtgcacca 5100
ccggacaatc cggtgtgcca gactgagctg agtcttggct gtacacagcc aagcttttgc 5160
acctctcttc ttttctgttt ctaacactta gacaaatata ttagtacaca aaaccaatgt 5220
actaaggctt agaaacatac ctttactctt gatttgcact ttgttcatcc atgggcataa 5280
attcacattt aagcacttgt gtttgcactc aatcaccaaa atacttagaa atggcacaag 5340
agctcatttc cctttcaatc tccccctttt tggtgattta tgccaacaca acataaagca 5400
actataacaa gtgcaatatc acttcaaata aaaactcagt tttattttga ttcaattttg 5460
gcatatatgg atcatccttt gccaccactt ggtttgtttt tgcaaatcaa actcaaatct 5520
ctatctctaa gtcaaacaca catgttgaaa cataaagaga gtcattccaa aagagattga 5580
tcaaggattt caaaaactcc ccctttttcc cataatcact acttctcccc acaagaagcc 5640
aacttttgac aaaagagaca atgaaagagt tttgacaaac caaaaactct actctactat 5700
tttcaaatct ctcaagtggt agctgatcca tttttcactt tggcctttat tttctccccc 5760
tttggcatca agcaccaaaa cggaatcaat cttggccctt taaccccatt gcctcaccaa 5820
aatcttcaat taagagcaaa tggcaataag agttcatgag atgaacttgg aattagttac 5880
cctctcatcg gagtgcagtg gaagtctttc atggtccaag tccaccgttt ctctttcaat 5940
tctcctttga gactaaatca agcaaactca agcatatggt tagtctcaaa gggtcaagtt 6000
gtaacacatc tccccctaaa catgtgcatc actttgcaac ggacttgtga ggtccgggga 6060
gggtttgtac aacttgagca ccacaataag caacaaaatg cagaatgaac atgatcaaag 6120
gcataaacac atgtatgcta caattcaatc caagttccgc gaatctagga catttagctc 6180
actacgcagc ttgcaaaagg tcttctcatc tagaggcttg gtaaagatat cggctagctg 6240
gttctcggtg ctaacatgaa acacttcgat atctcccttt tgctggtggt ctctcaaaaa 6300
gttatgccgg atgtctatgt gctttgtgcg gctgtgctca acaggatttt ccgccatgcg 6360
gatagcactc tcattatcac ataggagtgg gactttgctc agattgtagc caaagtccct 6420
gagggtttgc ctcatccaaa gtagttgcgc gcaacactgt cctgcggcaa cgtactcggc 6480
ctcagcggtg gatagggcaa cagaagtttg tttcttagag ttccacgaca ccagggacct 6540
tccctaagaa ttggcacgtc cccgatgtac tcttcctatc gaccttacat ccagcatagt 6600
cggaatctga gtatccaacc aagtcaaagg tagacccctt ttggatacca gagtccgaag 6660
caaggcgtag caaccaaata tctaagaatt cgcttcaccg ccactaagtg acactcctta 6720
ggatcggatt gaaatctagc acacatgcat acgctaagca taatatccgg tctactagca 6780
cataagtaaa gtaatgacct tatcattgac cggtatgcct tttgatcaac ggacttacct 6840
cctttgttga ggtcggtgtg tccgtcggtt cccatcggag tctttgcggg tttggcgtcc 6900
ttcatcccaa accgcttcag caaatcttgc gtgtatttcg tttgggagat gaaggtgccg 6960
tccttgagtt gcttcacttg gaacccaagg aagtagttca actcgcccat cattgacatc 7020
tcgaatttct gcgtcatcac cctgctaaac tcttcacaag acttttatta gtagaaccaa 7080
atattatgtc atcgacataa atttggcata caaacaaatc accatcacat gtcttagtga 7140
aaagagttgg atcggctttc ccaaccttga aagcattagc aattaagaaa tctctaaggc 7200
attcatacca tgctcttggg gcttgcttaa gtccatagag cgccttagag agcttacaca 7260
cgtggtcggc gtaccgttca tcctcgaagc cagggggttg ctctacgtac acctcctcct 7320
ttattggccc gttgaggaaa gcgctcttca catccatttg gaacaacctg aaagaatggt 7380
gagcggcata tgctagcaag atacgaatgg actctagcct agccacagga gcaaaagtct 7440
cctcaaagtc caaacctgcg acttgggcat aaccttttgc cacaagtcga gccttgttcc 7500
ttgtcaccac tccgtgctcg tcttgtttgt tgcggaacac ccacttggtt cccacaacat 7560
tttgcttagg acgaggcacc agcgtccaaa cttcattcct cttgaagttg ttgagctcct 7620
cttgcatggc caacacccag tccggatctt gcaaggcctc ctctatcctg aaaggctcaa 7680
tagaagagac aaaggagtaa tgctcacaaa aattaactaa tcgagatcga gtagttactc 7740
ccttgctaat gtcacccaaa atttggtcga cgggatgatc cctttgaatc atcgcttgaa 7800
catgggttgg aggtgccggt tgcgcatctt cctccatcac atgatcatct tgtgctcccc 7860
cttgatcaca cgcctcctgt tgatgaacct gttcatcgtc ttgagttggg ggtagcacca 7920
tagttgagga aggtggttga tctcgttcat cttgttcctg tggccgcact tctccaatcg 7980
ccatggttcg tatagcgccc gtcggaacat cttcttcatc tacatcatca caatcaacaa 8040
cttgctctct tggagagcca ttagtctcat caaatacaac gtcgctagag atttcaacca 8100
aacccgatga tttgttgaaa actctatacg cctttgtatt tgagtcataa cctaacaaaa 8160
agccttctac agctttggga gcaaattttg aatttctacc cttcttcaca agaatgttgc 8220
acttgctccc aaatacacga aagtacgata cattgggttt gttaccggtt agtagctcat 8280
atgacgtctt cttgaggagg cggtgaaggt agaccctgtt gatggcgtgg caagtcgtgt 8340
taacggcttc cgaccaaaaa cgctcggggg tcttgaattc tccaagcatc gtcctcgcca 8400
tatcgattag cgtcctgttc ttcctctcta ccacaccatt ttgctgtggt gtgtagggag 8460
cggagaactc gtgcttgatc ccttcctcct caaggaactc ctccacttga aggttcttga 8520
actcggatcc gttgtcgctc cttatcttct tcaccttgag ctcaaactca ttttgagctc 8580
tcctgaggaa gcgtttgagg gtcccttggg tttcagactt atcctgcaaa aagaacaccc 8640
aagtgaagcg ggaaaagtca tcaacaataa ctagaccata cttacttcct cctatgctta 8700
gataggcgac gggtccgaag aggtccatat gtagcagctc caggggtctt gatgtggtca 8760
tcacattctt gctgtgatgt gctcctccca cttgtttacc tgcttgacaa gctgcacaag 8820
gtctatcttt ttcgaattgc acgttagtta aacctatcac gtgttgtccc tttagaagct 8880
tgtgaaggtt cttcatcccc acatgtgcta agcggcgatg ccacagccag cccatgctag 8940
tcttagctat taagcatgca tctagaccgg cctcttcttt tgcaaaatca actaaataaa 9000
gtttgccgtc taatacaccc ttaaaagcta gtgaaccatc acttcttcta aagacagaca 9060
catctacatt tgtaaataga cagttatacc ccatgttgca taattgacta acagatagca 9120
aattatatcc aagagactct actaaaaaca cattagagat agagtgctca ttagaaattg 9180
caattttgcc taaccctttt accttgcctt gattcccatc accgaatata attgaatctt 9240
gagaatcctt attcttgacg taggaggtga acatcttctt ctcccccgtc atatggtttg 9300
tgcatccgct atcaataatc cagcttgaac ccccggatgc ataaacctgc aagacaaatt 9360
taggcttggg acttaggtac ccaactcttg ttgggtccta taaggttagt cacaatttcc 9420
ttagggaccc aaatgcaagt tttatcagcc ttgcattttg cccctaactt cctagcaatt 9480
acctttctat cctttctaca aattgcaaag gaagcattca aagcatgata tattgtagaa 9540
ggctcattaa ctttcctagg aatattaaca acatttctcc taggcatatt atgaacaaca 9600
tcccttctac caacatttct atcatgcaca tatgaagaac tagaagcaaa catagcatga 9660
gaaaaatcat cgtacgcatt ataactccta taagcatttc tagtttgtct cctatcatga 9720
tacaaaaagg catgattctt tttagcacta gtagccatag gggccttccc tttctcctta 9780
gcgagaatgg gagccttatg gcttgttaag ttcttggctt ccctcttgaa gccaagtcca 9840
tccttaattg aggggtgtct accgatcgtg taggcatccc ttgcaaattt tagtttatca 9900
aattcattct tgctagtctt aagttgggca ttaagactag ccaattcctc agttaatttg 9960
gaaattgaaa ctaaatgatc actacaagca tcaacattga aatctttaca cctagtgcaa 10020
atctcaacat gttctacaca agaattagat ttactaccta cttctagttt agcatttaag 10080
tcatcattaa cactctttaa agtagcaatg gtttcatgac aagaagatag ttcactagaa 10140
agcacttcat ttcttttaac ttctaaagca taagattttt gtgcctctac aaatttgtca 10200
tgctcttcat acaaaaggtc ctcttgtttt tctaagagtc tatctttttc attcaaggca 10260
tcaatcaatt cattaatttt atctacttta gttctatcca atcccttgaa caaactagag 10320
taatctattt cattatcact agactcatca tcactggaag aatcataagt gacattgttt 10380
tgattacata ccttcttctc ccttgccata aggcatgtgt gacgctcgtt tgggaagagg 10440
gatgacttgt tgaaggcagt ggcggcgagt ccttcatttt cggagtcgga ggaggagcaa 10500
tccgaatccc actcctttcc gatatgtgcc tcgcccttgg ccttcttgta atgcttcttc 10560
ttttccctct tgctcccgtg ttcctggtca ctatcattgt cgggacagtt agcaataaga 10620
tgaccaagct taccgcattt gaagaatgat cgctttccct tggtcttagt cttgcttggc 10680
tgtcccttgc gaccctttag tgccgtcttg aatcttttga tgatgagggc catctcttta 10740
tcattaagac cgaccgcctc aatttgcgcc accttgctgg gtagcgcctc cttgctcctt 10800
gttgccttga gagcaatggg ttgaggctca tggattgggc cattcaacgc gtcgtccacg 10860
tacctcgcct ccttgatcat cattcgcccg cttacaaatt ttccaagaat ttcttcgggc 10920
gacatcttga tgtacctagg attttcacga atattgttta ccaagtgagg atcaagaacg 10980
gtaaatgacc ttagcattag gcggacgacg tcgtgatccg tccatcgcgt gcttccgtag 11040
ctccttattt tgttgataag gatcttgagc cggttgtatg tttgtgtcgg ctcctcgccc 11100
cttatcatcg cgaatcgtcc gagctcgccc tccaccaact ccatcttggt gagtaaggtg 11160
acatcattcc cctcatgaga gatcttgagg gtgtcccaaa tttgcttggc attgtccaag 11220
ccgctcacct tgtgatactc gtccctgcac aaagaggcta acaacacagt agtagcttgt 11280
gcatttttat ggatctgttc attaataaac gaagggctat ccgagctatc aaatttcatt 11340
ccactttcca caatctccca aatgcttgga tggagagaaa ataggtgagt acgcattttg 11400
tgactccaaa atccgtagtc ctctccatca aagtgaggag gcttgccaag tggaatgggg 11460
agcaaatgag catttgagct atgcggaatg cgcgaataat caaaagaaaa gtttgagtta 11520
accgtctttt gtttgtcata gtcgttgtcg tcgttgtcct tttgggaaga ggaagattcg 11580
tcgctgtcgt cgtagtagac gatctccttg atgcgccttg tcttcctctt cttcccttcc 11640
ttccgtctgt ggcccgagcc ggagtcggta ggcttgtcat ctttgggctc gttgacgaag 11700
gactccttct ccttatcgtt gatcacgatt cccttcccct taggatccct ttcttcgggc 11760
ggttagtccc tttcttgaag agaacggctc cgataccaat tgagagcacc tagagggggg 11820
tgaataggtg atcctgaata attcaaactt atagccacaa aaacttgtta agcgttagca 11880
cagttaatgc caagtggcta gagcgaagat caatatgata atcacaaaga gttcaacaca 11940
gagaagacac agtgatttat cccgtggttc ggccaagtac aaaacttgcc tactccacgt 12000
tgtggcgtcc caacggacga gagttgcact caacccctct caagtgatcc aatgatcaac 12060
ttgaatacca cagtgttatg cttttctttt cttatcgcgt ttgtgaggaa tctccacaac 12120
ttggagtctc tcacccttac acttgaagtt cacaaagaag cacggagtaa gggagagaag 12180
caacacacac aaatccacag caaaatgcgc acacacacga ccaagaatcg agctcaaaag 12240
actatctcaa agttctcact agaacggagc tcgaatcact gagaatgaca aacgaatgcg 12300
caaagactga gtgtggatga tcaagaatgc tctaaggttg cttggtctct tcctccatgc 12360
gcctatgggt cccttttata gccccaaggc agctaggagc cgttgagagt aaaactggaa 12420
ggctgatctt gccttctgtc gactggtgca ccggacagtc cggtgcacac cggacactgt 12480
ctggtgcccg atttctttcc ttaaatggcg cagtcgaccg ttgcagatct gggagccgtt 12540
ggcgcaccgg acatgtccgg tgcacaccgg acagtccggt gcccccttcc gaccgttggc 12600
tcggccacgt gtcccgcgca gattgcgcgg ccgaccgttg gcccggccga ccgttggctc 12660
accggacagt ccggtgcaca ccggacagtc cggtgaatta tagccgtacg ccgtcggcga 12720
aatcccgaga gcggccactt catgccgagt cagcctggcg caccggacac tgtccggtgc 12780
accaccggac agtccggtgt gccagactga gctgagtctt ggctgtacac agccaagctt 12840
ttgcacctct cttcttttct gtttctaaca cttagacaaa tatattagta cacaaaacca 12900
atttactaag gcttagaaac atacctttac tcttgatttg cactttgttc atccatgggc 12960
ataaattcac atttaagcac ttgtgtttgc actcaatcac caaaatactt agaaatggcc 13020
caagagctca tttccctttc acctcctcag catcttattg tgaatttctg aaaatgcttt 13080
aaaccccata aacatgatac tgtttttcaa tggtggtgcc gttttttaac gaaatgactc 13140
atgtgaatat ccaaaaagta gacaagttgg aaaaatgatt tgaaagtaac aaagatttca 13200
tgcatttaat taagaacatt tttttgtggc gcgcgctggg gggggggggc agtctatttt 13260
tgctgtccca attaccaaag taagccttgg aaaatgaact gatcagcgac cagacattgg 13320
gttggtttcc ctattattgt aagatttgca gcatgttggt tctttacatg catccttttt 13380
tggtcccttt gccccccccc ccctgtgatt tatgggtaat ttgtcttcga agaagctgtg 13440
ctagtaaaca gatattcatt tatcagcaaa tctctagtgt ttcttttttt ttgtgaactt 13500
ttaagtatat tttattgctt gcttacagat ccgtgaatat catcggcgga acccatctgc 13560
ccgctttgtt agtacaactg atgactatga agagcttcta aaggaggaac cagttattga 13620
attcactggc gaggtattgt cacctttttt gattattgca acttcgtttg atattttgtg 13680
tgccttttta tcatgggtca tatgacgttt aatcttagta acttgttact tgcacgcatt 13740
tagtcttagt aacttgttac ttgcatgatt tttccagatg attgatactt atatgcctgt 13800
gactattcaa gcctttaaaa ctattgcagt ttatctggac acatcttttt gtaattgttt 13860
gtgccatgtt atagtctttg tgttttgacc tatgcaagtt acgttgctca tcaacagggt 13920
tttctaaaaa cctttgggct tgtttggtga caagggaatt gaagaggatt ggaggggatt 13980
gagagggaaa ttagttcatt tccccctcaa tcccctccaa tccccctcaa ttcccttgtt 14040
accaaaggag cccttagagt ccatcagtgc ctttcctttt cctttcacta cagtagtctt 14100
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gctgcacagt ccttttcctg ttataccatg ttgcatattt actacatttt tctgttacta 14340
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<213> Zea mays
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<211> 504
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 28
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1 5 10 15
Glu Arg Leu Glu Arg Leu Ala Val Ser Glu Leu Gln Arg Glu Pro Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Asp Arg Leu Phe Gln Ser His Arg Val Arg His Met Leu
35 40 45
Asp Leu Val Val Ser Thr Ser Gly Lys Leu Val Glu Ile Tyr Glu Asp
50 55 60
Lys Asp Asn Ala Arg Lys Asp Glu Ile Asn Thr His Leu Thr Ala Pro
65 70 75 80
Thr Gln Ser Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Tyr Glu Arg Leu Lys Glu Ile
85 90 95
Arg Glu Tyr His Arg Arg Asn Pro Ser Ala Arg Phe Val Ser Thr Thr
100 105 110
Asp Asp Tyr Glu Glu Leu Leu Lys Glu Glu Pro Val Ile Glu Phe Thr
115 120 125
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gacacgatcg aggacgccat caagtggctc gacggcaacc agctcgcgga ggccgaggag 2880
ttcgaggaca agatgaagga gctggagagc atctgcaacc ccatcatctc acagatgtac 2940
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ccattaggct tagtaaaata gtaaccctag tgttactgta accgcctccg cgagttcagg 3300
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<211> 1959
<212> DNA
<213> Zea mays
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<213> Zea mays
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Lys Asn Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg
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Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys
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Lys Lys Asp Ile Ser Gly Asn Pro Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr
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645 650 655
Asp
<210> 42
<211> 1974
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 42
atggcgagca agggaggcaa caagggggag ggccctgcga tcggcatcga cctcggcacc 60
acctactcct gcgtcggcgt atggcagcac gaccgggtgg agatcgtcgc caacgaccaa 120
ggcaaccgca ccacgccgtc ctacgtcgcc ttcaccgaca ccgagcggct catcggcgac 180
gccgccaaga accaggtcgc catgaacccc accaacaccg tttttgatgc caagcggctc 240
atcgggcggc gcttctcgga cgcatccgtg cagtcggaca tgaagatgtg gccgttcaag 300
gtggtccccg gcgccggcga caaaccgatg atcgtggtca gctacaaggg ggaggagaag 360
accttctccg ccgaggagat atcctccatg gtgctcacca agatgaggga gatcgccgag 420
gccttcctca gcacgaccat caacaacgcc gtcgtcaccg tcccggcgta cttcaacgac 480
tcccagcgcc aggccaccaa ggacgccggc gtgatcgcgg gtctcaacgt catgcgcata 540
atcaacgagc ccaccgcggc ggccatcgct tacggcctcg acaagaaggc caccagcacc 600
ggggagaaga acgtgctcat cttcgacctc ggcggcggca ccttcgatgt gtccatcctc 660
accatcgagg aaggcatatt cgaggtcaag tccaccgccg gcgacaccca cctgggaggc 720
gaggacttcg acaaccggat ggtgaaccac ttcgtgcaag agttcaagag gaagaacaag 780
aaggacatca gcggcaaccc gagggcgctc cggcggctga ggacggcgtg cgagagggcg 840
aagaggaccc tctcttccac cgcccagacc accattgaga tcgactcgct ctacgagggg 900
atcgacttct acgcgaccat cacccgtgcc aggttcgagg agctcaacat ggacctcttc 960
cgcaagtgca tggagcccgt cgagaagtgc ctccgggacg ccaagatgga caagacccaa 1020
atccacgaca tcgtgctcgt cggaggctcc acccggatcc ccaaggtgca gcagctcctc 1080
caggacttct tcaacgggaa ggagctctgc aagagcatca accccgacga ggccgtcgcg 1140
tacggcgccg ccgtccaggc cgccatcctc agcggcgagg gcaaccagaa ggtgcaggac 1200
ctgctcctgc tcgacgtgac gccgctctcg ctcgggttgg agacggccgg aggcgtgatg 1260
acgaccctga tcccgaggaa caccaccatc cccaccaaga aggagcaggt cttctcaacc 1320
tactcggaca accagcccgg cgtgctgatc caggtgtacg agggcgagag gacgaggacc 1380
aaggacaaca acctgctggg caagttcgag ctgtccggca tcccgtcggc gcccaggggc 1440
gtaccccaga tcacggtgac cttcgacatc gacgcgaacg gcatcctgaa cgtgtcggcg 1500
gaggacaaga cgaccgggca gaagaacaag atcaccatca ccaacgacaa ggggcggctg 1560
agcaaggagg agatcgagcg catggtgcag gaggcggaga agtacaagtc ggaggacgag 1620
caggtgcggc acaaggtgga ggcccgcaac gcgctggaga actacgcgta caacatgcgc 1680
aacacggtgc gggacgagaa gatcgcgtcc aagctccccg ccgacgacaa gaagaagatc 1740
gaggactcca tcgaggacgc catcaagtgg ctcgacggca accagctcgc cgaggccgac 1800
gagttcgagg acaagatgaa ggagctggag agcatctgca accccatcat ctccaagatg 1860
taccagggtg ctggcccggg cggcgcggcc ggcatggacg aggacatgcc cggcggcggc 1920
gcgggcaccg gcggtgggag cggtgccggg cccaagatcg aagaagtgga ctga 1974
<210> 43
<211> 657
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 43
Met Ala Ser Lys Gly Gly Asn Lys Gly Glu Gly Pro Ala Ile Gly Ile
1 5 10 15
Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Trp Gln His Asp Arg
20 25 30
Val Glu Ile Val Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr
35 40 45
Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn
50 55 60
Gln Val Ala Met Asn Pro Thr Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu
65 70 75 80
Ile Gly Arg Arg Phe Ser Asp Ala Ser Val Gln Ser Asp Met Lys Met
85 90 95
Trp Pro Phe Lys Val Val Pro Gly Ala Gly Asp Lys Pro Met Ile Val
100 105 110
Val Ser Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Thr Phe Ser Ala Glu Glu Ile Ser
115 120 125
Ser Met Val Leu Thr Lys Met Arg Glu Ile Ala Glu Ala Phe Leu Ser
130 135 140
Thr Thr Ile Asn Asn Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp
145 150 155 160
Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn
165 170 175
Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly
180 185 190
Leu Asp Lys Lys Ala Thr Ser Thr Gly Glu Lys Asn Val Leu Ile Phe
195 200 205
Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu Thr Ile Glu Glu
210 215 220
Gly Ile Phe Glu Val Lys Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly
225 230 235 240
Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met Val Asn His Phe Val Gln Glu Phe Lys
245 250 255
Arg Lys Asn Lys Lys Asp Ile Ser Gly Asn Pro Arg Ala Leu Arg Arg
260 265 270
Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg Thr Leu Ser Ser Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Thr Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr Glu Gly Ile Asp Phe Tyr
290 295 300
Ala Thr Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe
305 310 315 320
Arg Lys Cys Met Glu Pro Val Glu Lys Cys Leu Arg Asp Ala Lys Met
325 330 335
Asp Lys Thr Gln Ile His Asp Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg
340 345 350
Ile Pro Lys Val Gln Gln Leu Leu Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Leu Cys Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala
370 375 380
Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Glu Gly Asn Gln Lys Val Gln Asp
385 390 395 400
Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala
405 410 415
Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Pro Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr
420 425 430
Lys Lys Glu Gln Val Phe Ser Thr Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val
435 440 445
Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Thr Arg Thr Lys Asp Asn Asn
450 455 460
Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Ser Gly Ile Pro Ser Ala Pro Arg Gly
465 470 475 480
Val Pro Gln Ile Thr Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu
485 490 495
Asn Val Ser Ala Glu Asp Lys Thr Thr Gly Gln Lys Asn Lys Ile Thr
500 505 510
Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys Glu Glu Ile Glu Arg Met
515 520 525
Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ser Glu Asp Glu Gln Val Arg His
530 535 540
Lys Val Glu Ala Arg Asn Ala Leu Glu Asn Tyr Ala Tyr Asn Met Arg
545 550 555 560
Asn Thr Val Arg Asp Glu Lys Ile Ala Ser Lys Leu Pro Ala Asp Asp
565 570 575
Lys Lys Lys Ile Glu Asp Ser Ile Glu Asp Ala Ile Lys Trp Leu Asp
580 585 590
Gly Asn Gln Leu Ala Glu Ala Asp Glu Phe Glu Asp Lys Met Lys Glu
595 600 605
Leu Glu Ser Ile Cys Asn Pro Ile Ile Ser Lys Met Tyr Gln Gly Ala
610 615 620
Gly Pro Gly Gly Ala Ala Gly Met Asp Glu Asp Met Pro Gly Gly Gly
625 630 635 640
Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Pro Lys Ile Glu Glu Val
645 650 655
Asp
<210> 44
<211> 1259
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 44
cgatatttgc caaaagttta cggttttgta tttcatcgtg tcgcccaaga aaatcgaagg 60
aacgcgccgc caccggccgc aacaaagcaa cgcaggcctc cggcctccct gaactgactt 120
cagaagtcac caacgcaccc agcacagaca gaagaccctc gccggacgct cgctctcgcc 180
ggggacaact caatcacgag gccaggatgg cccgctacga tcgcgcgatc accgtgttct 240
cacccgacgg ccacctcttc caggtcgagt acgccctcga ggccgtccgc aagggcaacg 300
ccgctgtcgg cgtccgcggt gtcgacaccg tcgtcctcgg cgtcgagaag aagtccaccc 360
ccaagctcca ggactccagg tcggtccgtc ggtacctccc cctccctccc atccaccaga 420
tctcttgacc ccgggcgccg cctcacccaa atcctccccc aaaaaatctc cgcaggtccg 480
tgcgcaagat cgcgagcctg gacacccaca tcgcgctggc gtgcgcgggg ctcaaggccg 540
acgcgcgcgt gctcatcaac cgcgctcgcg tggagtgcca gagccaccgc ctcacagtcg 600
aggaccccgt caccgtcgag tacatcacgc gctacatcgc cggcctgcag cagaagtaca 660
cgcagagcgg aggggtgcgc cccttcggcc tctccacgct catcgtcggc ttcgatccct 720
acacccagaa gcccgcgctg taccagactg acccctcggg gaccttctcc gcttggaagg 780
ccaacgcaac cggccgcaac tccaactcca tgcgcgagtt tctcgagaag aattacaagg 840
agacgtccgg taaggagacc atcaagctcg ccatcagagc actccttgag gtatacactc 900
aagcacttaa ttagcactag tggatccaaa caggcccttt tatgtgatta ttcagagaga 960
catagtactt gaagggtgtc aattgggagc aattagtata gaatgagaaa gatcaactcc 1020
ttatttataa aggcgacaat ttgtcactga agtgaaccaa atgatgtggc agtgctggac 1080
ttagaactaa gcttgcattg ctcaactcaa tgtaccactg gagtgttgaa atctatactt 1140
tgtgtgtgct gtggcagcca agtgtttcat gtgtcatggt tgattcatta tgaatagtgg 1200
tagcatcaac tatagatccc agtttaaacg atagttgcag atttcaatga aatttttat 1259
<210> 45
<211> 750
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 45
atggcccgct acgatcgcgc gatcaccgtg ttctcacccg acggccacct cttccaggtc 60
gagtacgccc tcgaggccgt ccgcaagggc aacgccgctg tcggcgtccg cggtgtcgac 120
accgtcgtcc tcggcgtcga gaagaagtcc acccccaagc tccaggactc caggtccgtg 180
cgcaagatcg cgagcctgga cacccacatc gcgctggcgt gcgcggggct caaggccgac 240
gcgcgcgtgc tcatcaaccg cgctcgcgtg gagtgccaga gccaccgcct cacagtcgag 300
gaccccgtca ccgtcgagta catcacgcgc tacatcgccg gcctgcagca gaagtacacg 360
cagagcggag gggtgcgccc cttcggcctc tccacgctca tcgtcggctt cgatccctac 420
acccagaagc ccgcgctgta ccagactgac ccctcgggga ccttctccgc ttggaaggcc 480
aacgcaaccg gccgcaactc caactccatg cgcgagtttc tcgagaagaa ttacaaggag 540
acgtccggta aggagaccat caagctcgcc atcagagcac tccttgaggt tgttgagagt 600
ggtggcaaga acatagagat tgcagtgatg acacacgagg acggccttca tgaactcgaa 660
gaggctgaga ttgatgagta tgttgccgaa attgaagcag agaaagccgc tgccgaggct 720
gcaaagaagg gtgcaccaaa ggggaactga 750
<210> 46
<211> 249
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 46
Met Ala Arg Tyr Asp Arg Ala Ile Thr Val Phe Ser Pro Asp Gly His
1 5 10 15
Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Val Arg Lys Gly Asn Ala
20 25 30
Ala Val Gly Val Arg Gly Val Asp Thr Val Val Leu Gly Val Glu Lys
35 40 45
Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg Ser Val Arg Lys Ile Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Thr His Ile Ala Leu Ala Cys Ala Gly Leu Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val Glu Cys Gln Ser His Arg
85 90 95
Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser Gly Gly Val Arg Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Ser Thr Leu Ile Val Gly Phe Asp Pro Tyr Thr Gln Lys Pro
130 135 140
Ala Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Ser Gly Thr Phe Ser Ala Trp Lys Ala
145 150 155 160
Asn Ala Thr Gly Arg Asn Ser Asn Ser Met Arg Glu Phe Leu Glu Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Glu Thr Ser Gly Lys Glu Thr Ile Lys Leu Ala Ile Arg
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Gly Gly Lys Asn Ile Glu Ile Ala
195 200 205
Val Met Thr His Glu Asp Gly Leu His Glu Leu Glu Glu Ala Glu Ile
210 215 220
Asp Glu Tyr Val Ala Glu Ile Glu Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Ala
225 230 235 240
Ala Lys Lys Gly Ala Pro Lys Gly Asn
245
<210> 47
<211> 750
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 47
atggcccgct acgaccgagc gatcaccgtc ttctcccccg acggccacct cttccaggtt 60
gagtacgccc tcgaggccgt ccgcaagggc aacgccgccg tcggcgtccg aggcgtcgac 120
accgtcgtcc tcggtgtcga gaagaagtcc acccccaagc tccaggactc caggtccgtg 180
cgcaagatcg cgagcctgga cacccacatc gcgctggcct gcgcgggtct gaaggcggac 240
gcgcgcgtgc tcatcaaccg ggcgcgcgtc gagtgccaga gccaccgcct caccgtcgag 300
gaccccgtca ctgtcgagta catcacgcgc tacatcgccg gcctgcagca gaagtacacg 360
cagagcggag gggtgcgccc gttcgggctc tccacgctca tagttggctt cgacccctat 420
accgagaagc ccgcgctgta ccagaccgac ccctccggca ccttctccgc ctggaaggcc 480
aacgccaccg gccgcaactc caactccatg cgcgaattcc ttgagaagaa ttacaaggag 540
acgtccggca aggagaccat caagcttacc atccgagccc tccttgaggt tgtcgagagt 600
ggtggcaaga acattgagat tgctgtgatg acgcacaaag atggtcttcg ccagcttgag 660
gaagaggaga tcgatgagta tgttgctgag attgaagcag agaaggccgc tgctgaggct 720
gcaaagaagg gtggcccgaa agacacataa 750
<210> 48
<211> 249
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 48
Met Ala Arg Tyr Asp Arg Ala Ile Thr Val Phe Ser Pro Asp Gly His
1 5 10 15
Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Val Arg Lys Gly Asn Ala
20 25 30
Ala Val Gly Val Arg Gly Val Asp Thr Val Val Leu Gly Val Glu Lys
35 40 45
Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg Ser Val Arg Lys Ile Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Thr His Ile Ala Leu Ala Cys Ala Gly Leu Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val Glu Cys Gln Ser His Arg
85 90 95
Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser Gly Gly Val Arg Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Ser Thr Leu Ile Val Gly Phe Asp Pro Tyr Thr Glu Lys Pro
130 135 140
Ala Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Ser Gly Thr Phe Ser Ala Trp Lys Ala
145 150 155 160
Asn Ala Thr Gly Arg Asn Ser Asn Ser Met Arg Glu Phe Leu Glu Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Glu Thr Ser Gly Lys Glu Thr Ile Lys Leu Thr Ile Arg
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Gly Gly Lys Asn Ile Glu Ile Ala
195 200 205
Val Met Thr His Lys Asp Gly Leu Arg Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ile
210 215 220
Asp Glu Tyr Val Ala Glu Ile Glu Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Ala
225 230 235 240
Ala Lys Lys Gly Gly Pro Lys Asp Thr
245
<210> 49
<211> 750
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 49
atggcccgct acgaccgagc gatcaccgtc ttctcccccg acggccacct cttccaggtt 60
gagtacgccc tcgaggccgt ccgcaagggc aacgccgccg tcggcgtccg aggcgtcgac 120
accgtcgtcc tcggtgtcga gaagaagtcc acccccaagc tccaagactc caggtccgtg 180
cgcaagatcg cgagcctgga cacccacatc gcgttggcct gcgcgggtct gaaggcggac 240
gcgcgcgtgc tcatcaaccg ggcgcgcgtc gagtgccaga gccaccgcct caccgtcgag 300
gaccccgtca ctgtcgagta catcacgcgc tacatcgccg gcctgcagca gaagtacacg 360
cagagcggag gggtgcgccc gttcgggctc tccacgctca tagttggctt cgacccctat 420
actgagaagc ctgcgctgta ccagaccgac ccctccggca ccttctccgc ctggaaggcc 480
aacgccaccg gccgcaactc caactccatg cgcgagttcc ttgagaagaa ttacaaggag 540
acgtccggca aggagaccat caagcttacc atccgagccc tccttgaggt tgtcgagagt 600
ggtggcaaga acattgagat tgctgtgatg acgcacaaag atggtcttcg ccagcttgag 660
gaagaggaga tcgatgagta tgttgctgag attgaagcag agaaggctgc tgctgaggct 720
gcgaagaagg gtggcccgaa agacacataa 750
<210> 50
<211> 249
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 50
Met Ala Arg Tyr Asp Arg Ala Ile Thr Val Phe Ser Pro Asp Gly His
1 5 10 15
Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Val Arg Lys Gly Asn Ala
20 25 30
Ala Val Gly Val Arg Gly Val Asp Thr Val Val Leu Gly Val Glu Lys
35 40 45
Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg Ser Val Arg Lys Ile Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Thr His Ile Ala Leu Ala Cys Ala Gly Leu Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val Glu Cys Gln Ser His Arg
85 90 95
Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser Gly Gly Val Arg Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Ser Thr Leu Ile Val Gly Phe Asp Pro Tyr Thr Glu Lys Pro
130 135 140
Ala Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Ser Gly Thr Phe Ser Ala Trp Lys Ala
145 150 155 160
Asn Ala Thr Gly Arg Asn Ser Asn Ser Met Arg Glu Phe Leu Glu Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Glu Thr Ser Gly Lys Glu Thr Ile Lys Leu Thr Ile Arg
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Gly Gly Lys Asn Ile Glu Ile Ala
195 200 205
Val Met Thr His Lys Asp Gly Leu Arg Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ile
210 215 220
Asp Glu Tyr Val Ala Glu Ile Glu Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Ala
225 230 235 240
Ala Lys Lys Gly Gly Pro Lys Asp Thr
245
<210> 51
<211> 750
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 51
atggcccgct acgaccgagc gatcaccgtc ttctcccccg acggccacct cttccaggtt 60
gagtacgccc tcgaggccgt ccgcaagggc aacgccgccg tcggcgtccg aggcgtcgac 120
accgtcgtcc tcggtgtcga gaagaagtcc acccccaagc tccaggactc caggtccgtg 180
cgcaagatcg cgagcctgga cacccacatc gcgctggcct gcgcgggtct caaggcggac 240
gcgcgcgtgc tgatcaaccg ggcgcgcgtc gagtgccaga gccaccgcct caccgtcgag 300
gaccccgtca ctgtcgagta catcacgcgc tacatcgccg gcctgcagca gaagtacacg 360
cagagcggag gggtgcgccc gttcgggctc tccacgctta tagttggctt cgacccctat 420
actgagaagc cggcgctgta ccagaccgac ccctccggca ccttctccgc ctggaaggcc 480
aacgccaccg gccgcaactc caactccatg cgcgagttcc ttgagaagaa ttacaaggag 540
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gcgaagaagg gtggcccgaa agacacataa 750
<210> 52
<211> 249
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 52
Met Ala Arg Tyr Asp Arg Ala Ile Thr Val Phe Ser Pro Asp Gly His
1 5 10 15
Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Val Arg Lys Gly Asn Ala
20 25 30
Ala Val Gly Val Arg Gly Val Asp Thr Val Val Leu Gly Val Glu Lys
35 40 45
Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg Ser Val Arg Lys Ile Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Thr His Ile Ala Leu Ala Cys Ala Gly Leu Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val Glu Cys Gln Ser His Arg
85 90 95
Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser Gly Gly Val Arg Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Ser Thr Leu Ile Val Gly Phe Asp Pro Tyr Thr Glu Lys Pro
130 135 140
Ala Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Ser Gly Thr Phe Ser Ala Trp Lys Ala
145 150 155 160
Asn Ala Thr Gly Arg Asn Ser Asn Ser Met Arg Glu Phe Leu Glu Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Glu Thr Ser Gly Lys Glu Thr Ile Lys Leu Thr Ile Arg
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Val Val Glu Ser Gly Gly Lys Asn Ile Glu Ile Ala
195 200 205
Val Met Thr His Lys Asp Gly Leu Arg Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ile
210 215 220
Asp Glu Tyr Val Ala Glu Ile Glu Ala Glu Lys Ala Ala Ala Glu Ala
225 230 235 240
Ala Lys Lys Gly Gly Pro Lys Asp Thr
245

Claims (22)

1.一种分离的不育多核苷酸，包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、4或7有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:2、5或8有至少85％的一致性；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6或9有至少90％的一致性；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列。其中植物中所述多核苷酸表达的增加能使植物不育，并能被用于开发新的种子生产技术。
2.权利要求1所述的分离的不育多核苷酸，其中所述多核苷酸包含的核苷酸序列为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
3.权利要求1所述的分离的不育多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽包含的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9，或是与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9有至少90％一致性的氨基酸序列。
4.在植物中使用权利要求1-3中所述的任一分离的不育多核苷酸来调控植物的不育性。
5.一种重组DNA构建体，该重组DNA构建体含有权利要求1-3所述的任一分离的不育多核苷酸，可操作地连接至少一个异源调控元件。
6.一种转基因植物、植物细胞或种子，在其基因组中含有重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体含有权利要求1-3中任一多核苷酸，可操作地连接至少一个调控元件。所述植物是不育的。
7.权利要求6所述的转基因植物或植物细胞，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
8.权利要求6所述的转基因植物或植物细胞，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9。
9.权利要求6所述的植物，其中编码DnaK多肽或ZOS3-17多肽或PPT1-1多肽的多核苷酸是一种内源性多核苷酸。
10.权利要求7到9所述的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
11.一种产生不育植物的方法，包括增加权利要求1所述的多核苷酸的表达。
12.权利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1、4或7有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:2、5或8有至少85％的一致性；和(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:3、6或9有至少90％的一致性。
13.权利要求12所述的方法，包括：
(a)向一个可再生植物细胞引入一个重组DNA构建体，所述重组DNA构建体含有可操作地连接至少一个异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6或9有至少80％的序列一致性；
(b)在步骤(a)之后从可再生植物细胞再生转基因植物，该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和
(c)获得一个来源于步骤(b)的转基因植物的子代植物，该子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，且当和不含有该重组DNA构建体的对照植物相比较时表现出增加的抗虫性。
14.权利要求11到13所述的任一植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
15.一种鉴定与水稻植物群体中不育特性相关的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括一下步骤：
(a)在水稻植物群体中检测(i)编码多肽的基因组区域或(ii)控制该多肽表达的调控区域中的一种或多种多态性，其中所述多肽含有的核苷酸序列为SEQ ID NO:3、6或9，或与SEQ ID NO:3、6或9的序列有90％的一致性，其中编码所述多肽的基因组区域或控制该多肽表达的调控区域中的一种或多种多态性与不育性状有关；和
(b)鉴定与不育性状相关的一种或多种多态性的一个或多个等位基因。
16.权利要求15所述的方法，其中与不育性状相关的一个或多个等位基因被用于标记辅助选择具有不育性状的水稻植株。
17.权利要求15所述的方法，其中一个或多个多态性位于多核苷酸的编码区。
18.权利要求15所述的方法，其中所述调控区域是一个启动子。
19.一种分离的不育多核苷酸，包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO:26、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44、45、47、49或51有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，其中植物中该多核苷酸表达的增加赋予植物雌性不育性状，并能够被用于开发新的种子生产技术。
20.一种产生雌性不育植物的方法，包括增加权利要求19的多核苷酸的表达。
21.权利要求20所述的方法，其中所述雌性不育植物是水稻、玉米或小麦。
22.一种鉴定玉米或小麦植物群体中与雌性不育性状相关的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)检测一个玉米或小麦植物群体中(i)编码多肽的基因组区域或(ii)控制该多肽表达的调控区域中的一个或多个多态性，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52，或与SEQ ID NO:28、30、32、34、37、39、41、43、46、48、50或52有90％一致性的序列。其中编码所述多肽的基因组区域或控制该多肽表达的调控区域中的一种或多种多态性与雌性不育性状有关；和
(b)鉴定与雌性不育性状相关的一种或多种多态性的一个或多个等位基因。
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