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CN113939279A - 包封多肽的植物信使包及其用途 - Google Patents

包封多肽的植物信使包及其用途 Download PDF

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CN113939279A
CN113939279A CN202080038715.XA CN202080038715A CN113939279A CN 113939279 A CN113939279 A CN 113939279A CN 202080038715 A CN202080038715 A CN 202080038715A CN 113939279 A CN113939279 A CN 113939279A
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pmp
pmps
plant
composition
protein
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CN202080038715.XA
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玛丽亚·海伦娜·克莉丝汀·范·鲁扬
小约翰·帕特里克·凯西
娜塔莉亚·弗拉基米罗夫娜·卢科洛娃
西蒙·施威泽
丹尼尔·加西亚·卡瓦尼利亚斯
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Original Assignee
Flagship Venture Six
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Abstract

本文披露了包封一种或多种外源多肽的植物信使包(PMP)。还披露了产生包含外源多肽的PMP的方法。

Description

包封多肽的植物信使包及其用途
背景技术
多肽(例如，蛋白质或肽)在用于疗法(例如，用于治疗疾病或病症)中、用于诊断目的以及用作病原体防治剂。然而，目前将多肽递送至细胞的方法可能受递送机制(例如将多肽递送至细胞的效率)的限制。因此，本领域需要将多肽递送至细胞的方法和组合物。
发明内容
在一方面，本发明的特征在于一种包含一种或多种外源多肽的植物信使包(PMP)，其中该一种或多种外源多肽是哺乳动物治疗剂并且被PMP包封，并且其中这些外源多肽不是病原体防治剂。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是酶。在一些方面，酶是重组酶或编辑酶。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是抗体或抗体片段。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是Fc融合蛋白。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是激素。在一些方面，哺乳动物治疗剂是胰岛素。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是肽。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是受体激动剂或受体拮抗剂。
在一些方面，哺乳动物治疗剂是表1的抗体、表2的肽、表3的酶或表4的蛋白质。
在一些方面，哺乳动物治疗剂具有小于100kD的尺寸。
在一些方面，哺乳动物治疗剂具有小于50kD的尺寸。
在一些方面，哺乳动物治疗剂具有中性的总电荷。在一些方面，哺乳动物治疗剂已经修饰以具有中性电荷。在一些方面，哺乳动物治疗剂具有正的总电荷。在一些方面，哺乳动物治疗剂具有负的总电荷。
在一些方面，在与PMP接触的靶细胞中，外源多肽从该PMP中释放。在一些方面，外源多肽在靶细胞的细胞质中发挥活性。在一些方面，外源多肽被易位至靶细胞的细胞核。在一些方面，外源多肽在靶细胞的细胞核中发挥活性。
在一些方面，相对于未被PMP包封的该外源多肽的摄取，细胞对被该PMP包封的该外源多肽的摄取增加。
在一些方面，相对于未被PMP包封的该外源多肽的有效性，被该PMP包封的该外源多肽的有效性增加。
在一些方面，外源多肽包含至少50个氨基酸残基。
在一些方面，外源多肽的尺寸是至少5kD。
在一些方面，PMP包含纯化的植物细胞外囊泡(EV)或其节段或提取物。在一些方面，EV或其节段或提取物获得自柑橘属果实，例如葡萄柚或柠檬。
在另一方面，本发明的特征在于包含多个如以上方面中任一项所述的PMP的组合物。
在一些方面，组合物中的PMP的浓度有效增加哺乳动物的适应度。
在一些方面，外源多肽的浓度为至少0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或1μg多肽/mL。
在一些方面，多个PMP中的至少15％的PMP包封外源多肽。在一些方面，多个PMP中的至少50％的PMP包封外源多肽。在一些方面，多个PMP中的至少95％的PMP包封外源多肽。
在一些方面，组合物被配制用于施用于哺乳动物。在一些方面，组合物被配制用于施用于哺乳动物细胞。
在一些方面，组合物进一步包含药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
在一些方面，组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些方面，PMP在4℃下稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。在一些方面，PMP进一步在至少20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
在另一方面，本披露的特征在于一种包含多个PMP的组合物，其中这些PMP中的每个是植物EV、或其节段或提取物，其中该多个PMP中的每个包封外源多肽，其中该外源多肽是哺乳动物治疗剂，该外源多肽不是病原体防治剂，并且该组合物被配制用于递送至动物。
在另一方面，本披露的特征在于药物组合物，该药物组合物包含如以上方面中的任一项所述的组合物和药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
在另一方面，本披露的特征在于一种产生包含外源多肽的PMP的方法，其中该外源多肽是哺乳动物治疗剂，并且其中该外源多肽不是病原体防治剂，该方法包括(a)提供包含该外源多肽的溶液；以及(b)使该PMP负载该外源多肽，其中该负载导致该外源多肽被该PMP包封。
在一些方面，外源多肽可溶于该溶液中。
在一些方面，负载包含超声处理、电穿孔和脂质挤出中的一种或多种。在一些方面，负载包含超声处理和脂质挤出。在一些方面，负载包含脂质挤出。在一些方面，在脂质挤出前分离PMP脂质。在一些方面，分离的PMP脂质包含糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)。
在另一方面，本披露的特征在于一种用于将多肽递送至哺乳动物细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含一种或多种外源多肽的PMP，其中该一种或多种外源多肽是哺乳动物治疗剂并且被PMP包封，并且其中这些外源多肽不是病原体防治剂；以及(b)使该细胞与该PMP接触，其中以足以允许由该细胞摄取该PMP的量和时间进行接触。在一些方面，细胞是受试者中的细胞。
在另一方面，本披露的特征在于如以上方面中任一项所述的PMP、组合物、药物组合物或方法，其中哺乳动物是人。
在另一方面，本披露的特征在于一种用于治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含多个PMP的组合物，其中一种或多种外源多肽被该PMP包封。在一些方面，多个PMP的施用降低了受试者的血糖。在一些方面，外源多肽是胰岛素。
在另一方面，本披露的特征在于如以上方面中任一项所述的PMP、组合物、药物组合物或方法，其中该PMP不会被胃液显著降解，例如不会被空腹胃液显著降解。
在另外的方面，本披露的特征在于一种包含一种或多种外源多肽的植物信使包(PMP)，其中该一种或多种外源多肽被PMP包封。
在一些方面，外源多肽是治疗剂。在一些方面，治疗剂是胰岛素。
在一些方面，外源多肽是酶。在一些方面，酶是重组酶或编辑酶。
在一些方面，外源肽是病原体防治剂。
在一些方面，在与PMP接触的靶细胞中，外源多肽从该PMP中释放。在一些方面，外源多肽在靶细胞的细胞质中发挥活性。在一些方面，外源多肽被易位至靶细胞的细胞核。在一些方面，外源多肽在靶细胞的细胞核中发挥活性。
在一些方面，相对于未被PMP包封的该外源多肽的摄取，细胞对被该PMP包封的该外源多肽的摄取增加。
在一些方面，相对于未被PMP包封的该外源多肽的有效性，被该PMP包封的该外源多肽的有效性增加。
在一些方面，外源多肽包含至少50个氨基酸残基。在一些方面，外源多肽的尺寸是至少5kD。
在一些方面，外源多肽包含少于50个氨基酸残基。
在一些方面，PMP包含纯化的植物细胞外囊泡(EV)或其节段或提取物。在一些方面，EV或其节段或提取物获得自柑橘属果实。在一些方面，柑橘属果实是葡萄柚或柠檬。
在另一方面，本披露的特征在于包含多个如以上方面中任一项所述的PMP的组合物。
在一些方面，组合物中的PMP的浓度有效增加生物体的适应度。在一些方面，组合物中的PMP的浓度有效降低生物体的适应度。
在一些方面，外源多肽的浓度为至少0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或1μg多肽/mL。
在一些方面，多个PMP中的至少15％的PMP包封外源多肽。在一些方面，多个PMP中的至少50％的PMP包封外源多肽。在一些方面，多个PMP中的至少95％的PMP包封外源多肽。
在一些方面，组合物被配制用于施用于动物。在一些方面，组合物被配制用于施用于动物细胞。在一些方面，组合物进一步包含药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
在一些方面，组合物被配制用于施用于植物。在一些方面，组合物被配制用于施用于细菌。在一些方面，组合物被配制用于施用于真菌。
在一些方面，组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些方面，PMP在4℃下稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。在一些方面，PMP进一步在至少20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
在另一方面，本披露的特征在于包含多个PMP的组合物，其中这些PMP中的每个是植物EV、或其节段或提取物，其中该多个PMP中的每个包封外源多肽，并且其中该组合物被配制用于递送至动物。
在另一方面，本披露的特征在于药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1所述的组合物和药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
在另一方面，本披露的特征在于产生包含外源多肽的PMP的方法，该方法包括(a)提供包含该外源多肽的溶液；以及(b)使该PMP负载该外源多肽，其中该负载导致该外源多肽被该PMP包封。
在一些方面，外源多肽可溶于该溶液中。
在一些方面，负载包含超声处理、电穿孔和脂质挤出中的一种或多种。在一些方面，负载包含超声处理和脂质挤出。
在一些方面，负载包含脂质挤出。在一些方面，在脂质挤出前分离PMP脂质。在一些方面，分离的PMP脂质包含糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)。
在另一方面，本披露的特征在于一种用于将多肽递送至细胞的方法，该方法包括(a)提供包含一种或多种外源多肽的PMP，其中该一种或多种外源多肽被PMP包封；以及(b)使该细胞与该PMP接触，其中以足以允许由该细胞摄取该PMP的量和时间进行接触。
在一些方面，细胞是动物细胞。在一些方面，细胞是受试者中的细胞。
在另一方面，本披露的特征在于一种用于治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含多个PMP的组合物，其中一种或多种外源多肽被该PMP包封。在一些方面，多个PMP的施用降低了受试者的血糖。在一些方面，外源多肽是胰岛素。
附图说明
图1A是散点图和条形图，其示出了过滤器灭菌后组合的含PMP的尺寸排阻色谱法(SEC)级分中的PMP最终浓度(PMP/mL)和PMP尺寸(以nm计)。
图1B是曲线图，其示出了如使用二辛可宁酸测定(BCA测定)测量的来自SEC的单个洗脱级分中的PMP蛋白浓度(以μg/mL计)。PMP洗脱在级分4-6中。
图2A是示意图，其示出了具有负载有Cre重组酶的植物信使包(PMP)的Cre报告系统的用途。包含Cre报告转基因的人胚胎肾293细胞(HEK293细胞)在不存在Cre蛋白(未重组的报告+细胞)的情况下表达GFP，并且在存在Cre蛋白(重组的报告+细胞)的情况下表达RFP。将Cre蛋白以PMP(+Cre-PMP)递送至细胞。
图2B是一组显微照片，其示出了用Cre重组酶(Cre)和葡萄柚(GF)PMP(未电穿孔)；仅GFP PMP；仅CRE；或负载Cre的葡萄柚PMP处理的HEK293细胞中荧光蛋白的表达。顶行显示GFP的荧光。中间行显示RFP的荧光。RFP仅在接受了负载Cre的GF PMP的细胞中表达。底行显示GFP荧光信号和RFP荧光信号和明场通道的叠加。
图3是示意图，其示出了通过口服递送提供的负载的PMP的稳定性测定。(i)示出了负载人胰岛素多肽并包含共价膜染料DL800 IR或Alexa488的PMP。(ii)示出了暴露于胃肠(GI)液模拟物的PMP和胰岛素的体外稳定性测定。(iii)示出了通过对链脲霉素诱导的糖尿病模型小鼠进行口服递送(PMP灌胃)提供的PMP和胰岛素的体内稳定性测定。测量血糖水平、血液人胰岛素水平、免疫谱和DL800标记的PMP的生物分布。
图4是示意图，其示出了针对通过PMP体内递送Cre重组酶至具有荧光素酶Cre报告构建体(Lox-STOP-Lox-LUC)的小鼠的测定。当将Cre重组酶递送至细胞或组织时，发生重组并表达荧光素酶。通过评估小鼠组织中的荧光素酶表达来测量PMP对Cre重组酶的生物分布。
图5A是示意图，其示出了使用破坏性榨汁步骤(涉及使用共混器)、随后超速离心和蔗糖梯度纯化进行葡萄柚PMP生产的方案。图像包括在以1000x g离心10min后的葡萄柚汁以及在以150,000x g超速离心2小时后的蔗糖梯度条带图案。
图5B是由Spectradyne NCS1测量的PMP颗粒分布的图。
图6是示意图，其示出了使用温和榨汁步骤(涉及使用网过滤器)、然后超速离心和蔗糖梯度纯化进行葡萄柚PMP生产的方案。图像包括在以1000x g离心10min后的葡萄柚汁以及在以150,000x g超速离心2小时后的蔗糖梯度条带图案。
图7A是示意图，其示出了使用超速离心、然后尺寸排阻色谱法(SEC)分离含有PMP的级分来进行葡萄柚PMP生产的方案。分析洗脱的SEC级分的颗粒浓度(NanoFCM)、中值粒度(NanoFCM)和蛋白质浓度(BCA)。
图7B是曲线图，其示出了颗粒浓度/mL洗脱的尺寸排阻色谱法(SEC)级分(NanoFCM)。含有大部分PMP的级分(“PMP级分”)用箭头指示。PMP洗脱在级分2-4中。
图7C是一组曲线图和表，其示出了如使用NanoFCM测量的所选SEC级分的以nm计粒度。这些曲线图示出了级分1、3、5和8中的PMP尺寸分布。
图7D是曲线图，其示出了如使用BCA测定测量的SEC级分中的以μg/mL计的蛋白质浓度。含有大部分PMP的级分(“PMP级分”)被标记，并且箭头指示含有污染物的级分。
图8A是示意图，其示出了用于从使用榨汁机得到1升葡萄柚汁(约7个葡萄柚)、随后差速离心以除去大碎片、使用TFF对汁进行100x浓缩、以及尺寸排阻色谱法(SEC)分离含有PMP的级分的规模化PMP生产。分析SEC洗脱级分的颗粒浓度(NanoFCM)、中值粒度(NanoFCM)和蛋白质浓度(BCA)。
图8B是一对曲线图，其示出了来自1000ml葡萄柚汁的规模化起始材料的SEC洗脱物体积(ml)的蛋白质浓度(BCA测定，上图)和颗粒浓度(NanoFCM，下图)，示出了晚期SEC洗脱体积中高量的污染物。
图8C是曲线图，其示出了孵育最终浓度为50mM EDTA(pH 7.15)的粗葡萄柚PMP级分、然后使用300kDa膜进行过夜透析成功除去了晚期SEC洗脱级分中存在的污染物，如通过在280nm下的吸光度所示。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
图8D是曲线图，其示出了孵育最终浓度为50mM EDTA(pH 7.15)的粗葡萄柚PMP级分、然后使用300kDa膜进行过夜透析成功除去了在SEC后晚期洗脱级分中存在的污染物，如通过BCA蛋白质分析所示，该BCA蛋白质分析除了检测蛋白质外，还对糖和果胶的存在敏感。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
图9A是曲线图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的洗脱的BMS植物细胞培养物SEC级分中的颗粒浓度(颗粒/ml)。PMP洗脱在SEC级分4-6中。
图9B是曲线图，其示出了在
Figure BDA0003372619390000081
分光光度计上测量的洗脱的BMS SEC级分中的在280nm处的吸光度(A.U.)。PMP洗脱在级分4-6中；级分9-13含有污染物。
图9C是曲线图，其示出了如通过BCA分析确定的洗脱的BMS SEC级分中的蛋白质浓度(μg/ml)。PMP洗脱在级分4-6中；级分9-13含有污染物。
图9D是散点图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的合并的含有BMSPMP的SEC级分中的颗粒。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)。
图9E是曲线图，其示出了图6D的门控颗粒的BMS PMP的尺寸分布(nm)(减去背景)。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸(nm)。
图10是曲线图，其示出了在重复样品中用超纯水(阴性对照)、3ng游离荧光素酶蛋白(仅蛋白质的对照)或用3ng有效荧光素酶蛋白剂量的负载荧光素酶蛋白的PMP(PMP-Luc)在室温下处理2h的铜绿假单胞菌细菌的发光(R.L.U.，相对发光单位)。使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))通过发光测量并且在
Figure BDA0003372619390000082
分光光度计上测量上清液和沉淀细菌中的荧光素酶蛋白。
图11A是蛋白质印迹，其示出了负载胰岛素的重构PMP(recPMP)(已用1％TritonTMX-100溶液(Triton；Tx)、蛋白酶K(ProtK)溶液、Tx溶液随后ProtK溶液或ProtK溶液随后Tx溶液处理)的胰岛素蛋白。还示出了未处理的对照。
图11B是蛋白质印迹，其示出了在模拟胃肠液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照中在37℃下孵育后，来自柠檬PMP脂质的负载胰岛素的recPMP的胰岛素蛋白。PBS，pH 7.4，空腹胃液(胃禁食)，pH 1.6，孵育1小时；空腹肠液(肠禁食)，pH 6.4，孵育4小时；进食肠液(肠进食)，pH 5.8，孵育4小时。
具体实施方式
I.定义
如本文所用的，术语“包封”或“包封的”是指将部分(例如，如本文定义的外源多肽)封装在封闭的脂质膜结构(例如，脂质双层)内。脂质膜结构可以是例如，植物信使包(PMP)或植物细胞外囊泡(EV)，或者可以获得自或衍生自植物EV。包封的部分(例如，包封的外源多肽)由脂质膜结构封闭，例如，这样的包封的部分位于封闭的脂质膜结构的内腔(例如，PMP的内腔)中。在一些情况下，包封的部分(例如，包封的多肽)可以与脂质膜结构的内表面相互作用或缔合。在一些情况下，可以将外源多肽插入脂质膜结构。在一些情况下，外源多肽具有腔外部分。
如本文所用的，术语“外源多肽”是指被PMP(例如，衍生自植物细胞外囊泡的PMP)包封的多肽(如本文所定义)，该多肽不天然存在于植物脂质囊泡(例如，不天然存在于植物细胞外囊泡中)中或以在天然存在的植物细胞外囊泡中未发现的量包封在PMP中。在一些情况下，外源多肽可以天然存在于衍生出PMP的植物中。在其他情况下，外源多肽不天然存在于衍生出PMP的植物中。外源多肽可以在衍生出PMP的植物中人工表达，例如可以是异源多肽。外源多肽可以衍生自另一种生物体。在一些方面，例如使用超声处理、电穿孔、脂质提取和脂质挤出中的一种或多种将外源多肽负载到PMP中。外源多肽可以是，例如，治疗剂、酶(例如，重组酶或编辑酶)或病原体防治剂。
如本文所用的，“递送”或“接触”是指向生物体(例如动物、植物、真菌或细菌)提供或应用PMP组合物(例如，包含外源蛋白或肽的PMP组合物)。向动物递送可以是例如口服递送(例如，通过饲喂或通过灌胃递送)或全身递送(例如，通过注射递送)。可以将PMP组合物递送至消化道，例如胃、小肠或大肠。PMP组合物在消化道中可以是稳定的。
如本文所用的，术语“动物”是指人、牲畜、农场动物、无脊椎动物(例如，昆虫)或哺乳动物类兽医动物(例如，包括例如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊、鸡、和非人灵长类动物)。
如本文所用的，“降低病原体的适应度”是指作为施用本文所述的PMP组合物的结果，对病原体生理学的任何破坏，包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用：(1)使病原体的群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使病原体的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使病原体的移动性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使病原体的体重或质量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使病原体的代谢速率或活动降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(6)使病原体的病原体传播(例如，病原体从一只昆虫到另一只昆虫的垂直或水平传播)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。可以例如与未处理的病原体相比确定病原体适应度的降低。
如本文所用，“降低媒介的适应度”是指作为施用本文描述的媒介防治组合物的结果，对所述媒介的生理学或其进行的任何活动的任何破坏，包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用：(1)使媒介群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)的移动性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)的体重降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)的代谢速率或活动增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使由媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)导致的媒介-媒介病原体传播(例如，媒介从一只昆虫到另一只昆虫的垂直或水平传播)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使媒介-动物病原体传播降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)寿限降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、虱子)对杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂)的易感性增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(10)使媒介(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的媒介效能降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。可以例如与未处理的媒介相比确定媒介适应度的降低。
如本文所用，术语“被配制用于递送至动物”是指包含药学上可接受的载体的PMP组合物。
如本文所用，术语“被配制用于递送至病原体”是指包含药学上可接受的或农业上可接受的载体的PMP组合物。
如本文所用，术语“被配制用于递送至媒介”是指包含农业上可接受的载体的PMP组合物。
如本文所用，术语“感染”是指病原体在动物中(例如，在动物的一个或多个部分中)、在动物上(例如，在动物的一个或多个部分上)、或在动物周围的生境中的存在或定殖，特别是在感染例如通过引起疾病、疾病症状、或免疫(例如，炎症)应答降低动物的适应度的情况下。
如本文所用，术语“病原体”是指通过以下方式引起动物的疾病或疾病症状的生物体，诸如微生物或无脊椎动物：例如(i)直接感染动物，(ii)产生引起动物的疾病或疾病症状的因子(例如，产生病原体毒素等的细菌)，和/或(iii)引发动物的免疫(例如，炎症反应)(例如，咬昆虫(biting insect)，例如臭虫)。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生生物、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒、或其任何组合，其中每种病原体能够(自身或与另一种病原体共同)引发人类的疾病或症状。
如本文所用的，术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或超过1000个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与多肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然多肽、合成的或重组的多肽、杂交分子、类肽或模拟肽。多肽的尺寸可以是，例如，至少0.1、至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50或超过50kD。多肽可以是全长蛋白质。可替代地，多肽可以包含蛋白质的一个或多个结构域。
如本文所用的，术语“抗体”涵盖能特异性结合抗原的免疫球蛋白(无论是天然的还是部分或全部经合成产生的)及其片段。该术语还包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。这些蛋白质可以衍生自天然来源，或部分或全部经合成产生。“抗体”进一步包括多肽，该多肽包含来自特异性结合并识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的构架区。术语“抗体”的使用是指包括全抗体、多克隆、单克隆和重组抗体、其片段，并且进一步包括单链抗体(纳米抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的、小鼠-人，小鼠-灵长类，灵长类-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，例如像，scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双抗体和抗体相关多肽。“抗体”进一步包括双特异性抗体和多特异性抗体。
如本文所用的，术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白的片段，和多肽(包括具有与抗原特异性结合的能力的抗原结合区)的任何部分。例如，抗原结合片段可以是F(ab′)2片段、Fab′片段、Fab片段、Fv片段、或scFv片段，但不限于此。Fab片段具有一个抗原结合位点并且含有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区CH1。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于Fab′片段另外地包括重链的铰链区(包括在重链CH1区的C末端处至少一个半胱氨酸残基)。F(ab′)2片段由Fab′片段的半胱氨酸残基通过铰链区的二硫键连接来产生。Fv片段是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生Fv片段的重组技术是本领域众所周知的。双链Fv片段可以具有其中重链可变区通过非共价键连接至轻链可变区的结构。单链Fv(scFv)片段通常可以具有与双链Fv片段中一样的二聚体结构，其中重链可变区经由肽接头与轻链可变区共价结合或重链和轻链可变区在其C末端彼此直接连接。抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，将全抗体用木瓜蛋白酶消化以获得Fab片段，并且用胃蛋白酶消化以获得F(ab′)2片段)，并且可以通过基因重组技术制备。dAb片段由VH结构域组成。
单链抗体分子可以包含具有多个单分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。
如本文所用的，术语“异源的”是指(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如，使用本文所述的负载方法添加至PMP的药剂)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)的浓度存在于PMP中(例如，使用本文所述的负载方法、遗传工程、以及体外或体内方法添加PMP)的药剂(例如，多肽)。
如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410)确定。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
如本文所用的，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、芽、叶、花粉、种子、果实、收获的生产、肿瘤组织、以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。此外，可以将植物基因工程化以产生异源蛋白或RNA。
如本文所用的，术语“植物细胞外囊泡”、“植物EV”、或“EV”是指植物中天然存在的封闭的脂质双层结构。任选地，植物EV包含一种或多种植物EV标记物。如本文所用，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合，包括但不限于附录中列出的任何植物EV标记物。在一些情况下，该植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，但不是杀有害生物剂。在一些情况下，该植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，而且还是杀有害生物剂(例如，与多个PMP缔合或被其包封的、或不直接与多个PMP缔合或被其包封的)。
如本文所用，术语“植物信使包”或“PMP”是指直径为约5-2000nm(例如，至少5-1000nm、至少5-500nm、至少400-500nm、至少25-250nm、至少50-150nm、或至少70-120nm)的脂质结构(例如，脂质双层，单层、多层结构；例如，囊泡状脂质结构)，该脂质结构源自(例如，富集、分离或纯化自)植物源或其节段、部分或提取物，包括与其缔合的脂质或非脂质组分(例如，肽、核酸、或小分子)，并且已从植物、植物部分或植物细胞中富集、分离或纯化，该富集或分离从源植物中除去一种或多种污染物或不希望的组分。PMP可以是天然存在的EV的高度纯化制剂。优选地，除去至少1％的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如，至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％)来自源植物的一种或多种污染物或不希望的组分，例如植物细胞壁组分；果胶；植物细胞器(例如，线粒体；质体，诸如叶绿体、白色体或淀粉质体；和核)；植物染色质(例如，植物染色体)；或植物分子聚集体(例如，蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、或脂质-蛋白质结构)。优选地，PMP是相对于来自源植物的该一种或多种污染物或不希望的组分至少30％纯的(例如，至少40％纯的、至少50％纯的、至少60％纯的、至少70％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、至少99％纯的、或100％纯的)，如通过重量(w/w)、光谱成像(透射率％)、或电导率(S/m)测量。
在一些情况下，PMP是脂质提取的PMP(LPMP)。如本文所用，术语“脂质提取的PMP”和“LPMP”是指源自脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡状脂质结构)的PMP，该脂质结构源自(例如，富集、分离或纯化自)植物源，其中该脂质结构在液相(例如，含有货物的液相)中被破坏(例如，通过脂质提取破坏)和重新组合或重构(使用标准方法，例如通过包括脂质膜水合和/或溶剂注射的方法重构)，以产生LPMP，如本文描述。如果期望，所述方法可以进一步包括超声处理、冷冻/融化处理和/或脂质挤出，例如以减小重构的PMP的尺寸。PMP(例如，LPMP)可包含10％至100％之间的衍生自植物来源的脂质结构的脂质，例如可包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的衍生自植物来源的脂质结构的脂质。PMP(例如，LPMP)可包含来自植物来源的脂质结构中存在的全部或部分脂质种类，例如，其可包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的来自植物来源的脂质结构中存在的脂质种类。PMP(例如LPMP)可包含来自植物来源的脂质结构中存在的蛋白质种类中的无、部分或全部，例如可包含来自植物来源的脂质结构中存在的蛋白质种类的0％、小于1％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于60％、小于70％、小于80％、小于90％、小于100％或100％。在一些情况下，PMP(例如LPMP)的脂质双层不包含蛋白质。在一些情况下，相对于来自植物来源的脂质结构，PMP的脂质结构(例如，LPMP)含有减少量的蛋白质。
PMP(例如LPMP)可以任选地包括外源脂质，例如以下脂质，其(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如，使用本文描述的方法添加PMP)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)的浓度存在于PMP中(例如，使用本文描述的方法、遗传工程、体外或体内方法添加PMP)的药剂(例如，杀有害生物剂)。PMP的脂质组合物可包括0％、小于1％或至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％外源脂质。示例性外源脂质包括阳离子脂质、可电离脂质、两性离子脂质和类脂质。
PMP可以任选地包括另外的药剂，诸如多肽、治疗剂、多核苷酸或小分子。PMP可以以多种方式携带另外的药剂(例如多肽)或与其缔合，以使该药剂能够递送至靶植物，例如通过包封该药剂、将该药剂掺入在脂质双层结构中、或将该药剂(例如，通过缀合)与脂质双层结构的表面缔合。异源功能剂可以体内(例如，在植物体内)或体外(例如，在组织培养物中、在细胞培养物中、或合成地掺入)掺入PMP中。
如本文所用的，术语“纯的”是指PMP制剂，其中相对于从植物或其部分分离的初始样品，已除去至少一部分(例如，至少20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％)植物细胞壁组分、植物细胞器(例如线粒体、叶绿体和核)或植物分子聚集体(蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体或脂质-蛋白质结构)。
如本文所用，术语“驱避剂”是指阻止病原体媒介(例如，昆虫，例如蚊子、蜱、螨、或虱子)接近或保留在动物上的药剂、组合物或其中的物质。驱避剂可以例如降低动物上或附近的病原体媒介的数量，但不一定杀死或降低该病原体媒介的适应度。
如本文所用的，术语“处理”是指为了预防和/或治疗目的而向动物或植物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患有疾病或病症但易患特定疾病或病症或其他方面处于特定疾病或病症风险中的动物或植物进行预防性治疗。“处理感染”是指向已经患有疾病的动物或植物施用处理剂以改善或稳定动物的病症。
如本文所用的，术语“处理感染”是指向已经患有疾病的个体(例如，植物或动物)施用处理剂以改善或稳定该个体的病症。这可以涉及使一种或多种病原体在动物或植物中、上或周围的病原体定殖相对于起始量减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)和/或允许个体受益(例如，以足以消释症状的量减少定殖)。在此类情况下，处理的感染可表现为症状的减轻(例如，减轻约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。在一些情况下，处理的感染可以有效增加个体存活的可能性(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)或增加群体的总体存活(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指感染的减少量足以可持续地消释动物或植物的症状(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。
如本文所用的，术语“预防感染”是指以足以维持初始病原体群体(例如，近似地在健康个体中发现的量)、预防感染开始和/或预防与感染相关的症状或病症的量预防一种或多种病原体在动物或植物中、上或周围的定殖增加(例如，相对于未处理的动物或植物，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或多于100％)。例如，在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备手术，诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁的静脉内导管插入、或接受在重症监护病房(intensive care unit)中的处理)时、在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、HIV/AIDS、或正在服用免疫抑制剂的个体)中、或在经受长期抗生素疗法的个体中，个体(例如，动物，例如，人)可以接受预防性治疗以预防真菌感染。
如本文所用的，术语“稳定的PMP组合物”(例如，包含负载或未负载的PMP的组合物)是指在一定时间段(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、或至少90天)内任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP组合物中PMP的数量(例如，在生产或配制时)保留初始PMP数量(例如，PMP/mL溶液)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)的PMP组合物；或任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP的初始活性(例如，在生产或配制时)保留其活性的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)。
在一些方面，稳定的PMP继续包封或保持与已负载到PMP的外源多肽缔合，例如，继续包封或保持与外源多肽缔合至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、至少90天、或90或更多天。
如本文所用，术语“媒介”是指可以将动物病原体从贮存器(reservoir)携带或传播给动物的昆虫。示例性媒介包括昆虫，诸如具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂(wasp)、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚁，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员。
如本文所用，术语“汁囊”或“汁囊泡”是指柠檬果(例如，柑橘果实)的内果皮(心皮)的含有汁的膜结合组分。在一些方面，将汁囊与果实的其他部分(例如，皮(外果皮或黄皮(flavedo))、内皮(中果皮、白皮(albedo)、或橘络(pith))、中心柱(胎座)、瓣壁、或种子)分离。在一些方面，这些汁囊是葡萄柚、柠檬、酸橙或橙子的汁囊。
II.包含包封的多肽的PMP及其组合物
本发明包括植物信使包(PMP)和包括多个植物信使包(PMP)的组合物。PMP是包含植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)的脂质(例如，脂质双层，单层或多层结构)结构。植物EV是指一种封闭的脂质双层结构，其自然存在于植物中并且直径是约5-2000nm。植物EV可以来源于多种植物生物合成途径。在自然界中，植物EV可以发现于植物的细胞内隔室和细胞外隔室，诸如植物质外体(位于质膜外部并且由连续的细胞壁和细胞外空间形成的隔室)。可替代地，PMP可以是在从植物细胞分泌后在细胞培养基中发现的富集的植物EV。可以通过本文进一步描述的多种方法从植物中(例如，从质外体流体中或从细胞外培养基中)分离出植物EV，从而产生PMP。
本文所述的PMP和PMP组合物包括包含外源多肽(例如本文第III部分所述的外源多肽)的PMP。外源多肽可以是例如，治疗剂、病原体防治剂(例如，具有抗病原体活性(例如，抗细菌活性、抗真菌活性、抗杀线虫活性、抗寄生生物活性或抗病毒活性)的药剂)或酶(例如，重组酶或编辑酶)。
PMP组合物中的多个PMP可以负载外源多肽，使得多个PMP中的至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的PMP包封外源多肽。
PMP可以包括植物EV或其节段、部分或提取物，其中植物EV的直径是约5-2000nm。例如，PMP可以包括具有约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm、或约1750-2000nm的平均直径的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包含平均直径为约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm、或约5-25nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物具有为约50-200nm的平均直径。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物具有为约50-300nm的平均直径。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物具有为约200-500nm的平均直径。在某些情况下，植物EV或其节段、部分或提取物具有为约30-150nm的平均直径。
在一些情况下，PMP可以包括具有至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、或至少1000nm的平均直径的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包括具有小于1000nm、小于950nm、小于900nm、小于850nm、小于800nm、小于750nm、小于700nm、小于650nm、小于600nm、小于550nm、小于500nm、小于450nm、小于400nm、小于350nm、小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、或小于50nm的平均直径的植物EV或其节段、部分或提取物。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量该植物EV或其节段、部分或提取物的粒径。
在一些情况下，PMP可以包括具有77nm2至3.2x 106nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x 104nm2、1x 104-1x 105nm2、1x 105-1x 106nm2、或1x 106-3.2x 106nm2)的平均表面积的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包括具有65nm3至5.3x 108nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x 104nm3、1x 104-1x 105nm3、1x 105-1x106nm3、1x 106-1x 107nm3、1x 107-1x 108nm3、1x 108-5.3x 108nm3)的平均体积的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包括具有至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x 104nm2、至少1x 105nm2、至少1x 106nm2、或至少2x 106nm2)的平均表面积的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包括具有至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x 104nm3、至少1x 105nm3、至少1x106nm3、至少1x 107nm3、至少1x 108nm3、至少2x 108nm3、至少3x 108nm3、至少4x 108nm3、或至少5x 108nm3的平均体积的植物EV或其节段、部分或提取物。
在一些情况下，PMP可以具有与植物EV或其节段、提取物或部分相同的尺寸。可替代地，PMP可以具有与产生PMP的初始植物EV不同的尺寸。例如，PMP的直径可以是约5-2000nm的直径。例如，PMP可以具有约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1200nm、约1200-1400nm、约1400-1600nm、约1600-1800nm、或约1800-2000nm的平均直径。在一些情况下，PMP可以具有至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、至少1000nm、至少1200nm、至少1400nm、至少1600nm、至少1800nm、或约2000nm的平均直径。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量PMP的粒径。在一些情况下，在负载异源功能剂之后或在PMP的其他修饰之后确定PMP的尺寸。
在一些情况下，PMP可以具有77nm2至1.3x 107nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x 104nm2、1x 104-1x 105nm2、1x 105-1x 106nm2、或1x 106-1.3x 107nm2)的平均表面积。在一些情况下，PMP可以具有65nm3至4.2x 109nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x 104nm3、1x 104-1x 105nm3、1x 105-1x 106nm3、1x 106-1x 107nm3、1x 107-1x 108nm3、1x108-1x 109nm3、或1x 109-4.2x109 nm3)的平均体积。在一些情况下，PMP具有至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x 104nm2、至少1x 105nm2、至少1x 106nm2、或至少1x 107nm2)的平均表面积。在一些情况下，PMP具有至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x 104nm3、至少1x 105nm3、至少1x 106nm3、至少1x 107nm3、至少1x 108nm3、至少1x 109nm3、至少2x 109nm3、至少3x 109nm3、或至少4x 109nm3)的平均体积。
在一些情况下，PMP可以包括完整的植物EV。可替代地，PMP可以包括植物EV的囊泡的整个表面积的节段、部分或提取物(例如，包括囊泡的整个表面积的小于100％(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于10％、小于5％、或小于1％)的节段、部分或提取物)。该节段、部分或提取物可以是任何形状，诸如圆周节段、球形节段(例如，半球)、曲线节段、线性节段、或平坦节段。在节段是囊泡的球形节段的情况下，该球形节段可以表示通过将球形囊泡沿一对平行线分裂而产生的球形节段或者通过将球形囊泡沿一对非平行线分裂而产生的球形节段。因此，多个PMP可以包括多个完整的植物EV，多个植物EV节段、部分或提取物，或完整的植物EV和节段的植物EV的混合物。本领域技术人员应当理解，完整的植物EV与节段的植物EV的比率将取决于所使用的特定分离方法。例如，与诸如真空渗透的非破坏性提取方法相比，将植物或其一部分研磨或共混可以产生含有更高百分比的植物EV节段、部分或提取物的PMP。
在其中PMP包括植物EV的节段、部分或提取物的情况下，该EV节段、部分或提取物可以具有小于完整的囊泡的平均表面积的平均表面积，例如小于77nm2、100nm2、1000nm2、1x104nm2、1x 105nm2、1x 106nm2、或3.2x 106nm2的平均表面积)。在一些情况下，该EV节段、部分或提取物具有小于70nm2、60nm2、50nm2、40nm2、30nm2、20nm2、或10nm2)的表面积。在一些情况下，PMP可以包括具有小于完整的囊泡的平均体积的平均体积(例如，小于65nm3、100nm3、1000nm3、1x 104nm3、1x 105nm3、1x 106nm3、1x 107nm3、1x 108nm3、或5.3x 108nm3的平均体积)的植物EV或其节段、部分或提取物。
在其中PMP包括植物EV的提取物的情况下，例如在PMP包括从植物EV中提取(例如，用氯仿)的脂质的情况下，PMP可以包括至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％的从植物EV提取(例如，用氯仿)的脂质。多个中的PMP可以包括植物EV节段和/或植物EV提取的脂质或其混合物。
本文进一步概述了关于生产PMP、可与PMP缔合的植物EV标记物、和用于包括PMP的组合物的配制品的方法的细节。
A.生产方法
可以从植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)中生产PMP，PMP天然存在于植物或其部分(包括植物组织或植物细胞)中。用于生产PMP的示例性方法包括(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；和(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。该方法可以进一步包括另外的步骤(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。每个生产步骤将在下面进一步详细讨论。关于PMP的分离和纯化的示例性方法例如在以下中找到：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17):e2533,2017；Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017；Mu等人,Mol.Nutr.Food Res.[分子营养与食品研究],58,1561-1573,2014,和Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009，将其中每个通过引用并入本文。
例如，可以通过包括以下步骤的方法从植物中分离出多个PMP：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)；以及(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)。
本文提供的PMP可以包括从多种植物中分离的植物EV或其节段、部分或提取物。可以从任何属植物(维管或非维管)中分离出PMP，该任何属植物包括但不限于被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、卷柏、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、藻类(例如，单细胞或多细胞的，例如原始色素体生物)或苔藓植物。在某些情况下，PMP可以从维管植物产生，该维管植物例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物。例如，PMP可以产生自：苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊苣、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦或蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，诸如葡萄、猕猴桃、蛇麻子；水果灌木和悬钩子，诸如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、或小麦。
PMP可以产生自整株植物(例如，整个莲座丛或幼苗)或可替代地产自一种或多种植物部分(例如，叶、种子、根、果实、营养部分、花粉、韧皮汁液、或木质部汁液)。例如，PMP可以产生自芽营养器官/结构(例如，叶、茎、或块茎)、根、花和花器官/结构(例如，花粉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、或胚珠)、种子(包括胚、胚乳、或种皮)、果实(成熟的子房)、汁液(例如，韧皮部或木质部汁液)、植物组织(例如，维管组织、基本组织、肿瘤组织等)、和细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、保卫细胞、卵细胞等)、或其子代。例如，分离步骤可以涉及(a)提供植物或其一部分，其中该植物部分是拟南芥属叶。该植物可以处在任何发育阶段。例如，PMP可以产生自幼苗，例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、或8周龄幼苗(例如，拟南芥属幼苗)。其他示例性PMP可以包括从根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、营养部分(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮汁液(例如，拟南芥属韧皮汁液)、或木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)产生的PMP。在一些方面，PMP产生自柑橘属果实，例如葡萄柚或柠檬。
PMP可以通过多种方法从植物或其一部分产生。允许释放植物的含有EV的质外体级分、或含有包含分泌的EV的PMP的其他细胞外级分(例如，细胞培养基)的任何方法适用于本发明的方法。EV可以通过破坏性(例如，研磨或共混植物或任何植物部分)或非破坏性(洗涤或真空渗透植物或任何植物部分)方法从植物或植物部分中分离。例如，可以将该植物或其一部分真空渗透、研磨、共混或其组合，以从该植物或植物部分中分离EV，从而产生PMP。例如，分离步骤可以涉及(b)从初始样品(例如，植物、植物部分、衍生自植物或植物部分的样品)中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，所述粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；其中分离步骤涉及真空渗入植物(例如用囊泡分离缓冲液)以释放和收集质外体级分。可替代地，分离步骤可以涉及(b)将植物研磨或共混以释放EV，从而产生PMP。
在分离植物EV(从而产生PMP)后，可以将PMP分离或收集到粗PMP级分(例如，质外体级分)中。例如，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差速离心或超速离心)和/或过滤将多个PMP分离到粗PMP级分中，以从大污染物，包括植物组织碎片、植物细胞、或植物细胞的细胞器(例如，核或叶绿体)中分离含有PMP的级分。因此，与来自源植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分将具有降低数量的大污染物，包括，例如，植物组织碎片、植物细胞、或植物细胞的细胞器(例如，核、线粒体或叶绿体)。
可以通过另外的纯化方法进一步纯化该粗PMP级分，以产生多个纯PMP。例如，可以通过超速离心，例如使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)、尺寸排阻、和/或使用除去聚集的组分的其他方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法)，将该粗PMP级分与其他植物组分分离。相对于在较早分离步骤中产生的一个或多个级分、或相对于预先确定的阈值水平(例如，商业释放规格)，所得的纯PMP可以具有降低水平的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如，一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合)。例如，相对于在初始样品中的水平，纯PMP可以具有降低水平(例如，降低约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或降低约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)的植物细胞器或细胞壁组分。在一些情况下，纯PMP基本上不含(例如，具有不可检测水平的)一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合。释放和分离步骤的其他实例可以在实例1中发现。PMP的浓度可以是例如1x 109、5x 109、1x 1010、5x 1010、5x 1010、1x 1011、2x 1011、3x 1011、4x 1011、5x 1011、6x 1011、7x1011、8x 1011、9x 1011、1x 1012、2x 1012、3x 1012、4x 1012、5x 1012、6x 1012、7x 1012、8x1012、9x 1012、1x 1013、或大于1x 1013PMP/mL。
例如，可以从分离的PMP中除去蛋白质聚集体。例如，可以使分离的PMP溶液经受一定范围的pH(例如，如使用pH探针测量)，以沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以通过添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处在指定的pH，就可以将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将分离的PMP溶液絮凝。简而言之，将Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后可以将溶液过滤以除去微粒。可替代地，可以通过增加盐浓度来增溶聚集体。例如，可以将NaCl添加到分离的PMP溶液中，直到其处于例如1mol/L。然后可以将溶液过滤以分离PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。例如，可以将分离的PMP在混合下加热直到溶液达到例如50℃的均匀温度持续5分钟。然后可以将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物可以通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。在一些方面，在外源多肽被PMP包封之前除去蛋白质聚集体。在其他方面，在外源多肽被PMP包封之后除去蛋白质聚集体。
本文所述的任何生产方法可以补充有本领域已知的任何定量或定性方法，以在生产过程的任何步骤中表征或鉴定PMP。可以通过估计PMP产率、PMP浓度、PMP纯度、PMP组成、或PMP尺寸的多种分析方法来表征PMP。可以通过本领域中已知的能够进行PMP的可视化、定量、或定性表征(例如，组成鉴定)的许多方法，诸如显微镜术(例如，透射电子显微镜术)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如，傅立叶变换红外分析)、或质谱法(蛋白质和脂质分析)，来评估PMP。在某些情况下，可以使用方法(例如，质谱法)来鉴定PMP上存在的植物EV标记物，诸如附录中披露的标记物。为了帮助分析和表征PMP级分，可以另外对PMP进行标记或染色。例如，可以将PMP用3,3’-二己基氧杂羰花青碘化物(DIOC6)(荧光亲脂性染料，PKH67(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))；Alexa
Figure BDA0003372619390000261
488(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))、或DyLightTM800(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))染色。在没有复杂形式的纳米颗粒追踪的情况下，这种相对简单的方法定量总膜含量并且可以用于间接测量PMP的浓度(Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17):e2533,2017)。为了更精确的测量以及为了评价PMP的尺寸分布，可以使用纳米颗粒跟踪、纳米流式细胞术或可调电阻式脉冲传感(Tunable Resistive Pulse Sensing)。
在生产过程中，可以任选地制备PMP，使得相对于对照或初始样品中的EV水平，PMP具有增加的浓度(例如，增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或增加约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)。分离的PMP可以占PMP组合物的约0.1％至约100％，诸如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％，约中的任一者。在一些情况下，该组合物包括至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中的任一者的PMP，例如，如通过wt/vol百分比PMP蛋白组成和/或百分比脂质组成(例如，通过测量荧光标记的脂质)测量；参见例如实例3)。在一些情况下，浓缩的药剂用作商业产品，例如最终使用者可以使用稀释的药剂，该稀释的药剂具有显著较低浓度的活性成分。在一些实施例中，将组合物配制成PMP浓缩物配制品，例如超低体积浓缩物配制品。在一些方面，组合物中的PMP的浓度有效增加生物体(例如，植物、动物、昆虫、细菌或真菌)的适应度。在其他方面，组合物中的PMP的浓度有效降低生物体(例如，植物、动物、昆虫、细菌或真菌)的适应度。
如实例1所展示，PMP可以产生自多种植物或其部分(例如，叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、或木质部汁液)。例如，PMP可以从植物的质外体级分，诸如叶的质外体(例如，拟南芥叶的质外体)或种子的质外体(例如，向日葵种子的质外体)释放。其他示例性PMP产生自根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、植物(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮汁液(例如，拟南芥属韧皮汁液)、木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)、或细胞培养物上清液(例如，BY2烟草细胞培养物上清液)。此实例进一步证明了从这些不同的植物来源中生产PMP。
如实例2所展示，可以通过多种方法(例如通过使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)结合超速离心和/或除去聚集的污染物的方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法))生产或纯化PMP。例如，实例2展示了经由实例1中概述的分离步骤获得的PMP的纯化。此外，PMP可以根据实例3中展示的方法来表征。
在一些情况下，可以从植物或其一部分中分离出本发明组合物和方法的PMP，并且不经进一步修饰PMP来使用。在其他情况下，可以在使用之前修饰PMP，如本文进一步概述。
B.植物EV标记物
本发明的组合物和方法的PMP可以具有一系列标记物，这些标记物将PMP鉴定为是从植物EV产生的和/或包括其节段、部分或提取物。如本文所用的，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合并且在植物体内掺入植物EV中或上的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合。植物EV标记物的实例可以在例如以下中发现：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Raimondo等人,Oncotarget.[肿瘤靶标]6(23):19514,2015；Ju等人,Mol.Therapy[分子疗法]21(7):1345-1357,2013；Wang等人,Molecular Therapy[分子疗法]22(3):522-534,2014；和Regente等人,J ofExp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017；将其中每个通过引用并入本文。植物EV标记物的另外实例在附录中列出并且在本文中进一步概述。
植物EV标记物可以包括植物脂质。可以在PMP中发现的植物脂质标记物的实例包括植物固醇、菜油固醇、β-谷固醇、豆固醇、燕麦固醇(avenasterol)、糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)、糖脂(例如，单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)或二半乳糖基二酰基甘油(DGDG))、或其组合。例如，PMP可以包括GIPC，GIPC表示植物中的主要鞘脂并且是植物中最丰富的膜脂质之一。其他植物EV标记物可以包括响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而在植物中积累的脂质，诸如磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI4P)。
可替代地，植物EV标记物可以包括植物蛋白。在一些情况下，蛋白质植物EV标记物可以是植物天然产生的抗微生物蛋白，包括植物响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而分泌的防御蛋白。植物病原体防御蛋白包括可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子缔合蛋白受体蛋白(SNARE)的蛋白质(例如，突触融合蛋白-121(SYP121；GenBank登录号：NP_187788.1或NP_974288.1)、渗透(Penetration)1(PEN1；GenBank登录号：NP_567462.1))或ABC转运蛋白渗透3(PEN3；GenBank登录号：NP_191283.2)。植物EV标记物的其他实例包括促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质，包括韧皮部蛋白(例如，韧皮部蛋白2-A1(PP2-A1)，GenBank登录号：NP_193719.1)、钙依赖性脂质结合蛋白、或凝集素(例如，木菠萝相关凝集素，例如向日葵(Helianthus annuus)木菠萝(Helja；GenBank：AHZ86978.1)。例如，RNA结合蛋白可以是富含甘氨酸的RNA结合蛋白-7(GRP7；GenBank登录号：NP_179760.1)。另外，在一些情况下，调节胞间连丝功能的蛋白质可以在植物EV(包括蛋白质，诸如Synap-Totgamin AA(GenBank登录号：NP_565495.1))中发现。在一些情况下，植物EV标记物可以包括参与脂质代谢的蛋白质，诸如磷脂酶C或磷脂酶D。在一些情况下，植物蛋白EV标记物是植物中的细胞运输蛋白。在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，该蛋白质标记物可以缺少典型地与分泌的蛋白质相关的信号肽。非常规的分泌蛋白似乎共有若干个共同特征，如(i)缺少前导序列，(ii)缺少对ER或高尔基体具有特异性的PTM，和/或(iii)不受布雷菲德菌素A影响的分泌，布雷菲德菌素A阻断经典的ER/高尔基体依赖性分泌途径。本领域技术人员可以使用公众可免费获取的多种工具(例如，SecretomeP数据库；SUBA3(拟南芥属蛋白的亚细胞定位数据库(SUBcellular localization database forArabidopsis proteins)))来评估信号序列的蛋白质或其缺少。
在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，该蛋白质可以具有与植物EV标记物(诸如附录中列出的任一种植物EV标记物)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，该蛋白质可以具有与来自拟南芥的PEN1(GenBank登录号：NP_567462.1)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括在植物中编码的核酸，例如植物RNA、植物DNA、或植物PNA。例如，PMP可以包括由植物编码的dsRNA、mRNA、病毒RNA、微RNA(miRNA)、或小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下，核酸可以是与促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质相关的核酸，如本文所讨论。在一些情况下，核酸植物EV标记物可以是参与宿主诱导的基因沉默(HIGS)的核酸植物EV标记物，HIGS是植物沉默植物有害生物(例如，病原体，诸如真菌)的外来转录物的过程。例如，核酸可以是使细菌基因或真菌基因沉默的核酸。在一些情况下，核酸可以是微RNA，诸如miR159或miR166，该微RNA靶向真菌病原体(例如，大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae))中的基因。在一些情况下，蛋白质可以是参与携带植物防御化合物的蛋白质，诸如参与芥子油苷(GSL)转运和代谢的蛋白质，包括芥子油苷转运蛋白-1-1(GTR1；GenBank登录号：NP_566896.2)、芥子油苷转运蛋白-2(GTR2；NP_201074.1)、或环硫特异性(Epithiospecific)修饰子1(ESM1；NP_188037.1)。
在植物EV标记物是核酸的情况下，核酸可以具有与植物EV标记物具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，例如诸如编码附录中列出的植物EV标记物的那些。例如，核酸可以具有与miR159或miR166具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的多核苷酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括由植物产生的化合物。例如，化合物可以是反应于非生物胁迫原或生物胁迫原而产生的防御化合物，诸如次生代谢物。在PMP中发现的一种此类次生代谢物是芥子油苷(GSL)，GSL是主要在十字花科(Brassicaceae)植物中发现的含有氮和硫的次生代谢物。其他次生代谢物可以包括化感物质。
在一些情况下，基于典型地不是由植物产生的但通常与其他生物体相关的(例如，动物EV、细菌EV、或真菌EV的标记物)某些标记物(例如，脂质、多肽、或多核苷酸)的缺少，PMP也可以被鉴定为是从植物EV产生的。例如，在一些情况下，PMP缺少典型地在动物EV、细菌EV或真菌EV中发现的脂质。在一些情况下，PMP缺少作为动物EV的典型特征的脂质(例如，鞘磷脂)。在一些情况下，PMP不含作为细菌EV或细菌膜的典型特征的脂质(例如，LPS)。在一些情况下，PMP缺少作为真菌膜的典型特征的脂质(例如，麦角固醇)。
可以使用本领域已知的能够鉴定小分子(例如，质谱法、质谱法)、脂质(例如，质谱法、质谱法)、蛋白质(例如，质谱法、免疫印迹法)、或核酸(例如，PCR分析)的任何方法来鉴定植物EV标记物。在一些情况下，本文所述的PMP组合物包括可检测量(例如，预定阈值量)的本文所述的植物EV标记物。
C.药物配制品
本文包括PMP组合物，这些PMP组合物可以配制成药物组合物，例如用于施用于动物，如人。可以用药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂将药物组合物施用于动物。根据施用方式和剂量，将本文所述的方法的药物组合物配制成合适的药物组合物以允许容易的递送。根据需要，单剂量可以是单位剂量形式。
PMP组合物可以被配制用于例如口服施用、静脉内施用(例如，注射或输注)、或皮下施用于动物(例如，人)。对于可注射配制品，本领域已知各种有效的药物载剂(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第22版,(2012)和ASHP Handbook on Injectable Drugs[可注射药物的ASHP手册],第18版,(2014))。
本发明组合物中的药学上可接受的载剂和赋形剂在使用的剂量和浓度下对受体无毒。可接受的载体和赋形剂可以包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES、和TAE；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如氯化六甲双铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚、和氯化苯甲烃铵；蛋白质，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖、和免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、和赖氨酸；以及碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、和山梨糖醇。可以根据常规药学实践来配制组合物。配制品中化合物的浓度将取决于许多因素而变化，这些因素包括待施用的活性剂(例如，被PMP包封的外源多肽)的剂量以及施用途径。
为了口服施用于动物，PMP组合物可以以口服配制品的形式制备。口服使用的配制品可以包括片剂、囊片、胶囊、糖浆、或口服液体剂型，其含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的一种或多种活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠)；制粒剂和崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐、或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油、或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。口服使用的配制品也可以提供在单位剂型中，作为可咀嚼片剂、非咀嚼片剂、囊片、胶囊(例如，作为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合；或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合)。本文披露的组合物还可以进一步包含立即释放配制品、延长释放配制品、或延迟释放配制品。
对于肠胃外施用于动物，PMP组合物可以以液体溶液或悬浮液的形式配制，并且通过肠胃外途径(例如，局部、皮下、静脉内、或肌内)施用。药物组合物可以配制用于注射或输注。用于肠胃外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水、或细胞培养基(例如，杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)、α-改良的伊格尔培养基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的，参见例如Gibson(编辑)Pharmaceutical Preformulation and Formulation[药物预配制和配制](第2版)Taylor&Francis Group[泰勒弗朗西斯集团],CRC Press[CRC出版社](2009)。
D.农业配制品
本文包括PMP组合物，这些PMP组合物可以配制成农业组合物，例如用于施用于病原体或病原体媒介(例如，昆虫)。可以用农业上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂将农业组合物施用于病原体或病原体媒介(例如，昆虫)。本文进一步概述了可用于本发明的组合物和方法中的农业配制品的其他实例。
为了允许易于应用、处理、转运、储存和活性，可以将活性剂(在此为PMP)与其他物质一起配制。可以将PMP配制成例如诱饵、浓缩乳液、粉尘剂、可乳化浓缩物、熏剂、凝胶、颗粒剂、微胶囊、种子处理剂、悬浮液浓缩物、悬乳剂、片剂、水溶性液体、水可分散颗粒剂或干燥可流动剂、可湿性粉剂、和超低容量溶液。关于配制品类型的进一步信息，参见“Catalogue of Pesticide Formulation Types and International Coding System[杀有害生物剂配制品类型目录和国际编码系统]”Technical Monograph[技术专论]n°2,第5版,CropLife International[国际作物生命协会](2002)。
活性剂(例如，包含外源多肽的PMP)可以最常以从此类药剂的浓缩制配制品制备的水性悬浮液或乳液的形式应用。此类水溶性、水可悬浮性、或可乳化配制品是固体，通常称为可湿性粉剂或水可分散颗粒剂；或液体，通常称为可乳化浓缩物或水性悬浮液。可压实形成水可分散颗粒剂的可湿性粉剂包含杀有害生物剂、载剂和表面活性剂的紧密混合物。载剂通常选自绿坡缕石(attapulgite)粘土、蒙脱石(montmorillonite)粘土、硅藻土、或纯化硅酸盐。占可湿性粉剂的约0.5％至约10％的有效表面活性剂经发现于磺化木质素、缩合萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、和诸如烷基苯酚的环氧乙烷加合物的非离子表面活性剂。
可乳化浓缩物可以包含合适浓度的溶解于载剂中的PMP(诸如从约50至约500克/升液体)，该载剂是水混溶性溶剂或水不可混溶性有机溶剂和乳化剂的混合物。可用的有机溶剂包括芳族化合物(尤其是二甲苯)和石油馏分(尤其是石油的高沸点萘和烯部分，诸如重芳族石脑油)。也可以使用其他有机溶剂，诸如包括松香衍生物的萜烯溶剂、诸如环己酮的脂族酮、和诸如2-乙氧基乙醇的复杂醇。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
水性悬浮液包含水不溶性杀有害生物剂以按重量计从约5％至约50％的浓度分散在水性载剂中的悬浮液。悬浮液通过以下方式制备：精细研磨杀有害生物剂并且将其剧烈混合到由水和表面活性剂构成的载剂中。还可以添加诸如无机盐和合成胶或天然胶的成分以增加水性载剂的密度和粘度。
PMP也可以以颗粒组合物的形式应用，这些颗粒组合物特别可用于应用于土壤。颗粒组合物通常含有按重量计从约0.5％至约10％的杀有害生物剂，该杀有害生物剂分散于包括粘土或类似物质的载剂中。通常通过将配制品溶解于合适的溶剂中并且将其应用到已预先形成为在从约0.5mm至约3mm的适当粒度的颗粒载体中来制备此类组合物。也可以通过制造载体和化合物的粘团或糊剂并且挤压和干燥以获得所希望的颗粒粒度来配制此类组合物。
通过将呈粉末形式的PMP与合适的粉尘状农业载体(诸如高岭土、研磨的火山岩等)紧密混合来制备含有本发明的PMP配制品的粉尘剂。粉尘剂可以适当地含有从约1％至约10％的小包。它们可以以拌种的形式或以用喷粉机的叶面应用的形式来应用。
同样实用的是以在适当的有机溶剂(通常为石油，诸如广泛用于农业化学的喷淋油)中的溶液的形式应用本发明的配制品。
PMP也可以以气雾剂组合物的形式应用。在此类组合物中，小包溶解或分散于作为产生压力的推进剂混合物的载剂中。将气雾剂组合物包装在通过雾化阀分配混合物的容器中。
另一个实施例是水包油乳液，其中该乳液包含各自具备层状液晶包衣并且分散在水相中的油性小珠，其中每个油性小珠包含至少一种具有农业活性的化合物并且单独地被单层状层或多层状层包覆，该单层状层或多层状层包含：(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂，(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂，和(3)至少一种离子表面活性剂，其中这些小珠具有小于800纳米的平均粒径。在2007年2月1日公开的美国专利公开20070027034中披露了有关该实施例的更多信息。为了易于使用，此实施例将被称为“OIWE”。
另外，通常，当以上披露的分子用于配制品时，此类配制品还可以含有其他组分。这些组分包括但不限于(这是非详尽且非互相排他性列表)润湿剂、铺展剂、粘着剂、渗透剂、缓冲液、螯合剂、减漂剂、相容剂、消泡剂、清洁剂、和乳化剂。接着描述数种组分。
润湿剂是当被添加到液体中时通过减小液体与它在上面铺展的表面之间的界面张力而增加液体的铺展或渗透能力的物质。润湿剂因两个主要功能而用于农业化学配制品：在加工和制造期间，增加粉末在水中润湿的速率以制造可溶性液体的浓缩物或悬浮液浓缩物；以及在将产品与水在喷洒罐中混合期间，减少可湿性粉剂的润湿时间并且改进水到水可分散颗粒剂中的渗透。用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂配制品的润湿剂的实例是：月桂基硫酸钠；磺基琥珀酸二辛酯钠；烷基酚乙氧基化物；和脂族醇乙氧基化物。
分散剂是吸附于颗粒表面上并且有助于保持颗粒的分散状态并且防止其再聚集的物质。将分散剂添加到农业化学配制品中以促进在制造期间的分散和悬浮并且确保颗粒再分散于喷洒罐中的水中。它们广泛用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物、和水可分散颗粒剂。用作分散剂的表面活性剂具有强烈吸附于颗粒表面上并且对颗粒再聚集提供带电荷的壁垒或空间壁垒的能力。最常用的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或两种类型的混合物。对于可湿性粉剂配制品，最常见的分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮液浓缩物，使用聚电解质(诸如萘磺酸钠甲醛缩合物)获得非常好的吸附和稳定。也使用三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯。诸如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物的非离子表面活性剂有时与作为分散剂的阴离子表面活性剂组合用于悬浮液浓缩物。近年来，已开发出新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。它们具有非常长的疏水性“主链”和大量环氧乙烷链，这些环氧乙烷链形成“梳型”表面活性剂的“齿”。这些高分子量聚合物可以赋予悬浮液浓缩物非常好的长期稳定性，因为疏水性主链具有到颗粒表面上的许多锚点。用于农业化学配制品的分散剂的实例是：木质素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯；脂族醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物；和接枝共聚物。
乳化剂是使一种液相的液滴在另一个液相中的悬浮液稳定的物质。在无乳化剂的情况下，可以将两种液体分成两种不可混溶性液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多个环氧乙烷单元的烷基酚或脂族醇和油溶性的十二烷基苯磺酸钙盐。从8至18的亲水亲油平衡(“HLB”)值将通常提供良好的稳定乳液。乳液稳定性有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改进。
增溶剂是将以高于临界胶束浓度的浓度在水中形成胶束的表面活性剂。这些胶束然后能够溶解或增溶胶束的疏水性部分内的水不溶性材料。通常用于增溶的表面活性剂的类型是非离子表面活性剂、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯乙氧基化物、和油酸甲酯。
表面活性剂有时单独使用或与作为用于喷洒罐混合料的辅助剂的其他添加剂(诸如矿物油或植物油)一起使用，以改进杀有害生物剂对于靶标的生物性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于杀有害生物剂的性质和作用方式。然而，它们通常是非离子表面活性剂，诸如：烷基乙氧基化物；线性脂族醇乙氧基化物；脂族胺乙氧基化物。
农业配制品中的载剂或稀释剂是添加到杀有害生物剂中以给出所希望的强度的产品的材料。载剂通常是具有高吸收能力的材料，而稀释剂通常是具有低吸收能力的材料。载剂和稀释剂用于粉尘剂、可湿性粉剂、颗粒剂、和水可分散颗粒剂的配制。
有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、水包油乳液、悬乳剂、和超低容量配制品，并且在较小程度上用于配制颗粒配制品。有时使用溶剂混合物。第一主组的溶剂是脂族石蜡油，诸如煤油或精制石蜡。第二主组(并且最常用的)包括芳族溶剂，诸如二甲苯和较高分子量的C9和C10芳族溶剂馏分。氯化烃可用作助溶剂以便当配制品乳化在水中时防止杀有害生物剂结晶。醇有时用作助溶剂以增加溶解能力。其他溶剂可以包括植物油、种子油、和植物油和种子油的酯。
增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮液浓缩物、乳液和悬乳剂，以改变液体的流变学或流动特性以及防止分散的颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉剂通常分成两个类别，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅来生产悬浮液浓缩物配制品。这些类型的材料的实例包括但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝、和绿坡缕石。水溶性多糖已被用作增稠胶凝剂多年。最常用的多醣类型是种子和海草的天然提取物或是纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包括但不限于瓜尔胶；刺槐豆胶；卡拉胶；藻酸酯；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。其他类型的防沉剂基于改性淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、和聚环氧乙烷。另一种良好的防沉剂是黄原胶。
微生物可以导致配制产品的腐败。因此，使用防腐剂来消除或减小其作用。此类药剂的实例包括但不限于：丙酸及其钠盐；山梨酸及其钠盐或钾盐；苯甲酸及其钠盐；对羟基苯甲酸钠盐；对羟基苯甲酸甲酯；和1,2-苯并噻唑啉-3-酮(BIT)。
表面活性剂的存在通常在生产中和在通过喷洒罐进行的应用中的混合操作期间导致基于水的配制品起泡。为了减少起泡的倾向，通常在生产阶段期间或在填充至瓶中之前添加消泡剂。通常，存在两种类型的消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非硅酮消泡剂是水不溶性油(诸如辛醇和壬醇)或二氧化硅。在两种情况下，消泡剂的功能是使表面活性剂从空气-水界面移位。
“绿色”剂(例如，辅助剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护配制品的整体环境足迹。绿色剂是可生物降解的并且通常衍生自天然和/或可持续源，例如植物源和动物源。具体实例是：植物油、种子油、及其酯，以及烷氧基化烷基聚葡萄糖苷。
在一些情况下，可以将PMP冷冻干燥或冻干。参见美国专利号4,311,712。PMP可以随后在与水或另一种液体接触后重构。可以将其他组分添加到冻干或重构的脂质体中，例如其他抗病原体剂、杀有害生物剂、驱避剂、农业上可接受的载剂、或根据本文所述的配制品的其他材料。
组合物的其他任选特征包括保护PMP组合物免受UV和/或酸性条件的载剂或递送媒介物。在一些情况下，递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH，包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。
可以将组合物另外与将有害生物(诸如病原体媒介(例如，昆虫))吸引到组合物附近的引诱剂(例如，化学引诱剂)一起配制。引诱剂包括信息素(由动物(尤其是有害生物)分泌的化学物)或化学引诱剂，它们影响相同物种的其他个体的行为或发育。其他引诱剂包括糖和蛋白水解产物糖浆、酵母和腐肉。引诱剂还可以与活性成分组合并喷雾到处理区域中的叶子或其他物品上。已知各种引诱剂影响有害生物的行为，如有害生物对食物、产卵或交配地点或配偶的搜寻。可用于本文描述的方法和组合物的引诱剂包括：例如，丁香酚、丙酸苯乙酯、二甲基异丁基环丙烷甲酸乙酯、苯并二噁烷甲酸丙酯、顺式-7,8-环氧-2-甲基十八烷、反式-8,反式-0-十二碳二烯醇、顺式-9-十四烯醛(具有顺式-11-十六烯醛)、反式-11-十四烯醛、顺式-11-十六烯醛、(Z)-11,12-十六碳二烯醛、顺式-7-十二烯基乙酸酯、顺式-8-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十四碳烯基乙酸酯、顺式-11-十四碳烯基乙酸酯、反式-11-十四碳烯基乙酸酯(具有顺式-11)、顺式-9,反式-11-十四碳二烯基乙酸酯(具有顺式-9,反式-12)、顺式-9,反式-12-十四碳二烯基乙酸酯、顺式-7,顺式-11-十六碳双烯乙酸酯(具有顺式-7,反式-11)、顺式-3,顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、反式-3,顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、茴香脑和水杨酸异戊酯。
关于农业配制品的进一步信息，参见D.A.Knowles编辑的“Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations[农业化学配制品的化学和技术]”,版权1998归属于Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社]。还参见A.S.Perry,I.Yamamoto,I.Ishaaya,和R.Perry的“Insecticides in Agriculture and Environment-Retrospects and Prospects[农业杀昆虫剂与环境-回顾与展望]”,版权1998归属于Springer-Verlag[施普林格出版社]。
III.外源多肽
本发明包括植物信使包(PMP)和PMP组合物，其中PMP包封外源多肽。可以将外源多肽封闭在PMP内，例如，位于脂质膜结构内部，例如通过脂质双层的两个小叶与周围材料或溶液分开。在一些方面，包封的外源多肽可以与PMP的内脂质膜相互作用或缔合。在一些方面，包封的外源多肽可以与PMP的外脂质膜相互作用或缔合。在一些情况下，可以将外源多肽插入脂质膜结构。在一些情况下，外源多肽具有腔外部分。在一些情况下，例如使用点击化学将外源多肽缀合至脂质膜结构的外表面。
外源多肽可以是不天然存在于植物EV中的多肽。可替代地，外源多肽可以是天然存在于植物EV中的但以天然存在的植物细胞外囊泡中未发现的量包封在PMP中的多肽。在一些情况下，外源多肽可以天然存在于衍生出PMP的植物中。在其他情况下，外源多肽不天然存在于衍生出PMP的植物中。外源多肽可以在衍生出PMP的植物中人工表达，例如可以是异源多肽。外源多肽可以衍生自另一种生物体。在一些方面，例如使用超声处理、电穿孔、脂质提取和脂质挤出中的一种或多种将外源多肽负载到PMP中。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，多肽可以是其功能片段或变体(例如，其酶活性片段或变体)。例如，多肽可以是本文所述的任一种多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，多肽可以与目的多肽具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
可以在用于本文所述的任一种用途的组合物中配制本文所述的多肽。本文披露的组合物可以包含任何数量或类型(例如，类别)的多肽，诸如至少约1种多肽、2、3、4、5、10、15、20、或更多种多肽中的任一者。组合物中每种多肽的合适的浓度取决于诸如功效、多肽的稳定性、组合物中不同多肽的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。在一些情况下，液体组合物中每种多肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种多肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。
制造多肽的方法在本领域是常规的。通常，参见Smales和James(编辑)，Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentalsand Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。
用于产生多肽的方法涉及在植物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5’或3’侧翼非转录序列；以及5’或3’非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点；以及终止序列。衍生自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达运载体：Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册](第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
不同哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于产生蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：例如，Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian CellCultures for Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白质的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,ProteinPurification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches toformulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。可替代地，多肽可以是化学合成的多肽。
在一些情况下，PMP包括抗体或其抗原结合片段。例如，本文所述的药剂可以是阻断或增强病原体的组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当病原体中多肽(例如，酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对病原体中的靶抗原的抗体的制造和使用是本领域已知的。参见例如Zhiqiang An(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench toClinic[治疗性单克隆抗体，从实验室到临床],第1版,Wiley,2009，以及还有Greenfield(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2013获得制造重组抗体的方法，包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5’-RACE、噬菌体展示、以及诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。
外源多肽可以从靶细胞中的PMP释放。在一些方面，外源多肽在靶细胞的细胞质或靶细胞的细胞核中发挥活性。可以将外源多肽易位至该靶细胞的细胞核。
在一些方面，相对于未被PMP包封的该外源多肽的摄取，细胞对被该PMP包封的该外源多肽的摄取增加。
在一些方面，相对于未被PMP包封的外源多肽的有效性，被该PMP包封的该外源多肽的有效性增加。
A.治疗剂
外源多肽可以是治疗剂，例如用于预防或治疗病症或疾病的药剂。在一些方面，疾病是癌症、自身免疫病或代谢障碍。
在一些实例中，治疗剂是肽(例如，天然存在的肽、重组肽或合成肽)或蛋白质(例如，天然存在的蛋白质、重组蛋白质或合成蛋白质)。在一些实例中，蛋白质是融合蛋白。
在一些实例中，多肽对于生物体(例如哺乳动物)(向其递送PMP)是内源的。在其他实例中，多肽对生物体不是内源的。
在一些实例中，治疗剂是抗体(例如，单克隆抗体，例如，单特异性、双特异性或多特异性单克隆抗体)或其抗原结合片段(例如，scFv、(scFv)2、Fab、Fab′和F(ab′)2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段，或双抗体)、纳米抗体、缀合的抗体或抗体相关多肽。
在一些实例中，治疗剂是抗微生物、抗细菌、抗真菌、抗杀线虫、抗寄生生物或抗病毒的多肽。
在一些实例中，治疗剂是变应原(allergenic)、过敏原或抗原。
在一些实例中，治疗剂是疫苗(例如，结合疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗)。
在一些实例中，治疗剂是酶，例如代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、泛素化蛋白。在一些实例中，酶是重组酶。
在一些实例中，治疗剂是基因编辑蛋白，例如CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指的组分。
在一些实例中，治疗剂是细胞因子、激素、信号传导配体、转录因子、受体、受体拮抗剂、受体激动剂、阻断或中和多肽、核糖蛋白或分子伴侣中的任一种。
在一些实例中，治疗剂是成孔蛋白、细胞穿透肽、细胞穿透肽抑制剂或蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
在一些实例中，治疗剂是适体、血液衍生物、细胞疗法或免疫疗法(例如，细胞免疫疗法)中的任一种。
在一些方面，治疗剂是具有酶活性、调节活性或靶向活性的蛋白质或肽治疗剂，例如具有影响以下中一种或多种的活性的蛋白质或肽：内分泌和生长调节、代谢酶缺陷、造血、止血和血栓形成；胃肠道障碍，肺部障碍；免疫缺陷和/或免疫调节；生育力；衰老(例如，抗衰老活性)；自噬调节；表观遗传调控；肿瘤学；或感染性疾病(例如，抗微生物肽、抗真菌剂或抗病毒剂)。
在一些方面，治疗剂是蛋白质疫苗，例如用于防止有害外来药剂、治疗自身免疫疾病或治疗癌症(例如新抗原)的疫苗。
在一些实例中，多肽是球状的、纤维状的或无序的。
在一些实例中，多肽具有小于1、小于2、小于5、小于10、小于15、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于70、小于80、小于90、或小于100kD的尺寸，例如具有1-50kD(例如，1-10、10-20、20-30、30-40、或40-50kD)或50-100kD(例如，50-60、60-70、70-80、80-90或90-100kD)的尺寸。
在一些实例中，多肽具有正、负或中性的总电荷。可以修饰多肽，使得总电荷改变，例如通过向多肽的N-末端或C-末端添加一个或多个带电荷氨基酸，例如一个或多个(例如，1-10或5-10个)带正电荷或带负电荷的氨基酸，如精氨酸尾(例如，5-10个精氨酸残基)来修饰。
在一些方面，疾病是糖尿病(diabetes)，例如糖尿病(diabetes mellitus)，例如1型糖尿病。在一些方面，通过向患者施用有效量的包含多个PMP的组合物来治疗糖尿病，其中一种或多种外源多肽被PMP包封。在一些方面，多个PMP的施用降低了受试者的血糖。在一些方面，治疗剂是胰岛素。
在一些实例中，治疗剂是表1中所示的抗体、表2中所示的肽、表3中所示的酶或表4中所示的蛋白质。
表1.抗体
Figure BDA0003372619390000421
Figure BDA0003372619390000431
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表2.肽
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表3.酶
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表4.蛋白
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B.酶
外源多肽可以是酶，例如催化生物反应的酶，该生物反应可用于预防或治疗病症或疾病、预防或治疗病原体感染、诊断疾病或诊断疾病或病症。
酶可以是重组酶，例如Cre重组酶。在一些方面，通过PMP将Cre重组酶递送至包含Cre报告构建体的细胞。
酶可以是编辑酶，例如基因编辑酶。在一些方面，基因编辑酶是例如CRISPR-Cas系统(例如，Cas9酶)、TALEN或锌指核酸酶的组分。
C.病原体防治剂
外源多肽可以是病原体防治剂，例如抗细菌、抗真菌、杀虫、杀线虫、抗寄生生物或杀病毒的多肽。在一些情况下，本文所述的PMP或PMP组合物包括靶向病原体中的途径的多肽或其功能片段或衍生物。可以将包括如本文所述的多肽的PMP组合物以一定量和一定时间施用于病原体或其媒介，该量和时间足以：(a)达到多肽浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除病原体。在一些情况下，可以将包括如本文所述的多肽的PMP组合物以一定量和一定时间施用于具有病原体感染或处于病原体感染风险的动物，该量和时间足以：(a)达到动物内多肽浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除病原体。本文所述的多肽可以配制在用于本文所述的任一种方法的PMP组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
本文可用的多肽的实例可以包括酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适体、或分子伴侣。
本文所述的PMP可以包括细菌素。在一些情况下，细菌素是由革兰氏阳性细菌天然产生的，诸如假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或乳酸菌(LAB，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))。在一些情况下，细菌素是由革兰氏阴性细菌天然产生的，诸如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、Serratia plymithicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、或大肠杆菌(Escherichia coli)。示例性细菌素包括但不限于I-IV类LAB抗生素(诸如羊毛硫抗生素)、大肠杆菌素、小菌素(microcin)和脓菌素。
本文所述的PMP可以包括抗微生物肽(AMP)。可以使用适用于抑制微生物的AMP。AMP是一组多样化的分子，根据其氨基酸组成和结构分为亚组。AMP可以衍生自或产生自天然产生AMP的任何生物体，这些AMP包括衍生自植物的AMP(例如，copsin)、衍生自昆虫的AMP(例如，蜂毒肽(mastoparan)、poneratoxin、杀菌肽、家蚕抗菌肽、蜂毒素)、衍生自蛙类的AMP(例如，爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、aurein)、以及衍生自哺乳动物的AMP(例如，组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)、防御素和抗菌肽)。
IV.用于生产包含外源多肽的PMP的方法
在另一方面，本披露的总体特征在于生产包含外源多肽的PMP的方法。该方法因此包括(a)提供包含外源多肽的溶液；以及(b)使该PMP负载该外源多肽，其中该负载导致该外源多肽被该PMP包封。
可以将外源多肽置于溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。外源多肽可以溶于或可以不溶于溶液中。如果多肽不溶于溶液，则可以调节该溶液的pH直到该多肽可溶于该溶液中。不可溶的多肽也可用于负载。
使PMP负载外源多肽可以包括以下或由其组成：超声处理包含外源多肽(例如，可溶的或不可溶的外源多肽)和多个PMP的溶液以诱导PMP穿孔并使多肽扩散到PMP中，例如，按照Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4:1867,2013中所述的方案的超声处理。
可替代地，使PMP负载外源多肽可以包括以下或由其组成：电穿孔包含外源多肽(例如，可溶的或不可溶的外源多肽)和多个PMP的溶液，例如，按照Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究],40(17),e130,2012中所述的方案的电穿孔。
可替代地，可以添加少量洗涤剂(例如皂苷)以增加外源多肽向PMP的负载，例如，如Fuhrmann等人,J Control Release.[控释杂志],205:35-44,2015中所述。
使PMP负载外源多肽可以包括以下或由其组成：脂质提取和脂质挤出。简而言之，可以通过将MeOH:CHCl3(例如，3.75mL 2:1(v/v)MeOH:CHCl3)添加到PBS溶液中的PMP(例如，1mL的PBS中的PMP)中并涡旋该混合物来分离PMP脂质。然后顺序地添加CHCl3(例如，1.25mL)和ddH2O(例如，1.25mL)并涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000r.p.m.离心10min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。含PMP脂质的有机相样品通过在氮气(2psi)下加热进行干燥。为了产生负载多肽的PMP，将分离的PMP脂质与多肽溶液混合，并例如按照Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。
还可以使用分离另外的植物脂质类别的方法分离PMP脂质(例如，糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)),如Casas等人,Plant Physiology[植物生理学],170:367-384,2016中所述。简而言之，为了提取PMP脂质(包括GIPC)，添加氯仿:甲醇:HCl(例如3.5mL的氯仿:甲醇:HCl(200:100:1，v/v/v))加丁羟甲苯(例如，0.01％(w/v)丁羟甲苯)并将其与PMP孵育。接下来，添加NaCl(例如，2mL的0.9％(w/v)NaCl)并涡旋5分钟。然后将样品离心以诱导有机相在玻璃管的底部聚集，并且收集有机相。可以将上层相用氯仿(例如，4mL的纯氯仿)进行再提取，以分离脂质。将有机相合并且干燥。干燥后，将水相重悬于水(例如，1mL的纯水)中，并使用丁醇-1(例如，1mL的丁醇-1)反萃取GIPC两次。为了产生负载多肽的PMP，将分离的PMP脂质相与多肽溶液混合，并按照Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。可替代地，可以用甲基叔丁基醚(MTBE):甲醇:水加丁羟甲苯(BHT)或用丙-2-醇:己烷:水提取脂质。
在一些方面，可以将分离的GIPC添加到分离的PMP脂质中。
在一些方面，使PMP负载外源多肽包括超声处理和脂质挤出，如上所述。
在一些方面，可以将外源多肽预复合(例如，使用硫酸鱼精蛋白)，或者可以添加阳离子脂质(例如，DOTAP)以促进带负电荷的蛋白质的包封。
在使用前，可以如实例2中所述的，纯化负载的PMP以除去未结合PMP或被PMP包封的多肽。可以如实例3所述表征负载的PMP，并且可以如实例4所述测试其稳定性。可以通过本领域已知的用于定量蛋白质的方法来定量外源多肽的负载。例如，Pierce定量比色肽测定可用于负载和未负载的PMP的小样本，或者使用特定抗体的蛋白质印迹可用于检测外源多肽。可替代地，可以荧光标记多肽，并且荧光可用于确定负载和未负载的PMP中的标记的外源多肽浓度。
V.治疗方法
本文所述的PMP和PMP组合物可用于多种治疗方法，特别是用于预防或处理动物的病症或疾病或用于预防或治疗动物的病原体感染。本发明方法涉及将本文所述的PMP组合物递送至动物。
本文提供了向动物施用本文披露的PMP组合物的方法。这些方法可以用于预防或处理动物的病症或疾病或用于预防动物的病原体感染。
例如，本文提供了一种处理具有真菌感染的动物的方法，其中该方法包括向该动物施用有效量的包括多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含外源多肽，该外源多肽是病原体防治剂，例如，抗真菌剂。在一些情况下，真菌感染是由白色念珠菌引起的。在一些情况下，方法降低或显著消除真菌感染。
在另一方面，本文提供了一种处理具有细菌感染的动物的方法，其中该方法包括向该动物施用有效量的包括多个PMP的PMP组合物。在一些情况下，该方法包括向该动物施用有效量的包括多个PMP的PMP组合物，其中该多个PMP包含外源多肽，该外源多肽是病原体防治剂，例如，抗细菌剂。在一些情况下，细菌是链球菌属物种(Streptococcus spp.)、肺炎球菌属物种(Pneumococcus spp.)、假单孢菌属物种(Pseudomonas spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、弯曲菌属物种(Campylobacterspp.)、或埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)。在一些情况下，方法降低或显著消除细菌感染。在一些情况下，动物是人、兽医动物、或牲畜动物。
本发明方法可用于处理动物的感染(例如，如由动物病原体引起的)，这是指将处理剂施用于已经患有疾病的动物以改善或稳定动物的病症。这可以涉及使一种或多种病原体在动物中、上或周围的病原体定殖相对于起始量减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)和/或允许个体受益(例如，以足以消释症状的量减少定殖)。在此类情况下，处理的感染可表现为症状的减轻(例如，减轻约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。在一些情况下，处理的感染可以有效增加个体存活的可能性(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)或增加群体的总体存活(例如，使存活的可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指感染的减少量足以可持续地消释动物的症状(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。
本发明方法可用于预防感染(例如，如由动物病原体引起的)，这是指以足以维持初始病原体群体(例如，近似地在健康个体中发现的量)、预防感染开始和/或预防与感染相关的症状或病症的量预防一种或多种病原体在动物中、上或周围的定殖增加(例如，相对于未处理的动物，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或多于100％)。例如，在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备手术，诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁的静脉内导管插入、或接受在重症监护病房(intensive care unit)中的处理)时、在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、HIV/AIDS、或正在服用免疫抑制剂的个体)中、或在经受长期抗生素疗法的个体中，个体可以接受预防性治疗以预防真菌感染。
PMP组合物可以被配制用于施用或通过合适的方法施用，该合适的方法包括例如，口服、静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、经腹膜、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、眼眶内、外用、透皮、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼液、通过吸入(例如，通过雾化器)、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、或在脂质组合物中。在本文所述的方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据不同因素(例如，所施用的化合物或组合物，以及所治疗的病症、疾病或障碍的严重性)而变化。在一些情况下，静脉内、肌内、皮下、外用、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内、或鼻内施用PMP组合物。给药可以通过任何合适的途径进行，例如口服或通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
对于本文所述的感染的预防或处理(当单独使用或与一种或多种另外的其他治疗剂组合使用时)，将取决于待处理的疾病的类型、疾病的严重性和病程、是否为预防或治疗目的而施用、先前的疗法、患者的临床病史以及对PMP组合物的反应。PMP组合物可以例如一次或经一系列处理施用于患者。对于经若干天或更长的重复施用，取决于病症，通常将持续处理直到出现所希望的对疾病症状的抑制或不再可检测到感染。这样的剂量可以例如每周或每两周间歇地施用(例如，使得患者接受例如约两剂至约二十剂的PMP组合物。可以施用初始较高的负载剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易监测此疗法的进展。
在一些情况下，施用于个体(例如，人)的PMP组合物的量可以在个体的体重的约0.01mg/kg至约5g/kg(例如，约0.01mg/kg-0.1mg/kg、约0.1mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-100mg/kg、约100mg/kg-1g/kg、或约1g/kg-5g/kg)的范围内。在一些情况下，施用于个体(例如，人)的PMP组合物的量是个体的体重的至少0.01mg/kg(例如，至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少100mg/kg、至少1g/kg、或至少5g/kg)。剂量可以以单剂量或以多剂量(例如，2、3、4、5、6、7或多于7剂)施用。在一些情况下，施用于动物的PMP组合物可以单独施用或与另外的治疗剂或病原体防治剂组合施用。与单一处理相比，可以减少在组合处理中施用的抗体的剂量。通过常规技术容易监测此疗法的进展。
在一方面，本披露的特征在于一种用于治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含多个PMP的组合物，其中一种或多种外源多肽被该PMP包封。多个PMP的施用可以降低该受试者的血糖。在一些方面，外源多肽是胰岛素。
VI.农业方法
本文所述的PMP组合物可用于多种农业方法，特别是用于预防或处理动物的病原体感染以及用于防治此类病原体的扩散(例如，通过病原体媒介)。本发明方法涉及将本文所述的PMP组合物递送至病原体或病原体媒介。
组合物和相关方法可以用于预防病原体或病原体媒介的侵染或减少病原体或病原体媒介在它们住居的任何生境中(例如，动物的外部，例如在植物、植物部分(例如，根、果实和种子)上；在土壤、水中或上；或在另一种病原体或病原体媒介生境上的数量。因此，这些组合物和方法可以通过例如杀死、伤害或减慢媒介的活动来减少病原体媒介的损害作用，并且可以从而控制病原体向动物的扩散。本文披露的组合物可以用于防治、杀死、伤害、麻痹处于任何发育阶段(例如，它们的卵、若虫、龄虫、幼虫(larvae)、成虫、幼龄虫(juvenile)、或干燥形式)的任何病原体或病原体媒介中的任何一种或多种，或减少其活动。这些方法中的每一种的细节将在下面进一步描述。
A.向病原体的递送
本文提供了通过使病原体与PMP组合物(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)接触而将PMP组合物递送至病原体(诸如本文披露的一种)的方法。方法可以用于降低动物病原体的适应度，例如作为递送PMP组合物的结果以预防或处理病原体感染或控制病原体的扩散。可以根据本文所述的方法靶向的病原体的实例包括细菌(例如，链球菌属物种、肺炎球菌属物种、假单胞菌属物种、志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、弯曲菌属物种或埃希氏杆菌属物种)、真菌(酵母属物种或念珠菌属物种)、寄生昆虫(例如，臭虫属物种)、寄生线虫(例如，Heligmosomoides属物种)、或寄生原生动物(例如，滴虫病(Trichomoniasis)物种)。
例如，本文提供了一种降低病原体的适应度的方法，该方法包括向该病原体递送本文所述的任一种组合物，其中相对于未处理的病原体，该方法降低该病原体的适应度。在一些实施例中，方法包括将PMP组合物(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)递送至其中病原体生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在本文所述的方法的一些情况下，将组合物作为病原体可食用组合物递送，以被该病原体摄食。在本文所述的方法的一些情况下，将组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如，至病原体)。
本文还提供了降低寄生昆虫的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生昆虫递送包含多个PMP(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)的PMP组合物。例如，寄生昆虫可以是臭虫。本文提供了寄生昆虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生昆虫，该方法降低该寄生昆虫的适应度
本文另外提供了降低寄生线虫的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生线虫递送包含多个PMP(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)的PMP组合物。例如，寄生线虫是多形螺旋线虫(Heligmosomoides polygyrus)。本文提供了寄生线虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生线虫，该方法降低该寄生线虫的适应度。
本文进一步提供了降低寄生原生动物的适应度的方法，其中该方法包括向该寄生原生动物递送包含多个PMP(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)的PMP组合物。例如，寄生原生动物可以是阴道毛滴虫(T.vaginalis)。本文提供了寄生原生动物的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生原生动物，该方法降低该寄生原生动物的适应度。
作为递送PMP组合物的结果的病原体适应度的降低可以以许多种方式表现。在一些情况下，作为递送PMP组合物的结果，病原体适应度的降低可以表现为病原体的生理学的劣化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与未施用PMP组合物的病原体相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、病原体发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可以有效降低病原体的总体健康或降低病原体的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物(包含外源多肽，例如，病原体防治剂)的病原体中发现的水平)，病原体的存活降低大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未施用PMP组合物的病原体相比，这些方法和组合物有效降低病原体繁殖(例如，繁殖速率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的病原体中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未递送PMP组合物的病原体相比，有害生物适应度的降低可以表现为病原体对抗病原体剂的敏感性的增加和/或病原体对抗病原体剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将病原体对杀有害生物剂的敏感性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未递送病原体防治(组合物的病原体相比，病原体适应度的降低可以显现为其他适应度劣势，诸如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文所述的任何多种方式有效降低病原体适应度。此外，PMP组合物可以降低任何数量的病原体纲、目、科、属、或物种(例如，1个病原体物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个病原体物种)中的病原体适应度。在一些情况下，PMP组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估病原体适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的病原体来评估有害生物适应度。可替代地，可以通过评价病原体群体来评估有害生物适应度。例如，病原体适应度的降低可表现为与其他病原体的成功竞争的降低，从而导致病原体群体规模的减小。
VII.病原体或其载体的处理方法
本文所述的PMP组合物和相关方法可用于降低动物病原体的适应度并且从而处理或预防动物的感染。本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的动物病原体或其媒介的实例。
A.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度，例如以预防或处理动物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至真菌的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于真菌感染(例如，由本文所述的真菌引起的)风险的动物或有需要的动物的真菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于处理或预防动物的真菌感染，包括由真菌引起的感染，该真菌属于子囊菌门(尖孢镰孢、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、曲霉属物种、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌(Coccidioides immitis/posadasii)、白色念珠菌(Candida albicans))、担子菌门(新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、毛孢子菌属(Trichosporon))、微孢子门(Microsporidia)(家兔脑胞内原虫(Encephalitozooncuniculi)、肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi))、毛霉亚门(Mucoromycotina)(卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimiacorymbifera))。
在一些情况下，真菌感染是由属于以下的引起的：子囊菌门、担子菌门、壶菌门(Chytridiomycota)、微孢子门、或接合菌门。真菌感染或过度生长可以包括一种或多种真菌物种，例如白色念珠菌、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、耳念珠菌(C.auris)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、球形马拉色菌(Malassezia globose)、限制马拉色菌(M.restricta)、或汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、串珠状赤霉(Gibberellamoniliformis)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、杰氏肺囊虫(P.jirovecii)、鼠源肺囊虫(P.murina)、兔源肺囊虫(P.oryctolagi)、大鼠源肺囊虫(P.wakefieldiae)、和棒曲霉(Aspergillus clavatus)。真菌物种可以被认为是病原体或机会病原体。
在一些情况下，真菌感染是由念珠菌属真菌引起的(即，念珠菌属感染)。例如，念珠菌属感染可以是由念珠菌属真菌引起的，该念珠菌属真菌选自由以下组成的组：人白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、克鲁斯念珠菌、耳念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、拟平滑念珠菌(C.orthopsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、多皱念珠菌(C.rugose)、和葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)。可以通过本文披露的方法处理的念珠菌属感染包括但不限于念珠菌血症、口咽念珠菌病、食管念珠菌病、粘膜念珠菌病、生殖器念珠菌病、外阴阴道念珠菌病、直肠念珠菌病、肝念珠菌病、肾念珠菌病、肺念珠菌病、脾念珠菌病、耳霉菌病、骨髓炎、化脓性关节炎、心血管念珠菌病(例如，心内膜炎)、和侵入性念珠菌病。
B.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度，例如以预防或处理动物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与PMP组合物接触而将PMP组合物施用于细菌的方法。另外地或可替代地，该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于细菌感染(例如，由本文所述的细菌引起的)风险的动物或有需要的动物的细菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由下文进一步描述的任何细菌引起的动物的细菌感染。例如，细菌可以是属于以下的细菌：芽孢杆菌目(Bacillales)(炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金色葡萄球菌(S.aureus)、产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes))、乳酸杆菌目(Lactobacillales)(肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes))、梭菌目(Clostridiales)(肉毒棱菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani))、螺旋体目(Spirochaetales)(伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum))、衣原体目(Chlamydiales)(沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci))、放线菌目(Actinomycetales)(白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分支杆菌(M.avium))、立克次氏体目(Rickettsiales)(普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)、嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、查菲埃立克体(E.chaffeensis))、根瘤菌目(Rhizobiales)(羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis))、伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)(百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei))、奈瑟氏菌目(Neisseriales)(淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis))、弯曲菌目(Campylobacterales)(空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团菌目(Legionellales)(嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila))、假单胞菌目(Pseudomonadales)(鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、气单胞菌目(Aeromonadales)(气单胞菌属物种(Aeromonas sp.))、弧菌目(Vibrionales)(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus))、硫发菌目(Thiotrichales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、肠杆菌目(Enterobacteriales)(肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(E.coli))。
实例
以下是本发明的各种方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。
实例1：从植物中粗分离植物信使包
此实例描述了从各种植物来源(包括叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、木质部汁液、和植物细胞培养基)粗分离植物信使包(PMP)。
实验设计：
a)从拟南芥叶的质外体分离PMP
将拟南芥属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0)种子用50％漂白剂进行表面灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在4℃下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座丛的质外体洗涤液分离PMP，如Rutter和Innes,PlantPhysiol.[植物生理学],173(1):728-741,2017所述。简而言之，在根处收获整个莲座丛，并且用囊泡分离缓冲液(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH 6)真空渗透。
将经渗透的植物小心地吸干以除去多余的液体，置于30mL注射器中，并且在50mL锥形管中在2℃下以700g离心20min，以收集含有PMP的质外体细胞外液。接下来，将质外体细胞外液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所述纯化PMP。
b)从向日葵种子的质外体分离PMP
将完整的向日葵种子(向日葵(H.annuus L.))在水中吸胀2小时，剥皮以除去种皮，并且将质外体细胞外液通过修改的真空渗透-离心程序进行萃取，该程序改编自Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009。简而言之，将种子浸入囊泡分离缓冲液(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH 6)中，并且经受三个10s真空脉冲，在45kPa的压力下间隔30s。将经渗透的种子回收，在滤纸上干燥，置于烧结玻璃过滤器中，并且在4℃下以400g离心20min。将质外体细胞外液回收，通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所描述纯化PMP。
c)从姜根分离PMP
从当地供应商购买新鲜姜(姜(Zingiber officinale))根茎，并且用PBS洗涤3x。将总共200克的经洗涤的根在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1min暂停1min)，并且分离PMP，如Zhuang等人,J Extracellular Vesicles[细胞外囊泡杂志],4(1):28713,2015中所述。简而言之，将姜汁顺序地在1,000g 10min、3,000g20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
d)从葡萄柚汁分离PMP
从当地供应商购买新鲜的葡萄柚(Citrus×paradisi)，除去皮，并且将果实手动压制或在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)以收集汁，如Wang等人,Molecular Therapy[分子疗法],22(3):522-534,2014(有少量修改)所述。简而言之，将汁/汁浆夜顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
e)从西兰花营养部分分离PMP
分离西兰花(羽衣甘蓝意大利变种(Brassica oleracea var.italica))PMP，如前所述(Deng等人,Molecular Therapy[分子疗法],25(7):1641-1654,2017)。简而言之，从当地供应商购买新鲜的西兰花，用PBS洗涤三次，并且在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)。然后将西兰花汁顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
f)从橄榄花粉分离PMP
分离橄榄(欧洲橄榄(Olea europaea))花粉PMP，如前在Prado等人,MolecularPlant.[分子植物]7(3):573-577,2014中所述。简而言之，将橄榄花粉(0.1g)在潮湿的室中于室温水化30min，然后转移到培养皿(直径15cm)中，该培养皿含有20ml萌发培养基：10％蔗糖、0.03％Ca(NO3)2、0.01％KNO3、0.02％MgSO4和0.03％H3BO3。花粉在黑暗中于30℃萌发16h。仅当管长于花粉粒的直径时，才认为花粉粒萌发。收集含有PMP的培养基，并且通过离心在0.85um过滤器上进行两次连续过滤，清除花粉碎片。如实例2中所述来纯化PMP。
g)从拟南芥属韧皮汁液分离PMP
将拟南芥属(拟南芥Col-0)种子用50％漂白剂进行表面灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在4℃下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座叶收集韧皮汁液，如Tetyuk等人,JoVE.[视觉实验杂志]80,2013所述。简而言之，在叶柄的基部切下叶，堆叠，并且置于含有20mM K2-EDTA的反应管中在黑暗中一小时以防止伤口封合。将叶轻轻地从容器中取出，用蒸馏水彻底洗涤以除去全部EDTA，放入干净的管中，并且在黑暗中收集5-8小时韧皮汁液。弃去叶，将韧皮汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所述纯化PMP。
h)从番茄植物木质部汁液分离PMP
将番茄(Solanum lycopersicum)种子种植在单个盆中的富含有机物的土壤(诸如阳光混合物(Sunshine Mix)(Sun Gro园艺公司(Sun Gro Horticulture)，阿格瓦姆，马萨诸塞州))中，并且维持在22℃与28℃之间的温室中。萌发后约两周，在两个真叶阶段，将幼苗单独地移植到填充有含有90％沙和10％有机混合物的无菌沙质土壤的盆(直径10cm并且深17cm)中。将植物在22℃-28℃的温室中维持四周。
从4周龄番茄植物收集木质部汁液，如Kohlen等人,Plant Physiology.[植物生理学]155(2):721-734,2011所述。简而言之，将番茄植物在下胚轴上方断头，并且在茎周围放置塑料环。断头后在90min内收集积累的木质部汁液。将木质部汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所述纯化PMP。
i)从烟草BY-2细胞培养基分离PMP
将烟草BY-2(烟草栽培变种嫩黄2(Nicotiana tabacum L cv.Bright Yellow 2))细胞在黑暗中于26℃，在振荡器上以180rpm，在包含补充有30g/L蔗糖、2.0mg/L磷酸二氢钾、0.1g/L myo肌醇、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸、和1mg/L硫胺素HCl的MS盐(Duchefa，哈勒姆，荷兰，#M0221)的MS(Murashige和Skoog，1962)BY-2培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5％(v/v)7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后，收集BY-2培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液，并且通过在0.85um过滤器上过滤来清除碎片。如实例2中所述来纯化PMP。
实例2：纯化的植物信使包(PMP)的生产
此实例描述了使用超滤与尺寸排阻色谱法(密度梯度(碘克沙醇或蔗糖))的组合并且通过沉淀或尺寸排阻色谱法除去聚集体如实例1中所述从粗PMP级分生产纯化的PMP。
实验设计：
a)使用超滤与尺寸排阻色谱法的组合生产纯化的葡萄柚PMP
使用100-kDA截留分子量(MWCO)Amicon旋转过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore))浓缩来自实例1a的粗葡萄柚PMP级分。随后，将浓缩的粗PMP溶液负载到PURE-EV尺寸排阻色谱柱(HansaBioMed生命科学公司(HansaBioMed Life Sciences Ltd))上，并且根据制造商的说明进行分离。洗脱后合并纯化的含有PMP的级分。任选地，可以使用100kDa MWCO Amicon旋转过滤器或通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩PMP。如实例3中所述分析纯化的PMP。
b)使用碘克沙醇梯度生产纯化的拟南芥属质外体PMP
如实例1a所述的分离粗拟南芥属叶质外体PMP，并且通过使用碘克沙醇梯度生产PMP，如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所述。为了制备不连续的碘克沙醇梯度(OptiPrep；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，通过将60％OptiPrep储备水溶液稀释在囊泡分离缓冲液(VIB；20mM MES、2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH6)中来产生40％(v/v)、20％(v/v)、10％(v/v)和5％(v/v)碘克沙醇的溶液。通过使3ml40％溶液、3mL 20％溶液、3mL 10％溶液和2mL 5％溶液分层形成梯度。将来自实例1a的粗质外体PMP溶液在4℃下以40,000g离心60min。将沉淀物重悬于0.5ml VIB中并且在梯度顶部上分层。在4℃下以100,000g进行离心17h。弃去梯度的顶部的前4.5ml，并且随后收集3体积的含有质外体PMP的0.7ml，用VIB补足至3.5mL，并且在4℃下以100,000g离心60min。将沉淀物用3.5ml VIB洗涤，并且在相同的离心条件下再沉淀。将纯化的PMP沉淀物合并用于后续分析，如实例3所述。
c)使用蔗糖梯度生产纯化的葡萄柚PMP
如实例1d所述的分离粗葡萄柚汁PMP，以150,000g离心90min，并且将含有PMP的沉淀物重悬于1ml PBS中，如(Mu等人,Molecular Nutrition&Food Research.[分子营养与食物研究]58(7):1561-1573,2014中所述。将重悬的沉淀物转移至蔗糖步进梯度(8％/15％/30％/45％/60％)并且以150,000g离心120min以产生纯化的PMP。从30％/45％界面收获纯化的葡萄柚PMP，并且随后分析，如实例3中所述。
d)从葡萄柚PMP中除去聚集体
为了从如实例1d中所述的产生的葡萄柚PMP中除去蛋白质聚集体或从实例2a-c中除去纯化的PMP，可以包括另外的纯化步骤。使产生的PMP溶液经过一系列pH，以使蛋白质聚集体沉淀在溶液中。通过添加氢氧化钠或盐酸将pH调节至3、5、7、9或11。使用校准的pH探针测量pH。一旦溶液处在指定的pH，就将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将分离的PMP溶液絮凝。简而言之，将2-5g/L Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后将溶液过滤以除去微粒。可替代地，通过增加盐浓度来增溶聚集体。将NaCl添加到PMP溶液中，直到它处于1mol/L。然后将溶液过滤以纯化PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。将分离的PMP混合物在混合下加热，直到它达到50℃的均匀温度持续5分钟。然后将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。如实例3中所述分析产生的PMP。
实例3：植物信使包表征
此实例描述了如实例1或实例2中所述产生的PMP的表征。
实验设计：
a)确定PMP浓度
根据制造商的说明，通过使用Malvern NanoSight的纳米颗粒跟踪分析(NTA)、使用NanoFCM的纳米流式细胞术、或通过使用Spectradyne CS1的可调电阻式脉冲传感(TRPS)确定PMP颗粒浓度。通过使用DC蛋白质测定(伯乐公司(Bio-Rad))确定纯化的PMP的蛋白质浓度。使用荧光亲脂性染料(诸如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedicals)))确定纯化的PMP的脂质浓度，如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所述。简而言之，将来自实例2的纯化的PMP沉淀物重悬于100ml用MES缓冲液(20mM MES，pH6)加1％植物蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司)和2mM 2,29-联吡啶二硫化物稀释的10mM DiOC6(ICN生物医学公司)。将重悬的PMP在37℃下孵育10min，用3mL MES缓冲液洗涤，再沉淀(40,000g，60min，在4℃下)，并且重悬于新鲜的MES缓冲液中。在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。
b)PMP的生物物理学和分子表征
根据来自Wu等人,Analyst.[分析者]140(2):386-406,2015的方案，在JEOL 1010透射电子显微镜上通过电子和冷冻电子显微术表征PMP。还根据制造商的说明，使用Malvern Zetasizer或iZon qNano测量PMP的尺寸和ζ电位。使用氯仿提取从PMP中分离脂质，并且用LC-MS/MS进行表征，如Xiao等人Plant Cell.[植物细胞]22(10):3193-3205,2010所证明。提取和纯化糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)脂质，如Cacas等人,PlantPhysiology.[植物生理学]170:367-384,2016所述，并且通过LC-MS/MS分析，如上所述。根据说明，使用来自赛默飞世尔公司的Quant-It试剂盒对总RNA、DNA和蛋白质进行表征。根据Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017中的方案，通过LC-MS/MS对PMP上的蛋白质进行表征。使用Trizol提取RNA和DNA，用来自依诺米那公司(Illumina)的具有Ribo-Zero植物试剂盒和Nextera配对文库制备型试剂盒(Nextera MatePair Library Prep Kit)的TruSeq总RNA制备成文库，并且根据制造商的说明在IlluminaMiSeq上测序。
实例4：植物信使包稳定性的表征
此实例描述了在许多种储存和生理条件下测量PMP的稳定性。
实验设计：
使如实例1和2所述生产的PMP经受各种条件。将PMP悬浮在水、5％蔗糖或PBS中，并且在-20℃、4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水中，并且使用旋转蒸发仪系统干燥，并且分别在4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水或5％蔗糖溶液中，在液氮中速冻并且冻干。在1、7、30和180天后，然后将干燥且冻干的PMP重悬于水中。还将在温度高于0℃的条件下进行的前三个实验暴露在人造阳光模拟器中，以便确定模拟室外紫外线条件下的含量稳定性。还使PMP经受在添加或不添加1单位胰蛋白酶的pH为1、3、5、7和9缓冲溶液中或在其他模拟胃液中在37℃、40℃、45℃、50℃、和55℃的温度下持续1、6和24小时。
在这些处理的每个之后，使PMP回到20℃，中和至pH 7.4，并且使用实例3中描述的一些或全部方法进行表征。
实例5.使PMP负载多肽货物
此实例描述了使PMP负载多肽的方法。
如实例1和实例2中所述生产PMP。为了将多肽(例如，蛋白质或肽)负载到PMP中，将PMP置于多肽在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液中。如果多肽不可溶，则调节溶液的pH直至多肽可溶。如果多肽仍不可溶，则使用不可溶的多肽。然后根据来自Wang等人,NatureComm.[自然通讯],4:1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]40(17),e130,2012的方案将PMP电穿孔。
可替代地，通过将3.75mL 2:1(v/v)MeOH:CHCl3添加至1mL在PBS中的PMP中来分离PMP脂质并且涡旋混合物。顺序地添加CHCl3(1.25mL)和ddH2O(1.25mL)并且涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000r.p.m.离心10min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。含PMP脂质的有机相样品通过在氮气(2psi)下加热进行干燥。为了生产负载有多肽的PMP，将分离的PMP脂质与多肽溶液混合，并按照Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。
可替代地，使用分离另外的植物脂质类别的方法分离PMP脂质(包括糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC))，如Casas等人,Plant Physiology[植物生理学],170:367-384,2016中所述。简而言之，为了提取PMP脂质(包括GIPC)，添加3.5mL的氯仿:甲醇:HCl(200:100:1，v/v/v)加0.01％(w/v)丁羟甲苯并将其与PMP孵育。接下来，添加2mL的0.9％(w/v)NaCl并涡旋5分钟。然后将样品离心以诱导有机相在玻璃管的底部聚集，并且收集有机相。将上相用4mL的纯氯仿进行再提取，以分离脂质。将有机相合并且干燥。干燥后，将水相重悬于1mL纯水中，并使用1mL的丁醇-1将GIPC反萃取两次。为了产生负载多肽的PMP，将分离的PMP脂质相与多肽溶液混合，并按照Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。
可替代地，添加3.5mL的甲基叔丁基醚(MTBE):甲醇:水(100:30:25，v/v/v)加0.01％(w/v)丁羟甲苯(BHT)并将其与PMP孵育。孵育后，添加2mL的0.9％NaCl，涡旋5分钟，并离心。收集有机相(上)并将水相(下)用4mL的纯MTBE进行再提取。将有机相合并且干燥。干燥后，将水相重悬于1mL纯水中，并使用1mL的丁醇-1将GIPC反萃取两次。为了产生负载蛋白质的PMP，将分离的PMP脂质相与蛋白质溶液混合，并按照Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。
可替代地，将3.5mL的丙-2-醇:己烷:水(55:20:25，v/v/v)与样品在60℃下(伴随偶尔摇动)孵育15min。孵育后，将样品在500x g下旋转沉降并转移上清液，并用3.5mL的提取溶剂重复该过程。将上清液合并并干燥，然后重悬于1mL的纯水中。然后用1mL的丁醇-1将GIPC反萃取两次。可以将GIPC添加到经由此实例中所述的方法分离的PMP脂质。为了产生负载蛋白质的PMP，将分离的PMP脂质与蛋白质溶液混合，并按照Haney等人,J ControlRelease[控释杂志],207:18-30,2015的方案通过脂质挤出机。
在使用前，使用实例2中所述的方法纯化负载的PMP以除去未结合PMP或未被PMP包封的多肽。如实例3所述表征负载的PMP，并且如实例4所述测试其稳定性。为了测量蛋白质或肽的负载量，对负载的和未负载的PMP的少量样品使用Pierce定量比色肽测定，或使用蛋白质印迹检测(其使用蛋白质特异性抗体)。可替代地，可以荧光标记蛋白质，并且荧光可用于确定负载的和未负载的PMP中的经标记的蛋白质浓度。
实例6：用负载Cre重组酶蛋白的PMP处理人细胞
此实例证明了使PMP负载模型蛋白，目的是将功能性蛋白质递送到人细胞中。在此实例中，将Cre重组酶用作模型蛋白，并且将包含Cre报告转基因(Hek293-LoxP-GFP-LoxP-RFP)(Puro；金塔公司(GenTarget,Inc.))的人胚肾293细胞(HEK293细胞)用作模型人细胞系。
a)使用与SEC组合的TFF生产葡萄柚PMP
从当地的Whole Foods
Figure BDA0003372619390001171
获得红色有机葡萄柚。使用榨汁机收集两升葡萄柚汁，并且随后以3000x g 20分钟，然后10,000x g 40分钟进行离心以除去大碎片。将PMP在终浓度为50mM的EDTA(pH 7)中孵育30分钟，并且随后通过1μm和0.45μm过滤器。将过滤的汁通过切向流过滤(TFF)浓缩至700mL，用500mL的PBS洗涤，并浓缩至最终体积为400mL的汁(总浓度为5x)。使用300kDa透析膜将浓缩汁在PBS中透析过夜以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度为50mL。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，并根据制造商的说明，通过纳米流式细胞术(NanoFCM)分析PMP尺寸和浓度，并使用PierceTM二辛可宁酸(BCA)测定法分析蛋白质浓度(图1A和1B)。SEC级分8-12含有污染物。SEC级分4-6含有纯化的PMP，并将其合并在一起，使用0.85μm、0.4μm和0.22μm注射器过滤器过滤灭菌，通过NanoFCM分析(图1A)并用于负载Cre重组酶蛋白。
b)将Cre重组酶蛋白负载到葡萄柚PMP中
将获得自艾博抗公司(Abcam)的Cre重组酶蛋白(ab134845)溶解在超纯水中至蛋白质的终浓度为0.5mg/mL。使用改编自Rachael W.Sirianni和Bahareh Behkam(编辑),Targeted Drug Delivery:Methods and Protocols[靶向药物递送：方法和方案],Methodsin Molecular Biology[分子生物学方法],第1831卷的方案通过电穿孔向过滤灭菌的PMP负载Cre重组酶蛋白。将单独的PMP(PMP对照)、单独的Cre重组酶蛋白(蛋白质对照)、或PMP+Cre重组酶蛋白(负载蛋白质的PMP)与2x电穿孔缓冲液(在超纯水中的42％OptiprepTM(西格玛公司，D1556))混合，参见表5。将样品转移到冷却的比色皿中，并且使用BioradGenePulser以0.400kV、125μF(0.125mF)、低100Ω-高600Ω电阻以两个脉冲(4-10ms)电穿孔。将反应在冰上放置10分钟，并且转移至预冰冷却的1.5ml超速离心管中。将含有PMP的所有样品通过以下方式洗涤3次：添加1.4ml超纯水，随后超速离心(在4℃下，100,000g，1.5h)。将最终沉淀物重悬于最小体积的超纯水(30-50μL)中，并且保持在4℃直到使用。电穿孔后，将仅含有Cre蛋白的样品在超纯水中稀释(如表5中所指示的)，并储存在4℃直到使用。
表5.将Cre重组酶蛋白负载到葡萄柚PMP中。
Figure BDA0003372619390001181
Figure BDA0003372619390001191
c)用负载Cre重组酶的葡萄柚PMP处理Hek293 LoxP-GFP-LoxP-RFP细胞
从金塔公司购买Hek293 LoxP-GFP-LoxP-RFP(Puro)人Cre报告细胞系，并根据制造商的说明维持，无需抗生素选择。将细胞接种到96孔板中，并在具有负载Cre重组酶的PMP(电穿孔的PMP+Cre重组酶蛋白；2.63x 1010PMP/mL)、电穿孔的PMP(仅PMP对照；2.74x109PMP/mL)、电穿孔的Cre重组酶蛋白(仅蛋白质对照；8.57μg/mL)或非电穿孔的PMP+Cre重组酶蛋白(负载对照；3.25x 1010PMP/mL)的完全培养基中处理24小时，如表5所示。24小时后，用杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞两次，并添加新鲜的完全细胞培养基。处理后96-100小时，使用EVOS FL 2荧光成像系统(英杰公司(Invitrogen))对细胞成像。当将Cre重组酶蛋白功能性地递送到细胞中并转运到细胞核时，GFP被重组出来，诱导细胞中的颜色从绿色变为红色(图2A)。因此，红色荧光细胞的存在表明PMP对Cre重组酶蛋白的功能性递送。图2B示出了仅当细胞暴露于负载Cre重组酶的PMP时才观察到重组的红色荧光细胞，而这些在对照处理的Hek293 LoxP-GFP-LoxP-RFP细胞中不存在。我们的数据显示PMP可以负载蛋白质，并且可以功能性地将蛋白质货物递送至人细胞中。
实例7：用负载胰岛素的PMP处理糖尿病小鼠
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是经由口服和全身施用来体内递送蛋白质。在此实例中，将胰岛素用作模型蛋白，并将链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠用作体内模型(图3)。此实例进一步示出了PMP在整个胃肠(GI)道中都是稳定的并且能保护蛋白质货物。
治疗性设计：
将PMP溶液在PBS中配制为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1mg/ml的有效胰岛素剂量。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载胰岛素蛋白
根据实例1-2，从柠檬汁和其他植物来源产生PMP。将人重组胰岛素(吉博科公司(Gibco))和经标记的胰岛素-FITC(西格玛奥德里奇公司I3661)以3mg/ml的浓度溶于10mMHCl，pH 3。将PMP置于蛋白质在PBS中的溶液中。如果蛋白质不可溶，则调节pH，直到它可溶。如果蛋白质仍不可溶，则使用不可溶的蛋白质。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4:1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，可以根据来自Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究],40(17)，e130,2012的方案将PMP电穿孔。
为了产生负载蛋白质的PMP，可替代地可以通过将PMP分离的脂质与蛋白质混合并使用挤出或超声处理重新密封来负载胰岛素或FITC-胰岛素，如实例5中所述。简而言之，将溶解的PMP脂质与胰岛素蛋白溶液(pH 3，10mM HCl)混合，在40℃下超声处理20分钟，并使用聚碳酸酯膜挤出。可替代地，可以在PMP脂质与硫酸鱼精蛋白(西格玛公司，P3369)以5:1的比率混合之前预复合胰岛素蛋白，以促进包封。
将负载胰岛素的PMP通过旋转沉降(在4℃下，100,000x g持续1小时)纯化并用酸性水(pH 4)洗涤沉淀物2次，随后用PBS(pH 7.4)洗涤一次以除去上清液中未包封的蛋白质。可替代地，可以使用如实例2中所述的其他纯化方法。将最终沉淀物重悬于最小体积的PBS(30-50μL)中，并且储存在4℃直到使用。如实例3所述表征负载胰岛素的PMP，并且如实例4所述测试其稳定性。
通过HPLC、蛋白质印迹(抗胰岛素抗体，艾博抗公司ab181547)或通过人胰岛素ELISA(艾博抗公司，ab100578)测量PMP的胰岛素包封。可替代地，可以通过荧光(Ex/Em490/525)分析负载FITC-胰岛素的PMP。Pierce MicroBCATM分析(Thermo ScientificTM)可用于确定负载前后的总蛋白质浓度。通过将掺入的胰岛素(ug)除以添加到反应中的胰岛素总量(ug)来确定负载效率(％)。通过将掺入的胰岛素量(ug)除以经标记的PMP(在FITC-胰岛素的情况下)或PMP(未标记的胰岛素)的数量来确定PMP的负载容量。
b)负载胰岛素-FITC的柠檬PMP的体外胃肠道稳定性
为了确定PMP在GI道中的稳定性和PMP保护蛋白质货物免于降解的能力，负载胰岛素-FITC的PMP经受从Biorelevant公司(Biorelevant)(英国)购买的禁食和进食的GI胃和肠液模拟物，根据制造商的说明来制备它们：FaSSIF(禁食，小肠，pH 6.5)、FeSSIF(进食，小肠，pH 5，补充胰酶)、FaSSGF(禁食，胃，pH 1.6)、FaSSIF-V2(禁食，小肠，pH 6.5)、FeSSIF-V2(进食，小肠，含消化组分，pH 5.8)。
将20μl的负载胰岛素-FITC的PMP(具有有效剂量的0(仅PMP对照)、0.001、0.01、0.1、0.5、1mg/ml胰岛素-FITC)，或游离的0(PBS对照)、0.001、0.01、0.1、0.5、1mg/ml胰岛素-FITC与I mL的胃、进食和禁食的肠液(FaSSIF、F2SSIF、FaSSGF、FaSSIF-V2和FeSSIF-V2)、PMS(阴性对照)和PBS+0.1％SDS(PMP降解对照)在37℃下孵育1、2、3、4和6小时。可替代地，随后将负载胰岛素-FITC的PMP或游离蛋白质在37℃下暴露于F2SSIF>FASSIF-V2或F2SSIF>FESSIF-V2中持续1、2、3、4和6小时(针对每个步骤)。接下来，通过在4℃下以100,000xg超速离心1h来沉淀负载胰岛素-FITC的PMP。将沉淀物重悬于25-50mM Tris pH 8.6中，并分析荧光强度(Ex/Em 490/525)、FITC+PMP浓度、PMP尺寸和胰岛素蛋白浓度。在将溶液的pH调节至pH 8-9(碳酸氢盐缓冲液)后，通过荧光强度分析沉淀后的PMP上清液和仅胰岛素-FITC蛋白样品，测量溶液中颗粒的存在及其尺寸，并在沉淀后，通过蛋白质印迹确定胰岛素蛋白浓度。为了证明PMP在整个GI道中是稳定的并且保护它们的蛋白质货物免于降解，比较不同GI汁模拟物和PBS对照之间的胰岛素-FITC标记的PMP的总荧光(分光光度计)、总胰岛素蛋白(蛋白质印迹)、PMP尺寸和荧光PMP浓度(NanoFCM)和游离胰岛素-FITC蛋白。与PBS孵育相比，当GI汁暴露后可以检测到荧光PMP和胰岛素-FITC蛋白时，胰岛素-FITC标记的PMP是稳定的。
c)用负载胰岛素的PMP经由口服施用处理糖尿病小鼠
为了显示PMP在体内递送功能性蛋白质的能力，使用实例7a中所述的方法使PMP负载人重组胰岛素。用DyLight-800(DL800)红外膜染料(英杰公司)标记PMP。简而言之，将DyLight800溶解于DMSO中至最终浓度为10mg/mL，并且将200μL的PMP(1-3x 1012PMP/mL)与5μL染料混合并且在室温下在振荡器上孵育1h。通过超速离心机在4℃下以100,000x g持续1hr来将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物重悬于1.5ml超纯水中。将最终的DyLight800标记的沉淀物重悬于最少量的超纯PBS中并使用本文所述的方法表征。
在合同研究组织(Contract Research Organization)，使用成熟的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型进行小鼠实验，并根据标准程序对小鼠进行处理和监测。简而言之，将八周龄的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病雄性C57BL/6J小鼠口服灌胃300μl负载胰岛素的PMP(具有有效剂量的0(仅PMP对照)、0.01、0.1、0.5、1mg/mL胰岛素)，或游离的0(PBS对照)、0.1、0.5、1mg/mL胰岛素(每组5只小鼠)。在2、4、6、12和24小时后监测小鼠的血糖水平，并在终点收集血样用于ELISA以确定小鼠中的人胰岛素水平。当与游离胰岛素、未负载的PMP或PBS相比时，PMP可以有效地口服递送胰岛素(当诱导血糖水平时)。通过在实验终点分离小鼠器官和组织并使用Licor Odyssey成像仪测量800nm处的红外荧光来确定PMP的生物分布。
d)用负载胰岛素的PMP经由IV施用处理糖尿病小鼠
为了显示PMP在体内递送功能性蛋白质的能力，使用实例7a中所述的方法使PMP负载人重组胰岛素。用DyLight-800(DL800)红外膜染料(英杰公司)标记PMP。简而言之，将DyLight800溶解于DMSO中至最终浓度为10mg/mL，并且将200μL的PMP(1-3x 1012PMP/mL)与5μL染料混合并且在室温下在振荡器上孵育1h。通过超速离心机在4℃下以100,000x g持续1hr来将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物重悬于1.5ml超纯水中。将最终的DyLight800标记的沉淀物重悬于最少量的超纯PBS中并使用本文所述的方法表征。
在合同研究组织(Contract Research Organization)，使用成熟的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型进行小鼠实验，并根据标准程序对小鼠进行处理和监测。简而言之，通过尾静脉注射向八周龄的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病雄性C57BL/6J小鼠全身施用胰岛素-PMP(具有有效剂量的0(仅PMP对照)、0.01、0.1、0.5、1mg/ml胰岛素)、PBS(阴性对照)或10-20mg/kg游离胰岛素(阳性对照)(每组5只小鼠)。在2、4、6、12和24小时后监测小鼠的血糖水平，并在终点收集血样用于ELISA以确定小鼠中的人胰岛素水平。当与未负载的PMP和PBS相比时，PMP可以有效地全身递送胰岛素(当诱导血糖水平时)。通过在实验终点分离小鼠器官和组织并使用Licor Odyssey成像仪测量800nm处的红外荧光来确定PMP的生物分布。
e)用负载胰岛素的PMP经由IP施用处理糖尿病小鼠
为了显示PMP在体内递送功能性蛋白质的能力，使用实例7a中所述的方法使PMP负载人重组胰岛素。用DyLight-800(DL800)红外膜染料(英杰公司)标记PMP。简而言之，将DyLight800溶解于DMSO中至最终浓度为10mg/mL，并且将200μL的PMP(1-3x 1012PMP/mL)与5μL染料混合并且在室温下在振荡器上孵育1h。通过超速离心机在4℃下以100,000x g持续1hr来将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物重悬于1.5ml超纯水中。将最终的DyLight800标记的沉淀物重悬于最少量的超纯PBS中并使用本文所述的方法表征。
在合同研究组织(Contract Research Organization)，使用成熟的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型进行小鼠实验，并根据标准程序对小鼠进行处理和监测。简而言之，通过腹膜内(IP)注射向八周龄的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病雄性C57BL/6J小鼠施用胰岛素-PMP(具有有效剂量的0(仅PMP对照)、0.01、0.1、0.5、1mg/ml胰岛素)、PBS(阴性对照)或10-20mg/kg游离胰岛素(阳性对照)(每组5只小鼠)。在2、4、6、12和24小时后监测小鼠的血糖水平，并在终点收集血样用于ELISA以确定小鼠中的人胰岛素水平。当与未负载的PMP和PBS相比时，PMP可以有效地全身递送胰岛素(当诱导血糖水平时)。通过在实验终点分离小鼠器官和组织并使用Licor Odyssey成像仪测量800nm处的红外荧光来确定PMP的生物分布。
实例8：用负载蛋白质的植物信使包处理人、细菌、真菌、植物和线虫细胞
A.用负载蛋白质的PMP处理人细胞
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是递送蛋白质货物以增强或降低哺乳动物细胞的适应度。此实例描述了负载GFP的被人细胞吸收的PMP，并且它进一步描述了负载蛋白质的PMP在一系列加工和环境条件下是稳定的并且保持其活性。在此实例中，将GFP用作模型蛋白或多肽，并且将A549肺癌细胞用作模型人细胞系。
治疗剂量：
将负载GFP的PMP在水中配制为递送0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、或100μg/ml GFP蛋白(负载在PMP中的)的浓度。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载GFP蛋白
根据实例1，从柠檬汁和其他植物来源产生PMP。商业合成绿色荧光蛋白(艾博抗公司)，并将其溶解于PBS中。将PMP置于蛋白质在PBS中的溶液中。如果蛋白质不可溶，则调节pH，直到它可溶。如果蛋白质仍不可溶，则使用不可溶的蛋白质。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4:1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，可以根据来自Haney等人,J Control Release[控释杂志],207:18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究],40(17)，e130,2012的方案将PMP电穿孔。
为了产生负载蛋白质的PMP，可替代地可以通过将PMP分离的脂质与蛋白质混合并使用挤出或超声处理重新密封来负载GFP，如实例5中所述。简而言之，将溶解的PMP脂质与GFP蛋白溶液(pH 5-6，在PBS中)混合，在40℃下超声处理20分钟，并使用聚碳酸酯膜挤出。可替代地，可以在PMP脂质与鱼精蛋白(西格玛公司)以10:1的比率混合之前预复合GFP蛋白，以促进包封。
通过旋转沉降(在4℃下，100,000xg持续1小时)并洗涤沉淀物三次以除去上清液中未包封的蛋白质或通过使用实例2中所述的其他方法来纯化负载GFP的PMP。如实例3所述表征负载GFP的PMP，并且如实例4所述测试其稳定性。通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。
b)用负载GFP的柠檬PMP处理人A549细胞
A549肺癌细胞购自ATCC(CCL-185)并根据制造商的说明维持在补充有10％FBS的F12K培养基中。为了确定人细胞对负载GFP的PMP的摄取，将A549细胞以1E5个细胞/孔的浓度铺板在48孔板中，并允许细胞在37℃下粘附至少6小时或过夜。接下来，吸出培养基并将细胞与负载0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、或100μg/ml GFP的柠檬衍生的PMP或未负载的0(阴性对照)、0.01、0.1、1、5、10、或100μg/ml GFP蛋白在完全培养基中孵育。在37℃下孵育2、6、12和24小时后，吸出培养基并用DPBS或完全培养基轻轻洗涤细胞3次，持续5分钟。任选地，如果耐受，则将A549细胞与具有/不具有ProtK(2mg/mL)的0.5％triton X100在37℃下孵育10分钟，以爆破并降解未被细胞吸收的PMP和蛋白质。接下来，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。当细胞的细胞质变绿时，证明A549摄取了负载GFP的PMP或单独的GFP蛋白。记录与仅用PBS和GFP的对照处理相比，具有绿色细胞质的经负载GFP的PMP处理的细胞的百分比，以确定摄取。此外，在处理和未处理的细胞中分离总蛋白质后，使用抗GFP抗体(艾博抗公司)，使用标准方法通过蛋白质印迹测量细胞对GFP的摄取。记录GFP蛋白水平并在用负载GFP的PMP处理的细胞、单独的GFP蛋白处理的细胞和未处理的细胞之间进行比较，以确定摄取。
B.用负载蛋白质的PMP处理细菌
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是递送蛋白质货物以增强或降低细菌的适应度。此实例描述了负载GFP的被细菌吸收的PMP，并且它进一步描述了负载蛋白质的PMP在一系列加工和环境条件下是稳定的并且保持其活性。在此实例中，将GFP用作模型蛋白或肽，并且将大肠杆菌用作模型细菌。
治疗剂量：
如实例8A中所述配制负载GFP的PMP。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载GFP蛋白
如实例8A中所述来生产PMP。
b)将负载GFP的柠檬PMP递送至大肠杆菌
大肠杆菌购自ATCC(#25922)，并且根据制造商的说明在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂/肉汤上在37℃下生长。为了确定大肠杆菌对负载GFP的PMP的摄取，将10uL的1mL过夜细菌悬浮液与负载0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/mL GFP的柠檬衍生的PMP，或未负载的0(阴性对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/mL GFP蛋白在液体培养物中孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，将细菌用0.5％triton X100洗涤4次，并任选的ProtK处理(2mg/ml ProtK，在37℃下10分钟；如果细菌耐受)以爆破并降解未被细菌吸收的PMP和蛋白质。接下来，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。当细菌的细胞质变绿时，证明细菌摄取了负载GFP的PMP或单独的GFP蛋白。记录与仅用PBS和GFP的对照处理相比，具有绿色细胞质的负载GFP的PMP处理的细菌的百分比，以确定摄取。此外，在处理和未处理的细菌中分离总蛋白质后，使用抗GFP抗体(艾博抗公司)，使用标准方法通过蛋白质印迹测量细菌对GFP的摄取。记录GFP蛋白水平并在用负载GFP的PMP处理的细菌、单独的GFP蛋白处理的细菌和未处理的细菌之间进行比较，以确定摄取。
B.用负载蛋白质的PMP处理真菌
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是递送蛋白质货物以增强或降低真菌的适应度。此实例描述了负载GFP的被真菌(包括酵母)吸收的PMP，并且它进一步描述了负载蛋白质的PMP在一系列加工和环境条件下是稳定的并且保持其活性。在此实例中，将GFP用作模型肽和蛋白质，并且将酿酒酵母用作模型真菌。
治疗剂量：
如实例8A中所述配制负载GFP的PMP。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载GFP蛋白
如实例8A中所述来生产PMP。
b)将负载GFP的柠檬PMP递送至酿酒酵母
酿酒酵母获自ATCC(#9763)，并且如制造商所指示，在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)中维持在30℃。为了确定酿酒酵母对PMP的摄取，将酵母细胞在选择培养基中生长至OD600为0.4-0.6并且在液体培养物中与负载0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/ml GFP的柠檬衍生的PMP，或未负载的0(阴性对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/ml GFP蛋白一起孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，将酵母细胞用0.5％triton X100洗涤4次，并任选的ProtK处理(2mg/ml ProtK，在37℃下10分钟；如果细胞耐受)以爆破并降解未被细菌吸收的PMP和蛋白质。接下来，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。当酵母细胞的细胞质变绿时，证明酵母摄取了负载GFP的PMP或单独的GFP蛋白。记录与仅用PBS和GFP的对照处理相比，具有绿色细胞质的负载GFP的PMP处理的酵母的百分比，以确定摄取。此外，在处理和未处理的酵母中分离总蛋白质后，使用抗GFP抗体(艾博抗公司)，使用标准方法通过蛋白质印迹测量酵母对GFP的摄取。记录GFP蛋白水平并在用负载GFP的PMP处理的酵母、单独的GFP蛋白处理的酵母和未处理的酵母之间进行比较，以确定摄取。
C.用负载蛋白质的PMP处理植物
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是递送蛋白质货物以增强或降低植物的适应度。此实例描述了负载GFP的被植物吸收的PMP，并且它进一步描述了负载蛋白质的PMP在一系列加工和环境条件下是稳定的并且保持其活性。在此实例中，将GFP用作模型蛋白和肽，并且将拟南芥幼苗用作模型植物。
治疗剂量：
如实例8A中所述配制负载GFP的PMP。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载GFP蛋白
如实例8A中所述来生产PMP。
b)将负载GFP的PMP递送至拟南芥幼苗
野生型哥伦比亚(Col)-1生态型拟南芥获得自拟南芥生物资源中心(ABRC)。将种子用含有70％(v/v)乙醇和0.05％(v/v)Triton X-100的溶液表面灭菌，并在无菌板上在含有半强度的Murashige和Skoog(MS)，补充有0.5％蔗糖和2.5mM MES，pH 5.6的液体培养基中进行萌发。将三日龄的幼苗用负载0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/mlGFP的柠檬衍生PMP或未负载的0(阴性对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/ml GFP蛋白处理，并添加到MS培养基中持续6、12、24和48小时。处理后，将幼苗在MS培养基(任选地补充有0.5％Triton X100)中彻底洗涤，随后ProtK处理(2mg/mL ProtK，在37℃下10分钟；如果幼苗耐受)以爆破并降解未被植物吸收的PMP和蛋白质。接下来，在高分辨率荧光显微镜上获取图像以检测根、叶和其他植物部分中的GFP。当可以在植物组织中检测到GFP蛋白定位时，负载GFP的PMP或单独的GFP蛋白被幼苗吸收。比较负载GFP的PMP和仅用PBS和GFP的对照处理之间具有绿色荧光的幼苗数量，以确定摄取。此外，在处理和未处理的幼苗中分离总蛋白质后，可以使用抗GFP抗体(艾博抗公司)，使用标准方法通过蛋白质印迹定量幼苗对GFP的摄取。记录GFP蛋白水平并在用负载GFP的PMP处理的幼苗、单独的GFP蛋白处理的幼苗和未处理的幼苗之间进行比较，以确定摄取。
D.用负载蛋白质的PMP处理线虫
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是递送蛋白质货物以增强或降低线虫的适应度。此实例描述了负载GFP的被线虫吸收的PMP，并且它进一步描述了负载蛋白质的PMP在一系列加工和环境条件下是稳定的并且保持其活性。在此实例中，将GFP用作模型肽，并且将秀丽隐杆线虫用作模型线虫。
治疗剂量：
如实例8A中所述配制负载GFP的PMP。
实验方案：
a)使柠檬PMP负载GFP蛋白
如实例8A中所述来生产PMP。
b)将负载GFP的PMP递送至秀丽隐杆线虫
在20℃下将秀丽隐杆线虫野生型N2Bristol菌株(秀丽隐杆线虫基因组学中心(C.elegans Genomics Center))维持在线虫生长培养基(NGM)琼脂板(3g/l NaCl、17g/l琼脂、2.5g/l蛋白胨、5mg/l胆固醇、25mM KH2PO4(pH 6.0)、1mM CaCl2、1mM MgSO4)上的大肠杆菌(菌株OP50)菌苔上(从L1阶段直到L4阶段)。
按照Conte等人,Curr.Protoc.Mol.Bio.[微生物学的当前方案],109:26.3.1-26.330,2015中的进食方案，将一日龄秀丽隐杆线虫转移到新板中并进食液体溶液中的负载0(未负载的PMP对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/ml GFP的柠檬衍生的PMP，或未负载的0(阴性对照)、0.01、0.1、1、5、10、100μg/ml GFP蛋白。接下来，与未负载的PMP的处理，或单独的GFP蛋白和无菌水对照相比，使用绿色荧光的荧光显微镜检查蠕虫对负载GFP的PMP在消化道中的摄取。此外，在处理和未处理的线虫中分离总蛋白质后，可以使用抗GFP抗体(艾博抗公司)，使用标准方法通过蛋白质印迹定量秀丽隐杆线虫对GFP的摄取。记录GFP蛋白水平并在用负载GFP的PMP处理的线虫、单独的GFP蛋白处理的线虫和未处理的秀丽隐杆线虫之间进行比较，以确定摄取。
E.将Cre重组酶体内递送至小鼠
此实例描述了使PMP负载蛋白质，目的是经由口服和全身施用来体内递送蛋白质。在此实例中，将Cre重组酶用作模型蛋白，并且将具有荧光素酶Cre报告构建体(Lox-STOP-Lox-LUC)的小鼠用作体内模型(图4)。
可以使用本文所述的任一种方法将Cre重组酶递送至小鼠，如图4所示。荧光素酶在小鼠组织中的表达表明Cre已通过PMP递送到组织中。
实例9：使用超速离心和蔗糖梯度纯化从共混果汁生产PMP
此实例证明，可以通过共混水果并且使用顺序离心以除去碎片、超速离心以沉淀粗PMP、和使用蔗糖密度梯度以纯化PMP的组合从水果生产PMP。在此实例中，将葡萄柚用作模型水果。
a)通过超速离心和蔗糖密度梯度纯化生产葡萄柚PMP
用于使用共混器、超速离心和蔗糖梯度纯化生产葡萄柚PMP的工作流程在图5A中示出。从当地的Whole Foods
Figure BDA0003372619390001301
购买一个红色葡萄柚，并且除去白皮、黄皮、和节段膜以收集汁囊，将汁囊使用共混器以最大速度均化10分钟。将100mL汁用PBS稀释5x，然后以1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟进行顺序离心以除去大碎片。将28mL澄清的汁在4℃下在SorvallTMMX 120Plus微型超速离心机上使用S50-ST(4x 7mL)旋转桶式转子以150,000x g超速离心90分钟以获得粗PMP沉淀物，将该PMP沉淀物重悬于PBS pH7.4中。接下来，在Tris-HCL pH 7.2中制备蔗糖梯度，将粗PMP在蔗糖梯度顶部上分层(从上到下：8％、15.30.45％和60％蔗糖)，并且通过在4℃下使用S50-ST(4x 7mL)旋转桶式转子以150,000x g超速离心120分钟来旋转沉降。收集1mL级分，并且在30％-45％界面处分离PMP。通过在4℃下以150,000x g超速离心120分钟将级分用PBS洗涤，并且将沉淀物溶解在最少量PBS中。
使用Spectradyne nCS1TM颗粒分析仪使用TS-400筒确定PMP浓度(1x 109PMP/mL)和中值PMP尺寸(121.8nm)(图5B)。使用Malvern Zetasizer Ultra确定ζ电位，并且为-11.5+/-0.357mV。
此实例证明，可以使用超速离心与蔗糖梯度纯化方法的组合来分离葡萄柚PMP。然而，此方法在所有PMP生产步骤中以及在最终PMP溶液中诱导严重的样品胶凝。
实例10：使用超速离心和蔗糖梯度纯化从网压制的果汁生产PMP
此实例证明，可以在PMP生产过程中通过使用较温和的榨汁方法(网式滤器)来减少细胞壁和细胞膜污染物。在此实例中，将葡萄柚用作模型水果。
a)温和的榨汁减少了从葡萄柚PMP生产PMP过程中的胶凝
从红色葡萄柚分离汁囊，如实例9中所述。为了减少PMP生产过程中的胶凝，代替使用破坏性的共混方法，将汁囊轻轻地压在茶滤器网上以收集汁并且减少细胞壁和细胞膜污染物。差速离心后，该汁比使用共混器的更澄清，并且在蔗糖密度梯度离心后观察到在30％-45％相交处的一个干净的含有PMP的蔗糖条带(图6)。在PMP的生产过程中和之后，存在总体较少的胶凝。
我们的数据显示，当与包括共混的方法相比时，温和的榨汁步骤的使用减少了PMP生产过程中由污染物引起的胶凝。
实例11：使用超速离心和尺寸排除色谱法生产PMP
此实例描述了通过使用超速离心(UC)和尺寸排除色谱法(SEC)从水果中生产PMP。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)使用UC和SEC生产葡萄柚PMP
从红色葡萄柚分离汁囊，如实例9a中所述，并且轻轻地压在茶滤器网上以收集28ml汁。用于使用UC和SEC生产葡萄柚PMP的工作流程描绘在图7A中。简而言之，使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差速离心以除去大碎片。将28ml澄清的汁在4℃下在SorvallTMMX 120Plus微型超速离心机上使用S50-ST(4x 7mL)旋转桶式转子以100,000x g超速分离60分钟以获得粗PMP沉淀物，将该PMP沉淀物重悬于MES缓冲液(20mM MES，NaCl，pH 6)中。将沉淀物用MES缓冲液洗涤两次后，将最终的沉淀物重悬于pH7.4的1ml PBS中。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分。通过使用NanoFCM的纳米流式细胞术分析SEC洗脱级分，以使用由制造商提供的浓度和尺寸标准品确定PMP尺寸和浓度。另外，在SEC级分上确定280nm处的吸光度
Figure BDA0003372619390001321
和蛋白质浓度(PierceTMBCA测定，赛默飞世尔公司)，以鉴定PMP洗脱在哪些级分中(图7B-7D)。SEC级分2-4被鉴定为含有PMP的级分。对较早洗脱级分和较晚洗脱级分的分析表明，SEC级分3是主要的含有PMP的级分，其浓度为2.83x 1011PMP/mL(所有颗粒中的57.2％在50-120nm尺寸范围内)，并且中值尺寸为83.6nm+/-14.2nm(SD)。尽管晚期洗脱级分8-13具有非常低的如NanoFCM所示的颗粒浓度，但通过BCA分析在这些级分中检测到蛋白质污染物。
我们的数据显示，TFF和SEC可以用于从晚期洗脱污染物分离纯化的PMP，并且在此使用的分析方法的组合可以从晚期洗脱污染物中鉴定出PMP级分。
实例12：使用切向流过滤和尺寸排阻色谱法与减少污染物的EDTA/透析的组合来进行规模化PMP生产
此实例描述了通过使用切向流过滤(TFF)和尺寸排阻色谱法(SEC)与减少果胶大分子形成的EDTA孵育以及减少污染物的过夜透析的组合从水果中大规模生产PMP。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)使用TFF和SEC生产葡萄柚PMP
从当地的Whole
Figure BDA0003372619390001322
获得红色葡萄柚，并且使用榨汁机分离1000ml果汁。用于使用TFF和SEC生产葡萄柚PMP的工作流程描绘在图8A中。使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差速离心以除去大碎片。将澄清的葡萄柚汁浓缩并且使用TFF(5nm孔径)洗涤一次至2mL(100x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分。通过使用NanoFCM的纳米流式细胞术分析SEC洗脱级分，以使用由制造商提供的浓度和尺寸标准品确定PMP浓度。另外，确定SEC级分的蛋白质浓度(PierceTMBCA测定，赛默飞世尔公司)以鉴定PMP洗脱在其中的组分。从1升汁(100x浓缩)的规模化生产还在晚期SEC级分中浓缩了大量污染物，如可以通过BCA测定检测(图8B，上图)。当与单一葡萄柚分离相比时，该规模化生产中的总体的总PMP产率(图8B，下图)更低，这可以表明PMP的损失。
b)通过EDTA孵育和透析减少污染物
从当地的Whole
Figure BDA0003372619390001331
获得红色葡萄柚，并且使用榨汁机分离800ml汁。使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差速离心以除去大碎片，并且通过1μm和0.45μm过滤器过滤以除去大颗粒。将澄清的葡萄柚汁分为4个不同的处理组，各含有125ml汁。将处理组1如实例4a中所述进行加工，浓缩并且洗涤(PBS)至63x的最终浓度，并且经受SEC。在TFF之前，将475ml汁与最终浓度50mM EDTA(pH 7.15)在室温下一起孵育1.5小时以螯合铁并且减少果胶大分子的形成。之后，将汁分为三个处理组，这些处理组经受用PBS(不含钙/镁)pH 7.4、MES pH 6、或Tris pH 8.6洗涤液的TFF浓缩至63X的最终汁浓度。接下来，使用300kDa膜在4℃下将样品在相同的洗涤缓冲液中透析过夜，并且经受SEC。与仅TFF的对照的晚期洗脱级分中的高污染物峰相比，EDTA孵育随后进行过夜透析大大减少了污染物，如通过对糖和果胶的存在敏感的在280nm处的吸光度(图8C)和BCA蛋白分析(图8D)所示。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
我们的数据表明，与EDTA一起孵育然后进行透析减少了共纯化的污染物的量，从而促进规模化PMP生产。
实例13：从植物细胞培养基生产PMP
此实例证明，可以从植物细胞培养物生产PMP。在此实例中，黑色墨西哥甜玉米(Zea mays Black Mexican Sweet)(BMS)细胞系用作模型植物细胞系。
a)玉蜀黍BMS细胞系PMP的生产
从ABRC购买黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞系，并且在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(西格玛M5524)、2％蔗糖(S0389，密理博西格玛公司(MilliporeSigma))、1x MS维生素溶液(M3900，密理博西格玛公司)、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299，密理博西格玛公司)和250ug/L硫胺素HCL(V-014，密理博西格玛公司)的Murashige和Skoog基础培养基(pH 5.8)中在24℃下在搅拌(110rpm)下生长，并且每7天传代20％体积/体积。
传代后三天，收集160ml BMS细胞，并且以500x g旋转沉降5min以除去细胞以及以10,000x g旋转沉降40min以除去大碎片。使培养基通过0.45μm过滤器以除去大颗粒，并且将过滤的培养基浓缩并且通过TFF(5nm孔径)洗涤(100ml MES缓冲液、20mM MES、100mMNaCL，pH 6)至4mL(40x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过NanoFCM得到PMP浓度(通过在280nm处的吸光度
Figure BDA0003372619390001341
)以及通过蛋白质浓度测定(PierceTMBCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图9A-9C)。SEC级分4-6含有纯化的PMP(级分9-13含有污染物)，并且合并在一起。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定合并的含有PMP的级分中的最终PMP浓度(2.84x 1010PMP/ml)和中值PMP尺寸(63.2nm+/-12.3nm SD)(图9D-9E)。
这些数据显示，可以从植物液体培养基分离、纯化和浓缩PMP。
实例14：用负载蛋白质的PMP处理微生物
此实例证明，PMP可以外源负载蛋白质，PMP可以保护其货物免于降解，并且PMP可以将其功能性货物递送至生物体。在此实例中，葡萄柚PMP用作模型PMP，铜绿假单胞菌细菌用作模型生物体，并且荧光素酶蛋白用作模型蛋白。
尽管基于蛋白质和肽的药物具有影响具有抗性或难处理的许多种病原体细菌和真菌的适应度的很大潜力，但由于其不稳定性和配制挑战，因此其部署无法成功。
a)使用TFF与SEC的组合生产葡萄柚PMP
从当地的Whole Foods
Figure BDA0003372619390001351
获得红色有机葡萄柚。用榨汁机收集四升葡萄柚汁，用NaOH将pH调节至pH 4，与1U/ml果胶酶(西格玛公司，17389)一起孵育以除去果胶污染物，并且随后以3,000g离心20分钟，然后以10,000g离心40分钟以除去大碎片。接下来，在30分钟内将经加工的汁与500mM EDTA(pH 8.6)一起孵育至最终浓度50mM EDTA(pH 7.7)，以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使EDTA处理的汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁洗涤，并且使用300kDa TFF通过切向流过滤(TFF)进行浓缩。将汁浓缩5x，然后用PBS进行6体积交换洗涤，并且进一步过滤至最终浓度198mL(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度
Figure BDA0003372619390001352
和蛋白质浓度(PierceTMBCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分。将含有纯化的PMP(级分9-12含有污染物)的SEC级分3-7池化在一起，使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器过滤器通过顺序过滤进行过滤灭菌，并且通过以40,000x g沉淀PMP 1.5小时进一步浓缩，并将沉淀重悬浮于4mlUltraPureTMDNA酶/不含RNA酶的蒸馏水中(赛默飞世尔公司，10977023)。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定最终PMP浓度(7.56x 1012PMP/ml)和平均PMP尺寸(70.3nm+/-12.4nm SD)。
b)使葡萄柚PMP负载荧光素酶蛋白
如实例14a中所述生产葡萄柚PMP。荧光素酶(Luc)蛋白购自LSBio(目录号LS-G5533-150)，并且将其溶解于pH 7.4的PBS中至最终浓度为300μg/mL。使用改编自RachaelW.Sirianni和Bahareh Behkam(编辑),Targeted Drug Delivery:Methods and Protocols[靶向药物递送：方法和方案],Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第1831卷的方案通过电穿孔向过滤灭菌的PMP负载荧光素酶蛋白。将单独的PMP(PMP对照)、单独的荧光素酶蛋白(蛋白质对照)、或PMP+荧光素酶蛋白(负载蛋白质的PMP)与4.8x电穿孔缓冲液(在超纯水中的100％Optiprep(西格玛公司，D1556))混合以在反应混合物中具有最终21％Optiprep浓度(参见表6)。通过以下方式制造蛋白质对照：将荧光素酶蛋白与超纯水而不是Optiprep混合(蛋白质对照)，因为最终PMP-Luc沉淀物稀释在水中。将样品转移到冷却的比色皿中，并且使用Biorad
Figure BDA0003372619390001361
以0.400kV、125μF(0.125mF)、低100Ω-高600Ω电阻以两个脉冲(4-10ms)电穿孔。将反应在冰上放置10分钟，并且转移至预冰冷却的1.5ml超速离心管中。将含有PMP的所有样品通过以下方式洗涤3次：添加1.4ml超纯水，然后超速离心(在4℃下，100,000x g，1.5h)。将最终沉淀物重悬于最小体积的超纯水(50μL)中，并且保持在4℃直到使用。电穿孔后，仅含有荧光素酶蛋白的样品不通过离心洗涤，并且储存在4℃直到使用。
为了确定PMP的负载容量，使用1微升负载荧光素酶的PMP(PMP-Luc)和1微升未负载的PMP。为了确定负载在PMP中的荧光素酶蛋白的量，制作荧光素酶蛋白(LSBio，LS-G5533-150)标准曲线(10、30、100、300、和1000ng)。使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，E6110)并且使用
Figure BDA0003372619390001363
分光光度计测量发光来测定所有样品和标准品中的荧光素酶活性。使用荧光素酶蛋白(LSBio，LS-G5533-150)的标准曲线确定负载在PMP中的荧光素酶蛋白的量，并且相对于未负载的PMP样品中的发光归一化。负载容量(ng荧光素酶蛋白/1E+9个颗粒)计算为荧光素酶蛋白浓度(ng)除以负载的PMP(PMP-Luc)的数量。PMP-Luc负载容量是2.76ng荧光素酶蛋白/1x 109PMP。
我们的结果表明，PMP可以负载模型蛋白，该模型蛋白在包封后仍保持活性。
表6.使用电穿孔的荧光素酶蛋白负载策略。
Figure BDA0003372619390001362
注意：25μL荧光素酶等效于7.5μg荧光素酶蛋白。
c)用负载荧光素酶蛋白的葡萄柚PMP处理铜绿假单胞菌
根据供应商的说明，使铜绿假单胞菌(ATCC)在补充有50ug/ml利福平的胰蛋白酶大豆肉汤中在30℃下过夜生长。通过以3,000x g离心5min收集铜绿假单胞菌细胞(总体积5ml)。将细胞用10ml 10mM MgCl2洗涤两次，并且重悬于5ml 10mM MgCl2中。测量OD600并且调节至0.5。
在含有50μl补充有3ng PMP-Luc(稀释在超纯水中)、3ng游离荧光素酶蛋白(仅蛋白质的对照；稀释在超纯水中)、或超纯水(阴性对照)的重悬的铜绿假单胞菌细胞的1.5mlEppendorf管中一式两份地进行处理。将超纯水添加到75μl所有样品中。将样品混合并且在室温下孵育2h并且用铝箔覆盖。接下来将样品以6,000x g离心5min，并且收集70μl上清液并且保存用于荧光素酶检测。随后将细菌沉淀物用500μl含有0.5％Triton X-100的10mMMgCl2洗涤3次，以除去/爆破未被吸收的PMP。用1ml 10mM MgCl2进行最后洗涤以除去残余的Triton X-100。除去970μl上清液(将沉淀物留在30ul洗涤缓冲液中)，并且添加20μl 10mMMgCl2和25μl超纯水以重悬铜绿假单胞菌沉淀物。根据制造商的说明，通过使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司，E6110)的发光测量荧光素酶蛋白。将样品(细菌沉淀物和上清液样品)孵育10分钟，并且在
Figure BDA0003372619390001371
分光光度计上测量发光。用负载荧光素酶蛋白的葡萄柚PMP处理的铜绿假单胞菌具有比单独的游离荧光素酶蛋白或超纯水对照(阴性对照)的处理高19.3倍的荧光素酶表达，表明PMP能够高效地将其蛋白质货物递送到细菌中(图10)。另外，PMP似乎保护荧光素酶蛋白免受降解，因为在上清液和细菌沉淀物两者中的游离荧光素酶蛋白水平均非常低。考虑到处理剂量为3ng荧光素酶蛋白，基于荧光素酶蛋白标准曲线，在水中室温孵育2小时后的上清液或细菌沉淀物中的游离荧光素酶蛋白对应于<0.1ng荧光素酶蛋白，表明蛋白质降解。
我们的数据显示，PMP可以将蛋白质货物递送到生物体中，并且PMP可以保护其货物免受环境降解。
实例15：负载胰岛素的PMP保护其蛋白质货物免受酶促降解
此实例证明，人胰岛素蛋白被负载到柠檬和葡萄柚PMP中，并且这些PMP包封的胰岛素被保护免于被蛋白酶K和模拟胃肠(GI)液降解。可以经受住GI液降解的组合物可用于化合物(例如蛋白质)的口服递送。
a)PMP的生产
柠檬和葡萄柚获得自当地杂货店。将水果用1％
Figure BDA0003372619390001381
洗涤剂洗涤并在温水中漂洗。使用榨汁机收集柠檬汁和葡萄柚汁各六升，将其通过1mm网孔径金属过滤器脱除果肉，并在添加终浓度为0.5U/mL的果胶酶(来自黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酶，西格玛公司)之前用10N氢氧化钠调节至pH 4.5。将果汁与果胶酶在25℃下孵育2小时并且随后以3,000x g离心20分钟，然后以10,000x g离心40分钟以去除大碎片。接下来，将EDTA添加到加工的汁中，至终浓度为50mM，并将pH调节至7.5。通过11μm滤纸
Figure BDA0003372619390001382
真空过滤，随后通过1μM注射器过滤(玻璃纤维，
Figure BDA0003372619390001383
)和0.45μM真空过滤(PES，
Figure BDA0003372619390001384
科学产品)进行汁澄清，以去除大颗粒。
随后将过滤的汁浓缩，洗涤，并使用300kDa孔径的中空纤维过滤器通过切向流过滤(TFF)再次浓缩。将汁浓缩8x，随后渗滤到10个透析体积的1X PBS(pH 7.4)中，并基于初始汁体积进一步浓缩至50x的最终浓度。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法(SEC；maxiPURE-EV尺寸排阻色谱柱，HansaBioMed生命科学公司(HansaBioMed Life Sciences))洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度(
Figure BDA0003372619390001385
分光光度计)分析这些级分并通过BCA测定(PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒，赛默飞世尔公司)确定蛋白质浓度，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分。柠檬SEC级分3-8(早期级分)含有纯化的PMP；级分9-14含有污染物。葡萄柚SEC级分3-7(早期级分)含有纯化的PMP；级分8-14含有污染物。将早期级分合并并在无菌条件下，在组织培养罩中通过使用1μm玻璃纤维注射器过滤器(
Figure BDA0003372619390001386
颇尔公司(Pall Corporation))、0.45μm注射器过滤器(
Figure BDA0003372619390001387
PURADISCTM)和0.22μm(
Figure BDA0003372619390001388
PURADISCTM)注射器过滤器顺序过滤来过滤灭菌。然后，通过在4℃下以40,000xg超速离心1.5小时来浓缩PMP。将PMP沉淀物重悬于5.5mL的无菌1X PBS(pH 7.4)中。通过NanoFCM，使用制造商提供的浓度和尺寸标准，确定最终的PMP浓度(7.59x 1013柠檬PMP/mL；3.54x 1013葡萄柚PMP/mL)和PMP中值尺寸。通过BCA(PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒，赛默飞世尔公司)确定最终的PMP悬浮液的蛋白质浓度(柠檬PMP 1.1mg/mL；葡萄柚PMP 4.4mg/mL)。超速离心2mL生产的柠檬PMP和2mL生产的葡萄柚PMP(1.5小时，40,000x g，4℃)以用UltraPureTM水(英杰公司)代替PBS缓冲液，并通过NanoFCM重新测量该浓度(8.42x 1013柠檬PMP/mL；3.29x 1013葡萄柚PMP/mL)。将这些PMP悬浮液用于如实例15b中所述的脂质提取。
b)使PMP负载胰岛素蛋白
使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,Can J Biochem Physiol[加拿大生物化学与生理学杂志],37:911-917,1959)从柠檬和葡萄柚PMP中提取总脂质。通过在4℃下以40,000x g超速离心1.5小时来制备PMP沉淀物，并将其重悬于UltraPureTM水(英杰公司)中。在玻璃管中，以1:2v/v的比率制备氯仿:甲醇(CHCl3:MeOH)的混合物。对每1mL的PMP样品，添加3.75mL的CHCl3:MeOH并涡旋。然后，添加1.25mL CHCl3并涡旋。最后，添加1.25mLUltraPureTM水(英杰公司)并涡旋。将此制剂在室温下在台式离心机中以210x g离心5分钟以给出两相系统(顶部是水相，底部是有机相)。使用玻璃巴斯德吸管回收有机相，注意避开水相和中间相。将有机相等分到含有约2-3mg脂质的较小体积中(1L柑橘汁产生约3-5x1013PMP，其对应于约10mg脂质)。将脂质等分试样在氮气下干燥并在-20℃下储存直至使用。
将重组人胰岛素(吉博科公司，目录号A11382II)以10mg/mL溶解于10mM盐酸中并在水中稀释至1mg/mL。由3mg干燥柠檬PMP脂质和0.6mg胰岛素(5:1w/w比率)制备负载胰岛素的脂质重构的PMP(recPMP)，并将其以600μL的体积添加到脂质膜中。添加玻璃珠(约7-8)并将溶液在室温下搅拌1-2小时。然后将样品在室温下在水浴超声仪(必能信公司(Branson))中进行超声处理5分钟，涡旋并在室温下再搅拌1-2小时。然后使用具有连续800nm、400nm和200nm聚碳酸酯膜的Mini Extruder(
Figure BDA0003372619390001391
Polar Lipids)将配制品挤出。随后，使用ZebaTM旋转脱盐柱(40kDa MWCO，赛默飞世尔科技公司)纯化配制品，随后以100,000x g超速离心45分钟，并用UltraPureTM水洗涤一次。将沉淀物重悬于1X PBS(pH7.4)中，最终浓度为7.94x 1011recPMP/mL(使用nanoFCM测量)。
类似地配制负载胰岛素的葡萄柚recPMP，不同的是将2mg的干燥脂质与0.4mg的胰岛素混合(保持5:1w/w比率)。将样品在室温下搅拌3.5小时，超声处理5分钟，涡旋，并再超声处理5分钟(全部在室温下)。如上所述进行挤出。使用
Figure BDA0003372619390001405
超速离心过滤器(100KMWCO，密理博公司)，以14,000x g持续5分钟(重复一次)，随后ZebaTM旋转脱盐柱(40kDaMWCO，赛默飞世尔科技公司)和如上所述的超速离心进行纯化。将沉淀物重悬于1X PBS中，最终浓度为1.19x 1012recPMP/mL(使用nanoFCM测量)。
为了评估负载进recPMP中的胰岛素并测试来自柠檬和葡萄柚PMP脂质的负载胰岛素的recPMP是否可以保护人胰岛素蛋白，进行蛋白酶K(ProtK)处理，随后蛋白质印迹分析。为此，将负载胰岛素的recPMP样品与50mM Tris盐酸盐(pH 7.5)和5mM氯化钙中的20μg/mLProtK(New England
Figure BDA0003372619390001406
公司)一起在37℃下伴随搅拌孵育1小时。
为了评估胰岛素蛋白水平，将样品(10μL)用Laemmli样品缓冲液稀释(用橙色G(西格玛公司)取代溴酚蓝)以消除成像过程中的信号干扰。将样品煮沸10分钟，在冰上冷却，加载到Tris-甘氨酸凝胶(TGXTM，伯乐公司)上。随后，根据制造商的说明，使用iBlotTM2系统(英杰公司)将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜用1X PBS(pH 7.4)简单洗涤，并在室温下用Odyssey封闭缓冲液(Li-COR)封闭1小时。然后将膜与1:1000兔抗胰岛素一抗(ab181547，艾博抗公司)，随后与1:10,000山羊抗兔
Figure BDA0003372619390001401
800CW二抗(Li-COR)各孵育2小时。每次抗体孵育后，将膜用具有0.1％
Figure BDA0003372619390001402
20(西格玛公司)的1X PBS洗涤三次并在1X PBS中最后漂洗。将膜在iBrightTM1500FL(InvitrogenTM)上成像。柠檬和葡萄柚胰岛素-recPMP样品显示出相当水平的胰岛素蛋白(经或未经ProtK处理)，表明胰岛素包封在PMP内并受到其保护。基于游离胰岛素蛋白标准并针对PMP浓度归一化对负载的胰岛素的量进行的定量揭示了每109个柠檬recPMP负载21ng胰岛素。
为了确定在蛋白酶K(ProtK)处理之前或之后裂解PMP脂质膜是否会影响胰岛素稳定性，用以下处理负载葡萄柚胰岛素的recPMP样品：(1)1％TRITONTMX-100持续30分钟(裂解脂质膜并暴露蛋白质货物)；(2)10μg/mL ProtK处理1小时；(3)1％TRITONTMX-100持续30分钟，随后10μg/mL ProtK处理1小时，并通过添加10mM PMSF来灭活反应；和(4)10μg/mlProtK处理1小时，通过添加10mM PMSF，随后1％TRITONTMX-100持续30分钟来灭活ProtK。所有处理均在37℃下伴随搅拌进行。如上所述针对每个样品进行胰岛素的蛋白质印迹(图11A)。仅当ProtK消化前通过TRITONTMX-100裂解PMP膜时，包封的胰岛素货物才被降解，这证明胰岛素蛋白被包封在PMP内并且PMP保护蛋白质货物免受ProtK酶促消化。
c)负载胰岛素的PMP在GI液中的稳定性
为了进一步评估包封的胰岛素的稳定性，将由柠檬脂质制备的负载的PMP暴露于含有相关胆汁酸、消化酶和pH的模拟GI液中以模拟不同的胃肠环境和条件。消化缓冲液购自Biorelevant公司并根据制造商的说明制备。使用以下缓冲液：FaSSGF(禁食的胃，pH1.6)、FaSSIF(禁食的小肠，pH 6.4)和FeSSIF(进食的小肠，pH 5.8)。将1X PBS(pH 7.4)用作阴性对照。对于每个样品，在低涡旋下将980μL缓冲液添加到20μL负载胰岛素的recPMP(柠檬；7.94x 1011recPMP/mL)中。每个处理(缓冲条件)一式两份进行。将负载胰岛素的recPMP在FaSSGF中孵育1小时并在所有其他缓冲液中孵育4小时，以接近人消化系统中的通过时间。在37℃下在缓慢旋转下进行所有孵育。在37℃下孵育后，将样品置于冰上并以100,000x g离心50分钟，以沉淀负载胰岛素的recPMP。将样品通过在UltraPureTM水(英杰公司)中重悬来洗涤一次并再次离心。然后将沉淀物重悬于10μL UltraPureTM水中并用于蛋白质印迹分析以检测如上所述的胰岛素蛋白。GI缓冲液处理样品的成像(图11B)揭示，负载胰岛素的recPMP在模拟禁食胃(FaSSGF)和禁食小肠(FaSSIF)的缓冲液中是稳定的。然而，在模拟的进食小肠(FeSSIF)缓冲液中，不能检测到胰岛素(图11B)，表明在这些条件下，负载胰岛素的recPMP囊泡不能保护胰岛素免于降解。游离胰岛素蛋白仅在1X PBS中稳定，但在使用的所有三种GI缓冲液中都不稳定(数据未显示)。综上所述，这些实验表明，来自柑橘脂质的重构PMP保护其蛋白质有效负载免受低pH(FaSSGF)和消化酶/GI液(ProtK、FaSSIF)的降解。
其他实施例
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
其他实施例在权利要求中。
要求保护的是：
附录
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Claims (54)

1.一种包含一种或多种外源多肽的植物信使包(PMP)，其中该一种或多种外源多肽是哺乳动物治疗剂并且被PMP包封，并且其中这些外源多肽不是病原体防治剂。
2.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是酶。
3.如权利要求2所述的PMP，其中该酶是重组酶或编辑酶。
4.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是抗体或抗体片段。
5.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是Fc融合蛋白。
6.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是激素。
7.如权利要求6所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是胰岛素。
8.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是肽。
9.如权利要求1所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂是受体激动剂或受体拮抗剂。
10.如权利要求1-9中任一项所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂具有小于100kD的尺寸。
11.如权利要求10所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂具有小于50kD的尺寸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂具有中性的总电荷。
13.如权利要求12所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂已经修饰以具有中性电荷。
14.如权利要求1-11中任一项所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂具有正的总电荷。
15.如权利要求1-11中任一项所述的PMP，其中该哺乳动物治疗剂具有负的总电荷。
16.如权利要求1-15中任一项所述的PMP，其中在与该PMP接触的靶细胞中，该外源多肽从该PMP中释放。
17.如权利要求16所述的PMP，其中该外源多肽在该靶细胞的细胞质中发挥活性。
18.如权利要求16所述的PMP，其中该外源多肽被易位至该靶细胞的细胞核。
19.如权利要求18所述的PMP，其中该外源多肽在该靶细胞的细胞核中发挥活性。
20.如权利要求1-19中任一项所述的PMP，其中相对于未被PMP包封的该外源多肽的摄取，细胞对被该PMP包封的该外源多肽的摄取增加。
21.如权利要求1-20中任一项所述的PMP，其中相对于未被PMP包封的该外源多肽的有效性，被该PMP包封的该外源多肽的有效性增加。
22.如权利要求1-21中任一项所述的PMP，其中该外源多肽包含至少50个氨基酸残基。
23.如权利要求1-22中任一项所述的PMP，其中该外源多肽的尺寸是至少5kD。
24.如权利要求1-23中任一项所述的PMP，其中该PMP包含纯化的植物细胞外囊泡(EV)或其节段或提取物。
25.如权利要求24所述的PMP，其中该EV或其节段或提取物获得自柑橘属果实。
26.如权利要求25所述的PMP，其中该柑橘属果实是葡萄柚或柠檬。
27.一种组合物，该组合物包含多个如权利要求1-26中任一项所述的PMP。
28.如权利要求27所述的组合物，其中该组合物中的这些PMP的浓度有效增加哺乳动物的适应度。
29.如权利要求27或28所述的组合物，其中该外源多肽的浓度为至少0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或1μg多肽/mL。
30.如权利要求27-29中任一项所述的组合物，其中该多个PMP中的至少15％的PMP包封该外源多肽。
31.如权利要求30所述的组合物，其中该多个PMP中的至少50％的PMP包封该外源多肽。
32.如权利要求31所述的组合物，其中该多个PMP中的至少95％的PMP包封该外源多肽。
33.如权利要求27-32中任一项所述的组合物，其中该组合物被配制用于施用于哺乳动物。
34.如权利要求27-33中任一项所述的组合物，其中该组合物被配制用于施用于哺乳动物细胞。
35.如权利要求27-34中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
36.如权利要求27-35中任一项所述的组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
37.如权利要求27-36中任一项所述的组合物，其中这些PMP在4℃下稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。
38.如权利要求37所述的组合物，其中这些PMP进一步在至少20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
39.一种包含多个PMP的组合物，其中这些PMP中的每个是植物EV、或其节段或提取物，其中该多个PMP中的每个包封外源多肽，其中该外源多肽是哺乳动物治疗剂，该外源多肽不是病原体防治剂，并且该组合物被配制用于递送至动物。
40.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-26中任一项所述的组合物和药学上可接受的媒介物、载剂或赋形剂。
41.一种产生包含外源多肽的PMP的方法，其中该外源多肽是哺乳动物治疗剂，并且其中该外源多肽不是病原体防治剂，该方法包括：
(a)提供包含该外源多肽的溶液；以及
(b)使该PMP负载该外源多肽，其中该负载导致该外源多肽被该PMP包封。
42.如权利要求41所述的方法，其中该外源多肽可溶于该溶液中。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中该负载包含超声处理、电穿孔和脂质挤出中的一种或多种。
44.如权利要求43所述的方法，其中该负载包含超声处理和脂质挤出。
45.如权利要求43所述的方法，其中该负载包含脂质挤出。
46.如权利要求45所述的方法，其中在脂质挤出前分离PMP脂质。
47.如权利要求46所述的方法，其中这些分离的PMP脂质包含糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)。
48.一种用于将多肽递送至哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包含一种或多种外源多肽的PMP，其中该一种或多种外源多肽是哺乳动物治疗剂并且被该PMP包封，并且其中这些外源多肽不是病原体防治剂；以及
(b)使该细胞与该PMP接触，其中以足以允许由该细胞摄取该PMP的量和时间进行接触。
49.如权利要求48所述的方法，其中该细胞是受试者中的细胞。
50.如权利要求1-49中任一项所述的PMP、组合物、药物组合物、或方法，其中该哺乳动物是人。
51.一种用于治疗糖尿病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含多个PMP的组合物，其中一种或多种外源多肽被该PMP包封。
52.如权利要求51所述的方法，其中该多个PMP的施用降低了该受试者的血糖。
53.如权利要求52所述的方法，其中该外源多肽是胰岛素。
54.如权利要求1-53中任一项所述的PMP、组合物、药物组合物、或方法，其中该PMP不会被胃液显著降解。
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