CN113967199A - 白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球在制备抗骨性关节炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白藜芦醇‑聚乳酸长效纳米微球在制备抗骨性关节炎药物中的应用，属于骨性关节炎治疗领域。该纳米微球的制备方法包括：将白藜芦醇和聚乳酸共同溶解于二氯甲烷中，形成有机相；将有机相与PVA液Ⅰ混合，在冰浴条件下，高速剪切形成乳液，然后将其缓慢滴入PVA溶液Ⅱ中，低速搅拌挥发有机溶剂，收集微球；将所收集的微球离心，弃去上清液，清洗纳米微球，再经冷冻干燥，得到白藜芦醇‑聚乳酸长效纳米微球。该制备方法简单易操作，通过优化制备条件，提高白藜芦醇‑聚乳酸纳米微球的稳定性，适宜进行工业化推广和应用，并且该纳米微球膝关节腔注射后可显著减轻软骨损伤及滑膜炎症等症状，可用于治疗膝关节骨性关节炎的药物开发中。
Description
技术领域
本发明涉及骨性关节炎治疗领域，特别是涉及白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球在制备抗骨性关节炎药物中的应用。
背景技术
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种慢性肌肉骨骼系统疾病，在临床上，疼痛是其表现的主要症状，具体表现为疼痛、关节僵硬和关节摩擦音。据报道，该疾病的患病人群随着年龄的增长所占的比例逐渐增大，并且女性患病几率明显高于男性。OA的特点是软骨退化，关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，目前的治疗药物主要包括镇痛药、非甾体类抗炎药物、肾上腺皮质激素、透明质酸、过氧化物歧化酶(SOD)和D—葡萄胺等，这些药物皆能缓解症状，但并不能改变疾病进展的过程。因此，针对OA研发新的药物势在必行。
白藜芦醇(Resveratrol，RSV)又称芪三酚，是一种非黄酮类多酚化合物，广泛存在于虎杖根、葡萄、花生等种子植物中，该物质是植物在外来病菌侵入、紫外线照射等不利因素刺激时产生的一种抗毒素，对植物起到保护作用，同时对人体也具有抗肿瘤、抗炎、抗心血管疾病等作用。近些年大量的体内外抗癌试验研究表明，白藜芦醇对多种肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等，均具有潜在的抗癌活性，目前主要以口服为主，但是发现口服给药后存在生物利用度低，半衰期短，清除快，需要频繁给药，阻碍了在临床中的应用。而目前还没有白藜芦醇长效关节腔注射制剂在OA治疗中应用的相关报道，研究白藜芦醇与OA间的相关性，以及如何提高白藜芦醇在体内的长效作用对于开发治疗OA具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球在制备抗OA药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过膝关节腔注射白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球可以显著减轻软骨损伤及滑膜炎症等症状。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球在制备抗骨性关节炎药物中的应用。
优选的是，所述白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球平均粒径为100nm。
优选的是，所述白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球为注射剂。
本发明还提供一种白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将白藜芦醇和聚乳酸共同溶解于二氯甲烷中，形成有机相；
(2)将所述有机相与PVA溶液Ⅰ混合，在冰浴条件下，高速剪切形成乳液，然后将其缓慢滴入PVA溶液Ⅱ中，低速搅拌挥发有机溶剂，收集微球；
(3)将所收集的微球离心，弃去上清液，清洗纳米微球，再经冷冻干燥，得到白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球。
优选的是，步骤(1)中，白藜芦醇：聚乳酸：二氯甲烷的配比为(3-5)mg：(10-45)mg：(0.5-1)mL。
优选的是，步骤(2)中，所述有机相和所述PVA溶液Ⅰ等体积混合；所述乳液与5倍体积所述PVA溶液Ⅱ混合；所述PVA溶液Ⅰ和所述PVA溶液Ⅱ的质量分数均为2％。
优选的是，步骤(2)中，所述高速为：10000-12500rpm剪切3-5min；所述低速为：200-300rpm搅拌挥发4h。
优选的是，步骤(3)中，离心条件为：8000-10000rpm离心15-20min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过纳米载药体系递送白藜芦醇，充分发挥白藜芦醇的抗炎作用，从而实现治疗骨质关节炎的作用。
本发明制备的纳米微球平均粒径为100nm，不会造成注射用药的栓塞，可以膝关节腔局部注射给药，提高白藜芦醇的作用效果，实验证明，该纳米微球膝关节腔注射后可显著减轻软骨损伤及滑膜炎症等症状。
本发明纳米微球的制备方法简单易操作，通过优化制备条件，提高白藜芦醇-聚乳酸纳米微球的稳定性，适宜进行工业化推广和应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同组MRI图像；
图2为不同组MRI评价中T1ρ值结果；
图3为不同组MRI评价中T2值结果；
图4为不同组膝关节大体形态、H&E和番红O-固绿染色结果；
图5为不同组OARSI评分结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将3mg白藜芦醇和10mg聚乳酸共同溶解于0.5mL二氯甲烷中，混匀，形成有机相；
(2)将上述有机相与2％PVA溶液Ⅰ等体积混合，在冰浴条件下，10000rpm高速剪切3min形成乳液，然后将其缓慢滴入5倍体积的2％PVA溶液Ⅱ中，200rpm低速搅拌挥发4h有机溶剂，收集微球；
(3)将所收集的微球于8000rpm离心15min，弃去上清液，用蒸馏水清洗三次纳米微球，再经-80℃冷冻干燥，收集干燥粉末，得到白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球。
实施例2
一种白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4.2mg白藜芦醇和30mg聚乳酸共同溶解于1mL二氯甲烷中，混匀，形成有机相；
(2)将上述有机相与2％PVA溶液Ⅰ等体积混合，在冰浴条件下，11000rpm高速剪切4min形成乳液，然后将其缓慢滴入5倍体积的2％PVA溶液Ⅱ中，250rpm低速搅拌挥发4h有机溶剂，收集微球；
(3)将所收集的微球于9000rpm离心15min，弃去上清液，用蒸馏水清洗三次纳米微球，再经-80℃冷冻干燥，收集干燥粉末，得到白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球。
实施例3
一种白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将5mg白藜芦醇和45mg聚乳酸共同溶解于1mL二氯甲烷中，混匀，形成有机相；
(2)将上述有机相与2％PVA溶液Ⅰ等体积混合，在冰浴条件下，12500rpm高速剪切5min形成乳液，然后将其缓慢滴入5倍体积的2％PVA溶液Ⅱ中，300rpm低速搅拌挥发4h有机溶剂，收集微球；
(3)将所收集的微球于10000rpm离心20min，弃去上清液，用蒸馏水清洗三次纳米微球，再经-80℃冷冻干燥，收集干燥粉末，得到白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球。
对比例1
与实施例2的区别在于：步骤(2)中，有机相和PVA溶液Ⅰ按照体积比分别按照1:0.5、1:2混合，其它步骤相同。
对比例2
与实施例2的区别在于：高速设置分别为8000rpm、15000rpm，其它步骤相同。
对比例3
与实施例2的区别在于：低速分别设置为100rpm、500rpm，其他步骤相同。
对上述实施例1-3以及对比例1-3所制备的纳米微球的载药量和包封率进行统计，结果如表1所示。
纳米微球载药量(％)＝(纳米微球中实际载药量/冻干后纳米微球总重量)×100％；
药物包封率(％)＝(实际载药量/理论载药量)×100％。
上述纳米微球中的药物实际含量通过常规的质谱分析进行测定。
表1纳米微球载药量和药物包封率的统计结果
试验例
利用实施例2制备的白藜芦醇-聚乳酸纳米微球(RSV-PLGA-NPs)对OA进行表征
1、RSV-PLGA-NPs在抗OA中的应用
将40只大鼠随机分为3组：假手术对照组(Control组)、模型组(OA组)和RSV-PLGA-NPs治疗组(RSV-PLGA-NPs组)。RSV组在半月板切除术术后右膝关节腔注射10μL白藜芦醇(10μM)和DMSO(0.02％)，每4周注射一次，共12周。Control组和OA组按照与RSV-PLGA-NPs组相同的时间点在右膝关节腔注射10μL DMSO(0.02％)。在第12周进行MRI检查后处死大鼠，取其右膝关节进行组织形态学检查。
(1)MRI的评价
如图1所示，Control组膝关节间隙正常、关节面平整、光滑；与Control组比较，OA组关节软骨变薄、可见局部有充盈性缺损，膝关节腔内积液明显增加。RSV-PLGA-NPs组膝关节较OA组明显改善。定量磁共振弛豫测量(T1ρ和T2)结果如图2和图3所示，与Control组相比，12周时，OA组的MFC、LFC、LT和MT的T1ρ值显著高于Control组(图2)。与OA组相比，RSV-PLGA-NPs组大鼠的T1ρ值在12周时明显降低。同样，OA组的MFC、LFC、MT和LT在12周时的T2值显著高于Control组，RSV-PLGA-NPs治疗大鼠的T2值较OA组显著降低；与Control组相比，经RSV-PLGA-NPs治疗的大鼠MT和LT的T2值显著高于Control组(图3)。
(2)组织形态学观察
观察胫骨平台和股骨髁的大体形态。如图4所示，Control组的关节软骨表面完整、光滑，无任何缺陷和骨赘形成，OA组关节软骨表面侵蚀、凹陷、溃疡和骨赘形成，以及软骨下骨暴露；然而，注射RSV-PLGA-NPs后可显著减轻关节软骨损伤。
如图4所示，H&E和番红O-固绿染色结果显示，Control组关节软骨表层光滑完整；软骨细胞排列整齐，四层结构清晰可见，潮线完整。OA组有严重OA病理改变的证据，如软骨细胞聚集、裂隙和纤维性颤动、软骨浅层丢失、骨赘增生、软骨下骨小梁丢失，骨髓腔被纤维组织占据、软骨下骨囊肿和滑膜炎。与OA组相比，RSV-PLGA-NPs组的软骨细胞裂隙、紊乱和丢失明显改善，番红O染色区域增加，滑膜炎症明显减轻。
如图5所示，OARSI评分用于评估软骨退变、骨赘形成、软骨下骨和滑膜炎[参考文献：Rutgers M,van Pelt MJP,Dhert WJA,et al.Evaluation of histological scoringsystems for tissue-engineered,repaired and osteoarthriticcartilage.Osteoarthritis Cartilage.2010；18(1):12–23.]。RSV-PLGA-NPs组股骨内侧髁和胫骨平台的OARSI评分中位数明显低于OA组。此外，RSV-PLGA-NPs显著减弱骨赘形成、软骨下板厚度和滑膜炎。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球在制备抗骨性关节炎药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球平均粒径为100nm。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球为注射剂。
4.一种白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将白藜芦醇和聚乳酸共同溶解于二氯甲烷中，形成有机相；
(2)将所述有机相与PVA溶液Ⅰ混合，在冰浴条件下，高速剪切形成乳液，然后将其缓慢滴入PVA溶液Ⅱ中，低速搅拌挥发有机溶剂，收集微球；
(3)将所收集的微球离心，弃去上清液，清洗纳米微球，再经冷冻干燥，得到白藜芦醇-聚乳酸长效纳米微球。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，白藜芦醇：聚乳酸：二氯甲烷的配比为(3-5)mg：(10-45)mg：(0.5-1)mL。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述有机相和所述PVA溶液Ⅰ等体积混合；所述乳液与5倍体积所述PVA溶液Ⅱ混合；所述PVA溶液Ⅰ和所述PVA溶液Ⅱ的质量分数均为2％。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高速为：10000-12500rpm剪切3-5min；所述低速为：200-300rpm搅拌挥发4h。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，离心条件为：8000-10000rpm离心15-20min。
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