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CN113861330B - 一种应用于动物疫苗佐剂的卡波姆合成方法 - Google Patents

一种应用于动物疫苗佐剂的卡波姆合成方法 Download PDF

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CN113861330B CN202111166713.1A CN202111166713A CN113861330B CN 113861330 B CN113861330 B CN 113861330B CN 202111166713 A CN202111166713 A CN 202111166713A CN 113861330 B CN113861330 B CN 113861330B
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China Animal Husbandry Industry Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种可用于动物疫苗佐剂卡波姆的合成方法，是以烯丙基蔗糖醚作为交联剂，选用适用的引发剂，运用超临界二氧化碳，将丙烯酸单体在适当的溶剂体系中合成卡波姆聚合物，反应温度选择在31.5～60℃，反应压力选择7.2～30MPa。本发明提供的方法简单易行，体系反应完全，反应平稳，制得卡波姆纯度高，聚合度分布均一，安全性好，具有良好的佐剂性能。

Description

一种应用于动物疫苗佐剂的卡波姆合成方法
技术领域
本发明涉及到一种动物疫苗佐剂用卡波姆的合成方法，具体的是一种在超临界二氧化碳体系下以沉淀法合成卡波姆聚合物的方法。
背景技术
卡波姆又称卡波普，也称作羧基乙烯共聚物，是丙烯酸单体与交联剂如季戊四醇烯丙基醚、蔗糖烯丙基醚等进行化学交联所得的高分子聚合物，物理特性为白色、疏松的粉末，微有特殊臭味的粉末，具有较强的吸湿性，可溶于水、乙醇和甘油等，具有良好的凝胶性、粘合性、增稠性、乳化性、助悬性及成膜性等特点，且化学性质稳定安全，无刺激性和过敏性，广泛用于日化产品和药剂的增稠、稳定、缓释或控释等。目前合成卡波姆的方法大多采用丙烯酸单体与交联剂在引发剂存在条件下，在溶液中进行聚合获得。如专利CN103755861A通过采用叔丁醇水溶液作为水相反应体系，以葡萄糖丙烯酸酯、甘油丙烯酸酯、2,9-癸二烯或2-十六碳烯酸中的一种为交联剂，以过硫酸盐或双氧水中的一种为引发剂，在氮气保护65℃以下的条件下合成卡波姆；专利CN104761673A采用双丙烯酸蔗糖酯作为交联剂，同时加入十二醇丙烯酸酯单体与丙烯酸共聚，采用偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过氧化苯甲酰中的一种作为引发剂，氮气保护下45℃～70℃进行聚合制备卡波姆。
超临界二氧化碳是二氧化碳在临界温度和压力(Tc＝31.06℃，Pc＝7.39MPa)以上，具有溶解能力强且溶解能力可调，具有很强的溶胀能力、扩散能力和渗透性，传热传质速率快、能控制某些反应的速度、反应温度和压力、同时易被回收循环利用和无溶剂残留等优点。在超临界二氧化碳中进行的聚合反应，可在一定程度上克服了常规合成方法的不足，可根据需要调控反应单体之间的比例，达到分子水平的混合，发挥更优异的聚合性能，聚合过程添加助剂较少，不影响产物性能，反应中产物直接与介质分相，反应温度和压力适中，聚合反应工艺简单，产物易分离纯化等独特的优势，对于聚合物的合成和生产具有重要实际应用意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提出一种用二氧化碳作为合成卡波姆聚合物中的气体介质，尤其在超临界二氧化碳条件下合成高效疫苗佐剂材料。现行卡波姆的合成方法，均采用氮气保护下较高温度条件进行聚合，聚合反应时产物的分子量随着聚合温度升高而下降，随着单体和引发剂的浓度增加而下降，因而获得均匀度和聚合度高的卡波姆存在很大的难度，同时氮气只是作为隔绝氧气的手段，并未参与聚合反应过程的控制。而在超临界二氧化碳条件下进行卡波姆聚合反应，二氧化碳不仅是隔绝氧气的手段，而且还是聚合反应的控制条件，在该体系中引发剂得以加快分解，反应活化能降低，在低温下就能很快的产生数量可观的活性自由基，反应诱导期短，进而使得聚合反应在较低的反应温度下即可进行，同时在超临界条件下可通过调节体系反应压力和温度使得聚合反应平稳，转化率提高。这将增强卡波姆合成反应体系的稳定性，使生成的卡波姆聚合物分子量分布可控性提高，均一性更好，具有更高的佐剂性能。
为达到上述技术目标，本发明制备卡波姆的方法，将交联剂烯丙基蔗糖醚，丙烯酸单体、引发剂和溶剂混合均匀，在超临界二氧化碳条件下，进行交联聚合反应获得卡波姆聚合物。
本发明的方法是以二氧化碳作为反应控制因素和隔绝氧气的惰性气体，在二氧化碳的临界温度与压力以上，利用烯丙基蔗糖醚与丙烯酸单体在较低温度条件下，选择合适的引发剂，采用环保的乙酸乙酯、环己烷、去离子水溶剂体系中反应进行交联聚合获得卡波姆聚合物。利用超临界二氧化碳的特性，控制反应过程，制备适用于疫苗佐剂的反应产物。
在制备佐剂用卡波姆的工艺过程中选用副产物安全的引发剂和溶剂体系，因此本发明还涉及一种在超临界二氧化碳条件下进行佐剂用卡波姆合成的引发剂和溶剂体系的选择。
在卡波姆聚合过程中选择的引发剂可以为过氧化物类，偶氮类以及氧化还原类引发剂。
过氧化物类引发剂可以采用有机过氧化物，如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化环己酮硫酸盐类、过氧化二碳酸二异丙酯等，也可以是无机过氧化物类如过氧化氢、过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵中的一种或两种以上任意组合。
采用偶氮类引发剂可以为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐等。上述过氧化物类和偶氮类引发剂的引发效果通常在较高温度如在50～90℃时较为适用，限制了其在低温聚合反应中的应用，但是在超临界二氧化碳体系中，反应活化能降低，引发剂的活性自由基在较低温度下就可以产生相当的数量，因而聚合反应在较低的反应温度下即可进行，扩展了上述引发剂的适用温度范围。
超临界二氧化碳条件下(31.06℃以上)也可以采用氧化还原类引发剂进行低温的聚合反应。可构成氧化还原体系引发剂中的氧化剂可以是过氧化氢、氢过氧化物、过硫酸盐、过氧化二烷基，过氧化二酰基等，还原剂可以硫酸亚铁、亚硫酸钠以及胺、芳胺类、草酸、糖、硫醇、环烷酸盐等，可以配比组成如叔丁基过氧化氢/焦亚硫酸钠、过氧化苯甲酰/蔗糖、叔丁基过氧化氢/焦亚硫酸钠、过氧化苯甲酰/N,N-二甲基苯胺、过硫酸铵/亚硫酸氢钠、过硫酸钾/亚硫酸氢钠、过氧化氢/酒石酸、过硫酸铵/硫酸亚铁、过氧化氢/氯化亚铁，过硫酸盐/亚硫酸氢钠，过硫酸盐/次亚磷酸、过氧化苯甲酰/N,N-二乙基苯胺、过氧化苯甲酰/焦磷酸亚铁、过硫酸盐/硫醇、异丙苯过氧化氢/氯化亚铁、过硫酸钾/氯化亚铁、过氧化羟基二异丙苯(CHPO)/四乙烯五胺(TEPA)等组合。
在本发明中，引发剂优选采用偶氮类的中的偶氮二异丁腈，偶氮二异丁基脒盐酸盐，过氧化物中的过硫酸铵，氧化还原类的N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠，过硫酸铁/亚硫酸氢钠，过硫酸铵/N,N-二乙基羟胺(DEHA)，过硫酸钾/亚硫酸钾/二氧化硫脲，过氧化羟基二异丙苯(CHPO)和/四乙烯五胺(TEPA)。
更优选的，引发剂采用偶氮二异丁基脒盐酸盐，过硫酸铵，过硫酸铵/N,N-二乙基羟胺(DEHA)，N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠、过硫酸钾/亚硫酸钾/二氧化硫脲，过硫酸铁/亚硫酸氢钠，过氧化羟基二异丙苯(CHPO)/四乙烯五胺(TEPA)。
上述合成卡波姆的方法中，所述溶剂可选用苯，环己烷，乙酸乙酯、去离子水等中的一种或几种的组合物，在本发明中，溶剂优选采用乙酸乙酯、去离子水、环己烷中的一种或几种。
本发明的技术方案如下所述：
一种动物疫苗佐剂用卡波姆聚合物的合成方法，它包括如下步骤：
将所述交联剂烯丙基蔗糖醚，丙烯酸单体，溶剂，引发剂等加入反应釜，密封，通入二氧化碳排出所述反应釜内的空气，以保证反应在无氧环境中进行，加热到所需的反应温度，将所述反应釜内的温度和二氧化碳压力控制在超临界的范围，控制搅拌速率，控制反应温度、压力及反应时间直至反应结束，反应结束后，使所述反应釜降温至室温；打开所述反应釜的出气阀，降压至常压，取出产物，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
上述一种合成卡波姆的方法中所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸在两种单体的摩尔百分比为40～100％(不含100％)。优选为60-100％(不含100％)。
上述合成卡波姆的方法中，所述引发剂可选自上述的偶氮化合物、过氧化物、过硫酸盐、氧化-还原引发剂等中的一种或几种的组合物，在本发明中，优选采用偶氮二异丁基脒盐酸盐，过硫酸铵，N,N-二乙基羟胺(DEHA)/过硫酸钠，过硫酸钠-亚硫酸钠-甲脒(二氧化硫脲)等引发剂，用量为丙烯酸单体重量的0.5％～15％。
上述一种合成卡波姆的方法中，所述溶剂可选用苯,环己烷，乙酸乙酯、水等中的一种或几种的组合物，在本发明中，优选采用乙酸乙酯、环己烷、去离子水等溶剂的组合，用量为丙烯酸单体重量的100～800％，优选400-700％。
上述一种卡波姆的合成方法，所述反应釜内的压力为7.2～30MPa。
上述一种卡波姆的合成方法，所述反应温度控制在31.06～60℃。
上述一种卡波姆的合成方法，所述反应时间为1～24小时。
上述方法制备的卡波姆也属于本发明的保护范围
本发明由于采用了上述技术方案，它的有益方面为：利用二氧化碳来代替现有方法中所使用的氮气，二氧化碳的温度和压力在工业化生产中易于达到其临界温度和临界压力，同时二氧化碳自身具有不可燃、无毒、化学稳定性好、廉价易得等优点；在超临界二氧化碳体系中，反应活化能降低，引发剂的活性自由基在较低温度下就可以产生相当的数量，因而聚合反应在较低的反应温度下即可进行；反应可通过调节体系反应压力和温度控制聚合过程，使得聚合反应平稳，转化率提高，这将增强卡波姆合成反应体系的稳定性，使合成的卡波姆均一性更好，具有更高的佐剂性能；同时在制备工艺过程中选用了副产物安全的引发剂和环保的溶剂体系适用于医药级卡波姆的生产。
本发明提供的卡波姆聚合物格外适用禽用疫苗、畜用疫苗及宠物疫苗。
禽用疫苗包括但不限于禽流感疫苗、鸡新城疫灭活疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗、鸡传染性支气管炎疫苗、禽支原体病疫苗等或上述疫苗的联苗。
畜用疫苗包括但不限于口蹄疫疫苗、巴氏杆菌疫苗、链球菌疫苗、布氏杆菌疫苗、小反刍兽疫疫苗、猪圆环病毒疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪瘟疫苗、猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗、猪丹毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪支原体肺炎疫苗、猪传染性萎缩性鼻炎疫苗、牛传染性胸膜肺炎疫苗、山羊痘疫苗等或上述疫苗的联苗。
宠物疫苗包括但不限于狂犬疫苗、犬瘟热疫苗、犬传染性肝炎疫苗、猫泛白细胞减少症疫苗等或上述疫苗的联苗
基于本发明所述的卡波姆制备的疫苗具有稳定安全高效的优点。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，将结合实施例和对比例对本发明作进一步说明，所列实施例均是在以本发明技术方案为前提下实施的，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，本发明所提供的对应比例均为常规生产方法条件下所可达到。本发明中所使用的原料若无特殊说明均可从商业途径或常规方法获得。
实施例：
实施例1、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐，用量为丙烯酸单体重量的2％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为2:3，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的625％。
本实施例的超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.555mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐0.8g，溶剂乙酸乙酯100g，去离子水150g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度35℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到压力8MPa，此时开动搅拌器，反应12个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压，所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为62.3％，PH值为2.9。
实施例2、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为过硫酸铵，用量为丙烯酸单体重量的1.67％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为3:2，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的416％
本实施例的超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.555mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂过硫酸铵1.0g，溶剂乙酸乙酯150g，去离子水100g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度60℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力10MPa，此时开动搅拌器，反应12个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，羧基(-COOH)含量测定为64.1％，PH值为2.8。
实施例3、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为N,N-二乙基羟胺(DEHA)/过硫酸钠，用量为丙烯酸单体重量的1％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为2:3，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的625％
本实施例的超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.555mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂N,N-二乙基羟胺(DEHA)/过硫酸钠0.4g，溶剂乙酸乙酯100g，去离子水150g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度40℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力8MPa，此时开动搅拌器，反应6个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为62.9％，PH值为2.9。
实施例4、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为硫酸钠-亚硫酸钠-二氧化硫脲，用量为丙烯酸单体重量的1％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为2:3，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的416％
本实施例的超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸60g(0.833mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂过硫酸钠/亚硫酸钠/二氧化硫脲(三者重量比为：1：1：4)0.6g，溶剂乙酸乙酯100g，去离子水150g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度40℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力20MPa，此时开动搅拌器，反应6个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为65.7％，PH值为3.1。
实施例5、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐，用量为丙烯酸单体重量的1％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为2:3，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的416％
本实施例的卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.555mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐0.8g，溶剂乙酸乙酯65g，环己烷195g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度35℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力20MPa，此时开动搅拌器，反应6个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为62.7％，PH值为3.0。
实施例6、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.8％以上，引发剂为过硫酸铁/亚硫酸氢钠，用量为丙烯酸单体重量的15％，溶剂为乙酸乙酯和去离子水，二者的重量比为3:2，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的625％。
本实施例的卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.555mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g(0.001mol)，引发剂过硫酸铁/亚硫酸氢钠共6g，溶剂乙酸乙酯150g，去离子水100g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度60℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力30MPa，此时开动搅拌器，反应1个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为59.7％，PH值为2.8。
实施例7、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为40％以上，引发剂为过氧化羟基二异丙苯/四乙烯五胺，用量为丙烯酸单体重量的0.5％，溶剂为去离子水，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的100％。
本实施例的卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸20g(0.277mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚160g(0.4mol)，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐共0.1g，溶剂去离子水10g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度50℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力10MPa，此时开动搅拌器，反应24小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为57.1％，PH值为3.3。
实施例8、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为73％以上，引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐和过硫酸酸铵，，用量为丙烯酸单体重量的10％，溶剂为乙酸乙酯、去离子水、环己烷，三者的重量比为1:1:2，溶剂的用量为丙烯酸单体重量的400％。
本实施例的卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.277mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚40g(0.1mol)，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐2g，过硫酸酸铵2g，溶剂乙酸乙酯40g，去离子水40g,环己烷80g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度50℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力7.2MPa，此时开动搅拌器，反应6小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为58.9％，PH值为3.2。
实施例9、超临界二氧化碳中卡波姆制备的方法
本实施例中单体丙烯酸占所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为99.2％以上，引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐，用量为丙烯酸单体重量的10％，溶剂为乙酸乙酯和环己烷，二者的重量比为3:4，溶剂的用量为丙烯酸单体重量700％。
本实施例的卡波姆制备的方法包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g(0.277mol)、交联剂烯丙基蔗糖醚0.8g(0.002mol)，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐和N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠分别为2g，溶剂乙酸乙酯120g，环己烷160g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度31.06℃时，控制反应釜内二氧化碳的压力达到所需的压力7.2MPa，此时开动搅拌器，反应24小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压。所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为59.6％，PH值为3.1。
对比例：对比例1本对比例提供一种氮气保护条件下卡波姆制备的方法，包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g，引发剂偶氮二异丁腈0.8g，溶剂乙酸乙酯65g，环己烷195g分别加入到反应釜，密封。通入氮气10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度60℃时，控制反应釜内氮气的压力达到压力1MPa，此时开动搅拌器，反应12个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压，所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，测定羧基(-COOH)含量为60.7％，PH值为2.9。
对比例2本对比例提供一种二氧化碳常规压力下卡波姆制备的方法，包括如下步骤：
将单体丙烯酸40g、交联剂烯丙基蔗糖醚0.4g，引发剂偶氮二异丁基脒盐酸盐0.8g，溶剂乙酸乙酯65g，环己烷195g分别加入到反应釜，密封。通入二氧化碳10分钟，以排出反应釜内的空气，加热升温至反应温度40℃时，控制反应釜内氮气的压力达到压力1MPa，此时开动搅拌器，反应12个小时后，反应结束。使反应釜降温至室温，打开反应釜的出气阀，降压至常压，所得产物为白色产物卡波姆，经过滤洗涤真空干燥处理后保存。
合成产物为卡波姆的鉴定方法为：取产物0.1g，分散于10ml水中，搅拌使其溶解均匀，分成两份，一份加入麝香草酚蓝试液(取麝香草酚蓝0.1g，加乙醇100ml使溶解，即得)5滴，显橙色；另一份加入甲酚红试液(取甲酚红0.1g，置研钵中，加入0.01mol/L的氢氧化钠溶液26ml，研磨后，用水稀释至250ml，即得)5滴，显黄色。
卡波姆质量测定依照中国药典中的电位滴定法，羧基(-COOH)含量测定为60.1％，PH值为2.9。
实验例1合成的卡波姆聚合物物理性能表征实验
实验对象：对本发明提供的实施例1至实施例5，对比例1和对比例2所制备的卡波姆聚合物进行物理性能的表征。
1、粘度测定
在室温25℃条件下，按照药典要求，将0.5克的卡波姆均匀分散于98ml水中，待充分溶胀混匀后，用15％的氢氧化钠溶液调节PH值至7.3～7.8,加水至100ml混匀，采用旋转粘度计测定其运动粘度，各组数据如下表1所示：
表1.不同合成条件下卡波姆的粘度
Figure BDA0003291612310000131
Figure BDA0003291612310000141
从粘度数据上可以看出，超临界条件下合成的卡波姆聚合物具有较高的运动粘度，这与其超临界低温条件下，反应过程中产生的自由基速度均匀，聚合反应温和，分子量增加有关。
1.1玻璃化转变温度测定
采用示差扫描量热仪(DSC),对合成的卡波姆进行差示扫描量热的测定，测得不同条件下聚合物的玻璃化转变温度(Tg)如下表2所示：
表2.不同合成条件下卡波姆的玻璃化转变温度(Tg)
分组 Tg(℃)
实施例1 140.6
实施例2 139.5
实施例3 139.8
实施例4 141.2
实施例5 137.9
实施例6 137.2
实施例7 132.1
实施例8 136.7
实施例9 135.2
对比例1 131.4
对比例2 130.9
从玻璃化转变温度上可以看出，超临界条件下合成的卡波姆聚合物玻璃化转变温度有了相应程度的提高，这说明在此条件下聚合反应平稳，聚合体系交联程度更高。
实验例2合成的卡波姆聚合物的免疫佐剂性能实验
2.1聚合物佐剂及其疫苗的制备
依据猪圆环灭活疫苗生产规程的制备方法将实施例1至9和对比例1,2中合成的卡波姆配置同比例浓度，制备成卡波姆佐剂，用上述11种佐剂与猪圆环灭活抗原混合制备出猪圆环灭活疫苗。
2.2安全性检验
2.2.1细胞安全性检验
体外细胞毒性试验是评价生物医学材料安全性最常用的方法之一，本发明采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒进行卡波姆聚合物生物安全的评价测定。采用MARK145悬浮细胞，细胞数为80000个/毫升,接种到96孔板中，孔板最外圈只加入培养基，实验孔和空白对照孔每孔100μL微升细胞悬液，每孔加样10μL实施例1至9佐剂和对比例1,2佐剂，每个样品采用5个重复，二氧化碳培养箱中37度孵育48小时，每孔加入10微升CCK-8，继续在二氧化碳培养箱中37℃孵育4小时后用酶标仪读取各孔450nm波长的吸光值，依据细胞存活率计算公式计算各组数据如下表3所示：
表3实验例2中制备的不同卡波姆佐剂细胞存活率
Figure BDA0003291612310000151
Figure BDA0003291612310000161
实验结果表明，在实施例1至9中佐剂的细胞存活率明显高于对比例1,2，表明本发明提供的卡波姆聚合物具有良好的细胞安全性，其中实施例1和实施2的细胞安全性数据优于其他各实施例。
2.2.2动物安全性检验
将本发明实施例1至实施例9及对比例1,2所合成的卡波姆聚合物进行猪圆环疫苗佐剂动物安全性比较试验，用体重18～22g的小鼠25只，每只皮下注射疫苗0.5ml，用品种相同，4月龄、体重40Kg健康易感猪，17头，每头猪肌肉注射疫苗4ml，继续逐日观察7日。均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应，具体结果如下表4。
表4.不同合成条件制备的佐剂疫苗小鼠，猪的疫苗安全性试验结果
Figure BDA0003291612310000162
Figure BDA0003291612310000171
2.3疫苗稳定性测试
将实验例2中制备的各组猪圆环疫苗在2～8℃中放置24个月，观察其物理性状，具体结果如下表5所示。
表5.疫苗稳定性测试结果
分组 稳定性
实施例1 24个月稳定不分层
实施例2 24个月稳定不分层
实施例3 24个月稳定不分层
实施例4 24个月稳定不分层
实施例5 24个月稳定不分层
实施例6 24个月稳定不分层
实施例7 24个月稳定不分层
实施例8 24个月稳定不分层
实施例9 24个月稳定不分层
对比例1 分层状态，下层呈现雾状沉淀
对比例2 分层状态，下层呈现雾状沉淀
2.4不同卡波姆佐剂的猪圆环疫苗效力检验
按照猪圆环疫苗生产规程要求进行动物免疫：用5～6周龄PCV2 ELISA抗体阴性、健康雌性清洁级Balb/c小鼠(PCV 2ELISA抗体效价不高于1:50)，每组5只，分别皮下接种本发明提供的实施例1至实施例9猪圆环卡波姆佐剂疫苗和对比例1和对比例2疫苗，每只小鼠免疫0.2毫升，设空白对照组。各组小鼠均隔离饲养观察。分别在免疫后1周，2周，3周，4周，5周采血，分离血清，采用ELISA抗体检测方法测定血清中PCV2 ELISA抗体效价。各组结果取算数平均数，对照组应全部为阴性。数据显示，本发明提供的实施例1至实施例9各组平均抗体效价均高于对比例组。具体数据如表6所示。
表6.动物免疫评价结果圆环抗体水平测试
Figure BDA0003291612310000181
效力实验表明，应用本发明所提供卡波姆佐剂的圆环疫苗可以达到规程要求的抗体水平，较常规合成的卡波姆具有好的免疫效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种卡波姆聚合物的合成方法，其特征在于，将交联剂烯丙基蔗糖醚，丙烯酸单体、引发剂和溶剂混合均匀，在超临界二氧化碳条件下，进行交联聚合反应获得卡波姆聚合物；
所述引发剂为过氧化物类引发剂，偶氮类引发剂或氧化还原体系引发剂；
其中，过氧化物类引发剂采用有机过氧化物或无机过氧化物，所述有机过氧化物选自过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化环己酮硫酸盐类和过氧化二碳酸二异丙酯中的一种或两种以上任意组合，无机过氧化物选自过氧化氢、过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的一种或两种以上任意组合；
偶氮类引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐中的一种或两种以上任意组合；
氧化还原体系引发剂中的氧化剂选自过氧化氢、氢过氧化物、过硫酸盐、过氧化二烷基和过氧化二酰基一种或两种以上任意组合，还原剂选自硫酸亚铁、亚硫酸钠以及胺、芳胺类、草酸、糖、硫醇和环烷酸盐一种或两种以上任意组合；
所述溶剂可选用苯,环己烷，乙酸乙酯、去离子水中的一种或几种的组合物；
所述丙烯酸单体占交联剂烯丙基蔗糖醚和丙烯酸单体总用量的摩尔百分比为40～100%，但不含100%；
所述引发剂用量为丙烯酸单体重量的0.5％～15％；
所述溶剂的用量为丙烯酸单体重量的100～700%；
所述交联聚合反应的压力为7.2～30MPa；所述交联聚合反应的温度控制在31.06～60℃；交联聚合反应的反应时间为1～24小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化还原体系引发剂配比组成选自过氧化苯甲酰/蔗糖、过氧化苯甲酰/N,N-二甲基苯胺、过氧化氢/酒石酸、过硫酸铵/硫酸亚铁、过氧化苯甲酰/N,N-二乙基苯胺、过硫酸盐/硫醇或N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠；
所述偶氮类引发剂选自偶氮二异丁腈或偶氮二异丁基脒盐酸盐；
所述过氧化物类引发剂采用过硫酸铵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引发剂选自偶氮二异丁基脒盐酸盐，过硫酸铵，N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠、过硫酸铵/N,N-二乙基羟胺中的一种或几种组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引发剂选自偶氮二异丁基脒盐酸盐，过硫酸铵和N,N-二乙基羟胺/过硫酸钠中的一种或几种组合；
所述溶剂选自乙酸乙酯、去离子水或环己烷中的一种或几种的组合物。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法制备的卡波姆。
6.权利要求5所述的卡波姆在制备疫苗中的应用。
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