CN113929975B

CN113929975B - 壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物、水凝胶、其制备方法及医疗用途

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Publication number: CN113929975B
Application number: CN202111416003.XA
Authority: CN
Inventors: 刘丽; 郭志刚; 姜楠; 付博
Original assignee: TIANJIN CHEST HOSPITAL; Nankai University
Current assignee: TIANJIN CHEST HOSPITAL; Nankai University
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN113929975A

Abstract

本发明提供一种壳聚糖‑蛋白质水凝胶组合物，包含第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液包含二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物，第二溶液包含具有裸露巯基修饰的还原性牛血清白蛋白。本发明还提供由该组合物制备的水凝胶、以水凝胶为载体的药物制剂及它们的制备方法。该水凝胶组合物的一个医疗用途是作为治疗心肌梗塞的支架材料，其有高度的生物相容性和适宜的降解性能。

Description

壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物、水凝胶、其制备方法及医疗用途

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种可注射水凝胶、制备方法及其用途。

背景技术

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是一种常见的缺血性心脏病，表现为冠状动脉硬化和/或堵塞后心肌细胞因局部缺血、缺氧而坏死，仅以瘢痕纤维组织替代，室壁变薄，心室扩大，心功能进行性下降，最终导致心力衰竭。目前临床上还缺乏治疗MI的有效手段。而近年来的一个有益探索是利用促血管生长因子诱导梗死区域组织的血管生成，国内外研究者发现碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)具有促进缺血组织血管生成、加速侧枝循环建立、减少心梗面积且提高心脏功能的作用。但是，注射到缺血组织部位的bFGF存在体内扩散快、半衰期短、生物活性难保持、心肌修复作用不能按需实现等问题，从而限制了它的应用。随着组织工程研究的不断发展，利用可注射支架材料负载促血管生长因子直接注射到心肌损伤部位进行心肌修复，由于具有创伤小而更利于临床应用，成了心肌组织工程的研究热点之一。水凝胶作为一种新型生物医用可注射支架，在心肌修复方面发挥着重要的作用。这是由于水凝胶的三维网状交联结构不仅能够替代降解的细胞外基(Extracellular matrix，ECM)，挽救濒死心肌并防止梗死周边心肌细胞因失去ECM的支持而发生坏死，而且对受损心肌起到一定的机械支撑作用，使得心室变厚，压力降低，从而抑制心室重构。

目前，可注射壳聚糖水凝胶作为心肌组织工程中最常用的一种天然支架材料，具有良好的生物相容性、生物降解性、细胞粘附性、杀菌、防黏连等优点，已经在可注射心肌组织工程中得到应用。然而，目前的壳聚糖水凝胶在机械性能、稳定性等方面存在诸多问题，采用化学交联的方法虽然能解决上述问题，但是常用的方法会使用一些有毒且难去除的小分子交联剂如甲醛、乙二醛、碳二亚胺等，因此获得优良力学性能、无毒副作用、良好生物相容性的交联型可注射壳聚糖水凝胶仍是该领域内的技术难点。

发明内容

本发明的目的是，提供一种医用可注射水凝胶支架，其不引入有毒物质，与人体完全相容，且在人体内可降解，是一种安全的向人体递送药物的材料。

本发明的另一目的是，提供一种用于治疗心肌梗死的药物组合物，该组合物为一种有治疗活性的药物，将该组合物负载在一种无毒、可降解的壳聚糖-蛋白质水凝胶上。

本发明的又一目的是提供上述支架和其它治疗性药物组合物的制备方法。

根据本发明的第一方面，提供一种壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物，包含第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液包含二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物，第二溶液包含具有裸露巯基的还原性牛血清白蛋白。

根据本发明的第二方面，提供一种壳聚糖-蛋白质水凝胶，其由一种二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物和一种具有裸露巯基的还原性牛血清白蛋白交联形成。

本发明的第三方面提供一种制备上述壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物的方法，包括如下步骤：

1)将2-亚氨基硫烷盐酸盐的水溶液加入到所述壳聚糖衍生物的水溶液中，反应得到巯基修饰壳聚糖水溶液；

2)将二硫二吡啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液加到上述溶液中，反应完成后，用PBS缓冲溶液透析两天，冷冻干燥，得到所述二硫二吡啶修饰的壳聚糖衍生物；

3)将步骤2)所得二硫二吡啶修饰的壳聚糖衍生物配置成缓冲液，得到所述第一溶液；

4)将牛血清白蛋白溶解在PBS缓冲液，加入溶解在PBS缓冲液中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，在冰水浴中脱气搅拌；

5)步骤4)反应产物在冷PBS缓冲溶液中透析两天，冷冻干燥得到所述还原性牛血清白蛋白的PBS缓冲液，配置成所述第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液分开储存。

本发明的第四方面提供一种壳聚糖-蛋白质水凝胶的制备方法，其将前述第一溶液和第二溶液均匀混合，在32-40℃下反应。

优先地，所述第一溶液中二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的浓度是3-5w/v％，所述第二溶液中还原性牛血清白蛋白的浓度为0.75-3w/v％。

优选地，所述第一溶液和第二溶液是以等体积混合。

在本发明的第五方面，提供一种将上述壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物用于治疗心肌梗死的医用材料中的用途，所述医用材料包含由所述第一溶液和第二溶液现场制备的壳聚糖-蛋白质水凝胶和碱性成纤维细胞生长因子。

在一种具体实施方式中，所述还原性牛血清白蛋白和二硫二巯基修饰的羧甲基壳聚糖基本为1︰1的质量比使用。

在一种具体实施方式中，所述第一溶液和第二溶液皆是PBS缓冲溶液，pH值为7.4，浓度为100mM。

附图说明

图1是实施例1中各相关物质的红外光谱图；

图2是用流变仪测试实施例3产品的结果图，显示二硫吡啶与巯基的摩尔比及二硫二吡啶修饰的壳聚糖水凝胶的固含量对水凝胶力学性能的影响。

图3是实施例3所得水凝胶的电子显微镜照片。

图4是CKK-8法对水凝胶的细胞毒性的评价结果。

图5是实施例3所得水凝胶的降解测试结果图示。

图6是心梗治疗效果大鼠实验的心脏超声心动图检测结果。

图7是四组大鼠心脏组织标本组织形态学检测结果的显示图。

图8显示免疫组织化学染色和血管计数结果。

具体实施方式

在本发明第一方面的壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物中，第一溶液包含二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物，第二溶液包含还原性牛血清白蛋白，该蛋白具有裸露的巯基。在使用该组合物之前，第一溶液和第二溶液被分开储存。

本发明中，壳聚糖衍生物是将壳聚糖改性使其成为具有所需水溶性的衍生物，该衍生物包括羧化壳聚糖和壳聚糖盐类，羧化壳聚糖的例子包括但不限于羧甲基壳聚糖，壳聚糖盐类包括但不限于壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐，本发明中最优选羧甲基壳聚糖。在使用羧甲基壳聚糖的情况下，壳聚糖衍生物的分子量可以在10-30万之间。在典型的实施方式中，使用了分子量为15-25万的羧甲基壳聚糖。分子量低于10万时，所得水凝胶的机械性能变劣。在10-30分子量范围，可以通过调节羧甲基化程度来获得需要的水溶性。本发明中，羧化程度不适宜超过95％，优选不超过90％。因为过高的羧化会过分消耗壳聚糖衍生物中的反应性基团(例如羟甲基和氨基)，从而使后面进一步的改性难度增加。在本发明一个优选的实施例中，使用了分子为18-22万、羧甲基化程度为75-85％区间的羧甲基壳聚糖。

本发明的一个特征是，将前述壳聚糖衍生物进行修饰，使得在分子链上带有二硫吡啶基团，该二硫吡啶基团可以与本发明中提供的生物大分子交联剂发生化学键合，形成网络结构而形成水凝胶。该二硫吡啶基团可以通过适当的反应直接与壳聚糖衍生物连接，例如连接在游离的氨基或者羟甲基上，还可以通过一个生理可接受的基团将二硫吡啶基团间接地连接于前述氨基或羟甲基，换言之，在氨基或者羟甲基上连接上一个带有二硫吡啶基团的小分子(moiety)。

在本发明的一个最优选的实施例中，该二硫吡啶基团是通过2-亚氨基硫烷盐酸盐连接在壳聚糖的氨基形成的，见反应式I。

该方案中，第一步反应得到巯基修饰的羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)，然后利用巯基的反应活性与二硫二吡啶反应，得到二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖(CMCS-S-S-Py)。这种实施方式具有很好的优势，可以利用高效的巯基-二硫交换反应，将第一步所得的巯基修饰羧甲基壳聚糖完全转化为二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖。

在一个具体方面，在所得的二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖中，每个壳聚糖分子中被引入5-40个二硫吡啶官能团，优选7-30个，例如7-20个，典型的实施例显示，当每个壳聚糖分子中携带8-15范围内的整数个二硫吡啶基团时，所得水凝胶的成型性和机械性能最为理想。

本发明中，对牛血清白蛋白(BSA)进行改性，使所得的改性产品中具有裸露的巯基(-SH)，本说明书中称之为还原性牛血清白蛋白(rBSA)。在一种具体实施方式中，还原性牛血清白蛋白是通过将牛血清白蛋白与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)反应得到，见反应式II。

这种修饰方式具有特殊的优势，其无毒，且提供在生理条件下高度活泼的巯基，很容易与壳聚糖衍生物中的二硫吡啶基团发生反应而交联。形成的交联网络具有适宜的机械性能，而且可以在所需的时间内降解。

本发明优选的实施方式中，每个还原性牛血清白蛋白中含有5-20个裸露的巯基，优选具有8-12个。

在本发明的壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物中，通常第一溶液和第二溶液是PBS缓冲溶液，其中第一溶液浓度优选3-5w/v％，最优选3w/v％。第二溶液浓度优选0.75-3w/v％，最优选3w/v％。

上述壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物可以用来现场制备可注射水凝胶，在人体内形成支架，用于组织修复。使用时将所需药物与第一溶液和第二溶液混合，其中，还原性牛血清白蛋白和二硫二巯基修饰的羧甲基壳聚糖基本为1︰1的质量比使用，然后注入体内。在另一个变型例中，还原性牛血清白蛋白被制成冻干粉，注射前将其溶于所需药物的PBS缓冲液中，然后与第一溶液均匀混合即可。为此，可以提供一种药用组合物，其在第一溶液和第二溶液之一中进一步引入一种或多种所需药物(抗生素，抗癌药物，生长因子等)，使用时将第一溶液和第二溶液均匀混合后注入体内，在相应位置形成携带药物的支架材料。

本发明组合物的一个典型应用是，用本组合物制备负载有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的水凝胶支架，将其注射到心脏的心肌损伤部位进行心肌修复。在一种优选的具体方式中，将第一溶液配制成固含量为3-5w/v％的PBS缓冲液(pH 7.4)，将第二溶液配制成0.75-3w/v％的PBS缓冲液(pH 7.4)，使用前两个溶液等体积均匀混合，并引入需要量的bFGF，然后将所得混合物在所需时间内注射到体内。

本发明的第二方面，还提供一种壳聚糖-蛋白质水凝胶，其由一种二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物和一种具有裸露巯基的还原性牛血清白蛋白交联形成。该水凝胶中还负载一种或者多种具有有益生理活性的物质，这样，可以实现该生理活性物质以受控制的速度向人体或者动物体的预定部位的输送，例如一种水凝胶贴剂，贴于人体或者动物体体外，用于向皮下组织缓慢输送一种或者多种生理活性物质，例如用于美容的面膜、用于治疗皮肤病的贴剂、用于止血的凝血剂。

该壳聚糖水凝胶中，所述壳聚糖衍生物优选是羧甲基壳聚糖，分子量可以在10-30万之间。在典型的实施方式中，使用了分子量为15-25万的羧甲基壳聚糖，。分子量低于10万时，所得水凝胶的机械性能变劣。在10-30分子量范围，可以通过调节羧甲基化程度来获得适宜的水溶性。本发明中，羧化程度不适宜超过95％，优选不超过90％。因为过高的羧化程度会过分消耗壳聚糖衍生物中的反应性基团(例如羟甲基和氨基)，从而增加后续的改性难度。在本发明一个优选的实施例中，使用了分子为18-22万、羧化程度为75-85％区间的羧甲基壳聚糖。

将二硫吡啶基团引入壳聚糖衍生物的具体方式如前面所详细描述。在二硫吡啶修饰壳聚糖衍生物中，每个壳聚糖衍生物分子中可以含有5-40个二硫吡啶官能团，其中优选的数量在前面已经阐述。

作为优选，还原性牛血清白蛋白是由牛血清白蛋白改性而来，使得每个蛋白分子中含有5-20个裸露的巯基，该巯基可以高效地与前述二硫吡啶基团发生交换反应，交联成多孔网络结构。一种具体方式中，还原性牛血清白蛋白是通过将牛血清白蛋白与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应得到。

一种优选是，二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物与还原性牛血清白蛋白的质量比使得二硫吡啶基团与巯基的摩尔比为1:2。

本发明第三方面涉及制备前述壳聚糖-蛋白质水凝胶组合物的制备方法，包括：1)将2-亚氨基硫烷盐酸盐的水溶液加入到所述壳聚糖衍生物的水溶液中，反应得到巯基修饰壳聚糖水溶液；2)将二硫二吡啶加到上述溶液中，反应完成后，用PBS缓冲溶液透析，冷冻干燥，得到二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物；3)将步骤2)所得二硫二吡啶修饰的壳聚糖衍生物配置成缓冲液，得到所述第一溶液；4)将牛血清白蛋白溶解在PBS缓冲液，加入溶解在PBS缓冲液中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，在冰水浴中脱气搅拌；5)步骤4)反应产物在冷PBS缓冲溶液中透析，冷冻干燥得到所述还原性牛血清白蛋白的PBS缓冲液，配置成所述第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液分开储存。

本发明中，壳聚糖衍生物的分子量通常在15-30万之间。一个具体实施方式是使用羧甲基壳聚糖，分子量在18-22万之间，羧化率在75-85％之间，其与2-亚氨基硫烷盐酸盐和二硫二吡啶的质量比为1︰0.015-0.030︰0.86-0.18，优选1︰0.025-0.30︰0.13-0.18。

步骤4)中，牛血清白蛋白与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的质量比为1︰0.03-0.05之间，优选1︰0.04，其中所述壳聚糖衍生物与所述牛血清白蛋白的用量比基本为1︰1。

步骤2)和步骤5)中，透析优选用pH为6.0、10mM的PBS缓冲溶液进行。

本发明的第四方面，提供种壳聚糖-蛋白质水凝胶的制备方法，该方法是将前述第一溶液和第二溶液均匀混合，在32-40℃下反应所需时间得到。一种优选方式是，第一溶液中二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的浓度是3-5w/v％，第二溶液中还原性牛血清白蛋白的浓度为0.75-3w/v％。在还原性牛血清白蛋白的浓度为3w/v％时，优选将第一溶液和第二溶液等体积混合。

下面以具体实施例进一步例举说明本发明的实施方案，其中的操作细节不能被理解为对本发明技术方案的限制。

实施例1二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的制备

将0.5g羧甲基壳聚糖(CMCS，分子量20万，羧化程度约80％)溶解在45mL去离子水中，氩气保护下，将1mL溶解在去离子水中的2-亚氨基硫烷盐酸盐(13.4mg)加入到羧甲基壳聚糖溶液中。在37℃条件下反应4h，得到巯基修饰的羧甲基壳聚糖(CMCS-SH)，利用Ellman试剂法测得平均每个羧甲基壳聚糖分子中含有9个巯基官能团。将5mL溶解在DMF中的二硫二吡啶(77.1mg)溶液加入到上述溶液中，反应12h。反应产物用PBS缓冲溶液(pH＝6.0,10mM)透析两天(MWCO 12kDa)，冷冻干燥，得到二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖(CMCS-S-S-Py)。

利用Ellman试剂法测定二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖中巯基的含量，以间接计算羧甲基壳聚糖中二硫吡啶的含量，计算结果为平均每个羧甲基壳聚糖分子中含有9个二硫二吡啶官能团。同时，利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对羧甲基壳聚糖，巯基修饰的羧甲基壳聚糖以及二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖进行了表征，从图1中可以看出在二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖在940cm^-1处出现了苯环的C-H弯曲振动吸收峰，证明二硫吡啶已经成功修饰到羧甲基壳聚糖分子上。

实施例2还原性牛血清白蛋白的制备

将0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶解在50mL PBS缓冲液(pH 8.0,10mM)中，加入溶解在1mL PBS缓冲液中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP，19.3mg)，混合溶液在冰水浴中脱气搅拌5h，反应产物在冷PBS缓冲溶液(pH 6.0,10mM)中透析两天，冷冻干燥得到还原性牛血清白蛋白(rBSA)。利用Ellman试剂法测得平均每个BSA分子中含有6个巯基官能团。

实施例3二硫键交联壳聚糖水凝胶的制备

利用PBS缓冲液配制一系列浓度不同的巯基修饰的羧甲基壳聚糖1(3-5％w/v％)及还原性牛血清白蛋白(3-5w/v％)溶液，将上述两种溶液室温等体积混合均匀后，在37℃条件下反应10min，得到二硫键交联的壳聚糖水凝胶。

图2是用流变仪测试二硫吡啶与巯基的摩尔比及二硫二吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的固含量对水凝胶机械性能影响的测试结果图。从图2可以看出，当二硫吡啶与巯基的摩尔比为1:2且二硫二吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的固含量为3％时，水凝胶的机械性能最好。

利用透射电子显微镜观察采用多个二硫吡啶与巯基的摩尔比所得水凝胶微观结构。图3是部分照片，其中，A为2:1，B为1:1，C为1:2。从图3可以看出，当二硫吡啶与巯基的摩尔比为1:2时，由于交联度的增加，水凝胶具有更多的孔状结构，这些孔状结构有利于后续生长因子的负载。后续实验均选用二硫吡啶与巯基的摩尔比为1:2且二硫二吡啶修饰的羧甲基壳聚糖的固含量为3％的条件制备的水凝胶。

细胞毒性实验

利用CKK-8法对水凝胶的细胞毒性进行了评价，见图4。将NIH 3T3成纤维细胞在DMEM培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素)中，在CO₂浓度为5％的37℃的培养箱中培养。将水凝胶放入48孔培养板中，用灭菌的PBS反复冲洗。NIH 3T3成纤维细胞按10⁴个/孔接种于无菌水凝胶表面，37℃孵育。第1、3和5天后，在每孔中加入CCK-8试剂并孵育4h。通过酶标仪处测量细胞悬液的在450nm处的光密度(OD)值来评估3T3成纤维细胞的增殖情况，以无水凝胶的组织培养板上接种的细胞作为对照。从图4可以看出，水凝胶对NIH 3T3成纤维细胞几乎无细胞毒性。

体外降解实验

体外降解实验模拟生物体内的谷胱甘肽生理环境(谷胱甘肽浓度：0.5mM)，通过凝胶质量的变化来体现该水凝胶的降解性能。将制备好的水凝胶冻干，称重W₀，向离心管中的水凝胶加入1.5ml水，37℃条件下，放入恒温摇床中，溶胀90min。倒出离心管中的水，加入1.5mL含有0.5mM谷胱甘肽的PBS溶液(pH7.4，10mM)，37℃条件下，放入恒温摇床中，反应2,6，10，24，48，72h后，充分洗掉多余的酶与盐分，冷冻干燥后称重W₁，由下面公式计算失重率，每个时间点做三组平行样品，实验结果如图5所示。实验结果表明该水凝胶48小时被完全被降解。

失重率＝(W₀-W₁)/W₀

负载碱性成纤维细胞生长因子的二硫键交联壳聚糖水凝胶的制备

将3mg还原性牛血清白蛋白溶于0.1mL含有27μg碱性成纤维细胞生长因子bFGF的PBS缓冲液，将3mg巯基修饰的羧甲基壳聚糖溶于0.1mL PBS缓冲液中，将上述两种溶液室温均匀混合后，在37℃条件下反应5min，得到负载碱性成纤维细胞生长因子的二硫键交联可注射壳聚糖水凝胶。

治疗心梗效果试验

SD大鼠(250g-300g)以2％异氟烷麻醉后，气管插管呼吸机辅助通气，备皮，行开胸术。剪开心包，挤压胸腹腔充分暴露心脏如图8所示。于左心耳下缘2mm，左心耳与肺动脉圆锥中心交点与左心尖连线交界处，6-0号无创伤滑线结扎左冠状动脉。左室壁变苍白，室壁运动减弱，心电监护下Ⅱ导联ST段明显抬高，表明心肌梗死模型制备成功。

心梗模型建立后随机分为4组(n＝10)：磷酸缓冲溶液组(PBS)、bFGF组、水凝胶组(hydrogel)及负载bFGF的水凝胶组(bFGF-hydrogel)。

植入手术步骤：在心梗边缘区选择三个注射位点(左心房下方、左心室中部及心尖部)，分别将磷酸缓冲溶液(PBS)、bFGF、水凝胶(hydrogel)及负载bFGF的水凝胶(bFGF-hydrogel)注射至各组大鼠心肌中。注射完成后，关胸并做好标记。腹腔注射青霉素，连续注射1周，防止局部感染和粘连。

各组动物于术后4周，采用心脏超声检测心脏功能。各组动物麻醉后仰卧固定，备皮，进行心脏超声心动图检测。获取胸骨旁左室长轴切面及左室短轴切面，并行M型超声，测量左室舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs)，计算左室短轴缩短率(LVFS)以及射血分数(LVEF)。采用3-6个心动周期所测量的数据，取平均值，实验结果如图6所示，图中，A是4周后不同实验组中，典型的大鼠心脏超声图，B至E是4周后四组大鼠的心脏超声相关参数的图表结果。

从图6(A)可以看出PBS组LVEF和LVFS值最低，心功能明显下降，从图6(B)可以看出bFGF-hydrogel组大鼠的LVEF值(62.76±3.56％)明显高于bFGF组(55.53±4.00％)、hydrogel组(57.58±1.66％)、PBS组(54.60±5.63％)，P<0.06；从图6(C)可以看出bFGF-hydrogel组大鼠的LVFS值(29.94±2.22％)明显高于bFGF、hydrogel和PBS组(分别为25.59±2.34、26.51±1.11％和24.97±3.35％，P<0.06)；从图6(D)可以看出bFGF-hydrogel组大鼠的LVIDd数值增值最小(7.74±0.42mm)，低于bFGF组(8.45±0.34mm)、hydrogel组(8.32±0.61mm)和PBS组(8.79±0.23mm)，P<0.05；从图6(E)此外，bFGF-hydrogel组的LVIDs值增幅最小(5.24±0.40mm)，分别低于其它三组(5.94±0.72mm、5.82±0.66mm和6.43±0.51mm,P<0.05)，从以上数据可以得出，与其它三组大鼠相比，bFGF-hydrogel组大鼠的心脏功能得到了改善。

组织形态学检测

各组大鼠于术后4周，采集大鼠心脏组织标本，进行心梗面积测量。各组标本OTC包埋，液氮冷冻20s后，由心尖至心底按短轴平面连续切片(厚度5μm)，保证心尖、心底和梗死区中央都能切到。各组标本Masson三染色后进行心梗区域胶原纤维沉积程度检测。心梗区域胶原纤维沉积程度用纤维化区域占左心室壁区域的百分数来表示，采用RS Image Pro图像分析软件分析与计算。图7中，A是Masson染色显示各纤维化组织(蓝色)和正常组织(红色)的照片，比例尺，100μm；B是TUNEL细胞凋亡检测结果的照片，其中显示DAPI(蓝色荧光，正常细胞)和TUNEL(绿色荧光，凋亡细胞)，比例尺:20μm。C是左心室纤维化面积百分比(fibrosis)分析结果，D是细胞凋亡指数(apoptosis)百分比。

从图7可以看出，与其它三组相比，bFGF-hydrogel组大鼠心梗区域的纤维化程度得到了明显抑制。

TUNEL细胞凋亡检测

各组样本OCT包埋后行冰冻切片(厚度为5μm)，使用TUNEL试剂盒检测梗死交界区细胞凋亡，高倍镜(×400倍)下观察凋亡细胞。每个标本选取3张切片，每张切片随机选取5个不重叠视野，以细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞进行计数，计算细胞凋亡指数(apoptotic index)：凋亡指数＝单视野阳性细胞核个数/单视野总细胞核个数×100％，实验结果如图7(B，D)，从图中可以看出，与其它三组相比，bFGF-hydrogel组大鼠心梗区域凋亡细胞的数量明显减少。

免疫组织化学染色和血管计数

各组样本OCT包埋后行冰冻切片(厚度为5μm)，内源性过氧化物酶阻断及山羊血清封闭后，滴加一抗vWAg(1:200)及相应二抗，DAB显色，苏木素复染，高倍显微镜下观察梗死部位微血管(直径20-100μm)并计数。每组标本取5张切片，每张切片取5个高倍视野，测量结果取平均值，实验结果如图8所示，从图中可以看出，与其它三组相比，bFGF-hydrogel组大鼠心梗区域的微血管数明显增加，

本发明利用巯基修饰的牛血清白蛋白大分子交联剂代替传统的具有毒副作用且难去除的小分子交联剂如甲醛、乙二醛等，通过与含有二硫吡啶修饰的羧甲基壳聚糖之间进行反应条件温和且高效的巯基-二硫吡啶交换反应得到二硫键交联的可注射壳聚糖水凝胶。该材料容易制备，成本较低。该水凝胶在体内谷胱甘肽条件下可以降解，实现凝胶内生长因子的控制释放。

Claims

1.一种壳聚糖水凝胶组合物，包含第一溶液和第二溶液，其中，第一溶液包含二硫吡啶修饰的水溶性壳聚糖衍生物，第二溶液包含还原性牛血清蛋白，该还原性牛血清蛋白具有巯基，所述第一溶液是二硫吡啶修饰壳聚糖衍生物的PBS缓冲溶液，浓度3-5 w/v %，所述第二溶液是还原性牛血清蛋白的PBS缓冲溶液，浓度0.75-3 w/v %，所述二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物与还原性牛血清蛋白的质量比使得所述组合物中的二硫吡啶基团与巯基的摩尔比为1:2。

2.权利要求1所述的壳聚糖水凝胶组合物，其中，所述壳聚糖衍生物是羧甲基壳聚糖，分子量在10-30万。

3.权利要求1所述的壳聚糖水凝胶组合物，其中，所述二硫吡啶修饰壳聚糖衍生物是在所述壳聚糖衍生物的氨基上连接上一个带有二硫吡啶基团的小分子。

4.权利要求1所述的壳聚糖水凝胶组合物，其中，通过将所述壳聚糖衍生物先后与2-亚氨基硫烷盐酸盐和二硫吡啶反应得到，每个壳聚糖衍生物分子中含有8-15个二硫吡啶官能团，所述还原性牛血清蛋白优选是通过将牛血清蛋白与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应得到。

5.一种壳聚糖水凝胶，其由权利要求1至4任一项所述二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物和还原性牛血清蛋白交联形成。

6.如权利要求1-4任一项所述壳聚糖水凝胶组合物的制备方法，包括如下步骤：

1）将2-亚氨基硫烷盐酸盐的水溶液加入到所述壳聚糖衍生物的水溶液中，反应得到巯基修饰壳聚糖水溶液；

2）将二硫二吡啶加到上述溶液中，反应完成后，用PBS缓冲溶液透析，冷冻干燥，得到所述二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物；

3）将步骤2）所得二硫吡啶修饰的壳聚糖衍生物配置成缓冲液，得到所述第一溶液；

4）将牛血清蛋白溶解在PBS缓冲液，加入溶解在PBS缓冲液中的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，在冰水浴中脱气搅拌；

5）步骤4）反应产物在冷PBS缓冲溶液中透析两天，冷冻干燥得到所述还原性牛血清蛋白的PBS缓冲液，配置成所述第二溶液，将所述第一溶液和第二溶液分开储存。

7.权利要求6所述的方法，其中，所述壳聚糖衍生物的分子量在15-30万之间，其与2-亚氨基硫烷盐酸盐和二硫二吡啶的质量比为1︰0.015-0.030︰0.86-0.18，步骤4）中，牛血清蛋白与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的质量比为1︰0.03-0.05之间，其中所述壳聚糖衍生物与所述牛血清蛋白的用量比为1︰1。

8.如权利要求1-4任一项所述壳聚糖水凝胶组合物在制备用于治疗心肌梗死的医用材料中的用途，其中所述医用材料包含由所述第一溶液和第二溶液现场制备的壳聚糖水凝胶和碱性成纤维细胞生长因子。

9.一种药物制剂，其包含权利要求1所述的壳聚糖水凝胶和一种或多种有医疗活性的物质，该物质为凝血剂。