CN113913553B

CN113913553B - 基因ⅻ型新城疫病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其引物对

Info

Publication number: CN113913553B
Application number: CN202111205328.3A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 曾婷婷; 谢丽基; 黄青红; 华俊; 谢志勤; 张艳芳; 黄娇玲; 张民秀; 罗思思; 李孟; 范晴
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2024-08-27
Anticipated expiration: 2041-10-15
Also published as: CN113913553A

Abstract

本发明公开了基因Ⅻ新城疫病毒荧光定量RT‑PCR检测引物对，包括引物1和引物2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，还设计了相应试剂盒，它含有引物1、引物2和探针A，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3的碱基序列。本发明具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等特点，能够实现快速检测并定量基因Ⅻ型NDV。本发明可用于基因Ⅻ型NDV疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此对基因Ⅻ型NDV的防治有重要意义。

Description

基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物对

技术领域

本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物对。

背景技术

新城疫病毒(Newcaslte Disease Virus，NDV)的中等、强毒力的NDV引起的高传染性、高致病性、高致死性的传染病可以感染超过250种禽类和鸟类，给养禽业造成极大危害。之前主要对鸡、鸭、鹅等家禽致病的NDV主要是classⅡ基因Ⅶ型NDV，由于近年来规范使用疫苗，基因Ⅶ型NDV已经非常少见。2010年起，在我国两广及福建陆续分离到一种新城疫病毒的新基因型：基因Ⅻ型NDV，动物致病性试验证实该型NDV为强毒。虽然目前还没有基因Ⅻ型NDV对家禽自然感染致病的报道，但是在免疫压力下，基因Ⅻ型NDV很有可能演变为对家禽致病。因此，迫切需要建立针对基因Ⅻ型NDV的快速敏感检测方法，以便在感染早期就能准确检测识别，从而为控制疫病争取宝贵时间。此类病毒的传统检测方法有病毒分离、琼脂扩散试验等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠且能实现多重反应和实时性好等特点。经查，尚未见到应用荧光定量PCR技术对基因Ⅻ型NDV进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物对，以实现快速检测并定量基因Ⅻ型NDV。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测引物对，包括引物1和引物2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。

上述RT-PCR检测引物对在扩增基因Ⅻ型新城疫病毒的HN基因中的应用。

扩增反应程序为52℃5min；95℃10s；然后按95℃变性5s、60℃退火延伸34s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，有引物1、引物2和探针A，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1。

引物1、引物2和探针A的摩尔比为2:2:3。

该试剂盒包括以下试剂：

A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A；

B液：基因Ⅻ型NDV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照。

A液中引物1、引物2、探针A的终浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L和0.3μmol/L。

上述RT-PCR检测试剂盒在扩增基因Ⅻ型新城疫病毒的HN基因中的应用。

针对目前缺乏对基因Ⅻ型NDV检测和诊断的有效可靠技术，发明人研究设计了基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测引物对，包括引物1和引物2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，还设计了相应试剂盒，它含有引物1、引物2和探针A，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3的碱基序列。通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，并建立了基因Ⅻ型NDV的荧光定量RT-PCR的检测方法。实验证明，本发明具有如下优点：

1)检测时间短

应用本发明可实现反转录和PCR一步完成，仅需约60分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要2小时来完成扩增反应，然后还得花1.5小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强

当基因Ⅻ型NDV存在时，本发明对其检测的CT值与存在其他病毒时检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对基因Ⅻ型NDV的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量且检测敏感性非常高，能检测到1.7个拷贝的基因Ⅻ型NDV，比常规PCR方法敏感性高100倍，而且其他基因型NDV的存在并不会影响本发明的准确性和可靠性。

综上，本发明可用于基因Ⅻ型NDV疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此对基因Ⅻ型NDV的防治有重要意义。

附图说明

图1是本发明荧光定量RT-PCR检测基因Ⅻ型NDV的敏感性(FAM通道)结果图，图中：1～9分别为1.7×10⁸～1.7×10⁰拷贝/反应管，10为空白对照(为DEPC水)。

图2是本发明荧光定量RT-PCR检测基因Ⅻ型NDV的敏感性(FAM通道)的标准曲线。

图3是本发明荧光定量RT-PCR检测基因Ⅻ型NDV的特异性(FAM通道)结果图，图中：1基因Ⅻ型NDV，2鸭坦布苏病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒，5减蛋综合症病毒，6鸭瘟病毒，7 H9亚型禽流感病毒，8 H5亚型禽流感病毒，9 H7禽流感病毒，10传染性支气管炎病毒，11传染性喉气管炎病毒，12禽呼肠孤病毒，13传染性法氏囊炎病毒，14禽腺病毒，15其他基因型NDV混合(包括NDV基因型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ)，16 ddH₂O。

图4是本发明荧光定量RT-PCR检测基因Ⅻ型NDV的批内重复性(FAM通道)结果图，图中：1-3分别同一批次内三个重复样品，4为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

QuantStudio 5实时定量PCR仪(Thermo Fisher)；DNA片断回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自大连宝生物公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

鸭坦布苏病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，2013，30(6):31-35，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医,2010，37(11):156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

番鸭细小病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯,2008，160(06):30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“2018年广西活禽市场新城疫病毒分子流行病学分析”，中国家禽,2020,42，(03):22-28,及“2016—2017年广西4种野生鸟类新城疫病原学检测与遗传进化分析”，中国动物检疫，2018,35，(05)：21-24,50。公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；

传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，禽腺病毒记载在“九种鸡呼吸道病病原体GeXP检测方法的建立”，中国兽医科学，2013,10:1040-1046。

禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成

下载GenBank中不同基因型(classⅠNDV的3个基因型1.1.1,1.1.2和1.2；classⅡNDV的21个基因型Ⅰ-ⅩⅪ，每个基因型至少下载3个毒株序列)NDV的全基因序列。使用DNASTAR比对序列，结果显示不同基因型之间的基因序列差异主要在F和HN基因，因此本方法设计引物区域着眼于这两个基因。根据基因Ⅻ型NDV和其他基因型的差异序列，采用Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，最后选定一对特异性引物和一条Taqmam探针(表1)。这套引物和探针的扩增区域位于HN基因。经过NCBI Blast比对，这套引物和探针仅与基因Ⅻ型NDV序列重合，与其他基因型NDV均有碱基差异。

表1 引物和TaqMan探针序列(5’-3’)

实施例2、荧光定量RT-PCR检测的建立

一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定

1、样本的制备

1)、核酸的提取

参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取基因Ⅻ型NDV，鸭坦布苏病毒，番鸭细小病毒，鸭圆环病毒，减蛋综合症病毒，鸭瘟病毒，H9亚型禽流感病毒，H5亚型禽流感病毒，H7禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，禽腺病毒，其他基因型NDV(基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型，其中基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型NDV都有疫苗株，曾经或现在在中国普遍使用；基因Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ型都在中国有过大面积或散在流行，是中国的主要流行毒株基因型)的RNA和DNA。

2)、RNA的反转录

RNA反转录合成cDNA，建立如下反转录体系(总反应体积为20μL)：Ⅻ型NDV cDNA为2μL(约20μg)，4μL 8mM MgCl 2 (大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL10×PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，2μL 10mM dNTP(四种碱基)，1μL RNA抑制剂(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL随机引物(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，1μL AMV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR0019A)，用无Rnase水加至总体积为20μL，离心均匀，于25℃10min，42℃60min，95℃5min，4℃结束，得到基因Ⅻ型NDVcDNA。

2、标准品的制备

分别以上述得到的基因Ⅻ型NDV的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含0.2mmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl₂ 、0.5μmol/L引物(表1)、1.25U Taq聚合酶、1×PCRbuffer、5μL DNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，50℃60s，70℃60s，35个循环，72℃延伸10min。

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pGEM-T Easy载体，阳性克隆菌(pGEM-NDVⅫ)送大连宝生生物技术有限公司进行测序，pGEM-EDSV菌中含有的PCR产物大小为172bp，具有序列表中SEQ.ID.No.4的第1-172位核苷酸(为基因Ⅻ型NDVFrancolin/China/GX01/2017株的HN序列，genbank号为MZ306226，第7202-7373位核苷酸)，说明为阳性克隆，含有基因Ⅻ型NDV。

提取pGEM-NDVⅫ菌的质粒，得到pGEM-NDVⅫ质粒。

将pGEM-NDVⅫ质粒作为阳性标准品，按照文献(Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.&Sivonen K.(2003)QuantitativeReal-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E CopyNumbers forMicrocystis and Anabaena in Lakes.Applied and EnvironmentalMicrobiology.69:7289-7297.)计算拷贝数，结果为拷贝数为2.2×10⁹copies/μl。

将基因pGEM-NDVⅫ质粒，37℃SalⅠ单酶切过夜，使质粒线性化，琼脂糖凝胶电泳及试剂盒回收纯化质粒DNA线性化产物，用于体外转录，按T7体外转录试剂盒说明加入反应试剂37℃作用2h，然后加DNaseⅠ酶1μl，37℃消化转录产物中未转录的DNA 20min，70℃灭活DNaseⅠ酶15min，用等体积盐酸饱和苯酚、氯仿抽提，再用等体积氯仿抽提，取上清用0.5倍体积5M醋酸氨和2倍体积冰乙醇沉淀，再用75％冰乙醇洗沉淀，最后用DEPC水溶解，得到DHV-RNA，紫外分光光度计测DHV-RNA浓度和纯度，-70℃保存备用，结果为pGEM-NDVⅫ-RNA浓度为1.7×10⁹拷贝/μl。

3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立

用pGEM-NDVⅫ-RNA作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。

扩增反应总体积为20μl，其中2×One Step PrimeScript^TMIII RT-qPCR Mix(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR600A)10μl；1μl模板，终浓度均为0.2-0.8μmol/L的NDVⅫ-F、NDVⅫ-R和NDVⅫ-probe；ROX Reference Dye II 0.4μl余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置QuantStudio 5实时定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：52℃5min；95℃10s；然后按95℃变性5s、60℃退火延伸34s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，NDVⅫ-F、NDVⅫ-R终浓度分别为0.2μmol/L，NDVⅫ-probe为0.3μmol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。

因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20μl，其中2×One Step PrimeScript^TM III RT-qPCR Mix(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR600A)10μl；1μl模板，终浓度均为0.2μM的NDVⅫ-F、NDVⅫ-R，终浓度为0.3μmol/L的NDVⅫ-probe；ROX Reference Dye II 0.4μl；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置QuantStudio 5实时定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：52℃5min；95℃10s；然后按95℃变性5s、60℃退火延伸34s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测基因Ⅻ型NDV。

二、荧光定量RT-PCR的敏感性试验

分别以10倍系列稀释的pGEM-NDVⅫ-RNA(基因Ⅻ型NDV)，得到拷贝数均为1.7×10⁸-1.7×10⁰拷贝/μl的pGEM-NDVⅫ-RNA质粒，再将各种拷贝数的pGEM-NDVⅫ-RNA为模板进行荧光定量RT-PCR扩增，扩增体系和条件如一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。

在530nm激发光下的结果(FAM)如图1所示。从荧光曲线可见，对基因Ⅻ型NDV的检测1.7拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对基因Ⅻ型NDV的灵敏度均为1.7拷贝，比常规PCR方法敏感性高10倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。

三、荧光定量RT-PCR的特异性试验

按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为1基因Ⅻ型NDV，2鸭坦布苏病毒，3番鸭细小病毒，4鸭圆环病毒，5减蛋综合症病毒，6鸭瘟病毒，7H9亚型禽流感病毒，8H5亚型禽流感病毒，9H7禽流感病毒，10传染性支气管炎病毒，11传染性喉气管炎病毒，12禽呼肠孤病毒，13传染性法氏囊炎病毒，14禽腺病毒，15其他基因型NDV混合，16ddH₂O。

在530nm激发光下检测基因Ⅻ型NDV的特异性，结果(FAM)如图3所示，可见，样品1CR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品2-16均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应，特别是对其他基因型NDV没有扩增反应，可以排除其他基因型NDV对本发明应用的影响。

四、重复性试验

按照上述一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，模板为拷贝数为1.7×10⁷ 拷贝/μl的基因Ⅻ型NDV的阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-80℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。

检测结果见图4和表2所示，图4为在530nm激发光(FAM)下检测基因Ⅻ型NDV通道，可见，变异系数均小于3％(表2)。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。

表2 批间重复性

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A；其中，2×One Step PrimeScript^TMIIIRT-qPCR Mix(大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR600A)；引物1、引物2终浓度均为0.2μmol/L，探针A终浓度均为0.3μmol/L；

B液：基因Ⅻ型NDV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照。

实施例4、临床病料的检测

待测样本为广西地区活禽市场采集的家禽喉/泄殖腔棉拭子的100份(编号为1-100)，分别提取棉拭子的总RNA和DNA。分别将编号为1-100各个样本的总DNA和RNA作为模板，使用实施例3的试剂盒，按照实施例2一、3中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR。参照上述判断标准评价检出基因Ⅻ型NDV 2份(阳性率为2％)。

同时，将100份病料(编号为1-100)分别按照参照文献[1]刘华雷，吕艳，王静静，等.我国新出现基因Ⅻ型新城疫病毒的分布及特性[J].中国动物检疫,2017,34(9):1-3,18.中的方法进行基因Ⅻ型NDV检测，结果与本发明一致，说明本发明的方法正确。

上述结果说明广西地区存在基因Ⅻ型NDV的感染，该荧光定量RT-PCR方法的建立，对基因Ⅻ型NDV疫病控制有指导意义。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其引物对

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataggtcagt cacccccaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctccataaa ctgggaacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtaggagg tgggtctttc 20

<210> 4

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataggtcagt cacccccaca tcaatggtac acggaagatt agggtttgac ggtcaatacc 60

atgagaggga cttagacacc acagtcttat ttaaggattg ggtggcaaat tacccggggg 120

taggaggtgg gtctttcatt aacgaccgtg tatggttccc agtttatgga gg 172

Claims

1.基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测引物组合物，其特征在于包括引物对和探针，其中，引物对为引物1和引物2，分别如序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2所示的碱基序列；探针为探针A，如序列表SEQ.ID.No.3所示的碱基序列，5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1；引物1、引物2和探针A的摩尔比为2:2:3。

2.权利要求1所述的RT-PCR检测引物组合物在检测基因Ⅻ型新城疫病毒中的应用，所述应用不包括疾病的诊断和治疗。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述RT-PCR扩增反应程序为52℃5min；95℃10s；然后按95℃变性5s、60℃退火延伸34s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

4.一种基因Ⅻ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于含有引物1、引物2和探针A，分别如序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.3所示的碱基序列，5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ1；引物1、引物2和探针A的摩尔比为2:2:3。

5.根据权利要求4所述的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下试剂：

A液：PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、探针A；

B液：基因Ⅻ型NDV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照；

其中，A液中引物1、引物2、探针A的终浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L和0.3μmol/L。

6.权利要求4所述的RT-PCR检测试剂盒在检测基因Ⅻ型新城疫病毒中的应用，所述应用不包括疾病的诊断和治疗。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述RT-PCR扩增反应程序为52℃5min；95℃10s；然后按95℃变性5s、60℃退火延伸34s进行40个循环；最后于40℃结束反应。