CN113876895B - 一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有降糖活性的复合提取物制备方法：包括如下步骤：(1)半仿生提取：首先，将艾蒿、桑叶和青稞干燥粉碎并过筛，使用酸性纯净水提取，固液分离并收集滤液和滤渣。然后再使用碱性纯净水提取，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩；(2)纯化：将浓缩液过树脂柱，收集透过液，浓缩、透析并收集截留液、分级醇沉、离心并收集沉淀、干燥即得具有降血糖活性的复合提取物。本发明利用不同植物有效成分之间存在的协同效应来增加降血糖活性。与艾蒿、桑叶、青稞的单一品种相比，本实施例中制得的组合提取物具有更强的抑制α‑葡萄糖苷酶的作用。

Description

一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用

技术领域

本发明涉及降糖复合提取物制备技术及应用领域，具体涉及一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用方向。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为标志特征的慢性代谢性疾病。目前，我国有超过4亿糖尿病患者且数量呈逐年上升趋势。糖尿病通常会伴随一些并发症，例如神经病变、高血脂、肾功能障碍等。国内外在治疗糖尿病方面多采用双胍类降糖药、磺脲类药物和胰岛素辅助降低人体血糖。但是患者在使用这类药物时常出现过敏现象或较为明显的不良反应。近年来，从中药中提取具有降糖活性的天然产物用于合成无毒无害的降糖药物成为国内外学者研究的热点。

艾蒿在我国作为一种药食同源的植物被广泛用于食品、医药等领域。艾蒿种植面积较广，在河南、湖北、安徽等地区均有较大的种植量。研究发现艾蒿中存在大量的白坚木皮醇，且在提取过程中不会出现较多的手性化合物。另外，药理研究表明白坚木皮醇对二型糖尿病的治疗具有显著的作用，是一种天然的降糖原料。

桑叶同样作为一类药食同源的植物，在我国已有超过5000年的历史。目前我国是世界上桑叶种植面积最大的国家之一。桑叶中富含黄酮类化合物、多糖以及生物碱等成分，已有研究发现桑叶中生物碱类成分1-脱氧野尻霉素(DNJ)能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而较少人体肠道对糖的吸收，降低餐后血糖水平。

青稞又被称为裸大麦、米大麦，其广泛种植于世界高原地区。在我国青稞广泛分布于青藏高原、四川盆地、甘肃等地。青稞具有纤维含量高、维生素丰富、脂肪含量低、食用后不升血糖等特点，其中的青稞β-葡聚糖在各类谷物中含量居于首位。研究表明青稞β-葡聚糖具有清肠胃、辅助治疗糖尿病、提高人体免疫力等作用。青稞价格低廉，对青稞进行精深加工开发成降糖产品，不仅可以提高藏区人民的经济收入，而且缓解了糖尿病对患者的病症影响。

半仿生提取技术作为一种中药提取新技术，在中药有效成分复合提取领域有着尤为重要的地位。该技术基于中药复合物之间药效复杂且难以保持整体性的特点，在提取过程中模拟生物胃肠道的吸收过程，将中药复合物依次经过酸性溶剂、碱性溶剂进行提取，从而得到活性成分更高的复合提取物。中药的成分复杂多样，药效的发挥不仅与中药本身有关，更取决于复合药物在提取过程中各种活性成分之间的相互作用。有研究表明生物碱类成分与多糖类成分、多酚类成分之间具有协同降血糖的作用。目前，在药食同源植物的高值化利用上，艾蒿、桑叶和青稞受到的关注度较低(艾蒿仅作为食品添加剂或者制备成乙醇提取物；桑叶仅用于食品添加剂中或养殖业上；青稞仅作为农产品在市场上售卖)；研究发现部分药食同源的植物如桑叶、苦瓜、芦荟等能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，但抑制效果普遍低于阿卡波糖。所以，从药食同源的植物资源中筛选出某些品种，通过复配、提取、纯化的方式制备出一种较为有效的降糖复配提取物是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用，制备出的复合提取物抑制α-葡萄糖苷酶的效果高于阿卡波糖，可以加入保健食品或者作为药品原料用来达到降低血糖水平的目的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有降糖活性的复合提取物制备方法，包括以下步骤：

步骤一、半仿生提取：首先，将质量比为3-7：2-8：1-5的艾蒿、桑叶和青稞干燥粉碎并过20-40目筛，使用pH为2-6的酸性纯净水在提取温度为30-80℃的条件下提取1-3小时，固液分离并收集滤液和滤渣。然后再使用pH为8-11的碱性纯净水在提取温度为20-70℃的条件下提取1-3小时，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩至原体积的1/2-1/4；

步骤二、纯化：浓缩液过树脂柱，收集透过液，减压浓缩至原体积的1/2-1/5，透析并收集截留液、分级醇沉、离心并收集沉淀、干燥即得具有降血糖活性的复合提取物。

优选地，所述步骤二中所述的树脂柱包括D101型大孔树脂柱、聚酰胺树脂柱和AB-8型大孔树脂柱。

优选地，所述步骤二中透析所用的透析袋截留分子量为5000-10000Da。

优选地，所述步骤二中分级醇沉所用的醇的体积分数为20％-70％，醇的种类为乙醇。

优选地，所述分级醇沉为先使用40％乙醇醇沉，再使用65％乙醇醇沉，离心收集65％乙醇醇沉沉淀。

优选地，所述步骤二中离心后的沉淀干燥方式为真空冷冻干燥或板式真空干燥。

作为本发明的另一项发明目的，本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的具有降糖活性的复合提取物。

作为本发明的另一项发明目的，本发明还提供了上述复合提取物在制备降低血糖保健食品或者药品中的应用，其在保健食品中的添加比例为1％-5％，在药品中的添加比例为2％-7％。

本发明产生的有益效果是：

1.艾蒿、桑叶和青稞均为药食同源的植物资源，对艾蒿、桑叶和青稞进行精深加工，提高了艾蒿、桑叶和青稞的附加值，扩宽了艾蒿、桑叶和青稞的利用渠道。

2.艾蒿、桑叶和青稞均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，辅助降低血糖水平。但单体抑制α-葡萄糖苷酶的效果与阿卡波糖相比差距较大。在本发明中利用艾蒿、桑叶和青稞活性成分之间的协同增效作用，提取、纯化出抑制α-葡萄糖苷酶效果高于阿卡波糖的天然复合提取物，避免了药物对人体的不良反应。

3.本发明利用半仿生提取技术，在最大程度上保持了各药物之间活性成分的稳定性。

附图说明

图1为本发明各实施例和对比例对α-葡萄糖苷酶的抑制率趋势图

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例指出了一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用，其方法步骤具体如下：

(1)将艾蒿12g、桑叶6g和青稞2g干燥粉碎并过40目筛，使用pH为3的酸性纯净水在提取温度为70℃的条件下提取2小时，固液分离并收集滤液和滤渣。然后再使用pH为10的碱性纯净水在提取温度为50℃的条件下提取3小时，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩至原体积的1/4；

(2)将浓缩液过聚酰胺树脂柱，收集透过液，减压浓缩至原体积的1/5，透析(透析袋截留分子量为9000Da)并收集截留液，分级醇沉(先使用30％乙醇醇沉，再使用60％乙醇醇沉，离心收集60％乙醇醇沉沉淀)、干燥沉淀即得具有降血糖活性的复合提取物。

实施例2

本实施例指出了一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用，其方法步骤具体如下：

(1)将艾蒿10g、桑叶4g和青稞6g干燥粉碎并过30目筛，使用pH为3的酸性纯净水在提取温度为70℃的条件下提取1.5小时，固液分离并收集滤液和滤渣。然后再使用pH为9的碱性纯净水在提取温度为60℃的条件下提取3小时，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩至原体积的1/3；

(2)将浓缩液过聚酰胺树脂柱，收集透过液，减压浓缩至原体积的1/4，透析(透析袋截留分子量为8000Da)并收集截留液，分级醇沉(先使用30％乙醇醇沉，再使用60％乙醇醇沉，离心收集60％乙醇醇沉沉淀)、干燥沉淀即得具有降血糖活性的复合提取物。

实施例3

本实施例指出了一种具有降糖活性的复合提取物制备方法及应用，其方法步骤具体如下：

(1)将艾蒿8g、桑叶8g和青稞4g干燥粉碎并过40目筛，使用pH为3的酸性纯净水在提取温度为60℃的条件下提取2小时，固液分离并收集滤液和滤渣。然后再使用pH为11的碱性纯净水在提取温度为65℃的条件下提取2小时，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩至原体积的1/4；

(2)将浓缩液过聚酰胺树脂柱，收集透过液，减压浓缩至原体积的1/5，透析(透析袋截留分子量为8000Da)并收集截留液，分级醇沉(先使用40％乙醇醇沉，再使用65％乙醇醇沉，离心收集65％乙醇醇沉沉淀)、干燥沉淀即得具有降血糖活性的复合提取物。

对比例1

与实施例3相比，区别在于制备原料仅为20g艾蒿。

对比例2

与实施例3相比，区别在于制备原料仅为20g桑叶。

对比例3

与实施例3相比，区别在于制备原料仅为20g青稞。

对比例4

采用阿卡波糖标准品。

试验例1

使用pNPG法测定实施例和对比例中各提取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制性。

以阿卡波糖作为阳性对照品，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为作用底物，测定各实施例和对比例制备出的样品对α-葡萄糖苷酶的抑制性。

主要试剂与仪器：4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、α-葡萄糖苷酶均购于Sigma公司；阿卡波糖(纯度＞99.9％)购于阿拉丁试剂公司；Bio Tek Synergy 2型多功能酶标仪购于Gene CompanyLimited基因有限公司。

实验步骤：(1)PBS缓冲溶液的配制：精确称取0.6020g磷酸二氢钠、2.1874g磷酸氢二钠于容量瓶中，加纯净水定容至100mL。

(2)碳酸钠溶液的配制：精确称取1.06g碳酸钠于容量瓶中，加纯净水定容至10mL。

(3)pNPG溶液的配制：精确称取0.003pNPG于容量瓶中，加入10mLPBS缓冲溶液，摇匀，避光保存，备用。

(4)α-葡萄糖苷酶溶液的制备：精确称取0.05gα-葡萄糖苷酶于容量瓶中，加PBS缓冲溶液定容至10mL，冰水中保存，备用。

(5)样品溶液和阳性对照品溶液的制备：分别将各实施例和对比例制备出的提取物和阿卡波糖配制成母液(64mg/mL)，经过梯度稀释成1、2、4、8、16、32mg/mL。

(6)显色反应：

1)空白组：吸取10μL超纯水于96孔酶标板中，然后加入40μL配制好的α-葡萄糖苷酶溶液，放入37℃恒温培养箱中10min，之后加入50μLpNPG溶液，放入37℃恒温培养箱中30min，最后使用100μL碳酸钠溶液终止反应，于405nm波长处测定其吸光度值(Abs)。

2)对照组：分别吸取10μL 1、2、4、8、16、32mg/mL的阳性对照品溶液于96孔酶标板中，然后加入40μL配制好的PBS溶液，放入37℃恒温培养箱中10min，之后加入50μLpNPG溶液，放入37℃恒温培养箱中30min，最后使用100μL碳酸钠溶液终止反应，于405nm波长处测定其吸光度值(Abs)。

3)样品组：分别吸取10μL 1、2、4、8、16、32mg/mL的样品溶液和阳性对照品溶液于96孔酶标板中，然后加入40μL配制好的α-葡萄糖苷酶溶液，放入37℃恒温培养箱中10min，之后加入50μLpNPG溶液，放入37℃恒温培养箱中30min，最后使用100μL碳酸钠溶液终止反应，于405nm波长处测定其吸光度值(Abs)。

(7)α-葡萄糖苷酶抑制率(％)计算方法：

α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1-(A₃-A₂)/A₁]×100％

A₃-样品组的吸光度值

A₂-对照组的吸光度值

A₁-空白组的吸光度值

各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率数据结果及趋势图如表1和图1所示。

表1.各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)数据结果

试验例2

分别使用高效液相色谱法(测定提取物中的DNJ)、超高效液相色谱法(测定提取物中的白坚木皮醇)和β-葡聚糖测定试剂盒(测定提取物中的青稞β-葡聚糖)测定实施例和对比例中各提取物主要活性成分含量。

一、高效液相色谱法测定提取物中的DNJ含量

主要试剂与仪器：DNJ对照品(纯度＞97.7％)购于中国食品药品检定研究院；1200型高效液相色谱仪购于安捷伦有限公司。

实验步骤：(1)DNJ对照品溶液的配制：精确称取11mgDNJ对照品于容量瓶中，加入乙腈-水(45:55)定容至25mL。

(2)样品溶液的配制：精确称取10mg提取物样品，加入乙腈-水(45:55)定容至10mL。

(3)高效液相色谱条件：色谱柱：Shodex Asahipak NH₂P-50色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相乙腈-水(80:20)；流速：1.0mL/min；柱温：37℃；进样量：10μL。

(4)DNJ含量测定：精确吸取各提取物样品溶液2μL，按上述色谱条件进样检测，计算各样品DNJ含量。

二、超高效液相色谱法测定提取物中的白坚木皮醇含量

主要试剂与仪器：白坚木皮醇对照品(纯度＞99.7％)购于中国食品药品检定研究院；Waters ACQUITY型超高效液相色谱仪购于美国Waters公司。

实验步骤：

(1)精密称取白坚木皮醇对照品40mg于50mL的容量瓶中，用纯净水定容至50mL，摇匀即得。再精密吸取该溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL分别至容量瓶中，加水至10mL，摇匀，即得。

(2)样品溶液的配制：精密称取提取物粉末约1.0g于容量瓶中，加入40％乙醇100mL，超声溶解，滤过，取滤液即得。

(3)高效液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY

BEH Amide酰胺基色谱柱(150mm×1.6mm，5μm)；流动相乙腈-水(80:20)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：1μL。

(4)白坚木皮醇含量测定：精确吸取各提取物样品溶液1μL，按上述色谱条件进样检测，计算各样品中白坚木皮醇的含量。

三、β-葡聚糖测定试剂盒测定提取物中的青稞β-葡聚糖含量

主要试剂：β-葡聚糖测定试剂盒购于Megazyme公司。

测定方法：按照β-葡聚糖测定试剂盒说明书中的方法测定提取物中的青稞β-葡聚糖含量。

表2.各提取物样品中主要活性成分含量测定数据结果

从以上数据可以看出，实施例1、2、3制备的复合提取物样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果均高于同浓度条件下的对比例4，而对比例1、2、3制备的样品抑制α-葡萄糖苷酶酶活的效果均低于同浓度条件下的对比例4。这说明实施例1-3对各原料药进行复合提取、纯化后，它们之间存在的协同增效作用显著提高了对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。同时，可以看出各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制能力存在浓度依赖性，样品浓度越高，其抑制性越强。另外，从表2可知，在提取过程中实施例和对比例使用了相同质量的原料，更进一步来说实施例中每种中药(艾蒿、青稞和桑叶)在整体中所占的比例被明显降低，且实施例得到的复合提取物中每项活性成分含量指标相较于单体提取物显著性减少，但是对α-葡萄糖苷酶的抑制能力却得到显著加强，甚至超过对比例4的抑制效果。这说明复合提取物活性成分之间的协同增效效果非常显著的结论具有可靠性。

基于上述数据分析结果，本发明实施例中所制得的复合提取物可以作为一种天然降糖活性原料应用于保健食品或者药品用于降低血糖水平，其在保健食品中的添加比例为1％-5％，在药品中的添加比例为2％-7％。

综上所述，上述实施例仅是对本发明的优选方式进行举例说明，并不包括所有的发明实施范围。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。

Claims (5)

1.一种具有降糖活性的复合提取物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、半仿生提取：首先，将质量比为3-7：2-8：1-5的艾蒿、桑叶和青稞干燥粉碎并过20-40目筛，使用pH为2-6的酸性纯净水在提取温度为30-80℃的条件下提取1-3小时，固液分离并收集滤液和滤渣，然后再使用pH为8-11的碱性纯净水在提取温度为20-70℃的条件下提取1-3小时，固液分离并收集滤液，合并两次滤液，最后将合并后的滤液减压浓缩至原体积的1/2-1/4；

步骤二、纯化：浓缩液过树脂柱，收集透过液，减压浓缩至原体积的1/2-1/5，透析并收集截留液、分级醇沉、离心并收集沉淀、干燥即得具有降血糖活性的复合提取物；透析所用的透析袋截留分子量为5000-10000Da；分级醇沉为先使用40％乙醇醇沉，再使用65％乙醇醇沉，离心收集65％乙醇醇沉沉淀。

2.根据权利要求1所述的一种具有降糖活性的复合提取物制备方法，其特征在于，所述步骤二中所述的树脂柱包括D101型大孔树脂柱、聚酰胺树脂柱和AB-8型大孔树脂柱。

3.根据权利要求1所述的一种具有降糖活性的复合提取物制备方法，其特征在于，所述步骤二中离心后的沉淀干燥方式为真空冷冻干燥或板式真空干燥。

4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的具有降糖活性的复合提取物。

5.权利要求4所述的复合提取物在制备降低血糖保健食品或者药品中的应用，其特征在于，所述复合提取物在保健食品中的添加比例为1％-5％，在药品中的添加比例为2％-7％。

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