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CN113896751A - 安石榴苷纯化方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 - Google Patents

安石榴苷纯化方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用 Download PDF

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CN113896751A
CN113896751A CN202111376141.XA CN202111376141A CN113896751A CN 113896751 A CN113896751 A CN 113896751A CN 202111376141 A CN202111376141 A CN 202111376141A CN 113896751 A CN113896751 A CN 113896751A
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Abstract

本发明涉及安石榴苷制备技术领域，尤其涉及安石榴苷纯化方法和其在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。本发明采用D101大孔树脂和C18半制备色谱柱对所述安石榴苷提取物进行两次层析柱梯度洗脱，将两次层析柱梯度洗脱的洗脱剂设置为甲醇和水，并具体控制每次层析柱纯化时的梯度洗脱程序，避免共存杂质的干扰，有利于提高提取得到的安石榴苷的纯度。由实施例的结果表明，本发明提供的纯化方法得到的安石榴苷纯化物中安石榴苷的纯度＞92％。

Description

安石榴苷纯化方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及安石榴苷制备技术领域，尤其涉及安石榴苷纯化方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
背景技术
2型糖尿病是一种典型的与过量摄入膳食碳水化合物相关的疾病。除了限制饮食摄入量，控制碳水化合物的消化仍然是2型糖尿病管理的有效策略之一。在所有可用的药物中，α-葡萄糖苷酶抑制剂是阻碍碳水化合物消化最有效的。几种用于治疗2型糖尿病及其并发症的商业化的α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖、米格列醇和沃格利波糖，均有不同的副作用报道，包括腹泻、腹痛和肠胃气胀。
石榴皮(pomegranate peel)是石榴工业的主要加工副产品，是一种廉价且丰富的多酚来源，特别是鞣花单宁，包括没食子酸、安石榴苷和鞣花酸。其中，安石榴苷约占石榴皮中鞣花单宁总量的70％，具有羟基化程度高、安全性高的特点。据报道，安石榴苷具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒和抗动脉粥样硬化等功效，并安全无毒，具有很高的开发价值和健康功能应用价值。
但是，目前关于安石榴苷纯化的制备，始终存在着安石榴苷纯度低的缺点。例如，中国专利CN106349301A公开了一种石榴皮中安石榴苷的分离纯化方法，利用大孔树脂吸附和高速逆流色谱方式纯化，得到的安石榴苷纯化产物的纯度为90％。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了安石榴苷纯化方法及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，本发明提供的安石榴苷的纯化方法得到的安石榴苷纯化物的纯度＞92％。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种安石榴苷的纯化方法，包括以下步骤：
(1)以D101大孔树脂为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对安石榴苷提取物进行第一柱层析纯化，所述第一柱层析纯化采用第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第11梯度和第12梯度的洗脱液，得到安石榴苷粗品；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第11梯度 (0～50]min [10～30]:100
第12梯度 (50～120]min [40～80]:100
；
(2)以C18半制备色谱柱为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对所述安石榴苷粗品进行第二柱层析纯化，所述第二柱层析纯化采用第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第22梯度的洗脱液，得到安石榴苷纯化物；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第21梯度 (0～10]min [1～5]:100
第22梯度 (10～20]min [5～15]:100
。
优选的，所述步骤(1)中，每个梯度洗脱时，所述洗脱剂的流速独立地为28～35mL/min。
优选的，所述步骤(1)中，所述安石榴苷提取物以所述安石榴苷提取物水溶液的形式进行柱层析纯化，所述安石榴苷提取物水溶液的质量百分比为150～250mg/mL。
优选的，所述步骤(2)中，每个梯度洗脱时，所述洗脱剂的流速独立地为15～25mL/min。
优选的，所述步骤(2)中，所述安石榴苷粗品以所述安石榴苷粗品水溶液的形式进行柱层析纯化，所述安石榴苷粗品水溶液的质量百分比为0.3～0.4mg/mL。
优选的，所述安石榴苷提取物的制备方法包括以下步骤：
将石榴皮粉和提取剂混合进行超声提取，得到安石榴苷提取物；所述提取剂为乙醇和水的混合溶剂，所述提取剂中乙醇的体积百分比为40～80％。
优选的，所述超声提取的条件包括，固液比为1:(10～50)，超声功率为500～1050W，提取时间为10～50min。
优选的，所述石榴皮粉的粒径≤0.425mm。
本发明提供了安石榴苷在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
本发明提供一种安石榴苷的纯化方法分别采用D101大孔树脂和C18半制备色谱柱为固定相，对所述安石榴苷提取物进行两次层析柱梯度洗脱，两次层析柱梯度洗脱的洗脱剂为甲醇和水，并具体控制每次层析柱纯化时的梯度洗脱程序，避免共存杂质的干扰，有利于提高提取得到的安石榴苷的纯度。由实施例的结果表明，本发明提供的纯化方法得到的安石榴苷纯化物中安石榴苷额纯度＞92％。
本发明提供的纯化方法工艺简单，成本低，适宜工业化生产。
附图说明
图1为安石榴苷的的结构式和HPLC图；
图2为采用高效液相色谱法定量分析安石榴苷时得到的安石榴苷的标准曲线图；
图3为本发明对比例1采用不同大孔树脂对安石榴苷的吸附和解吸附作用图；
图4为安石榴苷纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型的影响图
图5为安石榴苷纯化物对α-葡萄糖苷酶的Ki的影响图；
图6为安石榴苷纯化物对α-葡萄糖苷酶的Ku的影响图；
图7为安石榴苷标准品对α-葡萄糖苷酶的抑制类型的影响图；
图8为安石榴苷标准品对α-葡萄糖苷酶的Ki的影响图；
图9为安石榴苷标准品对α-葡萄糖苷酶的Ku的影响图；
图10为石榴苷与α-葡萄糖苷酶分子对接图。
具体实施方式
本发明提供了一种安石榴苷的纯化方法，包括以下步骤：
(1)以D101大孔树脂为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对安石榴苷提取物进行第一柱层析纯化，所述第一柱层析纯化采用第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第11梯度和第12梯度的洗脱液，得到安石榴苷粗品；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第11梯度 (0～50]min [10～30]:100
第12梯度 (50～120]min [40～80]:100
；
(2)以C18半制备色谱柱为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对所述安石榴苷粗品进行第二柱层析纯化，所述第二柱层析纯化采用第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第22梯度的洗脱液，得到安石榴苷纯化物；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第21梯度 (0～10]min [1～5]:100
第22梯度 (10～20]min [5～15]:100
。
本发明以D101大孔树脂为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对安石榴苷提取物进行第一柱层析纯化，所述第一柱层析纯化采用第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第11梯度和第12梯度的洗脱液，得到安石榴苷粗品；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第11梯度 (0～50]min [10～30]:100
第12梯度 (50～120]min [40～80]:100
。
在本发明中，所述安石榴苷提取物的制备方法优选包括以下步骤：
将石榴皮粉和提取剂混合进行超声提取，得到安石榴苷提取物所述提取剂为乙醇和水的混合溶剂，所述提取剂中乙醇的体积百分比为40～80％。
在本发明中，所述石榴皮粉的粒径优选≤0.425mm，更优选为0.15～0.425mm，最优选为0.15～0.18mm。
在本发明中，所述石榴皮粉的制备方法优选包括以下步骤：
将石榴皮依次进行干燥、研磨和过筛，得到所述石榴皮粉。
在本发明的一个实施例中，所述石榴皮可以选择产自四川会理的石榴皮。
在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-60～-30℃，更优选为-55～-35℃。在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为24～48h。
在本发明中，所述干燥后得到干石榴皮，本发明优选对所述干石榴皮进行研磨。在本发明中，所述研磨时的转速优选为10000～20000rpm，更优选为12500～18500rpm，最优选为12800rpm。在本发明中，所述研磨的时间优选为0.5～5min，更优选为1min。在本发明中，所述研磨优选在研磨机中进行。
在本发明中，所述研磨后得到石榴皮颗粒，本发明优选对所述石榴皮颗粒进行筛分，得到石榴皮粉。在本发明中，所述筛分优选取40目筛的筛上物，同时取100目筛的筛下物，更优选为取40目筛的筛上物，同时取80目筛的筛下物。
在本发明中，所述提取剂优选为乙醇和水的混合溶剂，所述乙醇和水的混合溶剂中乙醇的体积百分比优选为40～80％，更优选为45～75％。
本发明对所述石榴皮粉和提取剂混合的具体实施方式没有特殊要求。
在本发明中，所述超声提取时，固液比优选为1:(10～50)，更优选为1:(15～40)。在本发明中，所述超声功率优选为500～1050W，更优选为650～1000W。在本发明中，所述提取时间优选为10～50min，更优选为15～40min。
在本发明中，所述超声提取后得到安石榴苷提取液，本发明优选对所述安石榴苷提取液进行后处理，得到所述安石榴苷提取物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行固液分离、除提取剂。在本发明中，所述固液分离优选过滤，所述过滤优选采用布氏漏斗过滤。本发明优选将固液分离得到的滤液除提取剂。在本发明中，所述脱除提取剂的方法优选包括：依次进行旋转蒸发除乙醇和冷冻干燥除水。在本发明中，所述旋转蒸发的温度优选为45℃，本发明对所述旋转蒸发的时间没有特殊要求，没有乙醇蒸出即可。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-60～-30℃，更优选为-55～-35℃。在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为24～48h。
在本发明中，所述第一柱层析纯化时，所述安石榴苷提取物优选以所述安石榴苷提取物水溶液的形式进行第一柱层析纯化，在本发明中，所述安石榴苷提取物水溶液的质量百分比优选为150～250mg/mL，更优选为200mg/mL。
本发明优选对所述D101大孔树脂进行预处理。在本发明中，所述预处理优选包括：采用无水乙醇浸泡D101大孔树脂24h后，对乙醇浸泡后的D101大孔树脂进行第一纯水洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的乙醇；使用5wt.％盐酸将第一纯水洗涤后的D101大孔树脂浸泡12h，对盐酸浸泡后的D101大孔树脂进行第二纯水洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的盐酸；再用5wt.％氢氧化钠将第二纯水洗涤后的D101大孔树脂浸泡12h，用纯水对氢氧化钠浸泡后的D101大孔树脂进行洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的氢氧化钠。
在本发明中，所述第一柱层析纯化时，所述D101大孔树脂优选采用湿法装柱的方式装入到层析柱中。在本发明的具体实施例中，所述D101大孔树脂优选在水中装入到层析柱中，更优选为去离子水。
在本发明的具体实施例中，当所述层析柱的体积优选具体优选为
Figure BDA0003363916090000061
时，D101大孔树脂的填充质量具体优选为400g。在本发明中，所述D101大孔树脂的粒径优选为0.3～1.25mm，更优选为0.5～1.0mm；所述D101大孔树脂的比表面积优选为480～550m2/g，更优选为500～530m2/g。
本发明将所述D101大孔树脂装入层析柱后，本发明优选采用甲醇和水的混合溶剂平衡填装有D101大孔树脂的层析柱。在本发明中，所述甲醇和水的混合溶剂中甲醇的体积百分比优选为5～5.5％。在本发明中，平衡的时间优选为24h。在本发明中，平衡时甲醇和水的混合溶剂的流速优选为20～25mL/min。
本发明优选采用安石榴苷提取物水溶液进样。在本发明中，所述第一柱层析纯化时，进样量优选为50mL。在本发明中，所述进样的流速优选为20～25mL/min。
本发明中，所述D101大孔树脂对安石榴苷具有较好的吸附性和选择性，本发明以D101大孔树脂为固定相，在安石榴苷提取物和D101大孔树脂接触过程中，D101大孔树脂表面分子与安石榴苷提取物中不同物质之间的相互作用力不同，从而使得D101大孔树脂能够选择性吸附安石榴苷，经洗脱剂洗脱而达到提取安石榴苷的目的。
在本发明中，所述第一层析柱纯化采用第一梯度洗脱；所述梯度洗脱包括依次进行的2个梯度，具体为第11梯度和第12梯度。
所述第一梯度洗脱前，本发明优选采用水洗脱除糖。在本发明中，所述水优选为去离子水。在本发明中，所述水的流速优选为30～35mL/min，所述水洗脱除糖的时间优选为20min，去离子水的用量为400mL。
本发明在进行第第一梯度洗脱前，优选采用水洗脱除糖，有利于洗掉D101大孔树脂吸附的糖类杂质，进一步有利于提高最终提取得到的安石榴苷的纯度。
在本发明中，所述第11梯度的洗脱时间为(0～50]min；所述第11梯度的洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂。所述第11梯度用洗脱剂中甲醇和水的体积比为[10～30]:100，优选为[15～25]:100。在本发明中，所述第11梯度的洗脱剂的流速优选为28～35mL/min，更优选为30mL/min。
在本发明中，所述第12梯度的洗脱时间为(50～120]min；所述第2梯度用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂。所述第12梯度用洗脱剂中甲醇和水的体积比为[40～80]:100，优选为[45～75]:100。在本发明中，所述第2梯度的洗脱剂的流速优选为28～35mL/min，更优选为30mL/min。
本发明将第一层析柱纯化的洗脱剂控制为甲醇和水混合溶剂，并具体第一梯度洗脱中第11梯度和第12梯度中混合溶剂中甲醇和水的体积比和洗脱时间，有利于提高提取得到的安石榴苷的纯度。
本发明优选将第11梯度的洗脱剂的流速优选为28～35mL/min，所述第12梯度的洗脱剂的流速优选为28～35mL/min，有利于洗脱剂与安石榴苷充分作用，达到洗脱的目的。
本发明优选收集第11梯度和第12梯度的洗脱液合并，得到第一层析柱纯化提取液。本发明优选将所述第一层析柱纯化提取液除洗脱剂，得到所述安石榴苷粗品。
在本发明中，所述除洗脱剂优选包括：依次进行旋转蒸发除甲醇和冷冻干燥除水。在本发明中，所述旋转蒸发除甲醇的温度优选为50～55℃，本发明对所述旋转蒸发的时间没有特殊要求，无甲醇蒸出即可。本发明对所述冷冻干燥除水的具体实施过程没有特殊要求。
本发明通过第一柱层析纯化除去安石榴苷提取物中的糖类、无机盐和黏液质杂质。
本发明优选将所述安石榴苷粗品保存在4℃的环境中。
得到安石榴苷粗品后，本发明以C18半制备色谱柱为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对所述安石榴苷粗品进行第二柱层析纯化，所述第二柱层析纯化采用第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第22梯度的洗脱液，得到安石榴苷纯化物；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比
第21梯度 (0～10]min [1～5]:100
第22梯度 (10～20]min [5～15]:100
。
在本发明中，所述安石榴苷粗品优选以所述安石榴苷粗品水溶液的形式进行第二柱层析纯化，所述安石榴苷粗品水溶液的质量百分比优选为0.3～0.4mg/mL，更优选为0.3444mg/mL。在本发明中，所述第二柱层析纯化时，进样量优选为20mL。在本发明中，所述进样的流速优选为10～25mL/min。
在本发明的具体实施例中，所述C18半制备色谱柱的尺寸优选为15mm×460mm，30μm。
在本发明中，所述C18半制备色谱柱对安石榴苷具有较好的吸附性和选择性，本发明以C18半制备色谱柱为固定相，在安石榴苷粗品和C18半制备色谱柱接触过程中，C18半制备色谱柱填料表面分子与安石榴苷粗品中不同物质之间的相互作用力不同，从而使得C18半制备色谱柱能够选择性吸附安石榴苷，经洗脱剂洗脱而达到制备安石榴苷的目的。
在本发明中，所述第二层析柱纯化采用第二梯度洗脱；所述第二梯度洗脱包括依次进行的2个梯度，具体为第21梯度和第22梯度。
本发明优选采用甲醇和水的混合溶剂平衡所述C18半制备色谱柱。在本发明中，所述甲醇和水的混合溶剂中甲醇的体积百分比优选为5～5.5％。在本发明中，平衡的时间优选为24h。在本发明中，平衡时甲醇和水的混合溶剂的流速优选为20～25mL/min。
在本发明中，所述第21梯度的洗脱时间为(0～10]min；所述第21梯度用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比为[1～5]:100，优选为[1.5～4]:100，更优选为[2～3.5]:100。在本发明中，所述第21梯度时，所述洗脱剂的流速优选为15～25mL/min，更优选为20mL/min。
在本发明中，所述第22梯度的洗脱时间为(10～20]min；所述第22梯度用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比为[5～15]:100，优选为[6.5～13]:100，更优选为[7～12]:100。在本发明中，所述第22梯度时，所述洗脱剂的流速优选为15～25mL/min，更优选为20mL/min。
本发明将第二层析柱纯化的洗脱剂设置为甲醇和水的混合溶剂，并具体控制3个梯度中每次洗脱时的洗脱时间和甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比，有利于提高提取得到的安石榴苷的纯度。
本发明优选将第21～23梯度洗脱时洗脱剂的流速设定为15～25mL/min，有利于洗脱剂与安石榴苷充分作用，达到洗脱的目的。
本发明优选收集第22梯度的洗脱液，得到第二层析柱纯化提取液。本发明优选将所述第二层析柱纯化提取液除洗脱剂，得到所述安石榴苷纯化物。
在本发明中，所述除洗脱剂优选包括：依次进行旋转蒸发除甲醇和冷冻干燥除水。在本发明中，所述旋转蒸发除甲醇的温度优选为50～55℃，本发明对所述旋转蒸发的时间没有特殊要求，无甲醇蒸出即可。本发明对所述冷冻干燥除水的具体实施过程没有特殊要求。
本发明通过第二柱层析纯化除去安石榴苷提取物中的非鞣质类杂质。
本发明优选将所述安石榴苷纯化物保存在4℃的环境中。
本发明优选采用高效液相色谱法对所述安石榴苷提取物、安石榴苷粗品和安石榴苷纯化物进行检测。
在本发明中，所述高效液相色谱法用色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱，所述色谱柱的尺寸优选为4.6mm×150mm，5μm。检测温度为30℃。流动相为：体积百分比为0.1％甲酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脱方式，洗脱程序为：0～10min，乙腈占流动相的体积百分数为1～3％；10～11min，乙腈占流动相的体积百分数为3～10％；11～20min，乙腈占流动相的体积百分数为10～30％；20～30min，乙腈占流动相的体积百分数为30～40％；30～48min，乙腈占流动相的体积百分数为40～70％；49min，乙腈占流动相的体积百分数为70～100％。流动相流速为1.0mL/min，检测波长为280nm，进样量为10μL。采用安石榴苷标准曲线(100～300μg/mL)对安石榴苷进行定量，以mg/g表示。
本发明提供的安石榴苷提取物的制备方法，缩短了提取时间，解决了安石榴苷一般提取技术生产周期长的问题。且操作简单，通过高效液相色谱法测定，所述安石榴苷提取物中安石榴苷的含量＞508mg/g，提高了安石榴苷的提取含量，降低了后期纯化制备的难度。通过高效液相色谱法测定，本发明提供的纯化方法得到的安石榴苷纯化物中安石榴苷的纯度＞92％。
本发明提供了安石榴苷在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
在本发明中，所述安石榴苷优选作为α-葡萄糖苷酶抑制剂。
本发明优选采用Lineweaver-Bur、Dixon或Cornish-Bowden模型分析所述安石榴苷对所述α-葡萄糖苷酶酶促反应的抑制模式和动力学参数。
在本发明中，采用Lineweaver-Bur、Dixon或Cornish-Bowden模型分析，所述安石榴苷对所述α-葡萄糖苷酶的抑制类型为线性混合型抑制。在本发明中，所述安石榴苷和α-葡萄糖苷酶酶促反应的竞争抑制常数为0.014μg/mL，非竞争抑制常数为0.1353μg/mL。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
将四川会理石榴皮在温度为-40～-25℃条件下进行冷冻干燥后放入研磨机中，以12800rpm的转速研磨1min，过筛筛分，取40目筛上物，80目筛下物，得到石榴皮粉。
将石榴皮粉按照表1中的参数：提取剂为乙醇和水的混合溶剂，乙醇的体积百分比为50％，固液比为20，超声功率为800W，提取时间为40min，进行超声提取，得到安石榴安提取液。
采用布氏漏斗过滤安石榴苷提取液，除去固体组分后，采用旋转蒸发除乙醇，冷冻干燥除水，得到安石榴苷提取物。
采用高效液相色谱法测定安石榴苷提取物中安石榴苷的含量。其中：
色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱，色谱柱的尺寸为4.6mm×150mm，5μm。检测温度为30℃。流动相为：体积百分比为0.1％甲酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脱方式，洗脱程序为：0～10min，乙腈占流动相的体积百分数为1～3％；10～11min，乙腈占流动相的体积百分数为3～10％；11～20min，乙腈占流动相的体积百分数为10～30％；20～30min，乙腈占流动相的体积百分数为30～40％；30～48min，乙腈占流动相的体积百分数为40～70％；49min，乙腈占流动相的体积百分数为70～100％；流动相流速为1.0mL/min，检测波长为280nm，进样量为10μL。采用安石榴苷标准曲线(100～300μg/mL)对安石榴苷进行定量，以mg/g表示，检测结果间表1。
将安石榴苷提取物溶解于水中，得到安石榴苷提取物水溶液，浓度为200mg/mL，体积为50mL。
采用无水乙醇浸泡D101大孔树脂24h后，对乙醇浸泡后的D101大孔树脂进行第一纯水洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的乙醇；使用5wt.％盐酸将第一纯水洗涤后的D101大孔树脂浸泡12h，对盐酸浸泡后的D101大孔树脂进行第二纯水洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的盐酸；再用5wt.％氢氧化钠将第二纯水洗涤后的D101大孔树脂浸泡12h，用纯水对氢氧化钠浸泡后的D101大孔树脂进行洗涤，直至D101大孔树脂表面没有残留的氢氧化钠。
在去离子水中，将400g D101大孔树脂装入层析柱
Figure BDA0003363916090000111
中，采用甲醇和水的混合溶剂(甲醇的体积百分比优选为5％)平衡填装有D101大孔树脂的层析柱，平衡时间为24h，，平衡时甲醇和水的混合溶剂的流速为20mL/min。
将安石榴苷提取物水溶液进样，进样的流速优选为25mL/min。
进样后，采用去离子水除糖，去离子水的流速为30mL/min，水洗脱除糖的时间为20min。
进行第一层析柱纯化，第1梯度洗脱的洗脱时间为(0～50]min，第1梯度洗脱的洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，第1梯度洗脱用洗脱剂中甲醇和水的体积比为30:100，洗脱剂的流速为30mL/min。第2梯度洗脱时间为(50～120]min；第2梯度洗脱用洗脱为甲醇和水的混合溶剂，第2梯度洗脱用洗脱剂中甲醇和水的体积比为40:100，洗脱剂的流速为30mL/min。
收集第1梯度和第2梯度的洗脱液，得到第一层析柱纯化提取液，50℃旋转蒸发除甲醇和冷冻干燥除水，得到安石榴苷粗品，保存在4℃的环境中。
将安石榴苷粗品溶解于水中得到质量百分比为0.3444mg/mL安石榴苷粗品水溶液进行第二柱层析纯化。安石榴苷粗品水溶液的进样速度为25mL/min，进样量为20mL。
采用尺寸为15mm×460mm，30μm的C18半制备色谱柱进行第二层析柱纯化，梯度洗脱包括依次进行的3个梯度，第I梯度的洗脱时间为(0～10]min；第I梯度洗脱用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比为5:100，所述洗脱剂的流速优选为20mL/min。
第II梯度的洗脱时间为(10～20]min，第II梯度洗脱用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比为5:100，洗脱剂的流速为20mL/min。
第III梯度的洗脱时间为(20～60]min；第III梯度洗脱用洗脱剂为甲醇和水的混合溶剂，甲醇和水的混合溶剂中甲醇和水的体积比为15:100，洗脱剂的流速为20mL/min。
收集第II梯度洗脱液，得到第二层析柱纯化提取液，50℃旋转蒸发除甲醇和冷冻干燥除水，得到安石榴苷纯化物，保存在4℃的环境中。
采用高效液相色谱法测定安石榴苷纯提物中安石榴苷的含量，测定方法与上文中记载的相同。
实施例2～29
实施例2～29与实施例1的方法基本相同，其中安石榴苷提取物的工艺参数如表1所示。
表1实施例1～29部分工艺参数和安石榴苷提取物中安石榴苷含量
Figure BDA0003363916090000131
Figure BDA0003363916090000141
对比例1
采用6种树脂(201-7、D101、AB-8、HPD-100、HPD-300、HPD-826)对安石榴苷提取物进行静态吸附和解吸附：吸附前对安石榴苷提取物中安石榴苷含量进行分析。将安石榴苷提取物溶解于水中，得到安石榴苷提取物水溶液，浓度我200mg/mL，体积为30mL。
将1.0g预处理后的大孔树脂(201-7、D101、AB-8、HPD-100、HPD-300、HPD-826)与30mL安石榴苷提取物水溶液一起置于50mL离心管中，在25℃、150rpm下震荡24h。吸附平衡后，离心，收集吸附液，测定吸附液中安石榴苷的含量。吸附比由下式(1)计算：
Figure BDA0003363916090000142
式(1)中，C0为安石榴苷提取物水溶液中安石榴苷的质量浓度，Ct为吸附平衡后吸附液中安石榴苷的质量浓度，m为大孔树脂的质量。
吸附平衡后，离心后收集吸附树脂，用30mL 70％乙醇在25℃，150rpm洗涤24h，离心，收集解吸液，测定解吸液中安石榴苷的质量浓度。解吸比按下式(2)计算：
Figure BDA0003363916090000143
式(2)中，Ce为解吸液中安石榴苷的质量浓度，m为大孔树脂的质量，A为吸附平衡时的吸附比。
不同树脂201-7、D101、AB-8、HPD-100、HPD-300、HPD-826的吸附比和解吸比如图3，由图3所示，D101的吸附比和解吸比均由于其他树脂。
对比例2
与实施例1提供的纯化方法相同，不同之处在于：提取时不进行超声。
采用与实施例1相同的高效液相色谱法测定安石榴苷提取物中安石榴苷的含量，实施例1得到的安石榴苷提取物中安石榴苷的含量比对比例2的高出63.30％。
实施例30
将一系列实施例1制备的安石榴苷纯化物水溶液稀释样品和安石榴苷纯品水溶液(50μL，0mg/mL，0.1mg/mL，0.12mg/mL，0.13mg/mL，0.15mg/mL，0.17mg/mL，0.24mg/mL，0.36mg/mL，0.48mg/mL)和α-葡萄糖苷酶溶液(1mg/mL，100μL)在37℃反应5min。然后加入底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)溶液(0.5mmol/L，50μL)启动反应，在405nm处观察120s内吸光度的增加情况。抑制率(IR，％)表示为：
抑制率(IR，％)＝(A0-As)/A0×100％；
其中A0和As分别为空白对照和样品的吸光度值。以阿卡波糖为阳性对照，每个样品分3个重复分析。α-葡萄糖苷酶抑制活性以抑制50％酶活性的抑制剂浓度(IC50)表示。采用Lineweaver-Bur、Dixon和Cornish-Bowden模型分析确定α-葡萄糖苷酶与安石榴苷酶反应的抑制模式和动力学参数(实验数据和模拟结果如图4～9所示，其中图4和7为Lineweaver-Bur模拟结果、图5和8为Dixon模型模拟结果，图6和9为Cornish-Bowden模型模拟结果)：安石榴苷对所述α-葡萄糖苷酶的抑制类型为线性混合型抑制。安石榴苷和α-葡萄糖苷酶酶促反应的竞争抑制常数(Ki)为0.014μg/mL，非竞争抑制常数(Ku)为0.1353μg/mL。实施例1制备的安石榴苷纯化物的竞争抑制常数(Ki)为0.051μg/mL，实施例1制备的安石榴苷纯化物的非竞争抑制常数(Ku)为0.0894μg/mL。
实施例31
利用分子对接方法，获得了安石榴苷与α-葡萄糖苷酶可能的结合位点(如图10所示)。α-葡萄糖苷酶(5NN4)的晶体结构来源于蛋白质数据库(PBD)，并利用chembio3D Ultra19.0和open babel1.4.2软件建立了安石榴苷的三维结构。去除配体和水分子，得到一个稳定的α-葡萄糖苷酶-安石榴苷的受体。利用AutoDock 4.2和MGL Tools 1.5.6进行分子对接模拟。根据对接结果得到了结合能和氢键距离等参数。对接过程为：去除水分子，加入极性氢到α-葡萄糖苷酶大分子；将大分子放入126A×126A×126A的网格框中，网格间距为0.842A；通过Genetic Algorithm法进行对接模块计算300次；由Genetic Algorithm法模块输出结果。在能量最小值的基础上，从所有对接结果中筛选出α-葡萄糖苷酶与安石榴苷构象最佳的对接结果，安石榴苷对α-葡萄糖苷酶的空间位阻力为-7.99kcal/mol。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种安石榴苷的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以D101大孔树脂为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对安石榴苷提取物进行第一柱层析纯化，所述第一柱层析纯化采用第一梯度洗脱，所述第一梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第11梯度和第12梯度的洗脱液，得到安石榴苷粗品；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比 第11梯度 (0～50]min [10～30]:100 第12梯度 (50～120]min [40～80]:100
；
(2)以C18半制备色谱柱为固定相，以甲醇和水的混合溶剂作为洗脱剂，对所述安石榴苷粗品进行第二柱层析纯化，所述第二柱层析纯化采用第二梯度洗脱，所述第二梯度洗脱包括依次进行2个梯度，收集第22梯度的洗脱液，得到安石榴苷纯化物；
所述梯度洗脱的洗脱程序为：
梯度洗脱 洗脱时间 甲醇和水的体积比 第21梯度 (0～10]min [1～5]:100 第22梯度 (10～20]min [5～15]:100
。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每个梯度洗脱时，所述洗脱剂的流速独立地为28～35mL/min。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述安石榴苷提取物以所述安石榴苷提取物水溶液的形式进行柱层析纯化，所述安石榴苷提取物水溶液的质量百分比为150～250mg/mL。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每个梯度洗脱时，所述洗脱剂的流速独立地为15～25mL/min。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述安石榴苷粗品以所述安石榴苷粗品水溶液的形式进行柱层析纯化，所述安石榴苷粗品水溶液的质量百分比为0.3～0.4mg/mL。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述安石榴苷提取物的制备方法包括以下步骤：
将石榴皮粉和提取剂混合进行超声提取，得到安石榴苷提取物；所述提取剂为乙醇和水的混合溶剂，所述提取剂中乙醇的体积百分比为40～80％。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述超声提取的条件包括，固液比为1:(10～50)，超声功率为500～1050W，提取时间为10～50min。
8.根据权利要求6或7所述的纯化方法，其特征在于，所述石榴皮粉的粒径≤0.425mm。
9.安石榴苷在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
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