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CN113969292A - 治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用 - Google Patents

治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN113969292A
CN113969292A CN202111347505.1A CN202111347505A CN113969292A CN 113969292 A CN113969292 A CN 113969292A CN 202111347505 A CN202111347505 A CN 202111347505A CN 113969292 A CN113969292 A CN 113969292A
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lactobacillus acidophilus
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王杰
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Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
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Abstract

本发明涉及医药领域和生物技术领域，具体涉及治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用；所述重组表达载体包括重组表达载体一和重组表达载体二；所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因pheP和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；首次构建在胃肠道中能够分泌苯丙氨酸氨裂合酶到菌体外的工程益生菌，有效降解胃肠道中被消化食物中的苯丙氨酸，降低患者的苯丙氨酸摄取量，用于治疗PKU。

Description

治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及医药领域和生物技术领域，具体涉及治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
苯丙酮尿症PKU是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病，目前针对苯丙酮尿症患者的唯一临床疗法是采取低苯丙氨酸PA饮食的策略，在婴儿期喂养低PA奶粉，在幼儿期和成人期遵循低蛋白饮食，控制苯丙氨酸摄取量；但是严格的低蛋白饮食治疗策略对青少年发育和成人都有极大的副作用，影响病人的生理和心理健康，患者生活质量差，依从性低。
目前，还有一些在实验阶段的PKU治疗策略，例如，将携带苯丙氨酸羟化酶PAH基因的腺病毒载体感染小鼠，恢复小鼠肝脏PAH活性，但该方案存在基因疗法的普遍缺陷；利用大肠杆菌表达重组PAH，口服后降低血液PA浓度，但重组PAH蛋白在口服后已被消化道中蛋白酶分解。另外，现有技术中利用大肠杆菌工程益生菌治疗PKU的方案中将苯丙氨酸解氨酶基因和苯丙氨酸转运泵基因整合到大肠杆菌基因组上构建大肠杆菌工程益生菌，制成菌剂经口服进入患者肠道，工程菌从肠道中将苯丙氨酸吸收到菌体内，然后在苯丙氨酸解氨酶的作用下降解PA，从而减少患者PA摄取量。但是，现有治疗苯丙酮尿症大肠杆菌工程菌主要定植于大肠，此外现有的大肠杆菌工程菌需要将苯丙氨酸吸收到菌体内才能发挥降解苯丙氨酸的作用，限制了工程菌对苯丙氨酸的降解效率。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供了治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用，通过基因工程技术手段改造嗜酸乳杆菌，构建出能够表达苯丙氨酸氨裂合酶和苯丙氨酸转运泵，同时将苯丙氨酸氨裂合酶分泌到菌体外的嗜酸乳杆菌工程益生菌，使工程益生菌在胃肠道中持续分泌苯丙氨酸氨裂合酶，经动物实验证明能降低苯丙酮尿症小鼠血液PA浓度，有潜力开发成用于治疗PKU的工程益生菌。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种重组表达载体，包括重组表达载体一和重组表达载体二；
所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；
所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸裂合酶基因PAL核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因(phenylalanine transporter，pheP)和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体。
优选地，所述苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL来源于Photorhabdus asymbioticaATCC43949，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP来源于Lacticaseibacillusparacasei ATCC 334，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述苯丙氨酸转运泵基因pheP来源于Escherichia coli K-12，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述嗜酸乳杆菌组成型启动子SL来源于Lactobacillus acidophilusNCFM，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的第二方面，提供一种治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，所述工程益生菌选自含有第一方面所述重组表达载体的嗜酸乳杆菌。
在本发明的一种或多种实施方式中，构建上述工程益生菌的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因，或者苯丙氨酸转运泵基因pheP和PAL基因置于嗜酸乳杆菌组成型启动子SL下游；
(2)采用常规分子生物学技术将上述基因片段连接到pORI28载体；
(3)以嗜酸乳杆菌NCFM为底盘菌，通过同源重组方法将上述基因整合到基因组上，获得蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因整合菌株或者基因PAL和基因pheP整合菌株。
在本发明的第三方面，提供第一方面所述的重组表达载体或第二方面所述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。
在本发明的第四方面，提供一种药物组合物，其包括第二方面所述的工程益生菌以及药学上可以接受的辅料。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明首次构建在胃肠道中能够分泌苯丙氨酸裂合酶到菌体外的工程益生菌，有效降解胃肠道中被消化食物中的苯丙氨酸，利用嗜酸乳杆菌主要定植于蛋白质消化、氨基酸吸收场所胃和小肠的特征，有效降解食物中苯丙氨酸，降低患者的苯丙氨酸摄取量，可用于治疗PKU；
来源于Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的苯丙氨酸裂合酶基因PAL在嗜酸乳杆菌中表达得到的酶的活力较高，能够有效降解苯丙氨酸，从而达到治疗苯丙酮尿症的目的；
来源于Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL和来源于Escherichia coli K-12的苯丙氨酸转运泵基因pheP，整合到嗜酸乳杆菌中后能够增强工程益生菌对食物中苯丙氨酸的吸收和降解效果，降低患者的苯丙氨酸摄取量；
来源于Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL和来源于Lacticaseibacillus paracasei ATCC 334的蛋白质分泌加工结构域基因prtP结合，将其整合到嗜酸乳杆菌中后能够得到在胃肠道中能够分泌苯丙氨酸裂合酶到菌体外的工程益生菌，有效降解胃肠道中被消化食物中的苯丙氨酸，降低患者的苯丙氨酸摄取量，用于治疗PKU；
本发明提供的工程益生菌，有助于治疗苯丙酮尿症患者，提高患者生活质量，具有重要的临床治疗价值和社会效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中的PKU小鼠血液中苯丙氨酸浓度；
图2为实施例2中的PKU小鼠血液中苯丙氨酸浓度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供了一种重组表达载体，包括重组表达载体一和重组表达载体二；
所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；
所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因(phenylalanine transporter，pheP)和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体。
优选地，所述苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL来源于Photorhabdus asymbioticaATCC43949，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：
atgaacgctaaagatatccagccaactattattattaatgaaaatggttttatctctctggaagatatctatcagattgcgacaaatcaaaaaaaagtagaaatatcaacgggtgtcatagatattttgaatcgtggtcgtgaaaaattagaggaaaaattaaacttaggagaggtgatatatgggattaatacaggatttgggggaaatgccaatttagttgtgccgtttgagaaaatctcagaacaccagaaaaatctgttaacttttctttctgctggcactggggactatatgtccaaaacttgtattagagcttcacaatttactgtgttactttctatttgcaaaggttggtcagcaacaaggccaattgtcgctcaaacgatagtcgatcatcttaaccatgatattgtgcctctggttccccgatatggctccgtgggagcaagcggtgatttaattcctctatcttatattgcacgtgcattatgtggtattggcaaggttaattatatgggagaggaaattaacgctgctgaagcaattaaacgtgcaggattaactccgttatcattacaagcaaaagaaggtctcgctctcattaatggcactcgggtaatgtcaggtatcagttcagttaccgtgattaaactggaaaaactattaaaagcgacaatctcttctatagcacttgctgtcgaagcattactcgcatctcatgaacattatgatgttcgaattcagcaagtaaaaaatcaccctggtcagaaagcagtagcgagtacattgcgtaatttattggaaggttcgacacagaccagtttattagaaggtattaaagaacaagcgaataaagcttgtcgtcaccaagaagttacccgactaaatgataccttacaagaagtttactcaattcgttgtgcgccgcaaatattaggcatagttccggaatctttagctacagctcgaaaaatattggaacgtgaagttatttctgctaatgataatccattgattgatccggaaaatggtgatgttctacacggtgggaattttatgggacaatatgttgcccggactatggatgcattgaagttggatattgctttaattgccaatcatcttcatgcaatcgtagcactgatgatggatagccgtttttctcgtggattaccaaattcattaagtccgacgcctggtatgtatcaaggtctgaaaggtgtccaactttcacaaacagctttagttgctgcaattcgccatgactgttctgcatctggtatacatactttagctacagagcagtataatcaagatattgtcagcttgggtttacatgccgcacaagacgttctggagatggaacaaaaattacgtaacattgttgcaatgacaattctggtagtttgtcaggccatttatctccgcggcaatattagtaagcttgctcctgaaaccgctaaattttaccatgcagtacgtgaaattagtcctcctctggaagccgatcgtgcattggatcaagatataatccggattgccgatgcaattattaatgataatcttcctttaccagaaatcattcttgaagaataa
优选地，所述蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP来源于Lacticaseibacillusparacasei ATCC 334，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2：
atgcaaaggaaaaagaaagggctatcgatcttgttagccggtacagtcgctttaggggcgctggctgtcttgccagtcggcgaaatccaagcaaaggcggctatctcgcagcaaactaaaggatcatcactcgcaaatacggttaaggccgcgactgctaagcaagcggccactgacacaaccgcagcgacaacgaatcaagcgattgccacacagttggcggctaaaggtattgattacaataagctgaataaagttcagcagcaagatacttatgttgacgtcattgttcaaatgagcgcagcgcctgcctctgaaaacggcactttaagaactgattactccagcacggcggagattcagcaggagaccaataaagtgatcgcggctcaggcaagcgttaaggcagctgttgaacaagtcacccaacaaactgccggtgaaagttatggctatgtcgttaacggcttttcaactaaagttagggttgttgatatccctaaactgaaacaaattgccggagttaaaacagtcacattggcgaaagtttactatccgactgatgctaaggctaactcgatggcgaatgtgcaggccgtatgg
优选地，所述苯丙氨酸转运泵基因pheP来源于Escherichia coli K-12，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO：3：
atgaaaaacgcgtcaaccgtatcggaagatactgcgtcgaatcaagagccgacgcttcatcgcggattacataaccgtcatattcaactgattgcgttgggtggcgcaattggtactggtctgtttcttggcattggcccggcgattcagatggcgggtccggctgtattgctgggctacggcgtcgccgggatcatcgctttcctgattatgcgccagcttggcgaaatggtggttgaggagccggtatccggttcatttgcccactttgcctataaatactggggaccgtttgcgggcttcctctctggctggaactactgggtaatgttcgtgctggtgggaatggcagagctgaccgctgcgggcatctatatgcagtactggttcccggatgttccaacgtggatttgggctgccgccttctttattatcatcaacgccgttaacctggtgaacgtgcgcttatatggcgaaaccgagttctggtttgcgttgattaaagtgctggcaatcatcggtatgatcggctttggcctgtggctgctgttttctggtcacggcggcgagaaagccagtatcgacaacctctggcgctacggtggtttcttcgccaccggctggaatgggctgattttgtcgctggcggtaattatgttctccttcggcggtctggagctgattgggattactgccgctgaagcgcgcgatccggaaaaaagcattccaaaagcggtaaatcaggtggtgtatcgcatcctgctgttttacatcggttcactggtggttttactggcgctctatccgtgggtggaagtgaaatccaacagtagcccgtttgtgatgattttccataatctcgacagcaacgtggtagcttctgcgctgaacttcgtcattctggtagcatcgctgtcagtgtataacagcggggtttactctaacagccgcatgctgtttggcctttctgtgcagggtaatgcgccgaagtttttgactcgcgtcagccgtcgcggtgtgccgattaactcgctgatgctttccggagcgatcacttcgctggtggtgttaatcaactatctgctgccgcaaaaagcgtttggtctgctgatggcgctggtggtagcaacgctgctgttgaactggattatgatctgtctggcgcatctgcgttttcgtgcagcgatgcgacgtcaggggcgtgaaacacagtttaaggcgctgctctatccgttcggcaactatctctgcattgccttcctcggcatgattttgctgctgatgtgcacgatggatgatatgcgcttgtcagcgatcctgctgccggtgtggattgtattcctgtttatggcatttaaaacgctgcgtcggaaataa
优选地，所述嗜酸乳杆菌组成型启动子SL来源于Lactobacillus acidophilusNCFM，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID NO：4：
Aggcgtgttgcctgtacgcatgctgattcttcagcaagactactacctcatgagagttatagactcatggatcttgctttgaagggttttgtacattataggctcctatcacatgctgaacctatggcctattacatttttttatatttcaaggaggaaaagaccac
本发明中，苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL来源于Photorhabdus asymbioticaATCC43949，发明人发现，编码不同来源苯丙氨酸裂合酶的基因在嗜酸乳杆菌中表达得到的酶的活力存在差异，发明人通过对众多不同来源的苯丙氨酸氨裂合酶进行深入研究发现，Photorhabdus asymbiotica ATCC43949编码基因在嗜酸乳杆菌中表达所得到的酶的活力较高，能够有效降解苯丙氨酸，从而达到治疗苯丙酮尿症的目的。
优选地，所述重组表达载体一由苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanineammonia-lyase，PAL)核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列、嗜酸乳杆菌组成型启动子SL和pORI28载体连接得到；
所述重组表达载体二由苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因(phenylalanine transporter，pheP)、嗜酸乳杆菌组成型启动子SL和pORI28载体连接得到；
本发明的一种实施方式中，提供了一种治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，所述工程益生菌选自含有上述重组表达载体的嗜酸乳杆菌；
优选地，所述嗜酸乳杆菌选择嗜酸乳杆菌NCFM；
本发明中来源于Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL和来源于Escherichia coli K-12的苯丙氨酸转运泵基因pheP，或者苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL与来源于Lacticaseibacillus paracasei ATCC 334的蛋白质分泌加工结构域基因prtP结合，将其整合到嗜酸乳杆菌中后能够得到在胃肠道中能够分泌苯丙氨酸氨裂合酶到菌体外的工程益生菌，有效降解胃肠道中被消化食物中的苯丙氨酸，降低患者的苯丙氨酸摄取量，用于治疗PKU。
在本发明的一种或多种实施方式中，构建上述工程益生菌的方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因，或者苯丙氨酸转运泵基因pheP和PAL基因置于嗜酸乳杆菌组成型启动子SL下游；
(2)采用常规分子生物学技术将上述基因片段连接到pORI28载体；
(3)以嗜酸乳杆菌NCFM为底盘菌，通过同源重组方法将上述基因整合到基因组上，获得蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因整合菌株或者基因PAL和基因pheP整合菌株。
优选地，采用全基因合成方法合成启动子SL、基因prtP、基因pheP和基因PAL。
优选地，所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌；本发明提供的工程益生菌可以将苯丙氨酸裂合酶分泌到胃和小肠中，更有效地降解食物中PA。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述的重组表达载体或上述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。
优选地，所述药物是固体剂型，给药方式为口服给药。
所述工程益生菌在胃肠道中可以将苯丙氨酸裂合酶到菌体外，降解被消化食物中的PA。
本发明的一种实施方式中，提供一种药物组合物，其包括上述的工程益生菌以及药学上可以接受的辅料。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
工程益生菌LA205构建
以嗜酸乳杆菌NCFM出发菌株，在基因组上整合蛋白质分泌加工结构域基因prtP和苯丙氨酸裂合酶PAL基因，包括如下步骤：
本实施例中全基因合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成。分子生物学实验包括感受态细胞制备、转化等参照《分子克隆实验指南》(第三版)进行。
设计含启动子SL(DNA序列NO3)、蛋白质分泌加工结构域基因prtP(DNA序列NO1)和苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL(DNA序列NO2)的基因片段SPAL，用全基因合成的方法获得DNA片段并构建到克隆载体pUC57，获得pUC57-SPAL载体。
以嗜酸乳杆菌NCFM基因组为模板，L-F和L-R为引物，PCR扩增获得上游同源臂L-arm。以NCFM基因组为模板，R-F和R-R为引物，PCR扩增获得下游同源臂R-arm。以pUC57-SPAL载体为模板，SPAL-F和SPAL-R为引物，PCR扩增获得SPAL片段。L-arm、R-arm和SPAL片段利用重组酶方法克隆到pORI28载体，获得pORI28-SPAL载体。
通过电转化将pORI28-SPAL载体和pTRK669辅助质粒一起转入嗜酸乳杆菌NCFM菌株，获得转化子，并用Val-F和Val-R，PCR筛选分泌型苯丙氨酸裂合酶基因整合到基因组上的重组菌株。然后通过42℃和在无抗生素培养基上连续传代消除质粒，最终获得工程菌LA205。
表1引物列表
引物名称 引物序列(5’→3’)
L-F TCTAGACTTTGTTTCTAACTCTCCAG
L-R CTGGAGAGTTAGAAACAAAGTCTAGA
R-F TCAGGCAAGATTATTAAACC
R-R AGATCTGAAATCAATTTCTTAATTGA
SPAL-F CAAAGGTGTAACCAGTTAAAGGCGTGTTGCCTGTACGCA
SPAL-R GGTTTAATAATCTTGCCTGATTATTCTTCAAGAATGATTT
Val-F AGAATTAACTCAAGGTCG
Val-R ATCACGGTAACTGAACTG
体外条件下工程益生菌LA205对苯丙氨酸的降解活性
将NCFM益生菌和LA205工程益生菌分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝1.0，离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤2次。再定量转接到添加50mg/L苯丙氨酸的低浓度MRS培养基(含1/10MRS培养基的营养成分)，37℃、250rpm培养，分别在0小时、2小时、4小时、6小时和8小时取样，离心收集上清样品，HPLC检测苯丙氨酸浓度。每个处理做3个重复，检测结果见表2。结果显示，LA205工程益生菌处理中苯丙氨酸浓度下降速度显著高于NCFM益生菌处理，表明LA205工程益生菌具有较好的降解苯丙氨酸能力。
表2益生菌处理条件下苯丙氨酸的平均浓度(mg/L)
时间 NCFM LA1314
起始 53.04 53.63
第2小时 50.61 47.51
第4小时 52.26 38.43
第6小时 45.71 28.06
第8小时 40.36 10.57
同时将NCFM益生菌和LA205工程益生菌分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝1.0，离心收集上清液，并用除菌滤膜过滤获得无菌的滤液。然后在无菌滤液中加入50mg/L苯丙氨酸，37℃、250rpm振荡，分别在0小时、1小时、2小时、3小时和4小时取样，取样用HPLC检测苯丙氨酸浓度。每个处理做3个重复，检测结果见表3。结果显示，LA205工程益生菌的无菌滤液可以有效降解苯丙氨酸，表明LA205工程益生菌能够向菌体外分泌苯丙氨酸裂合酶。
表3无细胞滤液中苯丙氨酸浓度变化(mg/L)
时间 NCFM LA1314
起始 50.24 51.43
第1小时 50.61 41.25
第2小时 51.06 32.53
第3小时 50.41 28.02
第4小时 49.57 8.53
工程益生菌LA205对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸浓度的影响
苯丙酮尿症小鼠模型购自生物技术公司，基因型为Pahenu2。该模型小鼠具备苯丙酮尿症的典型症状，在正常喂养条件下，Pahenu2小鼠在出生第6周时血液中苯丙氨酸含量为1200μmol/L，第8周时血液中苯丙氨酸含量达到1500μmol/L，体重和体型明显偏小，毛色逐渐表现棕黄色。
实验采用为8周龄Pahenu2小鼠，利用无苯丙氨酸饲料喂养，每天定时灌胃100μl含苯丙氨酸的纯化水作为苯丙氨酸补给。动物实验开始后，将小鼠分成3组，每天定时灌胃2次，分别灌胃200μl生理盐水、NCFM益生菌或LA205工程益生菌，每次益生菌服用量约1*1010cfu/只小鼠。每天定时采血取样，检验血液中苯丙氨酸浓度。血液中苯丙氨酸的平均浓度结果如图1所示。结果显示，口服LA205工程益生菌后，Pahenu2小鼠血液中苯丙氨酸浓度相比于口服生理盐水和NCFM益生菌都明显降低，说明LA205工程益生菌能够降解食物中苯丙氨酸，减少小鼠的苯丙氨酸摄取量。
综上所述，本发明所构建的嗜酸乳杆菌工程益生菌LA205能够向菌体外分泌苯丙氨酸裂合酶，降解胃肠道消化食物中的苯丙氨酸，显著降低苯丙酮症基因小鼠血液中苯丙氨酸浓度，有望应用于治疗苯丙酮尿症。
实施例2
工程益生菌LA1314构建
以嗜酸乳杆菌NCFM出发菌株，在基因组上整合苯丙氨酸裂合酶基因PAL和苯丙氨酸转运泵基因pheP，包括如下步骤：
本实施例中全基因合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成；分子生物学实验包括感受态细胞制备、转化等参照《分子克隆实验指南》(第三版)进行。
设计含启动子SL(DNA序列NO3)、苯丙氨酸裂合酶基因PAL(DNA序列NO1)和苯丙氨酸转运泵基因pheP(DNA序列NO2)的基因片段PALP，用全基因合成的方法获得DNA片段并构建到克隆载体pUC57，获得pUC57-PALP载体。
以嗜酸乳杆菌NCFM基因组为模板，L-F和L-R为引物，PCR扩增获得上游同源臂L-arm。以NCFM基因组为模板，R-F和R-R为引物，PCR扩增获得下游同源臂R-arm。以pUC57-PALP载体为模板，PALP-F和PALP-R为引物，PCR扩增获得PALP片段。L-arm、R-arm和PALP片段利用重组酶方法克隆到pORI28载体，获得pORI28-PALP载体。
通过电转化将pORI28-PALP载体和pTRK669辅助质粒一起转入嗜酸乳杆菌NCFM菌株，获得转化子，并用Val-F和Val-R，PCR筛选苯丙氨酸裂合酶基因PAL和苯丙氨酸转运泵基因pheP整合到基因组上的重组菌株。然后通过42℃和在无抗生素培养基上连续传代消除质粒，最终获得工程菌LA1314。
表4引物列表
引物名称 引物序列(5’→3’)
L-F TCTAGACTTTGGTTTCTAACTCTCCAG
L-R CTGGAGAGTTAGAAACAAAGTCTAGA
R-F TCAGGCAAGATTATTAAACC
R-R AGATCTGAAATCAATTTCTTAATTGA
PALP-F CAAAGGTGTAACCAGTTAAAGGCGTGTTGCCTGTACGCA
PALP-R GGTTTAATAATCTTGCCTGAAAATTTAAAACACAAAAAAAG
Val-F AGAATTAACTCAAGGTCG
Val-R ATCACGGTAACTGAACTG
体外条件下工程益生菌LA1314对苯丙氨酸的降解活性
将NCFM益生菌和LA1314工程益生菌分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝1.0，离心收集菌体，并用PBS缓冲液洗涤2次。最后用含0.5％葡萄糖和50mg/L苯丙氨酸的PBS缓冲液悬浮稀释至OD600＝1.0，37℃、250rpm培养，分别在0小时、1小时、2小时、3小时和4小时取样，离心收集上清样品，HPLC检测苯丙氨酸浓度。每个处理做3个重复，检测结果见表5。结果显示，LA1314工程益生菌处理中苯丙氨酸浓度下降速度显著高于NCFM益生菌处理，表明LA1314工程益生菌具有较好的降解苯丙氨酸能力。
表5益生菌处理条件下苯丙氨酸的平均浓度(mg/L)
时间 NCFM LA1314
起始 51.74 52.13
第1小时 45.61 30.24
第2小时 42.16 12.43
第3小时 40.75 8.96
第4小时 38.46 0.57
工程益生菌LA1314对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸浓度的影响
苯丙酮尿症小鼠模型购自生物技术公司，基因型为Pahenu2。该模型小鼠具备苯丙酮尿症的典型症状，在正常喂养条件下，Pahenu2小鼠在出生第6周时血液中苯丙氨酸含量为1200μmol/L，第8周时血液中苯丙氨酸含量达到1500μmol/L，体重和体型明显偏小，毛色逐渐表现棕黄色。
实验采用为8周龄Pahenu2小鼠，利用无苯丙氨酸饲料喂养，每天定时灌胃100μl含苯丙氨酸的纯化水作为苯丙氨酸补给。动物实验开始后，将小鼠分成3组，每天定时灌胃2次，分别灌胃200μl生理盐水、NCFM益生菌或LA1314工程益生菌，每次益生菌服用量约1*1010cfu/只小鼠。每天定时采血取样，检验血液中苯丙氨酸浓度。血液中苯丙氨酸的平均浓度结果如图1所示。结果显示，口服LA1314工程益生菌后，Pahenu2小鼠血液中苯丙氨酸浓度相比于口服生理盐水和NCFM益生菌都明显降低，说明LA1314工程益生菌能够降解食物中苯丙氨酸，减少小鼠的苯丙氨酸摄取量。
综上所述，本发明所构建的嗜酸乳杆菌工程益生菌LA1314能够降解苯丙氨酸，显著降低苯丙酮症基因小鼠血液中苯丙氨酸浓度，有望应用于治疗苯丙酮尿症。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东第一医科大学（山东省医学科学院）
<120> 治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用
<130> 202127698
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> PAL
<400> 1
atgaacgcta aagatatcca gccaactatt attattaatg aaaatggttt tatctctctg 60
gaagatatct atcagattgc gacaaatcaa aaaaaagtag aaatatcaac gggtgtcata 120
gatattttga atcgtggtcg tgaaaaatta gaggaaaaat taaacttagg agaggtgata 180
tatgggatta atacaggatt tgggggaaat gccaatttag ttgtgccgtt tgagaaaatc 240
tcagaacacc agaaaaatct gttaactttt ctttctgctg gcactgggga ctatatgtcc 300
aaaacttgta ttagagcttc acaatttact gtgttacttt ctatttgcaa aggttggtca 360
gcaacaaggc caattgtcgc tcaaacgata gtcgatcatc ttaaccatga tattgtgcct 420
ctggttcccc gatatggctc cgtgggagca agcggtgatt taattcctct atcttatatt 480
gcacgtgcat tatgtggtat tggcaaggtt aattatatgg gagaggaaat taacgctgct 540
gaagcaatta aacgtgcagg attaactccg ttatcattac aagcaaaaga aggtctcgct 600
ctcattaatg gcactcgggt aatgtcaggt atcagttcag ttaccgtgat taaactggaa 660
aaactattaa aagcgacaat ctcttctata gcacttgctg tcgaagcatt actcgcatct 720
catgaacatt atgatgttcg aattcagcaa gtaaaaaatc accctggtca gaaagcagta 780
gcgagtacat tgcgtaattt attggaaggt tcgacacaga ccagtttatt agaaggtatt 840
aaagaacaag cgaataaagc ttgtcgtcac caagaagtta cccgactaaa tgatacctta 900
caagaagttt actcaattcg ttgtgcgccg caaatattag gcatagttcc ggaatcttta 960
gctacagctc gaaaaatatt ggaacgtgaa gttatttctg ctaatgataa tccattgatt 1020
gatccggaaa atggtgatgt tctacacggt gggaatttta tgggacaata tgttgcccgg 1080
actatggatg cattgaagtt ggatattgct ttaattgcca atcatcttca tgcaatcgta 1140
gcactgatga tggatagccg tttttctcgt ggattaccaa attcattaag tccgacgcct 1200
ggtatgtatc aaggtctgaa aggtgtccaa ctttcacaaa cagctttagt tgctgcaatt 1260
cgccatgact gttctgcatc tggtatacat actttagcta cagagcagta taatcaagat 1320
attgtcagct tgggtttaca tgccgcacaa gacgttctgg agatggaaca aaaattacgt 1380
aacattgttg caatgacaat tctggtagtt tgtcaggcca tttatctccg cggcaatatt 1440
agtaagcttg ctcctgaaac cgctaaattt taccatgcag tacgtgaaat tagtcctcct 1500
ctggaagccg atcgtgcatt ggatcaagat ataatccgga ttgccgatgc aattattaat 1560
gataatcttc ctttaccaga aatcattctt gaagaataa 1599
<210> 2
<211> 603
<212> DNA
<213> prtP
<400> 2
atgcaaagga aaaagaaagg gctatcgatc ttgttagccg gtacagtcgc tttaggggcg 60
ctggctgtct tgccagtcgg cgaaatccaa gcaaaggcgg ctatctcgca gcaaactaaa 120
ggatcatcac tcgcaaatac ggttaaggcc gcgactgcta agcaagcggc cactgacaca 180
accgcagcga caacgaatca agcgattgcc acacagttgg cggctaaagg tattgattac 240
aataagctga ataaagttca gcagcaagat acttatgttg acgtcattgt tcaaatgagc 300
gcagcgcctg cctctgaaaa cggcacttta agaactgatt actccagcac ggcggagatt 360
cagcaggaga ccaataaagt gatcgcggct caggcaagcg ttaaggcagc tgttgaacaa 420
gtcacccaac aaactgccgg tgaaagttat ggctatgtcg ttaacggctt ttcaactaaa 480
gttagggttg ttgatatccc taaactgaaa caaattgccg gagttaaaac agtcacattg 540
gcgaaagttt actatccgac tgatgctaag gctaactcga tggcgaatgt gcaggccgta 600
tgg 603
<210> 3
<211> 1377
<212> DNA
<213> pheP
<400> 3
atgaaaaacg cgtcaaccgt atcggaagat actgcgtcga atcaagagcc gacgcttcat 60
cgcggattac ataaccgtca tattcaactg attgcgttgg gtggcgcaat tggtactggt 120
ctgtttcttg gcattggccc ggcgattcag atggcgggtc cggctgtatt gctgggctac 180
ggcgtcgccg ggatcatcgc tttcctgatt atgcgccagc ttggcgaaat ggtggttgag 240
gagccggtat ccggttcatt tgcccacttt gcctataaat actggggacc gtttgcgggc 300
ttcctctctg gctggaacta ctgggtaatg ttcgtgctgg tgggaatggc agagctgacc 360
gctgcgggca tctatatgca gtactggttc ccggatgttc caacgtggat ttgggctgcc 420
gccttcttta ttatcatcaa cgccgttaac ctggtgaacg tgcgcttata tggcgaaacc 480
gagttctggt ttgcgttgat taaagtgctg gcaatcatcg gtatgatcgg ctttggcctg 540
tggctgctgt tttctggtca cggcggcgag aaagccagta tcgacaacct ctggcgctac 600
ggtggtttct tcgccaccgg ctggaatggg ctgattttgt cgctggcggt aattatgttc 660
tccttcggcg gtctggagct gattgggatt actgccgctg aagcgcgcga tccggaaaaa 720
agcattccaa aagcggtaaa tcaggtggtg tatcgcatcc tgctgtttta catcggttca 780
ctggtggttt tactggcgct ctatccgtgg gtggaagtga aatccaacag tagcccgttt 840
gtgatgattt tccataatct cgacagcaac gtggtagctt ctgcgctgaa cttcgtcatt 900
ctggtagcat cgctgtcagt gtataacagc ggggtttact ctaacagccg catgctgttt 960
ggcctttctg tgcagggtaa tgcgccgaag tttttgactc gcgtcagccg tcgcggtgtg 1020
ccgattaact cgctgatgct ttccggagcg atcacttcgc tggtggtgtt aatcaactat 1080
ctgctgccgc aaaaagcgtt tggtctgctg atggcgctgg tggtagcaac gctgctgttg 1140
aactggatta tgatctgtct ggcgcatctg cgttttcgtg cagcgatgcg acgtcagggg 1200
cgtgaaacac agtttaaggc gctgctctat ccgttcggca actatctctg cattgccttc 1260
ctcggcatga ttttgctgct gatgtgcacg atggatgata tgcgcttgtc agcgatcctg 1320
ctgccggtgt ggattgtatt cctgtttatg gcatttaaaa cgctgcgtcg gaaataa 1377
<210> 4
<211> 167
<212> DNA
<213> 启动子SL
<400> 4
aggcgtgttg cctgtacgca tgctgattct tcagcaagac tactacctca tgagagttat 60
agactcatgg atcttgcttt gaagggtttt gtacattata ggctcctatc acatgctgaa 120
cctatggcct attacatttt tttatatttc aaggaggaaa agaccac 167
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> L-F
<400> 5
tctagacttt gtttctaact ctccag 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> L-R
<400> 6
ctggagagtt agaaacaaag tctaga 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> R-F
<400> 7
tcaggcaaga ttattaaacc 20
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> R-R
<400> 8
agatctgaaa tcaatttctt aattga 26
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> SPAL-F
<400> 9
caaaggtgta accagttaaa ggcgtgttgc ctgtacgca 39
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> SPAL-R
<400> 10
ggtttaataa tcttgcctga ttattcttca agaatgattt 40
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Val-F
<400> 11
agaattaact caaggtcg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Val-R
<400> 12
atcacggtaa ctgaactg 18
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> PALP-F
<400> 13
caaaggtgta accagttaaa ggcgtgttgc ctgtacgca 39
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> PALP-R
<400> 14
ggtttaataa tcttgcctga aaatttaaaa cacaaaaaaa g 41

Claims (10)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括重组表达载体一和重组表达载体二；
所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；
所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因(phenylalanine transporter，pheP)和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体。
2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL来源于Photorhabdus asymbiotica ATCC43949，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP来源于Lacticaseibacillus paracaseiATCC 334，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述苯丙氨酸转运泵基因pheP来源于Escherichia coli K-12，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌组成型启动子SL来源于Lactobacillus acidophilus NCFM，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体一由苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列、嗜酸乳杆菌组成型启动子SL和pORI28载体连接得到；
所述重组表达载体二由苯丙氨酸氨裂合酶基因核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因pheP、嗜酸乳杆菌组成型启动子SL和pORI28载体连接得到。
7.一种治疗苯丙酮尿症的工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌选自含有第一方面所述重组表达载体的嗜酸乳杆菌；
优选地，所述嗜酸乳杆菌选择嗜酸乳杆菌NCFM。
8.一种构建权利要求7所述工程益生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因，或者苯丙氨酸转运泵基因pheP和PAL基因置于嗜酸乳杆菌组成型启动子SL下游；
(2)采用常规分子生物学技术将上述基因片段连接到pORI28载体；
(3)以嗜酸乳杆菌NCFM为底盘菌，通过同源重组方法将上述基因整合到基因组上，获得蛋白质分泌加工结构域基因prtP和PAL基因整合菌株或者基因PAL和基因pheP整合菌株；
优选地，采用全基因合成方法合成启动子SL、基因prtP、基因pheP和基因PAL；
优选地，所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。
9.权利要求1所述的重组表达载体或权利要求7所述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用；
优选地，所述药物是固体剂型，给药方式为口服给药。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求7所述的工程益生菌以及药学上可以接受的辅料。
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