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CN114008080A - 抗pd-l1/抗lag-3多抗原结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

抗pd-l1/抗lag-3多抗原结合蛋白及其使用方法 Download PDF

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CN114008080A
CN114008080A CN202080042329.8A CN202080042329A CN114008080A CN 114008080 A CN114008080 A CN 114008080A CN 202080042329 A CN202080042329 A CN 202080042329A CN 114008080 A CN114008080 A CN 114008080A
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Abstract

提供了多抗原结合蛋白，所述多抗原结合蛋白含有特异性结合PD‑L1、优选地人PD‑L1上的表位的第一抗原结合部分；和特异性结合LAG‑3上的表位的第二抗原结合部分。还提供了编码所述多抗原结合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞和包含所述多抗原结合蛋白的药物组合物，以及使用所述多抗原结合蛋白和药物组合物治疗癌症的方法。

Description

抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月12日提交的PCT/CN2019/090904的优先权，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
以ASCII文本文件提交的序列表
本申请含有序列表，该序列表是以ASCII格式的序列表形式，通过EFS-Web以电子方式提交，其文件名是“689296.0020 Sequence Listing”且创建日期是2020年6月4日，并且大小是107kB。序列表是通过EFS-Web提交，作为本说明书的一部分并以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及多抗原结合蛋白，尤其是双特异性抗体，其包含特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)上的表位的第一抗原结合部分和特异性结合淋巴细胞激活基因3(LAG-3)上的表位的第二抗原结合部分；含有此类多抗原结合蛋白的药物组合物；以及其制备和使用方法。
背景技术
哺乳动物免疫系统是击退病原体并防止疾病发生的宿主防御系统(Chen等人,《免疫学前沿(Frontiers Immunol.)》9:320(2018))。这一普遍存在的复杂系统包含以时空方式协作的多种免疫细胞、组织和器官。当该系统适当地起作用时，鉴别出异常细胞并与身体自身的健康细胞相区别，随后将其消除。因此，完整的人体免疫系统对于我们的存活至关重要。相反地，这一系统的病症将导致自身免疫疾病、炎症性疾病和癌症(Ribas等人,《癌症发现(CancerDiscovery)》5:915-9(2015)；Yao和Chen,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》43:576-9(2013))。免疫系统可大体上分为体液免疫和细胞介导的免疫。体液免疫是由如抗体之类大分子介导的。相比之下，细胞介导的免疫涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活。
免疫反应的激活和抑制主要由两个独立的信号传导路径介导(Gorentla和Zhong,《临床与细胞免疫学杂志(J.Clin.Cell.Immunol.)》(2012)；Huse,《细胞科学杂志(J.CellSci.)》122:1269-73(2009)；Mizota等人,《麻醉学杂志(J.Anesthesia)》27:80-7(2013))。第一个信号是由特定T细胞受体(TCR)结合至与抗原呈递细胞(APC)膜上的主要组织相容性复合体(MHC)形成复合物的抗原肽所提供的抗原特异性信号。第二个信号是通过APC与T细胞膜上表达的共刺激分子接合而引起的抗原非特异性信号。在无共刺激情况下，激活T细胞使得T细胞无反应性或失能。
第二个信号传导路径中所涉及的一系列共刺激和共抑制受体将调节淋巴细胞针对抗原-受体接合的反应，以平衡阳性信号和阴性信号，由此使针对侵入物的免疫反应最大化，同时维持自身耐受性(Chen和Flies,《自然综述·免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》13:227-42(2013)；Ewing等人,《国际心脏病学杂志(Int.J.Cardiol.)》168:196574(2013)；Liu等人,《免疫学研究(Immunol.Invest.)》45:813-31(2016)；Shen等人,《生物科学前沿(Frontiers in Biosci.)》24:96-132(2019)；Zhang和Vignali,《免疫学(Immunity)》44:1034-51(2016))。
CD28，作为CD28家族的成员，是在初始CD4+和CD8+T细胞上组成性表达的主要T细胞共刺激受体。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，也是CD28受体家族的一个成员，它是在调节性T细胞(Treg)上组成性表达或在T细胞激活之后通过CD28诱导的共抑制受体。CD28或CTLA-4可结合至B7.1(CD80)或B7.2(CD86)配体，由此分别在T细胞中传输激活或抑制信号。
CD28受体的配体包括CD80、CD86、程序性死亡1配体(PD-L1)、程序性死亡2配体(PD-L2)等。确切地说，PD-L1是一种跨膜蛋白，它结合至PD-1的抑制性检查点分子，通过传输抑制性“未发现我(don't find me)”信号而引起适应性免疫反应的抑制。PD-1/PD-L1信号传导路径通过防止免疫系统的过度反应性而在免疫耐受性的发展中起到重要作用，并因此，避免自身免疫性疾病的发展(Dosset等人,《癌症免疫学(Oncoimmunol.)》7:e1433981(2018)；Feng等人,《癌症快报(Canc.Lett.)》407:57-65(2017)；Salmaninejad等人,《细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)》(2019))。然而，该路径在癌症进展期间通常会失调，使肿瘤细胞通过伪装为健康组织而绕开保护机制。高水平表达PD-L1的肿瘤细胞可通过激活PD-1/PD-L1信号传导路径而避开T细胞介导的死亡并减弱抗肿瘤适应性免疫反应(Black等人,《免疫疗法(Immunotherapy)》11:585-90(2019)；Bocanegra等人,《国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)》20(2019)；Carlsson等人,《应用免疫组织化学与分子形态学(Appl.Immunohistochem.Mol.Morph.)》(2019)；Davidsson等人,《欧洲泌尿科学(Eur.Urol.Oncol.)》2:214-21(2019))。经证实，人肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中PD-1的过度表达也抑制吞噬作用和肿瘤免疫。当前，经显示，中断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1单克隆抗体(mAb)引起癌症治疗的改善(Lee等人,《免疫肿瘤学(Immuno-Oncol.)》(2019))。尽管FDA批准Keytruda、Opdivo和Tecentriq治疗晚期癌症，但需要更有效的改善免疫疗法的方法，因为这些抗肿瘤剂仅产生部分反应。
淋巴细胞激活基因3(LAG-3)是在激活T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达的跨膜蛋白(Sierro等人,《治疗靶标的专家意见(Exp.Opin.Therap.Targ.)》15:91-101(2011))。LAG-3，与PD-1相似，是结合至APC上的MHCII并负向调节T细胞受体信号传导的一种免疫检查点受体(Andreae等人,《血液(Blood)》102:2130-7(2003)；Buisson和Triebel,《疫苗(Vaccine)》21:862-8(2003))。近来，纤维蛋白原样蛋白质1，即FGL1，作为一种肝脏分泌的蛋白质，被鉴别为另一种LAG3功能性配体。由于LAG-3也在Treg细胞上表达(Huang等人,《免疫(Immunity)》21:503-13(2004))，故阻断LAG-3可以抑制Treg的活性并增强抗肿瘤免疫。LAG-3阻断相较于包括PD-1/PD-L1路径在内的其它路径的抑制展示出优良的T细胞激活(Goldberg和Drake,《微生物学与免疫学当前主题(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)》344:269-78(2011)；Long等人,《基因与癌症(Genes&Canc.)》9:176-89(2018)；Lui和Davis,《自然·免疫学(Nat.Immunol.)》19:1278-9(2018)；Sierro等人,《治疗靶标的专家意见》15:91-101(2011))。更重要的是，临床前实验显示通过PD-1/PD-L1和LAG-3信号传导路径的双重阻断可实现协同抗肿瘤免疫(Butler等人,《自然·免疫学》13:188-95(2011)；Okazaki等人,《实验医学杂志(J.Exper.Med.)》208:395-407(2011)；Woo等人,《癌症研究(Canc.Res.)》72:917-27(2012))。
本文中所提及的所有出版物、专利、专利申请以及已公开的专利申请的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
本发明涉及包含多抗原结合蛋白的构建体，所述多抗原结合蛋白包含特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)上的表位的第一抗原结合部分和特异性结合淋巴细胞激活基因3(LAG-3)上的表位的第二抗原结合部分，以及所述构建体的制备和使用方法。
本文提供了分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。所述分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：(i)分别地，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分；其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
在某些实施例中，所述第二抗原结合部分包含单域抗体，该单域抗体包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其分别包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：(i)分别地，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQID NO:8的氨基酸序列；以及(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分，其中所述单域抗体包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其分别包含SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列；其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
在某些实施例中，第一抗原结合部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体。第一抗原结合部分可以例如是抗体片段，其包括含VH的重链和含VL的轻链。
在某些实施例中，第二抗原结合部分包含单一多肽链。在某些实施例中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合。第二抗原结合部分的羧基(C)末端可以例如与第一抗原结合部分的至少一条重链的氨基(N)末端或第一抗原结合部分的至少一条轻链的氨基(N)末端融合。第二抗原结合部分的氨基(N)末端可以例如与第一抗原结合部分的至少一条重链的羧基(C)末端或第一抗原结合部分的至少一条轻链的羧基(C)末端融合。在某些实施例中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分通过肽键或肽连接子彼此融合。在某些实施例中，肽连接子是GS连接子或突变的人IgG1铰链。肽连接子可例如包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40-43的氨基酸序列。
在某些实施例中，第一抗原结合部分的重链包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合部分的轻链包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的氨基酸序列。第一抗原结合部分的重链可包含SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:18的氨基酸序列，并且第一抗原部分的轻链可包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在某些实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。第二抗原结合部分可包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在某些实施例中，第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分是骆驼科、嵌合、人类、部分人源化或完全人源化的。
在某些实施例中，所述分离的抗CD47/抗PD-L1多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含抗CD47全长抗体和抗PD-L1单域抗体，其中：
(a)所述抗LAG-3 sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的C末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:24、28、45、47或49的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)其中所述抗LAG-3 sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的N末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:22、26或51的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(c)其中所述抗LAG-3 sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的C末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20或53的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQID NO:14或18的氨基酸序列；或
(d)其中所述抗LAG-3 sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的N末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ IDNO:14或18的氨基酸序列。
还提供了一种分离的核酸，该核酸编码如本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
还提供了一种载体，该载体包含编码如本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的分离的核酸。
还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含如本文所描述的分离的核酸或分离的载体。
还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或抗原结合片段，和药学上可接受的载剂。
本申请另一方面提供了一种治疗患有PD-L1和/或LAG-3相关疾病或有患PD-L1和/或LAG-3相关疾病的风险的受试者的方法，该方法包含向个体施用有效量的如本文所描述的药物组合物中的任一种。在一些实施例中，PD-L1和/或LAG-3相关疾病是癌症。在一些实施例中，癌症是实体肿瘤，如结肠癌。
在一些实施例中，所述方法另外包含向个体施用额外癌症疗法，如手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
在一些实施例中，PD-L1相关疾病是致病性感染。
在一些实施例中，药物组合物是全身性施用，如静脉内(i.v.)施用的。在一些实施例中，药物组合物是局部施用，如肿瘤内施用的。在一些实施例中，个体是人。
本申请另一方面提供一种产生本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或抗原结合片段中的任一种的方法，该方法包含在有效表达所编码的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的条件下，培养包含本文所描述的分离的核酸或载体中的任一种的宿主细胞，或培养以上描述的分离的宿主细胞中的任一种；以及从所述宿主细胞获得所表达的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述方法另外包含产生包含本文所描述的分离的核酸或载体中的任一种的宿主细胞。
附图说明
当与附图结合阅读时，将更好地理解以上发明内容以及以下具体实施方式。出于说明本发明的目的，附图中示出了目前优选的实施例。然而，应理解，本发明不限于示出的精确布置和仪器。在附图中：
图1描绘了例示性多抗原结合蛋白的示意性结构，所述多抗原结合蛋白包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体以及两种相同的单域抗体(sdAb)，其中每种sdAb的氨基(N)末端通过任选的肽连接子与一条重链的羧基(C)末端融合(例如mPDL1HCv1-E-sLAG3和mPDL1HCv5-E-sLAG3)。所述全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。所述两种sdAb特异性结合第二表位。例如，所述多抗原结合蛋白可由四条多肽链组成，该四条多肽链从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在替代性型式中，每种sdAb可被彼此融合的sdAb的两个拷贝置换。
图2描绘了例示性多抗原结合蛋白的示意性结构，所述多抗原结合蛋白包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体，以及两种相同sdAb，其中每种sdAb的C末端与一条重链的N末端融合(例如sLAG3-E-mPDL1HCv1和sLAG3-E-mPDL1HCv5)。所述全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。所述两种sdAb特异性结合第二表位。例如，所述多抗原结合蛋白可由四条多肽链组成，该四条多肽链从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在替代性型式中，每种sdAb可省略，或被彼此融合的两种相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩大结合特异性。
图3描绘了例示性多抗原结合蛋白的示意性结构，所述多抗原结合蛋白包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体，以及两种相同sdAb，其中每种sdAb的N末端通过任选的肽连接子与一条轻链的C末端融合(例如mPDL1LCv1-E-sLAG3-HCv1和mPDL1LCv1-E-sLAG3-HCv5)。所述全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。所述两种sdAb特异性结合第二表位。例如，所述多抗原结合蛋白可由四条多肽链组成，该四条多肽链从N末端至C末端具有如下结构：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL-VHH，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在替代性型式中，每种sdAb可省略，或被彼此融合的两种相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩大结合特异性。
图4描绘了例示性多抗原结合蛋白的示意性结构，所述多抗原结合蛋白包含具有两条相同重链和两条相同轻链的单特异性全长抗体，以及两种相同sdAb，其中每种sdAb的C末端通过任选的肽连接子与一条轻链的N末端融合(例如sLAG3-E-mPDL1LCv1-HCv1和sLAG3-mPDL1Cv1-HCv5)。所述全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。所述两种sdAb特异性结合第二表位。例如，所述多抗原结合蛋白可由四条多肽链组成，该四条多肽链从N末端至C末端具有如下结构：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在替代性型式中，每种sdAb可省略，或被彼此融合的两种相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩大结合特异性。
图5描绘了使用表达PD-L1的CHO-K1细胞进行FACS结合测定的结果。
图6描绘了使用表达LAG-3的CHO-K1细胞进行FACS结合测定的结果。
图7描绘了PD-1/PD-L1阻断生物测定的结果。
图8描绘了LAG-3阻断生物测定的结果。
图9描绘了使用表达PD-L1的CHO-K1细胞进行FACS结合测定的结果。
图10描绘了使用表达LAG-3的CHO-K1细胞进行FACS结合测定的结果。
图11描绘了PD-1/PD-L1阻断生物测定的结果。
图12描绘了LAG-3阻断生物测定的结果。
图13描绘了LAG-3阻断生物测定的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。所述分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含第一抗原结合部分，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点；和第二抗原结合部分，其包含特异性结合LAG-3的单域抗体(sdAb)，以及其抗体变体。作为抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的构造块，抗LAG-3 sdAb相对于以当前已知的多特异性型式使用的其它抗原结合片段，如Fab和scFv具有若干优势。所述优势可包括但不限于较小的大小、高溶解性和稳定性，以及在人体中较弱的免疫原性。因此，相较于全长抗体或抗原结合片段组分，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白可具有类似的分子量和药物动力学特性。
还提供了包含抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的组合物(如药物组合物)、试剂盒和制品；制备抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的方法；以及使用抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段治疗PD-L1和/或LAG-3相关疾病(例如癌症)的方法。
I.定义
除非明确地作相反指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，以下将出于说明的目的描述其中的许多方法。此类技术在文献中有完整说明，参见例如《现代分子生物学实验技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)》或《新编免疫学实验手册(Current Protocols inImmunology)》John Wiley&Sons,纽约州纽约(New York,N.Y.)(2009)；Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecule Biology)》,第3版,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,《分子克隆实验室手册(Molecule Cloning:A LaboratoryManual)》(第3版,2001)；Maniatis等人,《分子克隆实验室手册》(1982)；《DNA克隆实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I卷和第II卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编,1984)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.Hames和S.Higgins编,1985)；《转录与翻译(Transcription andTranslation)》(B.Hames和S.Higgins编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编,1986)；Perbal,《分子克隆实践指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》(1984)和其它类似参考文献。
术语“程序性细胞死亡1配体1”、“PD-L1”、“B7同源物1(B7-H1)”、“PD-L1抗原”、“PDCD1配体1”和“CD274”(参见例如Chemnitz(2004)《免疫学杂志(J.Immunol.)》173:945-954)可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、同种型、物种同源物，以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物(参见例如Butte(2008)《分子免疫学(Mol Immunol.)》45:3567-3572)。因此，在某些情况下，本发明的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可与来自除人类外的物种的PD-L1或结构与人PD-L1有关的其它蛋白质(例如人PD-L1同源物)交叉反应。在其它情况下，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可对人PD-L1具有完全特异性并且不展现物种或其它类型的交叉反应性。
术语“人PD-L1”是指人序列PD-L1，如具有基因库(Genebank)寄存编号Q9NZQ7的人PD-L1的完整氨基酸序列。人PD-L1序列与基因库寄存编号Q9NZQ7的人PD-L1的不同之处可在于具有例如保守突变或在非保守区中具有突变，并且PD-L1具有与基因库寄存编号Q9NZQ7的人PD-L1大体上相同的生物功能。例如，人PD-L1的生物功能是具有本公开的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段特异性结合的PD-L1的细胞外结构域中的表位，或人PD-L1的生物功能是调节T细胞活性。
如本文所使用，术语“程序性细胞死亡1(PD-1)”意图指属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体并在T细胞和前B细胞上表达。人B7-1(CD80)的氨基酸序列在基因库寄存编号NP_005009公开。
术语“LAG-3”是指淋巴细胞激活蛋白质3(LAG-3)，包含503个氨基酸，属于Ig超家族并且含有4个细胞外Ig样结构域，命名为D1至D4。LAG-3与CD4密切相关。LAG-3是在激活的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达的细胞表面蛋白质，并且在这些淋巴细胞亚群的功能中起到重要但未完全理解的作用。LAG-3蛋白质负向地调节T细胞的细胞增殖、激活和动态平衡。LAG-3还有助于将CD8+T细胞维持在致耐受性状态。LAG-3与其主要配体II类MHC之间的相互作用被认为在调节树突状细胞功能方面起到作用。近期的临床前研究证实了LAG-3在CD8 T细胞耗竭中的作用，并且多项临床试验正在评估在癌症患者中使用LAG-3阻断抗体或LAG-3-Ig融合蛋白阻断LAG-3/II类MHC相互作用的效果。
术语“LAG-3”包括人LAG-3的变体、同种型、物种同源物，以及与LAG-3具有至少一个共同表位的类似物。因此，在某些情况下，本发明的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可与来自除人类外的物种的LAG-3或结构与人LAG-3有关的其它蛋白质(例如人LAG-3同源物)交叉反应。在其它情况下，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可对人LAG-3具有完全特异性并且不展现物种或其它类型的交叉反应性。
术语“表位”意思指能够特异性结合至抗体的蛋白质决定子。表位通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，抗体与前者的结合丧失，但与后者的结合不丧失。
如本文所使用，“治疗(treatment/treating)”是获得包括临床结果在内的有益或所希望的结果的一种方法。出于本发明的目的，有益或所希望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状；降低疾病的程度；使疾病稳定(例如预防或延迟疾病的恶化)；预防或延迟疾病的扩散(例如转移)；预防或延迟疾病的复发；延迟或减慢疾病的进展；改善疾病状态；使疾病减轻(部分或完全减轻)；减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；延迟疾病的进展；提高生活质量；和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理结果。本发明的方法考虑了治疗的这些方面中的任一个或多个。
本文所使用的术语“有效量”是指足以治疗指定病症、疾患或疾病，如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或多种症状的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包含足以使肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(如抑制肿瘤生长)，或者预防或延迟其它不想要的细胞增殖的量。在一些实施例中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以分一次或多次施用来施用。有效量的药物或组合物可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减慢并且优选地停止癌细胞向周边器官中的浸润；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的出现和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。
如本文所使用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人类、牛科动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物或灵长类动物。在某些实施例中，受试者是人。
术语“抗体”或“抗体部分”是以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体和其抗原结合片段，只要其展现出所希望的抗原结合活性即可。
基础4链抗体单元是由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成的异四聚糖蛋白。IgM抗体由5个基础异四聚体单元和称为J链的额外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基础4链单元，所述单元可以聚合而与J链组合形成多价集合物。在IgG情况下，所述4链单元一般是约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而取决于H链同型，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同型的四个CH结构域。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对准且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。相信特定氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。VH与VL一起配对形成单一抗原结合位点。有关不同种类抗体的结构和特性，参见例如《基础临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology)》,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编),Appleton和Lange,康涅狄格州诺瓦克(Norwalk,CT),1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以指定为不同种类或同型。存在五个种类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α种类基于CH序列和功能的相对微小的差异，进一步分成若干亚类，例如人类表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“分离的”抗体(或构建体)是从其制造环境(例如天然地或以重组方式制造)的组分鉴别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽不与其制造环境中的所有其它组分缔合。其制造环境中的污染物组分，如由重组转染的细胞产生者，是典型地将干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施例中，多肽将被纯化至：(1)通过例如劳里法(Lowry method)所确定的超过95重量％并且在一些实施例中超过99重量％的抗体；(2)通过使用旋转杯序列分析仪足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)在非还原或还原条件下，通过SDS-PAGE，使用考马斯蓝(Coomassie Blue)或优选地银染色剂确定为均质的。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为在抗体天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的多肽、抗体或构建体将通过至少一个纯化步骤制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体中变化最大的部分(相对于同一种类的其它抗体)并且含有抗原结合位点。来自骆驼科物种的重链抗体具有单一重链可变区，称为“VHH”。因此，VHH是一种特殊类型的VH。
术语“可变”是指各抗体间可变结构域某些区段的序列广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并且决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变结构域内并非均匀地分布。实际上，可变性集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域中保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要呈β折叠构型，通过三个CDR连接形成环，所述环连接β折叠结构并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密邻近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,《免疫学感兴趣的序列(Sequences of ImmunologicalInterest)》,第五版,美国国立卫生研究院(National Institute ofHealth),马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。与典型地包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的优势还在于，这些抗体是由杂交瘤培养物合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示从大体上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，打算根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein.,《自然(Nature)》,256:495-97(1975)；Hongo等人,《杂交瘤(Hybridoma)》,14(3):253-260(1995)；Harlow等人,《抗体实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(Cold SpringHarbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等人,《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas)》563-681(Elsevier,纽约,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,《自然》,352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》222:581-597(1992)；Sidhu等人,《分子生物学杂志》338(2):299-310(2004)；Lee等人,《分子生物学杂志》340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》284(1-2):119-132(2004)；以及在具有人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因中的部分或全部的动物体内产生人类或人类样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,《美国国家科学院院刊》90:2551(1993)；Jakobovits等人,《自然》362:255-258(1993)；Bruggemann等人,《免疫学年鉴(Year in Immunol.)》7:33(1993)；美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号和第5,661,016号；Marks等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:779-783(1992)；Lonberg等人,《自然》368:856-859(1994)；Morrison,《自然》368:812-813(1994)；Fishwild等人,《自然·生物技术(Nature Biotechnol.)》14:845-851(1996)；Neuberger,《自然·生物技术》14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,《国际免疫学评述(Intern.Rev.Immunol.)》13:65-93(1995)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换地使用，指呈大体上完整形式的抗体，与抗体片段相对。具体地说，全长4链抗体包括具有重链和轻链且包括Fc区的抗体。仅全长重链抗体包括重链(如VHH)和Fc区。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应功能。
术语“恒定结构域”是指相对于含有抗原结合位点的免疫球蛋白的另一部分，即可变结构域，免疫球蛋白分子中氨基酸序列保守性较高的部分。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)以及轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列可分配到称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地是完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体(参见美国专利案第5,641,870号，实例2；Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；单域抗体(如VHH)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残留的“Fc”片段，此名称反映易于结晶的能力。Fab片段由完整L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段关于抗原结合是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大的F(ab')2片段，该片段大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端处具有几个额外残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是对于恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初是以其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对形式产生。抗体片段的其它化学偶合也已为人所知。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能是由Fc区的序列决定，所述区域也是由某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段是由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域折叠得到六个高变环(H链和L链各3个环)，这些高变环提供用于抗原结合的氨基酸残基并且使抗体具有抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或对抗原具有特异性的仅包含三个CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，不过其亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，又缩写为“sFv”或“scFv”，是连接成单一多肽链的包含VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽还在VH结构域与VL结构域之间包含多肽连接子，由此使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。有关sFv的评述，参见Pluckthun,《单克隆抗体药理学(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约,第269-315页(1994)。
本文所描述的抗体的“功能片段”包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合或可变区，或抗体中保留或具有改变的FcR结合能力的Fv区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“重链抗体”或“HCAb”是指包含重链但缺乏4链抗体中通常发现的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(如骆驼、大羊驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独sdAb能够结合至抗原，而不与相应的含CDR多肽配对。在一些情况下，单域抗体是由骆驼科HCAb工程改造得到，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”(重链抗体的重链可变结构域)。一些VHH也可称为纳米抗体。骆驼科sdAb是最小已知的抗原结合抗体片段中的一种(参见例如Hamers-Casterman等人,《自然》363:446-8(1993)；Greenberg等人,《自然》374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,《纳米医学(Nanomedicine)》(Lond),8:1013-26(2013))。基础VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
单克隆抗体在本文中特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这些链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现所希望的生物活性即可(美国专利第4,816,567号；Morrison等人,《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984))。“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
非人类(例如大羊驼、骆驼科和/或鼠类)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的抗体。在一个实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体CDR(如下文所定义)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和/或能力的非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔、骆驼、大羊驼、羊驼或非人类灵长类动物的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包含至少一个，典型地为两个，可变结构域的大体上全部，其中全部或大体上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环，且全部或大体上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，不过，FR区可包括一个或多个改良如结合亲和力、异构化、免疫原性等抗体性能的个别FR残基取代。FR中这些氨基酸取代的数量典型地在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。有关进一步详情，参见Jones等人,《自然》321:522-525(1986)；Reichmann等人,《自然》332:323-329(1988)；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。另外，参见例如Vaswani和Hamilton,《过敏、哮喘和免疫学年鉴(Ann.Allergy,Asthma&Immunol.)》1:105-115(1998)；Harris,《生物化学学会学报(Biochem.Soc.Transactions)》23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,《生物技术新观点(Curr.Op.Biotech.)》5:428-433(1994)；以及美国专利第6,982,321号和第7,087,409号。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用本文所公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这一定义尤其排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示库来产生。Hoogenboom和Winter,《分子生物学杂志》,227:381(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》,222:581(1991)。Cole等人,《单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies and CancerTherapy)》,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,147(1):86-95(1991)中所描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还参见van Dijk和van deWinkel,《药理学新见(Curr.Opin.Pharmacol.)》,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用给转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰成响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已经停用，例如免疫接种的转基因小鼠xenomice(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。另外，关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，参见例如Li等人,《美国国家科学院院刊》,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域中序列具有高变化性和/或形成结构确定的环的区域。一般来说，4链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中且三个在VL(L1、L2、L3)中。单域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。在天然4链抗体中，H3和L3展示六个HVR中的最大多样性，并且在单域抗体中，HVR3(或CDR3)展示三个HVR中的最大多样性。H3、L3和HVR3被认为在赋予抗体良好特异性方面起到独特作用。参见例如Hamers-Casterman等人,《自然》363:446-448(1993)；Sheriff等人,《自然-结构生物学(Nature Struct.Biol.)》3:733-736(1996)；Xu等人,《免疫(Immunity)》13:37-45(2000)；Johnson和Wu,《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》248:1-25(Lo编,Human Press,新泽西州特图瓦市(Totowa,NJ),2003)。
术语“互补决定区”或“CDR”用于指通过Kabat系统定义的高变区。参见Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)》第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991)。
本文使用且涵盖许多HVR描述。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性且是最常用的(Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》,第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院的公共卫生服务部(1991))。Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,《分子生物学杂志》196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR与Chothia结构环之间的折中，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用。“Contact”HVR是基于可获得的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基标注于下表1中。
表1.HVR描绘.
Figure BDA0003399880520000171
HVR可包含如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。关于这些定义中的每一个，可变结构域残基是根据前述Kabat等人编号。
单域抗体(如VHH)的氨基酸残基是根据Kabat等人(“免疫学感兴趣的蛋白质的序列”,马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院的美国公共卫生服务部,出版号91)所提供的VH结构域的一般编号进行编号，这适用于Riechmann和Muyldermans在2000年6月23日的《免疫学方法杂志》；240(1-2):185-195的文章中的来自骆驼的VHH结构域。根据这一编号，VHH的FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含在位置36-49处的氨基酸，VHH的CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。就这一点而言，应注意，如本领域中关于VH结构域和VHH结构域众所周知的，每个CDR中氨基酸残基的总数可变化并且可能不对应于由Kabat编号所指示的氨基酸残基的总数(也就是说，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能未被占据，或实际序列含有的氨基酸残基可能多于Kabat编号所允许的数量)。
表述“根据Kabat的可变结构域残基编号”或“根据Kabat的氨基酸位置编号”以及其变化形式是指前述Kabat等人中的用于抗体编译中的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这一编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域中FR或HVR的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入(根据Kabat，残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列中的同源性区域与“标准”Kabat编号序列相比对，可以确定给定抗体中残基的Kabat编号。
除非本文中另外指示，否则免疫球蛋白重链中残基的编号是如在前述Kabat等人中的EU索引的编号。“如在Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文所定义的HVR残基以外的可变结构域残基。
“人共有框架”或“人接受体框架”是表示在一系列人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。一般来说，所述一系列人免疫球蛋白VL或VH序列是来自可变结构域序列的亚组。一般来说，所述序列的亚组是如Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》,第5版,马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院的公共卫生服务部(1991)中的亚组。实例包括对于VL，所述亚组可以是如前述Kabat等人中的亚组κI、κII、κIII或κIV。此外，对于VH，所述亚组可以是如Kabat等人中的亚组I、亚组II或亚组III。或者，人共有框架可来源于上述，其中特定残基，如当人框架残基是基于通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合相比对所确定的其与供体框架的同源性而选择时。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的人受体框架可以包含与其相同的氨基酸序列，或该人受体框架可以含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施例中，预先存在的氨基酸变化的数量是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。
“亲和力成熟”的抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变使得抗体对抗原的亲和力相较于不具有这一个或多个改变的亲本抗体有所改善。在一些实施例中，亲和力成熟的抗体对靶标抗原具有纳摩尔浓度或甚至是皮摩尔浓度的亲和力。亲和力成熟的抗体是通过本领域中已知的程序产生。例如，Marks等人,《生物技术》10:779-783(1992)描述了通过VH结构域和VL结构域改组实现的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于例如以下：Barbas等人,《美国国家科学院院刊》91:3809-3813(1994)；Schier等人,《基因(Gene)》169:147-155(1995)；Yelton等人,《免疫学杂志》155:1994-2004(1995)；Jackson等人,《免疫学杂志》154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等人,《分子生物学杂志》226:889-896(1992)。
如本文所使用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对……具有特异性”是指可测量且可重现的相互作用，如靶标与抗体之间的结合，其确定在包括生物分子在内异质分子群体的存在下所述靶标的存在。例如，特异性结合靶标(该靶标可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶标更大亲和性、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合这一靶标的抗体。在一些实施例中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，抗体与不相关靶标的结合程度是抗体与所述靶标的结合的不到约10％。在一些实施例中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(Kd)≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施例中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的所述蛋白质中保守的表位。在一些实施例中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白或抗体对抗原特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所使用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白或抗体具有多表位特异性(即，能够特异性结合至一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位或能够特异性结合至两个、三个或更多个不同生物分子上的表位)。如本文所使用，“双特异性”表示抗原结合蛋白或抗体具有两种不同的抗原结合特异性。除非另外指示，否则所列多抗原结合蛋白结合抗原的次序是任意的。也就是说，例如，术语“抗PD-L1/抗LAG-3”、“抗PD-L1/抗LAG-3”、“LAG-3×PD-L1”、“PD-L1×LAG-3”、“LAG-3-PD-L1”和“PD-L1-LAG-3”可互换使用，意思指特异性结合至PD-L1和LAG-3的多抗原结合蛋白。如本文所使用，术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述结合位点各自结合同一抗原的相同表位。
如本文所使用，术语“价”表示抗原结合蛋白或抗体中指定数量结合位点的存在。例如，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”表示在抗原结合蛋白或抗体中分别存在三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。本申请的双特异性抗体是至少“二价”的。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低所结合抗原的生物活性的抗体。在某些实施例中，阻断抗体或拮抗剂抗体大体上或完全抑制抗原的生物活性。
“激动剂”或激活抗体是增强或起始所结合的抗原的信号传导的抗体。在某些实施例中，激动剂抗体在无天然配体存在下引起或激活信号传导。
“抗体效应功能”是指可由抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性并且随抗体同型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；以及B细胞激活。使抗体效应功能“减弱或降到最低”意思指抗体效应功能自野生型或未修饰抗体减弱至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应功能的确定可容易地由本领域的普通技术人员确定和测量。在一个优选实施例中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性之类抗体效应功能受到影响。在一些实施例中，通过恒定区中消除糖基化的突变，例如“无效应物突变(effector-less mutation)”，来消除效应功能。在一方面，无效应物突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(9):6591-6604(2001)。或者，使效应功能减弱或消除的额外突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，可通过制造技术减弱或消除效应功能，如在不糖基化的宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达，或在宿主细胞中引起在促进效应功能方面无效或不太有效的糖基化模式改变(例如Shinkawa等人,《生物化学杂志》278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性的一种形式，其中所分泌的Ig结合至某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至携带抗原的靶标细胞，随后利用细胞毒素杀伤靶标细胞。抗体将“武装”细胞毒性细胞并且是通过这种机制杀伤靶标细胞所需的。介导ADCC的初代细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上Fc的表达概述于Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴》9:457-92(1991)第464页上的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所描述的测定。用于这类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人,《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》,95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常定义为从位置Cys226或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的产生或纯化期间或通过以重组方式工程改造编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可包含去除所有K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。适用于本文所描述的抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这些受体具有类似氨基酸序列，其不同之处主要在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见M.
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《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》15:203-234(1997)。FcR评述于Ravetch和Kinet，《免疫学年鉴》，9:457-92(1991)；Capel等人,《免疫方法(Immunomethods)》,4:25-34(1994)；以及de Haas等人,《实验室与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》,126:330-41(1995)中。其它FcR，包括将来识别的FcR，都涵盖在本文的术语“FcR”中。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等人,《免疫学杂志》117:587(1976)和Kim等人,《免疫学杂志》24:249(1994)。已知测量与FcRn的结合的方法(参见例如Ghetie和Ward,《今日免疫学(Immunol.Today)》18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人,《自然·生物技术》15(7):637-40(1997)；Hinton等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。人FcRn高亲和力结合多肽与FcRn在体内的结合以及血清半衰期可例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染后的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定。WO 2004/42072(Presta)描述与FcR的结合改善或减少的抗体变体。另外，参见例如Shields等人,《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001)。
“效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应功能的白细胞。在一方面，效应细胞至少表达FcgRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可从天然来源，例如血液分离。效应细胞一般是与效应期相关的淋巴细胞，并且用以产生细胞因子(辅助T细胞)，杀灭感染病原体的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶标细胞的溶解。补体系统第一组分(C1q)与结合至同源抗原的抗体(属于适当亚类)结合将起始经典补体路径的激活。为了评估补体激活，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santaro等人,《免疫学方法杂志》,202:163(1996))中所描述。Fc区氨基酸序列改变并且C1q结合能力增强或减弱的抗体变体描述于美国专利第6,194,551B1号和WO99/51642中。这些专利公开的内容明确地以引用的方式并入本文中。另外，参见Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)。
“结合亲和力”一般是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)各成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所描述的方法。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且往往容易解离，而高亲和力抗体一般较快地结合抗原并且往往会保持较长时间的结合。本领域中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一种均可用于本申请的目的。用于测量结合亲和力的具体说明性和例示性实施例描述于下。
“抗体或抗原结合结构域的结合特异性”可通过本领域中已知的方法，以实验方式确定。此类方法包含但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIAcore测试和肽扫描。
“半数最大抑制浓度(IC50)”是对一种物质(如抗体)抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。它指示将给定生物过程(例如PD-L1与B7-1之间的结合、LAG-3与II类MHC之间的结合或一个过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半需要的特定药物或其它物质(抑制剂，如抗体)的量。这些值典型地以摩尔浓度表示。对于激动剂药物或其它物质(如抗体)，IC50与EC50相当。EC50还表示在体内获得最大作用的50％所需的血浆浓度。如本文所使用，“IC50”用于指示在体外中和抗原生物活性(如PD-L1和/或LAG-3生物活性)的50％所需要的抗体(如抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白)的有效浓度。IC50或EC50可通过生物测定，如通过FACS分析(竞争结合测定)确定的配体结合抑制、基于细胞的细胞因子释放测定或放大发光邻近均相测定(amplified luminescent proximity homogeneous assay，AlphaLISA)测量。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在对准候选序列与特定肽或多肽序列并在必要时，引入空位以达到最大序列同一性百分比之后，并在不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的对准可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件实现。本领域的技术人员可以确定测量对准的适当参数，包括在所比较的序列的全长内实现最大对准所需的任何算法。
本文所描述的编码抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是经过鉴别并与至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，该核酸分子与所述至少一种污染核酸分子通常在其制造环境中相缔合。优选地，分离的核酸不与同制造环境相关联的所有组分缔合。编码本文所描述的多肽和抗体的分离的核酸分子呈与其在自然界中所发现的形式或环境不同的形式。因此，分离的核酸分子与细胞中天然存在的编码本文所描述的多肽和抗体的核酸不同。分离的核酸包括在通常含有核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但所述核酸分子是存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
核酸在与另一核酸序列呈功能关系时是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA是表达为参与多肽分泌的前蛋白形式，则该DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位成使得其促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般来说，“可操作地连接”意味着所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下，是连续的并处于阅读期内。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在适宜的限制位点处接合来实现。如果不存在此类位点，则根据常规惯例使用合成的寡核苷酸接头或连接子。
如本文所使用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自复制核酸结构的载体，以及并入引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所使用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指用于将外源核酸转移或引入中宿主细胞中的方法。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括初代受试者细胞和其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这些细胞包括初代转化细胞和由其得到的后代，不管传代的次数如何。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，而且可能含有突变。本文中包括具有与在最初转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变后代。
“辅助治疗”是指个体有癌症史并且一般(但未必)对疗法具有反应性的临床环境(clinical setting)，其包括但不限于手术(例如手术切除)、放射疗法和化学疗法。然而，由于个体有癌症史，认为这些个体有发展疾病的风险。“辅助治疗”中的治疗或用药是指后续治疗模式。风险程度(例如当辅助治疗中的个体被认为有“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最通常的是在首次治疗时的疾病程度。
“新辅助治疗”是指在主要/决定性疗法之前进行所述方法的临床环境。
术语“药物组合物”的“药物配制物”是指呈允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将被施用所述配制物的受试者具有不可接受的毒性的额外组分的制剂。这类配制物是无菌的。“无菌”配制物是无致病微生物的或不含所有活的微生物和其孢子。
应理解，本文所描述的本发明的实施例包括“由实施例组成”和/或“主要由实施例组成”。
本文中提到“约”一个值或参数包括(且描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所使用，提到“不是”一个值或参数一般指并且描述“除一个值或参数外”。例如，所述方法不用于治疗X型癌症意味着，该方法用于治疗除X外的类型的癌症。
本文中使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(种)”、“或”和“所述”包括多个(种)指示物。
II.抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段
本申请一方面提供了一种多特异性抗原结合蛋白(MABP)，例如分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。所述分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可例如包含(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：(i)分别地，SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11；并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分；其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
所述分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可例如包含(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：(i)分别地，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5，或(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分，其中所述单域抗体包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其分别包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列；其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
在本申请某些方面，第一抗原结合部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体。第一抗原结合部分可以例如是抗体片段，其包括含VH的重链和含VL的轻链。在本申请某些方面，第二抗原结合部分包含单一多肽链。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第一抗原结合部分包含：重链可变结构域(VH)，其具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含SEQID NO:4的氨基酸序列或其包含约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，其具有包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施例中，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第一抗原结合部分包含：重链可变结构域(VH)，其具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，其具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第一抗原结合部分包含：重链可变结构域(VH)，其具有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含SEQID NO:10的氨基酸序列或其包含约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，其具有包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施例中，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第一抗原结合部分包含：重链可变结构域(VH)，其具有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，其具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的第一抗原结合部分包括含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链以及含SEQID NO:16的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18中所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的重链，以及与SEQ ID NO:16中所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的轻链。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第二抗原结合部分是抗LAG-3 sdAb部分，其包括含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的CDR1；含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的CDR2；以及含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的CDR3。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第二抗原结合部分是抗LAG-3 sdAb部分，其包括含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；以及含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR3。
在本申请某些方面，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合部分的第二抗原结合部分是抗LAG-3 sdAb部分，其包含VHH结构域，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO:37具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的变体。在一些实施例中，所述抗LAG-3 sdAb部分包含VHH结构域，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其在所述VHH结构域中包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，包括含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其变体的VHH结构域的抗LAG-3 sdAb部分在CDR中，如在CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施例中，包括含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHH结构域或其变体的抗LAG-3 sdAb部分包含SEQID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在FR中，如在FR1，和/或FR2，和/或FR3，和/或FR4中。
在本申请某些方面，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分融合。第二抗原结合部分的羧基(C)末端可以例如与第一抗原结合部分的至少一条重链的氨基(N)末端或第一抗原结合部分的至少一条轻链的氨基(N)末端融合。第二抗原结合部分的氨基(N)末端可以例如与第一抗原结合部分的至少一条重链的羧基(C)末端或第一抗原结合部分的至少一条轻链的羧基(C)末端融合。在某些实施例中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分通过肽键或肽连接子彼此融合。肽连接子可例如包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:40-43的氨基酸序列。
在本申请某些方面，第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分是骆驼科、嵌合、人类、部分人源化或完全人源化的。
在本申请某些方面，第一抗原结合部分包含Fc区。在某些实施例中，第二抗原结合部分与Fc区的N末端融合。Fc区可以例如是IgG1 Fc。Fc区可以例如是具有S228P突变和/或L235E突变的IgG4 Fc。
在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3 sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的C末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:24、28、45、47或49的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3 sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的N末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:22、26或51的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3 sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的C末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20或53的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的C末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3 sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的C末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗PD-L1全长抗体和抗LAG-3单域抗体，其中所述抗LAG-3 sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的N末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列。
在另一个普通方面，本申请涉及一种分离的核酸，其编码本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。本领域的技术人员应了解，蛋白质的编码序列可变化(例如置换、缺失、插入等)，而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员应理解，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸序列可改变，而不变化蛋白质的氨基酸序列。
在另一个普通方面，本申请涉及一种载体，其包含编码本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可使用本领域的技术人员已知的任何载体，如质粒、柯斯质粒(cosmid)、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施例中，载体是重组表达载体，如质粒。载体可包括确定表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记物和复制起点。启动子可以是组成性启动子、诱导性启动子或阻抑启动子。能够将核酸递送至细胞的多种表达载体是本领域中已知的并且可在本文中用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于产生根据本发明的实施例的重组表达载体。鉴于本公开，此类技术是本领域的技术人员众所周知的。
在另一个普通方面，本申请涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞都可用于重组表达本发明的多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施例中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据特定实施例，通过常规方法，如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化至宿主细胞中，其中该重组表达载体稳定地整合至宿主细胞基因组中，由此使重组核酸有效地表达。
在另一个普通方面，本申请涉及一种产生本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的方法，该方法包含在产生本发明的多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的条件下，培养包含编码所述多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的核酸的细胞；以及从细胞或细胞培养物(例如从上清液)回收所述多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。表达的多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可根据本领域中已知并且如本文所描述的常规技术从细胞收集和纯化。
抗PD-L1单克隆抗体部分
本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包括含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点。所述VH和VL可例如来自抗PD-L1单克隆抗体。抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段描述于2019年12月28日提交的PCT/CN2018/124925和2019年7月4日公布的国际公开第WO2019/129211号中，各案以全文引用的方式并入本文中。
抗PD-L1抗体可例如包括单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、双特异性抗体(例如抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白)、缀合的抗体、小模块免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)、单链抗体、骆驼科抗体、CDR移植的抗体和抗抗PD-L1抗体的功能变体(例如融合蛋白)，以及其片段和衍生物。这些抗体识别并结合至PD-L1蛋白质，特别是人PD-L1。这些抗体可调节，例如抑制、阻断、拮抗、中和或以其它方式干扰PD-L1表达、活性和/或信号传导。这些抗体可调节，例如抑制、阻断、拮抗、中和或以其它方式干扰PD-L1与PD-1(例如人PD-L1与人PD-1)之间的相互作用。这些抗体，包括其片段、功能变体和衍生物在内，可统称为“本公开的抗PD-L1抗体”、“公开的抗PD-L1抗体”、“公开的抗体”、“本公开的PD-L1抗体”等。
在某些实施例中，提供了一种抗PD-L1单克隆抗体部分，其包含：重链可变结构域(VH)，该VH具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，该VL具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施例中，提供了一种抗PD-L1单克隆抗体部分，其包含：重链可变结构域(VH)，该VH具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，该VL具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施例中，提供了一种抗PD-L1单克隆抗体部分，其包含：重链可变结构域(VH)，该VH具有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR1；包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，该VL具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR1；包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体的轻链CDR3。在某些实施例中，提供了一种抗PD-L1单克隆抗体部分，其包含：重链可变结构域(VH)，该VH具有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；以及轻链可变结构域(VL)，该VL具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1；包含SEQID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2；和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施例中，本公开提供了一种抗PD-L1单克隆抗体部分，其包括含SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，抗PD-L1单克隆抗体部分包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18中所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的重链，和与SEQ ID NO:16中所示序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的轻链。
本文所提供的抗PD-L1单克隆抗体部分例如通过抑制PD-L1表达(例如抑制PD-L1的细胞表面表达)、活性和/或信号传导，或通过干扰PD-L1与PD-1之间的相互作用来展现抑制活性。本文所提供的抗PD-L1单克隆抗体部分在结合至PD-L1，例如人PD-L1或以其它方式与其相互作用后，完全或部分降低或以其它方式调节PD-L1表达或活性。在抗PD-L1单克隆抗体部分与人PD-L1多肽和/或肽之间相互作用时，PD-L1生物功能的降低或调节是完全的、显著的或部分的。
当在抗PD-L1单克隆抗体部分存在下PD-L1的表达或活性水平相较于在无与本文所描述的抗体部分相互作用，例如结合存在下PD-L1的表达或活性水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为所述抗体完全抑制PD-L1表达或活性。
当在抗PD-L1单克隆抗体部分存在下PD-L1的表达或活性水平相较于在无与本文所描述的抗PD-L1单克隆抗体部分结合存在下PD-L1的表达或活性水平降低至少50％，例如55％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为所述抗PD-L1单克隆抗体部分显著抑制PD-L1的表达或活性。当在抗PD-L1单克隆抗体部分存在下PD-L1的表达或活性水平相较于在无与本文所描述的抗体部分相互作用，例如结合存在下PD-L1的表达或活性水平降低不到95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为所述抗体部分将部分地抑制PD-L1的表达或活性。
抗LAG-3单域抗体部分
本文所描述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含第二抗原结合部分，其包含特异性识别LAG-3的单域抗体(sdAb)部分(或“抗LAG-3sdAb”)。抗LAG-3单域抗体描述于2019年3月29日提交的PCT/CN2019/080528，并于2019年10月3日公布的国际公开号WO2019/185040申请中，其以全文引用的方式并入本文中。
单域抗体(sdAb)部分
例示性sdAb部分包括但不限于来自重链抗体的重链可变结构域(例如骆驼科中的VHH(重链抗体的重链可变结构域)或软骨鱼类中的VNAR(鲨鱼新抗原受体的可变结构域)、天然地缺乏轻链的结合分子、来源于常规4链抗体的单个结构域(如VH或VL)、人源化重链抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单域抗体以及工程改造的结构域和除来源于抗体的那些外的单域支架。sdAb部分可来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、大羊驼、七鳃鳗、鱼类、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文所涵盖的sdAb部分还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单域抗体分子。
在一些实施例中，sdAb部分来源于天然存在的单域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链抗体(本文中又称为“重链抗体”或“HCAb”)。例如，此类单域分子公开于WO94/04678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)《自然》363:446-448。为了清楚起见，来源于天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH，以使其与四链免疫球蛋白的常规VH相区分。此类VHH分子可以来源于骆驼科物种中，例如骆驼、大羊驼、小羊驼、单峰驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科动物以外的其它物种可产生天然地缺乏轻链的重链分子；并且此类VHH在本申请的范围内。
在一些实施例中，sdAb部分是重组、CDR移植、人源化、骆驼化、去免疫和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择)。在一些实施例中，框架区的氨基酸序列可通过使框架区中的特定氨基酸残基“骆驼化”来改变。骆驼化是指来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被重链抗体VHH结构域中一个或多个相应位置处出现的一个或多个氨基酸残基置换或取代。这可通过本身已知的方式执行，该方式是例如基于本文中的进一步描述而对技术人员显而易见。如本文所定义，此类“骆驼化”取代优选地插入形成VH-VL界面和/或存在于VH-VL界面处的氨基酸位置处，和/或所谓的骆驼科标志残基(参见例如WO 94/04678；Davies和Riechmann,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Letters)》339:285-290,1994；Davies和Riechmann,《蛋白质工程(ProteinEngineering)》9(6):531-537,1996；Riechmann《分子生物学杂志》259:957-969,1996；以及Riechmann和Muyldermans,《免疫学方法杂志》231:25-38,1999)。
在一些实施例中，sdAb部分是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb部分。参见例如US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些实施例中，sdAb部分是亲和力成熟的。
在一些实施例中，针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域可从(天然或免疫)骆驼科VHH序列库获得。此类方法可涉及或可不涉及使用一种或多种本身已知的筛选技术，使用所述抗原或靶标，或其至少一个部分、片段、抗原决定子或表位筛选此类库。此类库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO03/035694中。或者，可使用来源于(天然或免疫)VHH库的改良的合成或半合成库，如通过例如WO 00/43507中所描述的随机诱变和/或CDR改组等技术，从(天然或免疫)VHH库获得的VHH库。
在一些实施例中，sdAb部分是由常规四链抗体产生。参见例如EP 0368684；Ward等人(《自然》1989年10月12日；341(6242):544-6)；Holt等人,《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》,2003,21(11):484-490；WO 06/030220；和WO 06/003388。
在一些实施例中，提供了一种抗LAG-3 sdAb部分，该部分包含：CDR1，其包含SEQID NO:33的氨基酸序列，或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体；CDR2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体；以及CDR3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或其包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，提供了一种抗LAG-3 sdAb部分，其包括：含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR1；含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR2；和含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施例中，提供了一种抗LAG-3 sdAb部分，其包含VHH结构域，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO:37具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的变体。在一些实施例中，提供了抗LAG-3 sdAb部分，其包含VHH结构域，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或其在所述VHH结构域包含至多约3个(如约1个、2个或3个中的任一个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，包括含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其变体的VHH结构域的抗LAG-3 sdAb部分在CDR中，如在CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施例中，包括含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VHH结构域或其变体的抗LAG-3 sdAb部分包含SEQ ID NO:37的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在FR中，如在FR1，和/或FR2，和/或FR3，和/或FR4中。
生物活性
本文所描述的抗LAG-3 sdAb的生物活性可通过测量其半数最大有效浓度(EC50)或半数最大抑制浓度(IC50)确定，EC50是抗体结合至其靶标的效用的量度，IC50是抗体抑制特定生物或生物化学功能(如抑制LAG-3与II类MHC分子之间的结合)的效用的量度。例如，此处EC50可用于指示结合细胞表面上50％LAG-3所需的抗LAG-3 sdAb的有效浓度，IC50可用于指示在体外中和50％LAG-3生物活性所需的抗LAG-3 sdAb的有效浓度。EC50还表示在体内获得最大作用的50％所需的血浆浓度。EC50或IC50可通过本领域中已知的测定，例如生物测定如FACS结合分析、通过FACS分析(竞争结合测定)测定的配体结合抑制、基于细胞的细胞因子释放测定或放大发光邻近均相测定(AlphaLISA)测量。
例如，可使用流式细胞术研究配体结合的阻断。可将表达人LAG-3的CHO细胞从黏附培养瓶解离并与不同浓度的测试用抗LAG-3 sdAb和恒定浓度的标记的II类MHC蛋白质混合。可采用抗LAG-3抗体阳性对照，如BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)。将混合物在室温下平衡30分钟，用FACS缓冲液(含1％BSA的PB)洗涤三次。然后，添加恒定浓度的特异性识别标记的II类MHC的抗体并在室温下培育15分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞并通过流式细胞术分析。可利用Prism(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)的GraphPad Software)，使用非线性回归分析数据以计算IC50。由竞争测定得到的结果可展示抗LAG-3 sdAb在抑制II类MHC与LAG-3之间的相互作用中的能力。
可使用LAG-3阻断测定，通过荧光素酶报导体测试抗LAG-3 sdAb的生物活性。使用Promega LAG-3阻断报导体测定试剂盒(Promega,目录号at#CS194819)，根据供应商的方案执行LAG-3阻断报导体测定。简单点说，可将解冻和使用(Thaw-and-Use)MHC-II APC细胞(包括TCR激活抗原)涂铺过夜，然后将其与抗LAG-3抗体或抗LAG-3sdAb-Fc融合蛋白的连续稀释液一起培育，随后添加解冻和使用LAG-3效应细胞。在37℃和5％CO2下诱导6小时之后，可添加BIO-GLOTM荧光素酶测定试剂，并且可确定发光。结果可展示抗LAG-3 sdAb在抑制II类MHC与LAG-3之间的相互作用中的能力。
在一些实施例中，抗LAG-3 sdAb阻断或拮抗由LAG-3受体转导的信号。在一些实施例中，抗LAG-3 sdAb可结合至LAG-3上的表位，以便抑制LAG-3与II类MHC分子的相互作用。在一些实施例中，抗LAG-3 sdAb可使LAG-3与II类MHC分子的结合减少至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或99.9％中的任一个。
肽连接子
在一些实施例中，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段内的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可任选地通过肽连接子连接。抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段中使用的一个或多个肽连接子的长度、柔性程度和/或其它特性可对特性，包括但不限于对一个或多个特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力具有一定影响。例如，可选择较长肽连接子以确保两个相邻结构域在空间上不会相互干扰。在一些实施例中，肽连接子包含柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)，由此使相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是适合的肽连接子。
肽连接子可具有任何适合长度。在一些实施例中，肽连接子是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多氨基酸个中的任一长度。在一些实施例中，肽连接子不超过约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸中的任一长度。在一些实施例中，肽连接子的长度是以下任一个：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸，或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
肽连接子可具有天然存在的序列，或非天然存在的序列。例如，来源于重链抗体的铰链区的序列可用作连接子。参见例如WO1996/34103。在一些实施例中，肽连接子是突变的人IgG1铰链。在一些实施例中，肽连接子是柔性连接子。例示性柔性连接子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，以及本领域中已知的其它柔性连接子。在一些实施例中，肽连接子包含SEQ ID NO:38(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:41(GGGGSGGGS)或SEQ ID NO:42(GGGGSGGGGSGS)的氨基酸序列。在一些实施例中，肽连接子包含SEQ ID NO:12(EPKSSDKTHTSPPSP)、SEQ ID NO:40(ESKYGPPSPPSP)或SEQ ID NO:43(EPKSSDKGHGGPPGP)的氨基酸序列。
嵌合或人源化抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段
在一些实施例中，本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816，567号；和Morrison等人,《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如来源于骆驼科物种，如大羊驼的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是种类或亚种类已从亲本抗体的种类或亚种类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以减少对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般来说，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如作为HVR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和其制备方法评述于例如Almagro和Fransson,《生物科学前沿(Front.Biosci.)》13:1619-1633(2008)中，并且在例如以下中有进一步描述：Riechmann等人,《自然》332:323-329(1988)；Queen等人,《美国国家科学院院刊》86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人,《方法(Methods)》36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》28:489-498(1991))(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,《方法》36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,《方法》36:61-68(2005)和Klimka等人,《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Sims等人,《免疫学杂志》151:2296(1993))；具有来源于轻链或重链可变区特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人,《美国国家科学院院刊》89:4285(1992)；和Presta等人,《免疫学杂志》151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人胚系框架区(参见例如Almagro和Fransson,《生物科学前沿》13:1619-1633(2008))；以及由筛选FR库得到的框架区(参见例如Baca等人,《生物化学杂志》272:10678-10684(1997)和Rosok等人,《生物化学杂志》271:22611-22618(1996))。
在一些实施例中，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的第二抗原结合部分经历修饰，如人源化，而不会降低结构域对抗原的天然亲和力，同时减小其针对异源物种的免疫原性。例如，可确定大羊驼抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，并且例如框架区中的一个或多个骆驼科氨基酸被人共有序列中所发现的其人对应物置换，而所述多肽不会丧失其典型特性，即，人源化不会明显影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科单域抗体的人源化需要单一多肽链中有限量氨基酸的引入和诱变。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比，所述人源化需要在两条链，即轻链和重链中引入氨基酸变化并且保存两条链的组装。
包含VHH结构域的单域抗体可被人源化以具有人样序列。在一些实施例中，本文中使用的VHH结构域的FR区包含与人VH框架区至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高百分比中的任一百分比的氨基酸序列同源性。一个例示性种类的人源化VHH结构域的特征在于，根据Kabat编号，VHH在位置45处携带来自由以下组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，例如L45和在位置103处的色氨酸。因此，属于这一种类的多肽与人VH框架区显示出高氨基酸序列同源性并且所述多肽可直接施用给人，而没有预期的由此引起的不想要的免疫反应，并且没有进一步人源化的负担。
另一个例示性种类的人源化骆驼科单域抗体描述于WO 03/035694中并且含有典型地在人类来源或来自其它物种的常规抗体中所发现的疏水性FR2残基，但通过在位置103处用带电精氨酸残基取代来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基来补偿此亲水性丧失。因此，属于这两个种类的多肽与人VH框架区显示出高氨基酸序列同源性并且所述多肽可直接施用给人，而没有预期的由此引起的不想要的免疫反应，并且没有进一步人源化的负担。
人抗体
在一些实施例中，本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段是人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的各种技术产生。人抗体大体上描述于vanDijk和van de Winkel,《药理学新见》5:368-74(2001)和Lonberg,《免疫学当前观点》20:450-459(2008)中。能够产生完全人单域抗体的转基因小鼠或大鼠是本领域中已知的。参见例如US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
人抗体可通过将免疫原施用给转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰成响应抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物典型地含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座一般已失活。关于由转基因动物获得人抗体的方法的评述，参见Lonberg,《自然·生物技术》23:1117-1125(2005)。另外，参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003399880520000374
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003399880520000372
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003399880520000373
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合进行修饰。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor,《免疫学杂志》,133:3001(1984)；Brodeur等人,《单克隆抗体制造技术和应用(Monoclonal Antibody ProductionTechniques andApplications)》,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)；和Boerner等人,《免疫学杂志》,147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人,《美国国家科学院院刊》,103:3557-3562(2006)中。额外方法包括例如美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,《现代免疫学(XiandaiMianyixue)》,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所描述的方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,《组织学和组织病理学(HistologyandHistopathology)》,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,《实验和临床药理学的方法和发现(Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology)》,27(3):185-91(2005)中。
人抗体还可通过分离选自人源噬菌体展示库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后，可将此类可变结构域序列与所希望的人恒定结构域组合。从抗体库中选择人抗体的技术描述于下。
获得针对特定抗原或靶标的VHH序列的一项技术涉及对能够表达重链抗体的转基因哺乳动物进行适当地免疫接种(即，以便产生针对所述抗原或靶标的免疫反应和/或重链抗体)，从含有所述VHH序列(其编码核酸序列)的所述转基因哺乳动物获得适合生物样品(如血液样品、血清样品或B细胞样品)，然后使用本身已知的任何适合技术(如本文所描述的任何方法或杂交瘤技术)，以所述样品为起始物质，产生针对所述抗原或靶标的VHH序列。例如，为此目的，可使用表达重链抗体的小鼠以及WO 02/085945、WO 04/049794和WO 06/008548，以及Janssens等人,《美国国家科学院院刊》2006年10月10日；103(41):15130-5中所描述的其它方法和技术。例如，此类表达重链抗体的小鼠可表达具有任何适合(单个)可变结构域，如具有来自天然源的(单个)可变结构域(例如人(单个)可变结构域、骆驼科(单个)可变结构域或鲨鱼(单个)可变结构域)以及例如合成或半合成(单个)可变结构域的重链抗体。
库来源的抗体
本申请的抗体可通过针对具有一种或多种所希望活性的抗体筛选组合库来分离。例如，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示库和针对具有所希望结合特征的抗体筛选此类库的方法。这类方法评述于例如Hoogenboom等人,《分子生物学方法》178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,新泽西州特图瓦市,2001)，并且进一步描述于例如以下中：McCafferty等人,《自然》348:552-554；Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)；Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,《分子生物学方法》248:161-175(Lo编,Human Press,新泽西州特图瓦市,2003)；Sidhu等人,《分子生物学杂志》338(2):299-310(2004)；Lee等人,《分子生物学杂志》340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,《美国国家科学院院刊》101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,《免疫学方法杂志》284(1-2):119-132(2004)中。用于构建单域抗体库的方法已有描述，例如参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的谱系分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆并且随机重组于噬菌体库中，然后可筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,《免疫学年鉴》12:433-455(1994)中所描述。噬菌体典型地将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫源的库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。或者，可克隆(例如从人)初始谱系以提供针对众多非自身和自身抗原的单一来源的抗体，而无需进行任何免疫接种，如Griffiths等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J)》,12:725-734(1993)中所描述。最后，也可通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并且实现体外重排，来合成制备初始库，如Hoogenboom和Winter,《分子生物学杂志》,227:381-388(1992)中所描述。描述人抗体噬菌体库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段变体
在一些实施例中，涵盖本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当修饰引入编码抗体的核酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有所希望的特征，例如抗原结合即可。
a)取代、插入、缺失和变体
在一些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣位点包括HVR和FR。保守取代显示于表2中的“优选的取代”标题下。更显著的变化提供于表2中的“例示性取代”标题下，并且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。氨基酸取代可以引入感兴趣抗体中并且针对所希望的活性筛选产物，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表2.氨基酸取代
Figure BDA0003399880520000391
Figure BDA0003399880520000401
氨基酸可以根据共同的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要这些种类中的一个的成员与另一个种类交换。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般来说，所得到的一种或多种选择用于进一步研究的变体在某些生物特性方面相对于亲本抗体将有所改变(例如改善)(例如亲和力增加、免疫原性降低)，和/或将大体上保留亲本抗体的某些生物特性。例示性取代变体是亲和力成熟的抗体，该抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所描述的技术便利地产生。简单点说，使一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在HVR内进行改变(例如取代)，以例如改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点(hotspot)”，即由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子所编码的残基(参见例如Chowdhury,《分子生物学方法》207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中实行，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级库并从中重新选择来进行亲和力成熟描述于例如Hoogenboom等人的《分子生物学方法》178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,新泽西州特图瓦市(2001))中。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后，创建二级库。然后，筛选库以鉴别具有所希望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR引导的方法，其中将若干HVR残基(例如每次4-6个残基)随机分组。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特定地鉴别出涉及抗原结合的HVR残基。确切地说，CDR-H3和CDR-L3通常作为靶标。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可在一个或多个HVR内发生，只要此类改变大体上不会降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行大体上不会降低结合亲和力的保守改变(例如本文所提供的保守取代)。这类改变可在HVR“热点”或CDR的外部。在以上所提供的变体VHH序列的一些实施例中，每个HVR未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种鉴别抗体中可作为诱变的靶标的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085中所描述。在这一方法中，鉴别出靶标残基或靶标残基组(例如带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且用中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为取代候选物被靶向或除去。可筛选变体以确定其是否含有所希望的特性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合长度范围从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽，以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在一些实施例中，本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段被改变以增加或降低构建体糖基化的程度。抗体中糖基化位点的添加或缺失可以便利地通过改变氨基酸序列以使得产生或去除一个或多个糖基化位点来实现。
在抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段包含Fc区的情况下，可改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含分支状双天线寡糖，该寡糖一般通过N键联连接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人，《生物技术趋势(TIBTECH)》15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至双天线寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本申请的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段中的寡糖进行修饰以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施例中，提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白变体变体具有缺少连接至(直接或间接)Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是例如WO 2008/077546中所描述，通过相对于如利用MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如复合结构、混合结构和高甘露糖结构)的总和计算在Asn297处糖链内的岩藻糖的平均量确定。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即，在位置294与300之间。这类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的公开的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷型Lec13 CHO细胞(Ripka等人,《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人，尤其是实例11)，以及基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程》87:614(2004)；Kanda,Y.等人,《生物技术与生物工程学》,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供了具有等分寡糖的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白变体，例如其中连接至抗体Fc区的双天线寡糖被GlcNAc等分。这类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了寡糖中的至少一个半乳糖残基连接至Fc区的抗体变体。这类抗体变体可具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在一些实施例中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施例中，本申请涵盖一种抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白变体，其具有一些但非全部效应功能，使得其成为抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的体内半衰期很重要但某些效应功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用的理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的初代细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概述于Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴》9:457-492(1991)第464页上的表3中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等人,《美国国家科学院院刊》83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,《美国国家科学院院刊》82:1499-1502(1985)；第5,821,337号(参见Bruggemann,M.等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA)的Cell Technology Inc.)；以及CytoTox
Figure BDA0003399880520000431
非放射性细胞毒性测定(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI)的Promega))。用于这类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内，例如在动物模型中，如在Clynes等人,《美国国家科学院院刊》95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。还可进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人,《免疫学方法杂志》202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,《血液(Blood)》101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,《血液》103:2738-2743(2004))。可以使用本领域中已知的方法确定FcRn结合和体内清除率/半衰期(参见例如Petkova,S.B.等人,《国际免疫学(Int'l.Immunol.)》,18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应功能的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或抗原结合片段包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个处具有取代的抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述了与FcR的结合改善或减少的某些抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白变体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；和Shields等人，《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施例中，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处具有取代的Fc区。
在一些实施例中，在Fc区中作出引起改变(即，改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)中所描述。
在一些实施例中，提供了一种包含变体Fc区的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白(例如HCAb)变体，该变体Fc区包含一个或多个增加半衰期和/或改善与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中，所述FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,《免疫学杂志》117:587(1976)和Kim等人,《免疫学杂志》24:249(1994))。这些抗体包含具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan和Winter,《自然》322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程改造的抗体变体
在一些实施例中，可能希望产生半胱氨酸工程改造的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，被取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，由此使反应性硫醇基定位于抗体的可及位点处并且可以用于使抗体与其它部分，如药物部分或连接子-药物部分缀合以产生免疫缀合物，如本文中进一步描述。在一些实施例中，以下残基中的任一个或多个可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗PD-L1构建体可以如例如美国专利第7,521,541号所述产生。
e)抗体衍生物
在一些实施例中，本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可进一步修饰成含有本领域中已知且可容易地得到的额外非蛋白质部分。适于使抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。所述聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或非分支的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接超过一个聚合物，则其可以是相同或不同的分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于多种考虑确定，包括但不限于待改善的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于疗法等。
在一些实施例中，提供了抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段与非蛋白质部分的缀合物，该非蛋白质部分可通过暴露于辐射而选择性加热。在一些实施例中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,《美国国家科学院院刊》102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞，但将非蛋白质部分加热至杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。
在一些实施例中，本文所提供的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可进一步修饰成含有一种或多种生物活性蛋白质、多肽或其片段。如本文所使用，“生物活性(Bioactive)”或“生物活性(biologically active)”意思指在体内显示生物活性以进行特定功能。例如，其可意谓与特定生物分子，如蛋白质、DNA等组合，然后促进或抑制此类生物分子的活性。在一些实施例中，生物活性蛋白质或其片段具有免疫刺激/免疫调节、膜运输或酶活性。
在一些实施例中，可与本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段融合的生物活性蛋白质或其片段是配体，如与特定细胞受体相互作用的淋巴因子和细胞因子。淋巴因子是当抗原或凝集素刺激T细胞生长时T细胞所分泌的低分子量蛋白质。淋巴因子的实例包括但不限于干扰素-α、干扰素-γ、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如CSF-1、G-CSF或GM-CSF)、趋化因子、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、巨噬细胞激活因子(MAF)、NK细胞激活因子、T细胞替代因子、白细胞抑制因子(LIF)、淋巴毒素、破骨细胞激活因子(OAF)、可溶性免疫反应抑制蛋白(SIRS)、生长刺激因子、单核细胞生长因子等。可并入抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段中的细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素(IFN)和神经生长因子(NGF)等。
III.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，其包含抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段和任选地药学上可接受的载剂。药物组合物可通过将具有所希望的纯度的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制物或水溶液形式制备(《雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences)》第16版,Osol,A.编(1980))。
药物组合物优选是稳定的，其中此处所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段在储存时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域中可得到的并且评述于《肽和蛋白质药物递送(Peptide andProtein Drug Delivery)》,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,纽约州纽约出版社(1991)；和Jones,A.《高级药物递送综述(Adv.Drug Delivery Rev.)》10:29-90(1993)中。稳定性可在选定的温度下保持选定的时间段来测量。为进行快速筛选，可将配制物在40℃下保持2周至1个月，此时测量稳定性。在打算在2-8℃下储存配制物时，所述配制物一般应在30℃或40℃下稳定保持至少1个月，和/或在2-8℃下稳定保持至少2年。在打算在30℃下储存配制物时，所述配制物一般应在30℃下稳定保持至少2年，和/或在40℃下稳定保持至少6个月。例如，在储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施例中，本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的稳定配制物可在所述配制物中包含小于约10％(优选小于约5％)的以聚集物形式存在的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂；等渗剂(例如氯化钠)；稳定剂；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂，如EDTA和/或非离子性表面活性剂。
为了使药物组合物能用于体内施用，其必须是无菌的。可以通过经无菌过滤膜过滤来使药物组合物无菌。本文中的药物组合物一般被放置于具有无菌接取口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知的和可接受的方法，如通过在一段较长时间内以适合的方式进行单次或多次团注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注、表面施用、吸入或通过持续释放或延长释放手段施用。在一些实施例中，药物组合物是局部施用，如肿瘤内施用的。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有拮抗剂的由固体疏水性聚合物构成的半渗透基质，所述基质呈成形制品，例如膜或微胶囊形式。
根据需要，本文中的药物组合物还可以含有多于一种用于所治疗的特定适应症的活性化合物，优选具有不会不利地相互影响的互补活性的那些。或者或另外，所述组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子宜以有效用于预定目的量组合存在。
活性成分可以被包覆在微胶囊中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微米球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗乳液中，所述微胶囊是例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，分别地，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于《雷氏药学大全》第18版中。
在一些实施例中，药物组合物被包含在单次使用小瓶中，如单次使用密封小瓶中。在一些实施例中，药物组合物被包含在多次使用小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装形式包含在容器中。在一些实施例中，药物组合物被冷冻保存。
IV.使用方法
本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段以及其组合物(如药物组合物)可用于多种应用，如可用于诊断、分子测定和疗法中。
本发明一方面提供一种治疗有需要的受试者的PD-L1和/或LAG-3相关疾病或疾患的方法，该方法包含向受试者施用有效量的包含本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施例中，PD-L1和/或LAG-3相关疾病是癌症。在一些实施例中，PD-L1相关疾病是致病性感染，如病毒感染。
本发明部分地涵盖蛋白质构建体(如抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段)、其编码核酸分子和/或载体、包含其编码核酸分子和/或载体的宿主细胞，其可单独施用或与另一种疗法且在至少一些方面与药学上可接受的载剂或赋形剂一起以任何组合施用。在一些实施例中，在施用抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段之前，可将其与本领域中众所周知的适合药物载剂和赋形剂组合。根据本公开制备的组合物可用于治疗癌症或延缓癌症的恶化。
在一些实施例中，提供一种治疗癌症的方法，该方法包含向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施例中，癌症是实体肿瘤(如结肠癌)。
在一些实施例中，药物组合物是全身性(如静脉内)施用的。在一些实施例中，药物组合物是局部(如肿瘤内)施用的。在一些实施例中，所述方法另外包含向受试者施用额外癌症疗法(如手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，所述治疗癌症的方法具有以下一种或多种生物活性：(1)杀灭癌细胞(包括旁观者杀灭)；(2)抑制癌细胞增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫反应；(4)减小肿瘤大小；(5)缓解患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长癌症进展时间；以及(9)预防癌症复发、抑制癌症复发或减小癌症复发的可能性。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高百分比中任一百分比的肿瘤细胞死亡率。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高百分比中任一百分比的旁观者肿瘤细胞(未感染溶瘤VV)死亡率。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的减小肿瘤大小的方法可使肿瘤大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一百分比)的转移。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的延长个体(如人)的存活期的方法可使个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一时间。在一些实施例中，由本文所描述的药物组合物介导的延长癌症进展时间的方法可使癌症进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一时间。
本文所描述的方法适于治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌两者。所述方法适用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移癌、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移癌或缓解中的癌症。本文所描述的方法可在辅助治疗或新辅助治疗中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域中已知的其它类型癌症疗法的组合疗法，所述其它类型癌症疗法如化学疗法、手术、激素疗法、辐射、基因疗法、免疫疗法(如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声波疗法、光动力疗法、射频消融等(即，所述方法可在主要/决定性疗法之前进行)。在一些实施例中，所述方法被用于治疗先前经过治疗的受试者。在一些实施例中，癌症是先前疗法难治的。在一些实施例中，所述方法被用于治疗先前未经过治疗的受试者。
在一些实施例中，所述方法适于治疗具有异常PD-L1和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导的癌症，借助于非限制性实例，包括黑素瘤、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳癌、神经胶母细胞瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
因此，在一些实施例中，提供一种治疗免疫疗法反应性实体肿瘤(如癌瘤或腺癌，如具有异常PD-L1和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，该方法包含向受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施例中，癌症是实体肿瘤(如结肠癌)。
在一些实施例中，所述方法适于治疗具有异常PD-1或PD-L1/PD-L2和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导的癌症，借助于非限制性实例，包括实体肿瘤。可使用本发明的抗体抑制生长的一些癌症包括典型地对免疫疗法具有反应性的癌症。供治疗的其它癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本发明包括可使用本发明的抗体抑制生长的难治性或复发性恶性病。可使用本发明的抗体治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病在内的慢性或急性白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、包括由石棉诱发的癌症在内的环境诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人(2005)《国际免疫学》17:133-144)。
在某些实施例中，所公开的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白可以用作治疗剂。此类药剂可用于诊断、预测、监测、治疗、缓解和/或预防受试者的与异常PD-L1和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导相关联的疾病或病变。治疗方案是通过使用标准方法鉴别罹患与异常PD-L1和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导相关联的疾病或病症，例如癌症或其它赘生性病症(或有发展所述疾病或病症的风险)的受试者，例如人类患者进行。将抗体制剂，优选地对其一种或多种靶标抗原具有高特异性和高亲和力的制剂施用给受试者并且一般因其与靶标结合而具有作用。施用所述抗体可消除或抑制或干扰靶标(例如PD-L1和/或LAG-3)的表达、活性和/或信号传导功能。施用所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白可消除或抑制或干扰靶标(例如PD-L1和/或LAG-3)与其天然地结合的内源性配体(例如PD-1和/或II类MHC)的结合。例如，所述抗体结合至靶标并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰PD-L1和/或LAG-3表达、活性和/或信号传导。
本申请的药物组合物的剂量和所希望的药物浓度可根据设想的具体用途而变化。确定适当施用剂量或途径完全在普通技术人员的能力范围内。动物实验为确定用于人类疗法的有效剂量提供可靠指导。物种间有效剂量的按比例调整可遵循以下执行：Mordenti,J.和Chappell,W.,“物种间按比例调整在毒代动力学中的用途(The Use of InterspeciesScaling in Toxicokinetics)”,《毒代动力学和新药物开发(Toxicokinetics and NewDrug Development)》,Yacobi等人编,Pergamon Press,纽约,1989,第42-46页。
本申请的药物组合物，包括但不限于复原的液体配制物，是根据已知方法，如以推注方式静脉内施用或通过在一段时间内连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、静脉内(i.v.)、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入途径施用给需要用本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段治疗的受试者，优选地人。复原的配制物可通过将冻干的本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段溶解于稀释剂中以使得蛋白质整体分散来制备。适用于本申请中的例示性药学上可接受的(对于施用给人安全且无毒)稀释剂包括但不限于无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液，或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一些实施例中，药物组合物是通过皮下(即，在皮肤下方)施用来施用给受试者。出于此类目的，药物组合物可使用注射器注射。然而，施用药物组合物的其它装置也是可以的，如注射装置；注射笔；自动注射装置；无针装置；和皮下贴片递送系统。
在一些实施例中，将药物组合物静脉内施用给受试者。在一些实施例中，通过输注，如静脉内输注将药物组合物施用给受试者。用于免疫疗法的输注技术是本领域中已知的(参见例如Rosenberg等人,《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》319:1676(1988))。
用于筛选具有所希望的特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其它免疫介导的技术。
在其它实施例中，针对PD-L1和/或LAG-3的抗体可用于本领域内已知与PD-L1和/或LAG-3定位和/或定量相关的方法中(例如用于测量适当生理样品内PD-L1和/或LAG-3的水平，和/或测量PD-L1和/或LAG-3的水平用于诊断方法中、用于使蛋白质成像等)。
在其它实施例中，可使用抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白，通过标准技术，如免疫亲和力、色谱法或免疫沉淀分离PD-L1和/或LAG-3多肽。针对PD-L1蛋白质(或其片段)和/或LAG-3蛋白质(或其片段)的抗体可用于诊断，以监测组织中的蛋白质水平作为临床测试程序的一部分，例如以例如确定给定治疗方案的功效。
可通过将所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白与可检测物质偶合(即，以物理方式连接)来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。适合酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合荧光材料的实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；并且适合放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
在一些实施例中，所述抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白(例如抗体)含有可检测标记。抗体可以是例如多克隆或单克隆抗体。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab')2)。关于探针或抗体，术语“标记”意图涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶合(即，以物理方式连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂具有反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二次抗体对一次抗体进行检测，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，由此使其能用荧光标记的抗生蛋白链菌素检测。
术语“生物样品”意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。因此，术语“生物样品”的用法内包括血液和血液成分或组分，包括血清、血浆或淋巴液。也就是说，检测方法可用于在体外和体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的程序描述于例如“ELISA：分子生物学方法理论和实践(ELISA:Theory andPractice:Methods in Molecular Biology)”,第42卷,J.R.Crowther(编)Human Press,新泽西州特图瓦市,1995；“免疫测定(Immunoassay)”,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA),1996；以及“酶免疫测定的实践和理论(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)”,P.Tijssen,ElsevierScience Publishers,阿姆斯特丹(Amsterdam),1985。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白质抗体引入受试者体内。例如，抗体可以用放射性标记物标记，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
V.制备方法
本文所描述的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段可使用本领域中已知或如本文所描述的任何方法制备。另参见实例1。
用于产生多抗原结合蛋白，例如双特异性抗体的方法是本领域中已知的。
传统上，重组产生双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein和Cuello,《自然》,305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，所以这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十个不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一个具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和色谱步骤实现。类似程序公开于1993年5月13日公开的WO 93/08829以及Traunecker等人,《欧洲分子生物学杂志》10:3655-3659(1991)中。
具有所希望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选与包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域进行。在所述融合物中的至少一种中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)是优选的。编码免疫球蛋白重链融合物并且必要时编码免疫球蛋白轻链的DNA被插入独立表达载体中，并且共转染至适合宿主生物体中。关于产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986)。
根据WO 96/27011中所描述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可被工程改造成使得自重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在这一方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与一个或多个较大的侧链相同或类似的补偿性“空腔”。这提供了使异二聚体的产率相较于如同二聚体之类其它不想要的最终产物的产率增加的机制。
双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。由抗体片段产生双特异性抗体的技术在文献已有描述。例如，双特异性抗体可使用化学键联制备。Brennan等人,《科学》229:81(1985)描述了以蛋白水解方式裂解完整抗体以产生F(ab')2片段的程序。在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下将这些片段还原以使邻位二硫醇稳定并防止分子间二硫化物形成。然后，将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后，一种Fab'-TNB衍生物通过用巯基乙胺还原而再转化成Fab'-硫醇并将其与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用作选择性固定酶的药剂。
此外，Fab'片段可直接从大肠杆菌回收并以化学方式偶合形成双特异性抗体。Shalaby等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每个Fab'片段独立地由大肠杆菌分泌并在体外经历定向化学偶合而形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合至过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，并触发针对人乳房肿瘤靶标的人细胞毒性淋巴细胞的溶解活性。
直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。例如，已经使用亮氨酸拉链制造出双特异性抗体。Kostelny等人,《免疫学杂志》,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。将抗体同二聚体在铰链区处还原以形成单体，然后使其再氧化以形成抗体异二聚体。这一方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)描述的“双功能抗体”技术提供了一种制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过连接子连接至轻链可变结构域的重链可变结构域，所述连接子太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略也已有报导。Gruber等人,《免疫学杂志》,152:5368(1994)。
为了重组产生双特异性抗体，将编码双特异性抗体的核酸分离并插入可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码双特异性抗体的DNA易于使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离和测序。多种载体是可供使用的。载体的选择部分地取决于所使用的宿主细胞。一般来说，优选的宿主细胞是原核或真核(一般是哺乳动物)来源的。
VI.试剂盒和制品
还提供了包含本文所描述的任何抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了包含本文所描述的任一种药物组合物的试剂盒，并且优选地提供该试剂盒的使用说明书。
本申请的试剂盒呈适合包装形式。适合包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如密封Mylar或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供额外组分，如缓冲剂，以及说明性信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶(如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、柔性包装等。
所述制品可包含容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由如玻璃或塑料等多种材料形成。一般来说，容器容纳有效治疗本文所描述的疾病或病症的组合物并且可以具有无菌接取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或是具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示所述组合物是用于治疗个体的特定疾患。标签或包装插页还将包含有关向个体施用组合物的说明书。标签可指示关于复原和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可为多次使用的小瓶，该小瓶允许重复施用复原的配制物(例如2-6次施用)。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、有关使用此类治疗产品的禁忌和/或警告的信息。此外，所述制品还可包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度看所期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书、以足以在药房，例如在医院药房和配药房储存和使用的量包装。
实施例
本发明还提供以下非限制性实施例。
实施例1是一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：
(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：
(i)分别地，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或
(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；
并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分，其中所述单域抗体包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其分别包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:35的氨基酸序列；
其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
实施例2是根据实施例1所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体。
实施例3是根据实施例1或2所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分是抗体片段，所述抗体片段包括含所述VH的重链和含所述VL的轻链。
实施例4是根据实施例1至3中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含单一多肽链。
实施例5是根据实施例4所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的羧基(C)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条重链的氨基(N)末端融合。
实施例6是根据实施例4所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的羧基(C)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条轻链的氨基(N)末端融合。
实施例7是根据实施例4所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的氨基(N)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条重链的羧基(C)末端融合。
实施例8是根据实施例4所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的氨基(N)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条轻链的羧基(C)末端融合。
实施例9是根据实施例1至8中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分的重链包含与SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:18具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述第一抗原结合部分的轻链包含与SEQID NO:16具有至少95％同一性的氨基酸序列。
实施例10是根据实施例9所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分的重链包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且所述第一抗原部分的轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
实施例11是根据实施例1至10中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
实施例12是根据实施例11所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
实施例13是根据实施例1至12中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
实施例14是根据实施例1至13中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分是骆驼科、嵌合、人类、部分人源化或完全人源化的。
实施例15是根据实施例1至14中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分包含Fc区。
实施例16是根据实施例15所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分与所述Fc区的N末端融合。
实施例17是根据实施例15或16所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述Fc区是IgG1 Fc。
实施例18是根据实施例15或16所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述Fc区是具有S228P突变和/或L235E突变的IgG4 Fc。
实施例19是根据实施例1至18中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分通过肽键或肽连接子彼此融合。
实施例20是根据实施例19所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述肽连接子包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40-43的氨基酸序列。
实施例21是一种分离的核酸，其编码根据实施例1至20中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
实施例22是一种分离的载体，其包含根据实施例21所述的分离的核酸。
实施例23是一种宿主细胞，其包含根据实施例22所述的分离的载体。
实施例24是一种药物组合物，其包含根据实施例1至20中任一个所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，和药学上可接受的载剂。
实施例25是一种治疗患有PD-L1和/或LAG-3相关疾病或有患PD-L1和/或LAG-3相关疾病的风险的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据实施例24所述的药物组合物。
实施例26是根据实施例25所述的方法，其中所述PD-L1和/或LAG-3相关疾病是癌症。
实施例27是根据实施例26所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
实施例28是根据实施例26或27所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
实施例29是根据实施例25至28中任一个所述的方法，其另外包含向个体施用额外癌症疗法。
实施例30是根据实施例29所述的方法，其中所述额外癌症疗法是手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
实施例31是根据实施例25所述的方法，其中所述PD-L1相关疾病是致病性感染。
实施例32是根据实施例25至31中任一个所述的方法，其中所述药物组合物是全身或局部施用。
实施例33是根据实施例32所述的方法，其中所述药物组合物是静脉内施用。
实施例34是根据实施例32所述的方法，其中所述药物组合物是肿瘤内施用。
实施例35是根据实施例25至34中任一个所述的方法，其中所述受试者是人。
实例
以下实例仅意图作为本发明的示例，并且因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实例和详细描述是出于说明而非限制目的提供。
实例1：与单克隆抗体融合的抗PD-L1/抗LAG-3单域抗体的构建和表达(SMAB)
基于WO2018014855A1中所描述的与单克隆抗体融合的单域抗体(SMAB)结构，使用抗PD-L1单克隆抗体(mAb)和抗LAG-3单域抗体(sdAb)产生一系列抗PD-L1/抗LAG-3双特异性抗体。将抗LAG-3 sdAb分别与包括抗PDL1HCv1和抗PDL1HCv5在内的两种不同抗PD-L1mAb融合。抗LAG-3 sdAb位于抗PD-L1 mAb重链或轻链的氨基(N)或羧基(C)末端处，利用连接子(E连接子：EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO:12)，G连接子：(G4S)3(SEQ ID NO:38)，E4连接子：ESKYGPPSPPSP(SEQ ID NO:40)，G9连接子：GGGGSGGGS(SEQ ID NO:41)，G12连接子：GGGGSGGGGSGS(SEQ ID NO:42)或Ea连接子：EPKSSDKGHGGPPGP(SEQ ID NO:43))进行融合。每个构建体均由两条相同融合多肽链和两条相同天然多肽链构成，并将表达每条多肽链的DNA序列插入pTT5载体中EcoRI与HindIII限制位点之间。每个质粒还包括关于蛋白质分泌至生长培养基中的分泌信号序列。与包含S228P和L235E突变的IgG4 Fc部分的N末端融合的抗LAG-3 sdAb用作体外生物测定的对照。表达所述多抗原结合蛋白的质粒显示于下表3中。
表3：表达抗PD-L1/LAG3 SMAB蛋白质的质粒
Figure BDA0003399880520000581
在37℃和100rpm下，将用表达质粒转染的CHO-3E7细胞培养6天。通过离心收集上清液部分并通过蛋白质A柱纯化SMAB蛋白质。
如上文所提到的，使用包括PDL1HCv1和PDL1HCv5的两种不同PD-L1 mAb进行SMAB构建。PDL1HCv1 mAb由称为H1的重链和称为L1的轻链组成，并且PDL1HCv5 mAb由称为H2的重链和所述轻链L1组成。
通过利用E连接子(EPKSSDKTHTSPPSP)将LAG-3 sdAb分别与PDL1HCv1和PDL1HCv5融合，设计出不同的SMAB。将LAG-3 sdAb与轻链L1的C末端融合，产生新多肽，称为L2。将LAG-3 sdAb与轻链L1的N末端融合，产生新多肽，称为L3。类似地，将LAG-3 sdAb与重链H1的N末端融合，产生新多肽，称为H3；将LAG-3 sdAb与重链H1的C末端融合，产生新多肽，称为H4；将LAG-3 sdAb与重链H2的N末端融合，产生新多肽，称为H5；并且将LAG-3 sdAb与重链H2的C末端融合，产生新多肽，称为H6。同时，也使用其它连接子构建SMAB。通过三个其它连接子，即G15连接子、G9连接子或Ea连接子将LAG-3 sdAb与重链H1的C末端融合，产生新多肽，分别称为H8、H9和H10。此外，还通过G12连接子将LAG-3 sdAb与重链H1的N末端融合，产生新多肽，称为H11；通过E4连接子将LAG-3 sdAb与重链H1的C末端融合，产生新多肽，称为H12；并且通过E4连接子将LAG-3 sdAb与轻链L1的C末端融合，产生新多肽，称为L4。使用这些新融合蛋白，通过组合新轻链融合蛋白L2和天然重链H1，产生mPDL1LCv1-E-sLAG3-HCv1的SMAB；通过组合新轻链融合蛋白L2和天然重链H2，产生mPDL1LCv1-E-sLAG3-HCv5的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H3和天然轻链L1，产生sLAG3-E-mPDL1HCv1的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H4和天然轻链L1，产生mPDL1HCv1-E-sLAG3的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H5和天然轻链L1，产生sLAG3-E-mPDL1HCv5的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H6和天然轻链L1，产生mPDL1HCv5-E-sLAG3的SMAB；通过组合新轻链融合蛋白L3和天然重链H1，产生sLAG3-E-mPDL1LCv1-HCv1的SMAB；通过组合新轻链融合蛋白L3和天然重链H2，产生sLAG3-E-mPDL1LCv1-HCv5的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H8和天然轻链L1，产生mPDL1HCv1-G15-sLAG3的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H9和天然轻链L1，产生mPDL1HCv1-G9-sLAG3的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H10和天然轻链L1，产生mPDL1HCv1-Ea-sLAG3的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H11和天然轻链L1，产生sLAG3-G12-mPDL1HCv1的SMAB；通过组合新重链融合蛋白H12和天然轻链L1，产生mPDL1HCv1-E4-sLAG3的SMAB；并且通过组合新轻链融合蛋白L4和天然重链H1，产生mPDL1LCv1-E4-sLAG3-HCv1的SMAB。通过将抗LAG-3 sdAb连接至具有点突变(S228P和L235E)的人IgG4 Fc部分的N末端，构建出sdAb-LAG3-IgG4PE的Fc融合蛋白，命名为H7。
表4：抗PD-L1单克隆抗体部分的氨基酸序列
Figure BDA0003399880520000591
Figure BDA0003399880520000601
表5：抗LAG-3单域抗体部分的DNA和氨基酸(a.a.)序列
Figure BDA0003399880520000602
Figure BDA0003399880520000611
表6：分泌信号序列、连接子序列和IgG4 Fc序列的DNA和氨基酸(a.a.)序列
Figure BDA0003399880520000612
实例2：与单克隆抗体融合的抗PD-L1/抗LAG-3单域抗体(SMAB)的体外活性FACS结合测定
利用以300nM浓度开始3×连续稀释的抗体标绘在CHO-K1细胞上表达的PD-L1或LAG-3上双特异性抗体的结合模式。利用几何平均值生成抗体-抗原结合曲线。利用GraphPad Prism v6.02软件，用四参数最佳拟合值程序标绘原始数据以分析EC50。
对于PD-L1结合，当LAG-3 sdAb通过E连接子与PD-L1 mAb轻链的C末端融合时，包括mPDL1LCv1-e-sLAG3-HCv1和mPDL1LCv1-E-sLAG3-HCv5的最终构建体对PD-L1抗原的亲和力高于PDL1HCv1和PDL1HCv5对照(图5)。当LAG-3 sdAb通过E连接子与PD-L1 mAb重链的C末端融合时，最终构建体对PD-L1抗原的亲和力与PDL1HCv1和PDL1HCv5对照类似(图5)。然而，当LAG-3 sdAb与PD-L1 mAb重链/轻链的N末端融合时，最终构建体对PD-L1抗原的亲和力高于对照(图5)。
当使用其它连接子构建SMAB时，SMAB显示的对PD-L1的结合亲和力与PDL1HCv1mAb对照类似(图9)。
对于LAG-3结合，如图6和图10中所示，所有SMAB构建体都对LAG-3抗原显示出明显高于对照Fc融合蛋白sdAb-LAG3-IgG4PE的亲和力。
体外生物测定
多抗原结合蛋白可结合至两种靶标抗原，评价其协同作用比通过单抗原靶向检查反应更具挑战性。对于抗PD-L1/抗LAG3多抗原结合蛋白的体外生物测定，使用Promega检测试剂盒个别地执行PD-1/PD-L1和LAG-3阻断生物测定，因为没有此类测定系统来检测PD-1/PD-L1和LAG-3阻断。
PD-1/PD-L1阻断生物测定
可使用来自Promega(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))的PD-1/PD-L1阻断生物测定系统测量设计成阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体和其它生物制品的效力和稳定性。所述测定由两种基因工程改造的细胞系组成：PD-1效应细胞，所述细胞是表达人PD-1和由NFAT反应元件(NFAT-RE)驱动的荧光素酶报导体的Jurkat T细胞；和PD-L1aAPC/CHO-K1细胞，所述细胞表达人PD-L1和设计成以不依赖抗原的方式激活同源TCR的工程改造的细胞表面蛋白质的CHO-K1细胞。当共培养这两种细胞类型时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导和NFAT-RE介导的发光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗体将释放抑制信号并引起TCR激活和NFAT-RE介导的发光。
LAG-3阻断生物测定以类似方式作用并用于检测LAG-3抗体。所述测定由两种基因工程改造的细胞系组成：LAG-3效应细胞，所述细胞是表达人LAG-3和反应元件驱动的荧光素酶报导体的Jurkat T细胞；和MHC II/Raji细胞，所述细胞表达人MHC II的Raji细胞。当共培养这两种细胞类型时，LAG-3/MHC II相互作用抑制T细胞信号传导和发光反应。添加阻断LAG-3/MHC II相互作用的抗LAG-3抗体将释放抑制信号并引起T细胞激活和发光表达。
对于PD-1/PD-L1阻断生物测定，利用Tecentriq生物类似物作为参考抗体。如图7中所示，在这些SMAB构建体中，mPDL1HCv1-E-sLAG3的SMAB展现最高活性，甚至高于其亲本抗体PDL1HCv1(图7和表7)。当与参考抗体相比较时，其也显示出类似活性。当使用其它连接子构建SMAB时，SMAB当与参考抗体相比较时也显示出类似活性(图11)。
表7：SMAB样品的PD-1/PD-L1阻断生物测定
Figure BDA0003399880520000631
对于LAG-3阻断生物测定，利用25F7生物类似物作为参考抗体。如图8中所示，在这些SMAB构建体中，mPDL1HCv1-E-sLAG3的SMAB仍展现高于对照Fc融合蛋白sdAb-LAG3-IgG4PE的活性，但其活性略低于sLAG3-E-mPDL1HCv1的SMAB(图8和表8)。当使用其它连接子构建SMAB时，在这些SMAB构建体中，mPDL1HCv1-G15-sLAG3和mPDL1HCv1-G9-sLAG3的SMAB相较于对照Fc融合蛋白sdAb-LAG3-IgG4PE展现最高的活性(图12和图13)。其还显示出高于25F7 mAb的活性。
表8：SMAB样品的LAG-3阻断生物测定
Figure BDA0003399880520000632
基于LAG-3阻断生物测定和PD-1/PD-L1阻断生物测定的结果，mPDL1HCv1-E-sLAG3、mPDL1HCv1-G15-sLAG3和mPDL1HCv1-G9-sLAG3的SMAB构建体当与单一抗体PD-L1或LAG-3相比较时显示出较佳活性。因此，本实例展示，基于体外生物测定，抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白有较大的改善功效的潜力。
H1的DNA序列：PDL1HCv1重链(SEQ ID NO:13)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAG
H1的多肽序列：PDL1HCv1重链(SEQ ID NO:14)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
L1的DNA序列：PDL1HCv1或PDL1HCv5轻链(SEQ ID NO:15)：
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCTGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGACGTGTCCACCGCCGTGGATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACTCTGCCTCCTACCGGTACACAGGAGTCCCCGATAGATTCTCTGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCTTCACCATCTCCTCTCTGCAGCCTGAGGACATTGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACTCCATCCCTTTTACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCATCCGTGTTCATCTTTCCTCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAATAGCCAAGAGTCCGTCACCGAGCAAGACTCCAAGGACTCTACCTATTCTCTCTCCAGCACACTGACCCTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTTCCCCCGTGACAAAGTCCTTCAACAGAGGCGAGTGT
L1的多肽序列：PDL1HCv1或PDL1HCv5轻链(SEQ ID NO:16)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVDWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSIPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
H2的DNA序列：PDL1HCv5重链(SEQ ID NO:17)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCgctGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAG
H2的多肽序列：PDL1HCv5重链(SEQ ID NO:18)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
L2的DNA序列(SEQ ID NO:19)：
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCTGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGACGTGTCCACCGCCGTGGATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACTCTGCCTCCTACCGGTACACAGGAGTCCCCGATAGATTCTCTGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCTTCACCATCTCCTCTCTGCAGCCTGAGGACATTGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACTCCATCCCTTTTACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCATCCGTGTTCATCTTTCCTCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAATAGCCAAGAGTCCGTCACCGAGCAAGACTCCAAGGACTCTACCTATTCTCTCTCCAGCACACTGACCCTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTTCCCCCGTGACAAAGTCCTTCAACAGAGGCGAGTGTGAACCTAAGTCTAGCGACAAAACTCATACCAGCCCCCCTAGTCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
L2的多肽序列(SEQ ID NO:20)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVDWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSIPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
H3的DNA序列(SEQ ID NO:21)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCCGAACCTAAGTCTAGCGACAAAACTCATACCAGCCCCCCTAGTCCAGAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAG
H3的多肽序列(SEQ ID NO:22)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H4的DNA序列(SEQ ID NO:23)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGAACCTAAGTCTAGCGACAAAACTCATACCAGCCCCCCTAGTCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H4的多肽序列(SEQ ID NO:24)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
H5的DNA序列(SEQ ID NO:25)：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCCGAACCTAAGTCTAGCGACAAAACTCATACCAGCCCCCCTAGTCCAGAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCgctGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAG
H5的多肽序列(SEQ ID NO:26)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H6的DNA序列(SEQ ID NO:27)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCgctGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGAACCTAAGTCTAGCGACAAAACTCATACCAGCCCCCCTAGTCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H6的多肽序列(SEQ ID NO:28)：
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L3的DNA序列(SEQ ID NO:29)：
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L3的多肽序列(SEQ ID NO:30)：
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H7的DNA序列(SEQ ID NO:31)：
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H7的多肽序列(SEQ ID NO:32)：
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E4连接子的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)：
ESKYGPPSPPSP
G9连接子的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)：
GGGGSGGGS
G12连接子的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：
GGGGSGGGGSGS
Ea连接子的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：
EPKSSDKGHGGPPGP
H8的DNA序列(SEQ ID NO:44)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGGTGGAGGCGGTAGTGGAGGCGGTGGTTCAGGCGGAGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H8的多肽序列(SEQ ID NO:45)：
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H9的DNA序列(SEQ ID NO:46)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGGTGGAGGCGGTAGTGGAGGCGGTTCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H9的多肽序列(SEQ ID NO:47)：
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H10的DNA序列(SEQ ID NO:48)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGAACCTAAGTCTAGCGACAAAGGCCATGGAGGTCCCCCTGGACCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H10的多肽序列(SEQ ID NO:49)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEPKSSDKGHGGPPGPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
H11的DNA序列(SEQ ID NO:50)：
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H11的多肽序列(SEQ ID NO:51)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
L4的DNA序列(SEQ ID NO:52)：
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCTAGCAGCCTGAGCGCTTCTGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGACGTGTCCACCGCCGTGGATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACTCTGCCTCCTACCGGTACACAGGAGTCCCCGATAGATTCTCTGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCTTCACCATCTCCTCTCTGCAGCCTGAGGACATTGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACTCCATCCCTTTTACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCATCCGTGTTCATCTTTCCTCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAATAGCCAAGAGTCCGTCACCGAGCAAGACTCCAAGGACTCTACCTATTCTCTCTCCAGCACACTGACCCTGTCTAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTTCCCCCGTGACAAAGTCCTTCAACAGAGGCGAGTGTGAATCGAAGTACGGACCTCCATCTCCACCTAGTCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
L4的多肽序列(SEQ ID NO:53)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVDWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSIPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECESKYGPPSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS
H12的DNA序列(SEQ ID NO:54)：
GAAGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGGTACATCTTCACCGGCTACGGCATCACCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGAGATCTTTCCCAGGAGAGTGCAGACCTACTACTCCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTGACCATGACCACCGACACCTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTGCGGTCTCTGAGATCCGATGACACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGAGACTACGACCCTTATTTCGCCCTGGATTATTGGGGCCAAGGCACCACCGTGACAGTCTCCTCCGCCTCTACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTAGCAGCAAGTCCACATCAGGAGGCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACAAGTGGAGTGCATACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCTAGCGTGGTCACTGTGCCTTCCTCTAGCCTCGGCACACAGACATACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAAGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCTTGCGACAAAACCCACACATGTCCACCTTGTCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCGAAGGATACACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAAGAGCAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTCTCTGTGCTGACCGTCCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCTCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCTAAGGCCAAGGGACAGCCTCGGGAACCACAAGTGTACACCCTGCCTCCTTCTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTTCTGGACTCCGACGGTTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTTGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCTTGTCTCCTGGCAAGGAATCGAAGTACGGACCTCCATCTCCACCTAGTCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTACACCGTGTCCAGCTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGTCCGCTATCGACAGCGATGGCAGCGTGTCTTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTTTGCGCTGCTGACCTGTGCTGGGTGGACCAGGATCAGGGCGAGTATAATACATGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCC
H12的多肽序列(SEQ ID NO:55)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYGITWVRQAPGQGLEWMGEIFPRRVQTYYSEKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDPYFALDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKESKYGPPSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTVSSYCMGWFRQAPGKGREGVSAIDSDGSVSYADSVKGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAADLCWVDQDQGEYNTWGQGTLVTVSS。

Claims (34)

1.一种分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含：
(a)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第一抗原结合部分，其中所述VH和VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其包含以下氨基酸序列：
(i)分别地，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，或
(ii)分别地，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；
并且所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(b)包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分；
其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述单域抗体包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其分别包含SEQ ID NO:33、SEQID NO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分是包含两条重链和两条轻链的全长抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分是抗体片段，所述抗体片段包括含所述VH的重链和含所述VL的轻链。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含单一多肽链。
6.根据权利要求5所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的羧基(C)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条重链的氨基(N)末端融合。
7.根据权利要求5所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的羧基(C)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条轻链的氨基(N)末端融合。
8.根据权利要求5所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的氨基(N)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条重链的羧基(C)末端融合。
9.根据权利要求5所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分的氨基(N)末端与所述第一抗原结合部分的至少一条轻链的羧基(C)末端融合。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分的重链包含与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述第一抗原结合部分的轻链包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分的重链包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的氨基酸序列，并且所述第一抗原部分的轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述包含特异性结合LAG-3的单域抗体的第二抗原结合部分是骆驼科、嵌合、人类、部分人源化或完全人源化的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分通过肽键或肽连接子彼此融合。
17.根据权利要求16所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述肽连接子是GS连接子或突变的人IgG1铰链。
18.根据权利要求16或17所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述肽连接子包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40-43的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的抗CD47/抗PD-L1多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其包含抗CD47全长抗体和抗PD-L1单域抗体，其中：
(a)所述抗LAG-3sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的C末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:24、28、45、47或49的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQID NO:16的氨基酸序列；
(b)其中所述抗LAG-3sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条重链的N末端融合，并且其中重链融合多肽包含SEQ ID NO:22、26或51的氨基酸序列，并且轻链多肽包含SEQID NO:16的氨基酸序列；
(c)其中所述抗LAG-3sdAb的N末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的C末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20或53的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ IDNO:14或18的氨基酸序列；或
(d)其中所述抗LAG-3sdAb的C末端与所述抗PD-L1全长抗体的两条轻链的N末端融合，并且其中轻链融合多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且重链多肽包含SEQ ID NO:14或18的氨基酸序列。
20.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段。
21.一种分离的载体，其包含根据权利要求20所述的分离的核酸。
22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求21所述的分离的载体。
23.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的分离的抗PD-L1/抗LAG-3多抗原结合蛋白或其抗原结合片段，和药学上可接受的载剂。
24.一种治疗患有PD-L1和/或LAG-3相关疾病或有患PD-L1和/或LAG-3相关疾病的风险的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求23所述的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述PD-L1和/或LAG-3相关疾病是癌症。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其另外包含向个体施用额外癌症疗法。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述额外癌症疗法是手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述PD-L1相关疾病是致病性感染。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是全身或局部施用。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物组合物是静脉内施用。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述药物组合物是肿瘤内施用。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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