CN113862193A - 一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)及其在制备抗肿瘤药物中的应用，涉及生物制药技术领域。所述的一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC.M.2020950，保藏日期为2020年12月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。所述应用为其在制备抗肿瘤药物方面的应用。本发明通过分离、培养和鉴定，获得了一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌的新菌株Akkermansia muciniphila SZ，该菌株体外发酵的发酵上清液和活菌体均有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用，可用于制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物，其制备成本低，制备效率高，副作用小，具有良好的工业应用前景。

Description

一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于胃癌和食管癌，严重影响人类生命健康。转移性结肠癌手术根治效果差，术后复发率高，不能切除肿瘤的患者5年生存率几乎为0。药物靶向治疗虽然取得了很大的成功，但仍然存在许多不足，如用于靶向的抗体分子量大，在肿瘤组织中穿透力低，对肝脏和骨髓产生毒性作用；免疫原性强；制备过程及周期较长，价格昂贵等。因此，研发预防和治疗结肠癌的新药物成为目前科研工作的热点问题。

经研究发现，肠道细菌可影响患者对癌症免疫治疗的反应：免疫应答好的患者，肠道中存在大量“有益”细菌，如嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)，而无应答者的肠道菌群组成失衡——这与免疫细胞活性受损有关。因此，维持健康的肠道菌群，或可帮助患者对抗癌症。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是近年来发现的一种有益菌，疣微菌门，寄居于消化道营养丰富的黏液层，是从人粪便中分离培养的一株严格厌氧的革兰氏阴性菌，在健康肠道中的丰度占0.5-5％，它具有减肥、抗炎、改善代谢的作用，其还可以调节机体的免疫应答，维持体内代谢平衡。目前关于Akkermansia muciniphila菌在癌症、糖尿病、肥胖、早衰症、渐冻症、癫痫病、IBD、高血压、孤独症等多种疾病领域均有研究报道。

中国专利CN110693917A公开了Akkermansia muciniphila菌在制备抗抑郁药物或者保健品中的应用。

中国专利CN201811541031.2公开了一种鼠源Akkermansia muciniphila 139菌株用于促进淋巴细胞调节性T细胞分化及用于缓解肠炎。

目前，尚无任何报道显示Akkermansia muciniphila菌有直接抗癌的作用。

发明内容

本发明为解决现有的抗肿瘤药物副作用大且制备周期长、成本高等问题，提供了一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila SZ)及其在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明公开了一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC.M.2020950，保藏日期为2020年12月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

上述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila SZ)获得途径如下：申请人前期研究发现中国肠癌病人粪便样品中Akkermansia muciniphila菌的丰度显著低于健康人。特别是在研究肠道菌群与BMI(体重系数)的关系中，申请人发现了一位“吃不胖”的志愿者，其肠道中存在其他人没有的细菌，分离、培养该细菌后，对其16S rRNA基因全长进行测序，利用NCBI数据库对序列结果进行比对分析，鉴定该菌株为一株新的人源Akkermansiamuciniphila菌，将其命名为Akkermansia muciniphila SZ。

作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：

培养基成分可以是BHI38.5g/L、粘蛋白2g/L、L-半胱氨酸0.3g/L、琼脂粉17g/L；

培养条件可以是37℃厌氧培养96小时；

判断菌株是否分离纯化的依据可以是：革兰氏阴性菌、菌落形态；所述菌落形态为很小、圆形凸起、不透明、白色、表面光滑、不溶血。

另一方面，本发明公开了一种药物制剂，包括上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵上清液、改造菌、突变菌和/或诱变菌。

具体地，上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌的培养方法，包括以下步骤：

S1、接种嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950；

S2、厌氧培养，即得到嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌。

作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：

培养基成分可以是BHI 38.5g/L和粘蛋白2g/L。

具体地，上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950死菌的制备方法为将上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌75℃水浴10min进行巴氏灭菌，即得到嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950死菌。

具体地，上述细胞破碎物是利用外力破坏嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的细胞膜和细胞壁，流出的细胞内容物及被破坏的细胞膜和细胞壁即为细胞破碎物。

具体地，上述发酵上清液的制备方法包括以下步骤：

S1、接种嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950；

S2、厌氧培养；

S3、将步骤S2得到的培养物离心，收集发酵上清液，过滤除菌，即得嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950发酵上清液。

具体地，上述改造菌、突变菌和/或诱变菌是在嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950 的基础上，通过自然突变、诱变、人工设计改造原菌株的遗传型，获得的新菌株。

又一方面，本发明还公开了一种基因编码产物，由上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的基因组上的基因编码，且能够诊断、预防和/或治疗肿瘤。

具体地，上述基因编码产物包括RNA和蛋白质。

本发明还公开了上述嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。

又一方面，本发明还公开了上述药物制剂在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。

作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：

基于对结肠癌细胞HT29和HCT116的体外抑制效果，本发明所述应用于制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物的药物制剂可以包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950 的发酵上清液、嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的活菌和嗜黏蛋白阿克曼氏菌 CCTCC.M.2020950的死菌；优选为嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的发酵上清液。

基于对C57BL/6小鼠中结肠癌细胞株MC38的体内抑制效果，本发明所述应用于制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物的药物制剂可以包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的活菌。

具体地，上述肿瘤为消化系统肿瘤。

具体地，上述消化系统肿瘤为肠道肿瘤、胃部肿瘤、食道肿瘤、胰腺肿瘤、胆囊肿瘤、肝肿瘤和/或阑尾肿瘤。

具体地，上述肠道肿瘤为结肠肿瘤、直肠肿瘤、十二指肠肿瘤和/或小肠肿瘤。

作为优选的但并不限制本发明范围的一些实施方案可以是：

基于对结肠癌细胞HT29和HCT116的体外抑制效果和对C57BL/6小鼠中结肠癌细胞株 MC38的体内抑制效果，本发明所述的肿瘤优选为结肠肿瘤。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950来源于一位“吃不胖”志愿者的粪便，其肠道中存在一种其他人没有的细菌，通过肠道微生物群的宏基因组高通量筛查结合传统微生物学以及分子生物学和遗传学的方法，分离、培养和鉴定出了一株用于治疗结肠癌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950，其发酵上清液及活菌体均能显著抑制肿瘤细胞的增殖，可用于制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物，其制备成本低，效率高。

2.由于嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950来源于一位健康志愿者的粪便，且相关药物实验显示在给药剂量下，未表现出明显的药物毒性。因此，其制成的抗肿瘤药物生物安全性高、副作用低。

保藏说明

保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号

保藏日期：2020年12月21日

菌种名称：疣微菌SZ

拉丁名：Akkermansiamuciniphila SZ

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO:M2020950

附图说明

图1为本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950厌氧培养后的菌落形态图；

图2为本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的革兰氏染色镜检图；

图3为本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的生长曲线图；

图4为本发明实施例2中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950发酵上清液对结肠癌细胞HCT116的体外药效实验结果图；

图5为本发明实施例2中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌和死菌对结肠癌细胞HCT116的体外药效实验结果图；

图6为本发明实施例2中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950发酵上清液对结肠癌细胞HT29的体外药效实验结果图；

图7为本发明实施例2中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌和死菌对结肠癌细胞HT29的体外药效实验结果图；

图8为本发明实施例3中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌进行体内药效实验，小鼠体重变化趋势图；

图9为本发明实施例3中嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌进行体内药效实验，小鼠肿瘤体积变化趋势图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所有使用的试剂均为市售，对其来源不做具体限定,部分试剂来源如下表1。

表1

实验例1嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的分离、培养和鉴定

1、分离培养：取新鲜的健康志愿者粪便1g，置于盛有9mL无菌厌氧含L-半胱氨酸(0.3g/L)的PBS中，振荡1分钟。取0.1mL滴于培养基A(BHI38.5g/L+粘蛋白2g/L+L-半胱氨酸0.3g/L+琼脂粉17g/L)上，划线后，置于厌氧培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司，型号：LAI-3)中，37℃培养96小时。挑取疑似菌落于培养基C(哥伦比亚血平板)上，37℃厌氧培养72h，进行革兰氏染色。显微镜下观察形态，选取革兰氏阴性菌的菌落，划线接种于哥伦比亚血平板上，厌氧培养72h。根据平板上菌落形态特征及镜下观察菌体的染色特性、大小、形状和分布情况，判断是否纯化。如细菌不纯，则继续以上步骤，反复多次分离传代，直至得到纯化的菌株。

2、菌落特征分析：在哥伦比亚血平板上培养72h后，呈现圆形凸起、不透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落很小，见附图1。

3、染色观察：显微镜下进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的椭圆形，菌体中间不着色，边缘轮廓着色，单细胞或成对存在，见附图2。

4、16S rRNA基因全长测序进行菌种鉴定：在厌氧环境下用小移液器吸头挑取一个菌落于1.5mL的EP管中并进行标记，加入20μL ddH2O，沸水浴6min。依此为模板进行后续的PCR实验，扩增得到的PCR产物进行16S rRNA测序，序列进行NCBI blast。

PCR反应体系为：Premix Taq 25μL、上下游引物各1μL、模板2μL、ddH₂O 19μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s变性；50℃60s，72℃30s，72℃7min共40个循环；4℃+∞。

使用的引物序列为：通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1)；1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:2)。

16S rRNA基因全长核酸序列(SEQ ID NO:3)如下：

AACGAACGCTGGCGGCGTGGATAAGACATGCAAGTCGAACGAGAGAATTGCTAG CTTGCTAATAATTCTCTAGTGGCGCACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCCG AGAGCGGGATAGCCCTGGGAAACTGGGATTAATACCGCATAGTATCGAAAGATTAAA GCAGCAATGCGCTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCGATGACGGGTAGCCGGTCTGAGAGGATGTCCGGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACACCTACGGGTGGCAGCAGTCGAGAATCATTCACAATGGGGGAA ACCCTGATGGTGCGACGCCGCGTGGGGAAATGAAGGTCTTCGGATTGTAAACCCCTGT CATGTGGGAGCAAATTAAAAAGATAGTACCACAAGAGGAAGAGACGGCTAACTCTGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGTCTCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCTGTTTCGTAAGTCGTGTGTGAAAGGCGCGGGCTCAACCCGCGGACG GCACATGATACTGCGAGACTAGAGTAATGGAGGGGGAACCGGAATTCTCGGTGTAGCA GTGAAATGCGTAGATATCGAGAGGAACACTCGTGGCGAAGGCGGGTTCCTGGACATTA ACTGACGCTGAGGCACGAAGGCCAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC CTGGCAGTAAACGGTGCACGCTTGGTGTGCGGGGAATCGACCCCCTGCGTGCCGGAGC TAACGCGTTAAGCGTGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAAT TGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGCTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA CCTTACCTGGGCTTGACATGTAATGAACAACATGTGAAAGCATGCGACTCTTCGGAGG CGTTACACAGGTGCTGCATGGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTTAAGT CCAGCAACGAGCGCAACCCCTGTTGCCAGTTACCAGCCACGTGAAGGTGGGGACTCTG GCGAGACTGCCCAGATCAACTGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGGTCAGTATGGC CCTTATGCCCAGGGCTGCACACGTACTACAATGCCCAGTACAGAGGGGGCCGAAGCCG CGAGGCGGAGGAAATCCTAAAAACTGGGCCCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACCCGCC TACACGAAGCCGGAATCGCTAGTAATGGCGCATCAGCTACGGCGCCGTGAATACGTTC CCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACATCATGGAAGCCGGTCGCACCCGAAGTATCT GAAGCCAACCGCAAGGAGGCAGGGTCCTAAGGTGAGACTGGTAACTGGGATG

利用NCBI数据库对上述所得菌株的16SrRNA基因全长序列进行比对分析，该菌株鉴定为一株新的人源Akkermansia muciniphila菌，将其命名为Akkermansia muciniphilaSZ。

实施例1嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950

保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC.M.2020950，保藏日期为2020年 12月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

实施例2嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的培养

液体培养基：BHI(38.5g/L)+粘蛋白(2g/L)，其中BHI培养基成分(g/L)为：胰蛋白胨10g、牛心浸粉17.5g、氯化钠5g、葡萄糖2g、磷酸氢二钠(12H₂O)2.5g。

培养条件：37℃严格厌氧培养；接种量1:100，培养72-96h。

生长曲线见附图3。

实施例3嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的活菌

取100mL培养实施例2所得培养物(8000rpm，20min)高速离心收集菌体，加入含有2.5％甘油的PBS进行悬浮，调整活菌浓度约5×10⁸CFU/mL。

实施例4嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的死菌

取100mL培养实施例2所得培养物(8000rpm，20min)高速离心收集菌体，加入含有2.5％甘油的PBS进行悬浮，调整活菌浓度约5×10⁸CFU/mL，75℃水浴10min进行巴氏灭菌。

实施例5嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的发酵液

取100mL培养实施例2所得培养物(8000rpm，20min)高速离心收集发酵上清液，用0.22μm孔径细菌滤器进行过滤除菌。

实验例2

嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950对结肠癌细胞HT29和HCT116的抑制作用

实验方法：

1、细胞培养

人源结肠癌细胞HT29和HCT116细胞分别培养在90％McCoy’s 5a(Gibco)+10％FBS(Gibco)中，收集指数生长期的细胞，PBS重悬至适合浓度(活细胞数约5×10⁴/ml)，分别接种于96孔板中，每孔接种100μL，放入培养箱中，37℃，5％CO₂，培养12-24h，细胞贴壁率约75％时，即可进行加药处理。

2、样品处理

嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950活菌：同实施例3；

嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950死菌：同实施例4；

嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950发酵上清液：同实施例5。

稀释处理：将上述活菌(浓度为5×10⁸CFU/mL)用含有2.5％甘油的PBS进行10倍梯度稀释；将上述死菌(浓度为5×10⁸CFU/mL)用PBS进行10倍梯度稀释；将上述发酵上清液用PBS进行稀释，稀释浓度分别为50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、 10％、5％。

4、给药处理

加入100μL不同浓度的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950(本申请可简称：Akkermansia muciniphila SZ)活菌和死菌至接种好的96孔板细胞培养基中孵育72h，设置空白对照组(McCoy’s 5a培养液+细胞悬液)、对照组(PBS+细胞悬液)，实验组(不同浓度的Akkermansia muciniphila SZ活菌/死菌+McCoy’s 5a培养液+细胞悬液)，每组设5个重复孔；

加入100μL不同浓度的发酵上清液至接种好的96孔板细胞培养基中孵育72h，设置空白对照组(McCoy’s 5a培养液)、对照组(实施例2中的液体培养基)，实验组(不同浓度的发酵上清液)，每组设5个重复孔，实验重复三次。

去除旧培养基，加入100μL新的培养基+20μL MTT溶液放置培养箱内继续37℃、5％CO₂培养4h。

终止培养，将150μL二甲基亚砜DMSO加入各孔，均匀缓慢摇荡约10min，使紫色晶体充分溶解。

使用酶标仪在波长570nm/630nm处对各孔OD值进行测量，并记录各组的吸光度值。

实验结果：见附图4-7。

由附图4-7可知，Akkermansia muciniphila SZ活菌和死菌对结肠癌肿瘤细胞HT29和 HCT116的抑制作用弱，但其发酵上清液有较强地抑制人源结直肠癌细胞HT29和HCT116 增殖的作用。推测Akkermansia muciniphila SZ菌在生长过程中会产生多种短链脂肪酸，进而抑制结肠癌细胞的增殖，活菌无效的原因可能是该菌耐氧程度低，随着时间增加，大量活菌死亡，无法分泌有效的代谢产物。综上所述，该菌株的体外发酵产物能够有效抑制结肠癌肿瘤细胞的增殖。

实验例3

Akkermansia muciniphila SZ活体菌药物在小鼠结肠癌细胞株MC38异种移植C57BL/6 小鼠动物模型中的抗肿瘤作用。

试验动物：雌性C57BL/6或小鼠，周龄6-7周(肿瘤细胞接种时的小鼠预计周龄)，接种细胞时小鼠体重范围为18-22g，购自君科生物技术有限公司。

实验动物饲养室的环境条件：实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，并且提前适应环境至少7天，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替，早上七点到晚上七点光照，晚上七点到次日早上七点黑暗；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物，笼卡上标明IACUC批准号、实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳号进行标记。

实验方法：

1、试验分组

每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见下表：

表2

注：剂量为10μL/g，g为小鼠重量。

2、细胞培养

MC38细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。收集指数生长期的MC38细胞，PBS重悬至1×10⁷个/mL用于小鼠皮下肿瘤接种。

3、结肠癌小鼠模型构建

将0.1mL MC38细胞接种于实验小鼠的右侧背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积96mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药，肿瘤接种记为第0天。

4、随机分组

在给药开始前，称量所有动物的体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积。鉴于肿瘤体积会影响治疗的有效性，所以用随机分组设计的方法，根据鼠的肿瘤体积对其分组，以保证不同组别间的肿瘤体积相似。

5、药物溶液配制

化合物溶液的配制在生物安全柜或超净工作台中进行，现配现用，使用前混匀，确保药物制剂是均一的。

配制方式见下表3。

表3

6、给药

接种肿瘤第9天按照实验设计开始给药。

7、试验观察和数据收集

肿瘤细胞接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。试验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。开始给药后，分别在给药第6、8、10、12、14、16、19天测量小鼠的体重(g)和肿瘤的大小(mm³)。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm³)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。

实验结果

1、小鼠体重变化：如表4和附图8所示。

表4

由表4和附图8可知：Akkermansia muciniphila SZ菌给药组(实验组)均未出现小鼠体重下降或者死亡的情况，没有表现出明显的药物毒性，且治疗期间耐受良好。

2、小鼠肿瘤大小变化情况：如表5和附图9所示。

表5

由表5和附图9可知：与对照组相比，施用Akkermansia muciniphila SZ活菌后，肿瘤体积大幅减小约1倍，且减小具有统计学显著性差异，这说明，Akkermansia muciniphilaSZ活菌可以显著抑制结肠癌生长。且在给药剂量下，荷瘤小鼠对Akkermansia muciniphilaSZ菌耐受良好。

目前Akkermansia muciniphila SZ菌在结肠癌领域的研究，国内外均未有相关报道，只有一些关于缓解结肠炎症方面的研究，但对Akkermansia muciniphila菌对结肠癌是否有直接的抑制作用未进行直面和深入研究。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 江西普瑞森基因科技有限公司

<120> 一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacgaacgct ggcggcgtgg ataagacatg caagtcgaac gagagaattg ctagcttgct 60

aataattctc tagtggcgca cgggtgagta acacgtgagt aacctgcccc cgagagcggg 120

atagccctgg gaaactggga ttaataccgc atagtatcga aagattaaag cagcaatgcg 180

cttggggatg ggctcgcggc ctattagtta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgat 240

gacgggtagc cggtctgaga ggatgtccgg ccacactgga actgagacac ggtccagaca 300

cctacgggtg gcagcagtcg agaatcattc acaatggggg aaaccctgat ggtgcgacgc 360

cgcgtgggga aatgaaggtc ttcggattgt aaacccctgt catgtgggag caaattaaaa 420

agatagtacc acaagaggaa gagacggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 480

ggtctcaagc gttgttcgga atcactgggc gtaaagcgtg cgtaggctgt ttcgtaagtc 540

gtgtgtgaaa ggcgcgggct caacccgcgg acggcacatg atactgcgag actagagtaa 600

tggaggggga accggaattc tcggtgtagc agtgaaatgc gtagatatcg agaggaacac 660

tcgtggcgaa ggcgggttcc tggacattaa ctgacgctga ggcacgaagg ccaggggagc 720

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Claims (10)

1.一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC.M.2020950，保藏日期为2020年12月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。

2.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的活菌、死菌、细胞破碎物、发酵上清液、改造菌、突变菌和/或诱变菌。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述发酵上清液的制备方法包括以下步骤：

S1、接种嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950；

S2、厌氧培养；

S3、去除菌体，即得。

4.一种基因编码产物，其特征在于，所述的基因编码产物由权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950的基因组上的基因编码，且能够诊断、预防和/或治疗肿瘤。

5.权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、接种嗜黏蛋白阿克曼氏菌CCTCC.M.2020950；

S2、厌氧培养。

6.权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。

7.权利要求2所述的药物制剂在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。

8.根据权利要求6-7任一项所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为消化系统肿瘤。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的消化系统肿瘤为肠道肿瘤、胃部肿瘤、食道肿瘤、胰腺肿瘤、胆囊肿瘤、肝肿瘤和/或阑尾肿瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的肠道肿瘤为结肠肿瘤、直肠肿瘤、十二指肠肿瘤和/或小肠肿瘤。

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