CN113877000B - 注射用微球组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用微球组合物，含有：a)10％～97％重量的微球A，所述微球A含有聚丙交酯乙交酯美容和/或药用成分，b)1％～40％重量的微球B，所述微球B含有交联剂和熔点21‑45℃的基质材料，所述微球B在体温下融化并释放交联剂使透明质酸或其盐发生交联反应，c)2％～50％重量的透明质酸或其盐。本发明的使用方法为将微球A、微球B、透明质酸(盐)与等渗生理盐水溶液或磷酸盐缓冲液充分混合后，得到具有一定黏度但可以顺利注射的混悬液，注射到人体组织内，微球B在体温下融化并释放出交联剂，透明质酸(盐)与交联剂交联后生成机械强度更高的弹性体，不仅可以更稳定地发挥润滑和填充作用，还可以缓释美容和/或药用活性成分，发挥双重效果。

Description

注射用微球组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种注射用微球组合物及其在医学美容和医药领域的应用。

背景技术

骨关节炎是一种常见退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为关节疼痛，常发生于晨间，活动后疼痛反而减轻，但如活动过多，疼痛又可加重。另一症状是关节僵硬，常出现在早晨起床时或白天关节长时间保持一定体位后。检查受累关节可见关节肿胀、压痛，活动时有摩擦感或“咔嗒”声，病情严重者可有肌肉萎缩及关节畸形。

骨关节炎的主要治疗方法是减少关节的负重和负荷、以及进行适当的物理活动性理疗。口服和外贴非甾体类消炎镇痛药物亦可减轻或控制症状。软骨保护剂如硫酸氨基葡萄糖具有缓解症状和改善功能的作用，同时长期服用可以延迟疾病的结构性进展。对晚期病例，也可以进行人工关节置换术，可以大大提高患者的生活质量。

关节鞘注射透明质酸，即黏弹性补充疗法也是临床治疗主要方法之一，通过向关节腔内注射外源性透明质酸，可恢复关节滑液的润滑缓冲功能，促进软骨组织修复，缓解OA症状，改善关节的生理功能。

当前的主要用于治疗骨关节炎的主动治疗方法都是通过注射不含药物的透明质酸凝胶提供机械润滑支撑作用，且不含治疗性药物。一方面，由于透明质酸易被人体快速降解，在关节腔内留存时间较短，起不到长期提供治疗的作用，临床上往往需要反复注射给药，大大增大了治疗风险，患者依从性低，导致骨关节炎的治疗效果受到挑战；交联的透明质酸凝胶比普通透明质酸凝胶具有更强的机械性能，可以为骨关节炎提供更大的润滑和支撑作用，减少骨膜的磨损和骨关节炎的疾病程度，然而交联的透明质酸凝胶不具有流动性，无法进行注射。另一方面，没有药物进行积极治疗，紧靠物理润滑作用很难从根本上治疗骨关节炎。因此，具有长效释放治疗骨关节炎药物的原位交联微球凝胶，具有极大的临床优势和广阔的应用价值。

经过对现有技术文献的检索发现：中国专利201510593332.X公布了一种注射用含两亲性微球的透明质酸混合凝胶及其制备方法，所述微球材料涉及PLLA-PEG、PLGA、PLGA-PEG等两亲性材料。PLLA或PLGA分子量为10,000～500,000，PEG为1,000～10,000，PLGA中，LA/GA＝90/10～10/90。微球平均粒径为1～200μm，在凝胶中的质量分数为1～50％；所述凝胶成分为透明质酸，或为二乙烯基砜或缩水甘油醚交联的透明质酸，透明质酸分子量为100,000～3,000,000，质量分数为1～50％。凝胶成分还可以为动物源的胶原蛋白、壳聚糖、氨基酸纤维素、海藻酸钠等。微球混合凝胶在渗透压250～350mOsm/L、pH6.5～7.5的氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液中配制而成。该发明将两亲性微球直接与透明质酸凝胶混合，两亲性微球容易均匀分布在凝胶中，注射入人体后，在人体水环境下不易集结成块。所用的交联透明质酸凝胶是在注射前已经完成交联的,即预交联透明质酸，预交联透明质酸黏度超高，注射推针困难，且在组织内的流动性差容易造成在注射部位分布不均匀，存在临床缺陷；此外，该微球不含药物成分，不具有治疗疾病的作用。本发明的不同点在于含有两种微球和非交联的透明质酸盐，在注射前是未交联的透明质酸盐凝胶，黏度低，容易推针注射，在注射进入组织后，微球B可以快速释放交联剂和催化剂使透明质酸盐发生交联，在组织内转变为机械强度更高的交联凝胶，为骨关节提供更大支撑力和更长的维持作用，微球A的作用则是缓慢释放治疗骨关节炎的药物，实现长效释放药物治疗疾病。

中国专利201810348070.4公布了一种自交联注射美容填充材料，由A剂和B剂组成，且A剂和B剂独立存放，注射使用时混合即可，A剂、B剂混合的质量比是1:15；其中，A剂为柠檬酸钙微胶囊(囊壁为壳聚糖)；B剂由以下重量份的组分组成：海藻酸钠10～20份、透明质酸5～30份、胶原蛋白10～25份、维生素C1～15份、生理盐水80～120份。在使用时混合，水溶性的海藻酸钠，与具有缓释功能的柠檬酸钙缓释微球混合，其在机体内缓释钙离子，钙离子使海藻酸钠自交联，从而网络透明质酸，使海藻酸胶和透明质酸失去流变性，不但有效地防止透明质酸的降解，而且在机体填充塑性稳定，塑形效果好，具有良好的生物相容性，克服了使用交联透明质酸易造成生物毒性的缺陷。该填充材料特别对面部凹陷填充修复具有显著的作用。该发明的不足在于不含治疗性药物，无法为骨关节炎提供主动治疗作用，此外其是所使用的壳聚糖、海藻酸钠均不是人体内能正常降解的材料，植入骨关节会有长期的滞留毒性。其通过壳聚糖包裹柠檬酸钙，并在体内缓慢释放钙离子用于海藻酸钠发生自交联，进而把透明质酸包裹固定在海藻酸钙凝胶网络中。

中国专利201811491353.0公布了一种含有微球的可注射透明质酸钠凝胶的制备方法，包括以下步骤：将透明质酸钠溶解到纯水中，得到溶液A；向溶液A中加入微球材料，均匀搅拌得到均匀分散的悬浊液B；调节悬浊液B的PH值，得到悬浊液C；向悬浊液C中加入交联剂，并均匀搅拌得到混合均匀的悬浊液D，反应一定时间后，悬浊液D中的透明质酸钠交联形成含有均匀分散微球材料的胶体E；将胶体E粉碎，得到凝胶颗粒F，通过不同目数的筛网，得到凝胶颗粒G；将凝胶颗粒G通过反复浸泡或者透析的方式，将可溶性杂质、交联剂除去，得到凝胶颗粒H；使用平衡用磷酸盐缓冲液反复浸泡得到凝胶颗粒I；经过半脱水、灌装、灭菌步骤得到透明质酸钠凝胶。该方法有效的解决微球材料沉积结节的问题。该发明的不足在于不含治疗性药物，无法为骨关节炎提供主动治疗作用；此外，该发明是把微球混悬在海藻酸钠的凝胶中，然后在体外完成交联形成胶体，然后把胶体粉碎后形成凝胶颗粒，过筛后再进行浸泡透析、纯化，得到凝胶颗粒，其解决了凝胶颗粒材料沉积结节的问题。

发明内容

本发明要解决的技术课题

临床上常见的注射用交联透明质酸钠均为微交联的可以流动的透明质酸钠凝胶，这是为了方便注射，因此其黏度即交联度不能太高。然而，对于组织填充和骨关节炎患者而言，理想的是更高黏度的高强度交联透明质酸凝胶。临床上治疗骨关节炎通常是通过关节鞘内注射药物溶液进行封闭治疗，普通注射液不具有缓释药物的能力，因此需要频繁注射，给患者带来不便和反复注射的痛苦。

解决技术课题的技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提出一种在注射部位自发生成交联微球凝胶的组合物，即将流动性好的透明质酸钠溶液在注射到目标组织内后再与交联剂发生交联，既可以方便注射，也可以得到更高交联度的凝胶，解决了临床问题。此外，本发明还提出，将治疗骨关节炎药物，经过一定制剂学设计，使其与透明质酸溶液一起注射到关节鞘内，并实现长效缓慢释放，一举两得，一针注射既可以注射填充和润滑关节鞘的凝胶，也可以注射治疗活性成分。为了实现上述效果，本发明创造了如下技术方案：

本发明提供一种注射用微球组合物，包含：

含有交联剂和熔点在21-45℃的基质材料的微球B，以及透明质酸或其盐。

本发明还提供一种注射用微球组合物，包含：

a)10～97％重量的微球A，所述微球A含有聚丙交酯乙交酯以及美容或药用活性成分，

b)1～40％重量的微球B，所述微球B含有交联剂和熔点为21-45℃的基质材料；

c)2～50％重量的透明质酸或其盐。

本发明的组合物中，微球A的含量可以是20～80％重量，微球B的含量可以是10-35％重量，透明质酸或其盐的含量可以是10～45％重量。

本发明的组合物中，所述微球B的基质材料的熔点更加优选25-41℃，例如可以是25-38℃。

本发明的组合物中，所述交联剂选自赖氨酸乙酯、己二酸二酰肼、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、季戊四醇聚缩水甘油醚、山梨糖醇聚缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷和1,3-二环氧丁烷、三氯化铁、氯化钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙以及其混合物。

本发明的组合物中，进一步含有交联催化剂，所述交联催化剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(简称EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(简称NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(缩写为sulfo-NHS)中的一种或多种。

本发明的组合物中，所述透明质酸盐为药学上可接受的盐。

本发明的组合物中，所述活性成分为曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、泼尼松、可的松、利多卡因、丁卡因、维生素C、维生素E、氨甲环酸或其药学上可接受的盐中的一种或多种的任意组合。

本发明的组合物中，所述基质材料为C_10-35的脂肪酸酯。

本发明的组合物中，所述基质材料选自：十六酸甲酯、十七酸甲酯、十八酸甲酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯、十九酸乙酯、二十酸乙酯、十八酸丙酯、十九酸丙酯、二十酸丙酯、十九酸丁酯、二十酸丁酯中的一种或多种的组合物。

本发明的组合物中，所述微球A的平均粒径D50为10μm-200μm，所述微球A含有5％～70％重量的美容或药用活性成分。

本发明的组合物中，所述透明质酸或其盐的分子量优选为10万～600万，所述透明质酸盐优选透明质酸钠。

本发明的组合物中，微球B中交联剂的含量为0.1～30％重量。

本发明还提供上述组合物的制备方法，所述微球A通过油/水乳化-溶剂挥发法、固/油/水乳化-溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法、膜过滤法中的任意一种制得，所述微球B通过高温熔融喷雾低温固化法制得。

本发明的制备方法中，用于制备微球A的油/水乳化-溶剂挥发法包括：将所述药物与聚丙交酯乙交酯一起溶解在二氯甲烷溶剂中制得油相，将油相加入到含有0.2-2％体积的聚乙烯醇水溶液中，边加边搅拌，挥干二氯甲烷，过滤，收集微球，干燥后得到微球A。

本发明的制备方法中，制备所述微球B的高温熔融喷雾低温固化法包括：将基质材料(例如脂肪酸酯)和交联剂加热混合制成可以流动的均一热混合物，喷雾到小于或等于10℃的冷风气流中，雾化的液滴快速冷却，固化成微小颗粒物，即得微球B。

本发明的组合物可以用于组织填充、以及骨关节炎的治疗。

本发明的使用方法为将微球A、微球B、透明质酸(盐)与无菌水、等渗生理盐水溶液或磷酸盐缓冲液充分混合后，得到具有一定黏度但可以顺利注射的混悬液，注射到人体组织内，微球B在体温下融化并释放出交联剂，透明质酸(盐)与交联剂交联后生成机械强度更高的弹性体，起到组织润滑、填充以及治疗的作用。

有益的技术效果

1、与现有技术相比，本发明的组合物含一种或两种具有不同功能的微球和透明质酸或其盐，特点在于，微球B为一种温敏型微球，在常规存储温度(5-25℃)和低温(＜5℃)下呈固态，在注射到人体后，在体温下融化成液态，当其融化后，内部包载的交联剂被快速释放出来，与使周围的透明质酸或透明质酸盐的凝胶发生交联反应，生成机械强度更高的交联透明质酸凝胶或透明质酸盐凝胶，起到比普通关节凝胶更持久的润滑效果和更强的支撑力。在交联剂的作用下，微球凝胶还会在一定程度上与周围组织发生键合，实现了固定的效果，防止在组织内发生移位，延长在目标部位留存并发挥作用的时间。组合物中的微球A缓慢释放活性成分，起到长效治疗疾病(如：骨关节炎)的作用。

2、本发明的组合物在注射前流动性良好，可以很顺利地通过不锈钢注射针，完成注射，流体状的注射液更容易分布到整个肌体组织(例如关节鞘等腔体)内。完成注射后，关节需要更强的支撑作用。本发明的另一个特点在于，透明质酸凝胶的交联固化是发生在注射完成后，且交联是发生在腔体原位的，这就有效解决了预交联透明质酸凝胶无法注射的技术缺陷。在注射后交联还有一个优势，透明质酸凝胶在交联前可以流动充满整个腔体，交联后继续维持充满状态。

3、本发明的另一个优点是，组合物中的交联剂和交联催化剂在释放前是包裹在微球B中的，不与透明质酸钠接触，因此在注射前不会对透明质酸钠产生交联作用。在注射到腔体内后，在体温下，微球B发生熔化，其内部的交联剂和催化剂能快速地释放出来，扩散到整个腔体，最终与腔体内的透明质酸凝胶发生交联，得到高强度弹性凝胶。

4、本发明的组合物可应用于皮肤美学领域，例如用于软组织或皮肤填充，注射到皮内或皮下组织起到一定填充赋形作用、填充皱纹和皮下补水作用，具有很好的刺激胶原蛋白增生的效果、填充效果、和活性成分缓释效果，上述多种效果还可以同时发生，协同增效。本发明的组合物可应用于医学领域，例如用于关节腔注射可延长在体内的留存时间，减少注射次数，弥补现有医用透明质酸钠凝胶治疗骨关节炎时需要反复多次注射且没有活性成分治疗疾病的不足。

附图说明

图1.实施例1中微球A的扫描电镜照片；

图2.实施例1和比较例4的注射物释放甲氧喋呤的释药曲线(缓释90天)；

图3.实施例1和实施例2的微球B与比较例2的微球B的交联剂释放量。

具体实施方式

本发明的注射用微球组合物包含：含有交联剂和熔点在21-45℃的基质材料的微球B，以及透明质酸或其药学上可接受的盐。

本发明的组合物中还可以根据治疗/美容的需要，进一步含有搭载药用或医美活性成分的微球A，所述微球A优选使用具有良好的生物相容性、缓控释性能以及生物可降解的材料作为医美活性成分的搭载系统，本发明中，发明人优选聚丙交酯乙交酯(PLGA)。使用常规市售的PLGA即可，例如可以是50:50LA:GA,Mn～17,000Da、LG60:40，Mn75,000-85,000Da、LG75:25，Mn45,000-55,000Da、LG85:15，Mn100,000-125,000Da、LG85:15，Mn35,000-45,000Da、LG50:50，Mn25,000-35,000Da、LG50:50，Mn10,000-15,000Da、LG85:15，Mn35,000-45,000Da、LG85:15，Mn10,000-15,000Da等。

本发明的注射用微球组合物在使用前通过在诸如等渗生理盐水或磷酸盐缓冲液混匀得到一种以透明质酸或其盐为增稠剂的可以顺利注射的含微球的微球混悬液，当注射混悬液被注射到体内(特别是关节腔等腔体、也可以是皮肤组织、肌肉组织、结缔组织等)后，组合物中的微球B在体温环境下熔化并释放出包载在其中的交联剂(或者交联剂与交联催化剂)，交联剂与透明质酸或其盐在注射部位进行化学反应后生成机械强度更高的交联透明质酸凝胶。组合物中的微球A中含有的聚丙交酯乙交酯(PLGA)可以缓慢释放有治疗/美容作用的活性成分，起到长效治疗疾病(例如骨关节炎)的作用。

本发明的微球B具有在常规储存温度(5℃-20℃)和低温储存温度(小于5℃)下为固态、而在人体温度范围(35℃-41℃)内能够融化的温敏性能。

基质材料优选熔点略高于常规储存温度(5℃-20℃)且低于人体温范围(35℃-41℃)，更加优选具有良好的生物可降解性，以便于降低在机体内的滞留。

本发明的组合物中，所述微球B的基质材料优选不含羟基和氨基，因为羟基或氨基存在与交联剂发生交联反应从而使交联剂活性降低或部分失活的可能性，影响发明的技术效果。

所述基质材料优选C_10-35的脂肪酸酯，本发明的组合物中，所述基质材料优选选自：十六酸甲酯、十七酸甲酯、十八酸甲酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯、十九酸乙酯、二十酸乙酯、十八酸丙酯、十九酸丙酯、二十酸丙酯、十九酸丁酯、二十酸丁酯中的一种或多种的组合物。

本发明的组合物中，交联剂只要是能够使透明质酸或其盐发生交联的交联剂即可，优选但不限于赖氨酸乙酯、己二酸二酰肼、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、季戊四醇聚缩水甘油醚、山梨糖醇聚缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷和1,3-二环氧丁烷、三氯化铁、氯化钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙以及其混合物。

本发明的组合物中，还可以含有交联催化剂，所述交联催化剂用于提高交联反应速度和效率，只要是能够促进交联反应的催化剂即可，没有特别限定，优选1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(简称EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(简称NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(缩写为sulfo-NHS)中的一种或多种。

本发明的组合物中，所述透明质酸或其盐可以配制为等渗生理盐水或磷酸盐缓冲液。

本发明的组合物中，所述美容或药用活性成分没有特别限定，可以根据需要选择合适的活性成分，例如可以是曲安奈德、氢化可的松、地塞米松、泼尼松、可的松、利多卡因、丁卡因、维生素C、维生素E、氨甲环酸或其药学上可接受的盐中的一种或多种的任意组合。

本发明的组合物中，所述微球A的平均粒径D50为10μm-200μm，所述微球A含有5％～70％重量的美容或药用活性成分。

本发明的组合物中，所述透明质酸或其盐的分子量能够满足具有可在注射器中推注的黏度即可，优选不高于600万道尔顿，更加优选10万～600万道尔顿。

所述透明质酸盐只要是药学上可接受的盐即可，没有特别限定，考虑到经济性和易于获得性，优选本领域最常用的透明质酸钠。

本发明的组合物中，微球B中交联剂的含量没有特别限定，可以根据需要适当选择/调整，优选为0.1～30％重量。

本发明中，所述微球A和微球B的制备方法没有特别限定，可以根据需要选择本领域合适的微球制备方法制得，例如微球A可以通过油/水乳化-溶剂挥发法、固/油/水乳化-溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法、膜过滤法中的任意一种制得。所述微球B可以通过高温熔融喷雾低温固化法制得。

本发明的组合物可以用于组织填充，含有美容和/或药用活性成分的组合物同时还兼具缓释活性成分达到长效治疗疾病的作用。

实施例

下面结合实施例对本发明做详细的说明。实施例给出了详细的实施方式和过程，用于充分公开和展示发明可实施，实施例并不代表对发明的限制，本发明的保护范围并不限于下述的实施例。

说明书实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明中，如无特别说明，份表示重量份，％表示重量百分比。

一、微球组合物的制备方法

实施例1

微球A制备方法为：取分子量为6万Da的PLGA材料(PLGA 75:25)1g和甲氨喋呤0.25g，与二氯甲烷9g混合溶解，在高速均质下与0.5％PVA(水解度88％，分子量为4万)水溶液40g充分混合，制得乳液，转移至500mL水中，边搅拌边抽真空24小时，得到固体微球的分散液，用80μm和10μm孔径筛网过滤，搜集10μm-80μm粒径之间的微球，冻干，粉碎，即得。微球A的扫描电镜图片如图1所示。

微球B制备方法为：取45g十七酸乙酯，加热至50℃使其融化，加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚5g，在50℃下充分搅拌混合，在保持50℃温度下以1mL/min速度泵入喷雾干燥机内雾化成超小液滴并在5℃冷气下冷凝成固体颗粒(喷雾干燥机内送风为5℃液氮冷气)。

透明质酸钠冻干物：取分子量为160万Da的透明质酸钠200mg，与pH 7.8的0.1M磷酸盐缓冲液5mL充分混合溶解，经灭菌后，置于无菌西林瓶中，冻干，即得。

注射用微球组合物的制备方法：取微球A 1000mg、微球B 55mg，加至含透明质酸钠冻干物200mg的西林瓶中，密封，即得实施例组合物1。使用前，取无菌水5mL，注入到西林瓶中，振摇均匀，即可供注射使用。

实施例2

按实施例1的方法制备注射物，制备微球B时用二十酸丙酯替代十七酸乙酯。

比较例1

按实施例1的方法制备对比组合物1，制备微球B时不加交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚，交联剂的量用十七酸乙酯替代。

比较例2

按实施例1的方法制备对比组合物2，制备微球B时，用十六醇(熔点50℃)替换十七酸乙酯作为基质材料，且加热融化温度改为60℃。

比较例3

按实施例1的方法制备对比组合物3，将透明质酸钠溶液替换为用实施例1等量交联剂(即，1,4-丁二醇二缩水甘油醚)预先交联制得的交联透明质酸钠(2％浓度)。预先交联的交联透明质酸钠制备方法如下：将30g透明质酸钠溶解在100mL含0.2％w/v1,4-丁二醇二缩水甘油醚的碱性0.5N氢氧化钠溶液中，在40℃下搅拌反应8小时，加入5N盐酸溶液10mL中和至中性，加入1000mL乙醇沉淀，并继续用1000mL乙醇洗涤3次，然后抽滤得到白色沉淀，用pH 7.8的0.1M磷酸盐缓冲液1470mL充分搅拌溶解，即得交联透明质酸钠溶液。其他与实施例1保持一致。

比较例4

微球B制备方法为：取45g十七酸乙酯，加热至50℃使其融化，加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚5g，在50℃下充分搅拌混合，在保持50℃温度下以1mL/min速度泵入喷雾干燥机内雾化成超小液滴并在5℃冷气下冷凝成固体颗粒(喷雾干燥机内送风为5℃液氮冷气)。

透明质酸钠溶液制备方法：取分子量为160万的透明质酸钠200mg，与pH 7.8的0.1M磷酸盐缓冲液5mL充分混合溶解，并包装在经灭菌的预充式玻璃注射器中。

注射物制备方法：取甲氨喋呤0.25g、微球B 55mg，置于西林瓶中，将透明质酸钠溶液5mL注入到西林瓶中，振摇均匀，吸回注射器，即得对比组合物4。

二、模拟体内评价

1、粘弹性评价

通过旋转流变仪(TA公司DHR-1型号)在37℃使用25mm直径平板几何结构的夹具进行粘弹性测量，测量频率为0.01Hz至10Hz。为了确定材料的线性黏弹范围，在1Hz振荡频率下，进行应变扫描。

将实施例1组合物和比较例1组合物置于玻璃瓶中，在37℃温度下静置72小时后，测定组合物的黏弹参数，见表2。结果显示，实施例1(本发明)与不使用交联剂的比较例1相比，其弹性模量提高了50倍，黏度提高了40倍，说明本发明可以在体内生成高力学强度的凝胶。

表2.不同实施例的黏弹参数对比

2、可注射性评价

用1mL一次性塑料注射器2支，取下不锈钢针头，分别吸取实施例1和比较例3的注射物，安装25G不锈钢针头(内径0.26mm)后，用Instron^TM万能试验机夹具固定注射器套筒和推杆，保持活塞前进速度1mm/s(模拟手动注射的推进速度)，测定从注射器中挤出0.5mL体积待测物的平均动态滑移力(dynamic glide force，DGF)，对比注射阻力。结果如表3所示，实施例1(本发明)的注射阻力比比较例3(预交联的透明质酸钠)的注射阻力小约8倍，大大降低了临床操作的难度，也便于医生控制注射的剂量和注射位置。

表3.不同实施例的黏注射阻力对比

实施例	动态滑移力(N)
		实施例1	41N
比较例3	310N

3、微球A释放药物评价

如图2所示，实施例1的微球A中的药物可以缓释约90天，能够起到持久降低骨关节炎症、持续降低患者疼痛的目的；相比之下，比较例4中，药物未制备为微球，在1天之内就全部释放完全，没有缓释作用。

4、微球B释放交联剂的评价

取实施例1的微球B、实施例2的微球B和比较例2的微球B各0.5g，分别置于具塞试管中，加入pH 7.4磷酸盐缓冲液10mL，用封口膜密封后在37℃水浴摇床(振摇速度120rpm)中开展交联剂的释放考察，在不同时间点取1mL磷酸盐缓冲液，按照Nelis和Sinsheimer的方法，测定水解产物中环氧化物官能团的含量。Nelis和Sinsheimer的方法是采用高度灵敏的荧光光度法在生理条件下测定脂肪族环氧化合物的含量。测定波长为370nm下的吸收波长。(A Sensitive Fluorimetric for the Determination of Aliphatic Epoxidesunder Physiological Conditions,Analytical Biochemistry,Volume 115,Issue 1,15July 1981,Pages 151-157)。

如图3所示，实施例1和实施例2都可以迅速地在72小时内释放大部分交联剂；而比较例2的微球B几乎不能释放内部的交联剂。因此，本发明可以实现注射进入人体后在体温下释放交联剂、在注射部位生成交联透明质酸的效果。

三、动物体内评价

1、注射用微球组合物在胶原酶诱导骨关节炎动物模型中的评价

将兔子(新西兰白兔)驯化一周,并向兔子的右膝的滑液腔中注射1.25mL胶原酶(4mg/mL，Sigm公司，美国)，待胶原酶在膝关节腔内作用48小时后再注射一次碘乙酸钠(12mg,1mL)，在第14天造模结束，开始注射受试品。以造模成功后的不进行任何治疗的组作为空白组。

取新鲜配制的实施例1、比较例1的可注射物，注射3mL到膝关节腔内，治疗4周，并采集血样。将右膝切下并用10％福尔马林溶液固定。在实验期间观察临床症状，如行走行为、活动范围、肿胀等等。

使用疼痛测试仪Analgesy-Meter(Ugobasile公司,意大利)对兔膝关节进行挤压，测量兔出现回避反应时的施加压力。疼痛抑制率＝(受试组回避时压力-空白组回避时压力)/(阳性组回避时压力-空白组回避时压力)×100％。以关节内注射阳性组(关节腔内注射甲氨蝶呤注射液3mL：50mg)在注射2小时后测得疼痛抑制率作为100％。

如表4所示，实施例1(本发明)可以持续地缓解骨关节炎疼痛，在2个月的研究期内均显著优于阳性组和比较例1；而阳性组只能提供短时间的疼痛缓解，在1周及以后无疼痛抑制效果；比较例1的疼痛抑制率在2小时与实施例相当，但随时间降低显著，这是因为其不含交联剂，无法达到实施例1的原位生成强度高的交联透明质酸的效果，未交联的透明质酸随时间被组织吸收而被消耗，无法起到持续润滑关节腔和缓解疼痛的作用。因此，本发明可以实现注射进入人体后在体温下释放交联剂、在注射部位生成交联透明质酸，获得更持久和更强的疼痛减少效果。

表4.实施例1、阳性组、比较例1对家兔骨关节炎模型的疼痛抑制率

2、关节腔中透明质酸钠回收率评价

为了验证本发明在体内是否完成了原位交联，在家兔骨关节炎动物研究中的不同时间点，剖开治疗组的膝关节腔，取出腔液内容物，用旋转流变仪(TA公司DHR-1型号)在37℃使用25mm直径平板几何结构的夹具进行粘弹性测量，进行剪切速率-黏度扫描。从表5结果可见，与不含交联剂的比较例1相比，实施例1(本发明)治疗的关节腔中回收的透明质酸具有显著更高的黏度，说明本发明实现了在体内释放交联剂完成透明质酸交联的效果。

表5.注射后不同时间点从家兔关节腔中回收的透明质酸回收率(％)

综上，本发明的注射用微球组合物，可以有效控制微球B在注射完成后释放交联剂并对注射部位的透明质酸钠实施交联，得到高机械强度的原位交联凝胶，应用于关节注射可以为关节部位提供更好和更长时间的机械支撑力。本发明的透明质酸钠在注射前和注射时尚未交联，因此其注射阻力只有交联透明质酸钠的约八分之一，大大提高了可注射性。微球A可以长效释放药物3个月。关节腔内注射本发明持续有效地减少了关节疼痛。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和替换都被包括在本发明中，并以所附的权利要求书界定保护范围。

Claims (13)

1.一种注射用微球组合物，包含：

含有交联剂和基质材料的微球B、和

透明质酸或其盐，

所述基质材料是熔点在21-41℃且碳数为10-35的脂肪酸酯，所述基质材料选自：十六酸甲酯、十七酸甲酯、十八酸甲酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯、十九酸乙酯、十八酸丙酯、十九酸丙酯、十九酸丁酯中的一种或多种的组合。

2.一种注射用微球组合物，包含：

a)10～97％重量的微球A，所述微球A含有聚丙交酯乙交酯以及美容和/或药用活性成分，

b)1～40％重量的微球B，所述微球B含有交联剂和基质材料，所述基质材料是熔点为21-41℃且碳数为10-35的脂肪酸酯，所述基质材料选自：十六酸甲酯、十七酸甲酯、十八酸甲酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯、十九酸乙酯、十八酸丙酯、十九酸丙酯、十九酸丁酯中的一种或多种的组合；

c)2～50％重量的透明质酸或透明质酸盐。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，所述微球B中基质材料的熔点为25-41℃。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，所述交联剂选自赖氨酸乙酯、己二酸二酰肼、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、季戊四醇聚缩水甘油醚、山梨糖醇聚缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷和1,3-二环氧丁烷、三氯化铁、氯化钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙以及其混合物。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，进一步含有交联催化剂，所述交联催化剂选自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，所述透明质酸盐为透明质酸的药学上可接受的盐中的一种或多种的任意组合。

7.根据权利要求2所述的组合物，所述活性成分为曲安奈德或其药学上可接受的盐、氢化可的松或其药学上可接受的盐、地塞米松或其药学上可接受的盐、泼尼松或其药学上可接受的盐、可的松或其药学上可接受的盐、利多卡因或其药学上可接受的盐、丁卡因或其药学上可接受的盐、氨甲环酸或其药学上可接受的盐、维生素C、维生素E中的一种或多种的任意组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，所述微球A的平均粒径D50为10μm-200μm，所述微球A含有5％～70％重量的美容或治疗活性成分。

9.根据权利要求1或2所述的组合物，所述透明质酸或其盐的分子量为10万～600万，所述透明质酸盐为透明质酸钠。

10.根据权利要求1或2所述的组合物，所述微球B中，交联剂的含量为0.1～30％重量。

11.权利要求2～10中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述微球A通过油/水乳化-溶剂挥发法、固/油/水乳化-溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法、膜过滤法中的任意一种制得，所述微球B通过高温熔融喷雾低温固化法制得。

12.权利要求2～10中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述微球A制法包括：将所述活性成分与聚丙交酯乙交酯一起溶解在二氯甲烷溶剂中，制得油相，将油相加入到含有0.2-2％体积的聚乙烯醇水溶液中，边加边搅拌，挥干二氯甲烷，过滤收集微球，进一步干燥后得到微球A。

13.权利要求1-10中任一项所述的组合物在制备组织填充剂中的应用。

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