CN113832069B - 丁酸梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丁酸梭菌及其应用、药品、食品、保健品、兽药、饲料添加剂、微生态制剂，属于微生物技术领域。本发明的丁酸梭菌分类命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)F06，保藏号为CCTCC NO：M2019962。上述丁酸梭菌能够应用于生产γ‑氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱、乙酰胆碱、L‑色氨酸、酪氨酸、牛磺酸、乙酰胆碱、酪胺等神经递质类物质。对发酵条件优化后丁酸梭菌发酵液中γ‑氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱的含量分别达到4.78g/L，5.82g/L，135.9g/L和3.78g/L，丁酸梭菌能够应用于生产神经递质类物质，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及丁酸梭菌及其应用。
背景技术
γ-氨基丁酸是中枢神经系统中一种重要的神经递质，它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。其次，还可以促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的γ-氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。
谷氨酸是一种兴奋性神经递质，脑组织只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸，故谷氨酸可作为脑组织的能量物质，改进维持大脑机能。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂。谷氨酸能够促进消化道的蠕动。多巴胺对运动控制起重要作用，帕金森病是由于多巴胺能神经元变性引起严重的多巴胺减少所致。普遍认为中脑边缘多巴胺系统和中脑皮层多巴胺系统在学习记忆中发挥作用。有报道，猴A10区多巴胺能神经元涉及学习认知行为中基本注意力和动机过程中的冲动活动的短暂变化。随着年龄的增长，认知功能将随之下降这一事实，在人类和灵长类中都得到了很好的证明。近年来有研究提供了直接的证据，证明了多巴胺功能下降，认知功能下降和脑老化的明显相关性，对同年龄的志愿者进行对比性研究，其结果表明，多巴胺的水平与认知功能呈正相关。研究表明心情抑郁、沮丧、低愉悦感、情绪低落者，多巴胺水平低。
胆碱是所有生物膜的组成成分和胆碱能神经元中的乙酰胆碱的前体。胆碱可以促进脑发育和提高记忆能力，保证信息传递，调控细胞凋亡以及阻止胆固醇在血管内壁的沉积并清除部分沉积物，同时改善脂肪的吸收与利用，因此具有预防心血管疾病的作用。
γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、胆碱等神经递质类物质可以在体内多种酶的催化作用下转化获得，但在年龄增长、应激状态、肠道微生态失调、疾病或精神压力大的情况下，神经递质类物质(γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、胆碱等)在体内的合成显著降低，从而出现缺乏的现象。外源性的神经递质类物质添加可以改善内源性神经递质合成不足的状况，能够促进机体健康。也可能通过补充该功能性益生菌，在肠道中生产神经递质类物质直接吸收利用。因此，通过开发富含神经递质类物质(γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等)的食品、保健品、饲料或者微生态添加剂已成为研究的热点。
日本从米胚芽中开发出保健食品，该产品在改善失眠、抑郁和更年期综合症等方面具有显著效果，并被广泛添加在饮料、果酱和糕点等多种食品中。但米胚芽中含量较低，需经分离浓缩才能达到较高的含量，从而制约其应用。因此利用生物技术开发有益微生物，利用有益微生物生产富含γ-氨基丁酸的食品、保健品或饲料及其添加剂是解决此问题的关键技术。申请号为CN201910502771.3和CN201711386926.9均公开了一株高产γ-氨基丁酸的嗜热链球菌。申请号为CN201910502750.1公开了一株高产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌乳酸亚种。申请号为CN201910274454.0公开了一株高产γ-氨基丁酸的鼠李糖乳杆菌。申请号为CN201610964033.7公开了一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌。申请号CN201611003216.9公开了一株产γ-氨基丁酸的戊糖乳杆菌。申请号为CN201710149052.9公开了一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌。申请号为CN201910773775.5公开了一种促多巴胺成分的单一菌的筛选方法。申请号为CN201910257075.0公开了一株重组工程菌通过催化底物多巴来生产多巴胺。申请号为CN201911397692.7公开了一株高效生产谷氨酸的大肠杆菌。申请号为CN202010147933.9、CN201310361804.X和CN202010227468.X分别公开了一株高效生产L-谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。上述大多数微生物可以作为食品或饲料及其添加剂使用。但这些微生物所生产的神经递质较为单一，仅能生产一种神经递质。若将这些微生物联合培养应用来生产多种神经递质，这些微生物之间可能存在拮抗作用，从而达不到生产多种神经递质类物质的作用。此外，一些微生物(乳酸菌等)在体外存活能力差，不耐胃酸和胆汁酸，不能在肠道内同时生产γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、胆碱等神经递质类物质从而限制了其应用。因此，如何获得活性更强且能够同时生产多种神经递质类物质的益生菌成为新的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够生产多种神经递质类物质的丁酸梭菌，该功能性益生菌代谢产物不仅富含γ-氨基丁酸，还富含多巴胺、谷氨酸、胆碱以及L-色氨酸(5-羟色胺前体物)、酪氨酸、牛磺酸、乙酰胆碱、酪胺等多种神经递质类物质。
本发明的另一目的在于，提供上述丁酸梭菌的应用，具体包括在生产神经递质类物质中的应用、在制备药品中的应用、在制备兽药、饲料添加剂或微生态制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供包含上述丁酸梭菌的药品、兽药、饲料添加剂或微生态制剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一株丁酸梭菌，所述丁酸梭菌分类命名为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)F06，保藏号为CCTCC NO：M2019962F06。该丁酸梭菌属于芽孢杆菌科，梭菌属，丁酸梭菌种。
该丁酸梭菌是应用改良的RCM培养基，通过厌氧培养方法从健康鲤鱼肠道内容物中筛选出一株高产γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的菌株，该功能性益生菌代谢产物不仅富含γ-氨基丁酸，还富含多巴胺、谷氨酸、胆碱以及L-色氨酸(5-羟色胺前体物)、酪氨酸、牛磺酸、乙酰胆碱、酪胺等多种神经递质类物质。丁酸梭菌CCTCC NO：M2019962，菌落呈圆形，浊白色。镜检菌体为短杆状，革兰氏阳性，有芽孢，孢子卵圆。经16SrDNA电泳和测序分析，结果显示丁酸梭菌F06与丁酸梭菌(CP016332.1CP013352.1LN828942.1LN828931.1AB687551.1NR113244.1X68177.1)的16S rDNA同源性达到100％。
丁酸梭菌，又名酪酸菌、丁酸梭状芽孢杆菌、丁酸菌。丁酸梭菌属于芽孢杆菌科，梭菌属，G+，内生芽孢，可耐胃酸和胆汁酸，可抵抗不良环境。本发明的丁酸梭菌可广泛应用于药品、以及兽药、饲料添加剂、微生态制剂等领域。
本发明对上述丁酸梭菌进行了保藏，保藏菌株：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)F06，保藏编号：CCTCC NO：M2019962，保藏日期：2019年11月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
可以理解的是，本发明中神经递质类物质为神经递质和神经递质前体的统称。
本发明提供了上述丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，所述神经递质类物质为神经递质和/或神经递质前体。
具体地，上述丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、乙酰胆碱、胆碱、L-色氨酸、L-酪氨酸、牛磺酸、酪胺中的一种或任意组合。
进一步的，上述丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱、L-色氨酸和L-酪氨酸。更进一步的，所述γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱、L-色氨酸、L-酪氨酸和酪胺。
进一步的，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、乙酰胆碱、胆碱、L-色氨酸(5-羟色胺前体物)、L-酪氨酸和牛磺酸。
进一步的，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸和胆碱。
具体的，是将保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌接种到培养基中发酵生产神经递质类物质。
进一步的，本发明对丁酸梭菌发酵生产神经递质类物质的培养基成分和发酵条件进行了优化。
优选的，所述培养基包括种子培养基和发酵培养基。其中，种子培养基中包括以下浓度(g/L)的各组分：葡萄糖25、豆粕10、玉米浆30、谷氨酸钠10、磷酸二氢钾1.5、硫酸镁0.2、硫酸铵0.2、磷酸氢二钠0.5、碳酸钙0.3。发酵培养基中包括以下浓度(g/L)的各组分：葡萄糖140、豆粕15、玉米浆40、硫酸镁0.5、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.5、磷酸氢二钠0.5、碳酸钙0.3。
优选的，发酵条件：pH为6.8-7.4，温度为22℃-45℃，接种量为1％-10％，培养时间为12h-36h。
进一步优选的，最佳发酵条件：pH为7.2，温度为35℃，接种量为4％，培养时间为24h。
本发明提供了上述丁酸梭菌在制备药品中的应用。
本发明提供了一种包含上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06的药品。
本发明提供了上述的丁酸梭菌F06在制备兽药、饲料添加剂或微生态制剂中的应用。
本发明提供了一种包含上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06的兽药。
本发明提供了一种包含上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06饲料添加剂。
本发明提供了一种包含上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06的微生态制剂。
本发明取得的有益效果：
本发明应用改良的RCM培养基，通过厌氧培养方法从健康鲤鱼肠道内容物中筛选出一株高产γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的菌株：丁酸梭菌F06(CCTCCNo：M 2019962)。相较于生产单一神经递质类物质的乳酸菌，本发明提供的丁酸梭菌具有以下特点：1)是芽孢杆菌，抗逆性强，能够耐受胃酸和胆汁酸的作用；2)是厌氧菌，在结肠或盲肠生长繁殖，不与宿主争营养；3)代谢产物富含多种神经递质类物质，包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱以及L-色氨酸(5-羟色胺前体物)、L-酪氨酸、牛磺酸等；此外，本发明提供的丁酸梭菌与常规的丁酸梭菌也有所区别，常规丁酸梭菌的代谢产物为丁酸，而本发明提供的丁酸梭菌代谢产物不仅包含丁酸，而且富含γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱、以及L-色氨酸(5-羟色胺前体物)、L-酪氨酸、牛磺酸等神经递质类物质。试验证明，该菌株经发酵条件优化后，其发酵液中的γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量分别达到4.78g/L，5.82g/L，135.9g/L和3.78g/L，可广泛应用在饲料添加剂、兽药、整场益生菌等领域，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是丁酸梭菌F06菌落图；
图2是丁酸梭菌F06染色镜检图；
图3是不同时间点丁酸梭菌F06发酵液中γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量图；
图4是不同pH、温度和接种量时丁酸梭菌F06发酵液中γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量图；
图5是不同温度时丁酸梭菌F06发酵液中γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量；
图6是不同接种量时丁酸梭菌F06发酵液中γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量图；
图7是优化丁酸梭菌F06发酵条件后发酵液中γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1丁酸梭菌F06的筛选及鉴定
1、生产多种神经递质类物质的丁酸梭菌的筛选：
筛选中涉及的培养基如下：
1)经改良的RCM液体筛选培养基，1000mL中含有：胰蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母膏3g；葡萄糖5g；可溶性淀粉1g；氯化钠5g；乙酸钠3g；L-半胱氨酸0.5g；
谷氨酸钠3g；多黏霉素B 0.02g；6％的酵母浸粉；1.74％的硫酸亚铁；0.37％的磷酸氢二钾；0.2％的氯化钠；0.024％的硫酸镁。
2)经改良的RCM固体筛选培养基：1000mL经改良的RCM液体培养基加入15g琼脂。
3)经改良的强化梭菌培养基，1000mL中含有：蛋白质10g；牛肉膏10g；酵母粉3g；
葡萄糖5g；可溶性淀粉1g；氯化钠5g；L-半胱氨酸0.5g；谷氨酸钠3g；琼脂15g；
pH7.0-7.2。
4)改良的强化梭菌固体培养基：1000mL经改良的强化梭菌培养基加入15g琼脂。
5)种子发酵培养基,1000mL中含有：葡萄糖25g；豆粕10g；玉米浆30g；谷氨酸钠10g；
磷酸二氢钾1.5g；硫酸镁0.2g；硫酸铵0.2g；磷酸氢二钠0.5g；碳酸钙0.3g。
所有培养基均经过高温高压(121℃，1×105kPa)灭菌。
具体筛选步骤如下：
1)称取5g黄河河南省流域中的健康鲤鱼的肠道内容物，以1：4加入无菌生理盐水中，置于70℃水浴15分钟进行初步筛选以杀死部分非芽孢菌；
2)之后抽取5mL培养液转入100mL改良的RCM液体培养基中，37℃，180rpm条件下厌氧培养48h；
3)抽取5mL上述培养液于100mL的经改良的强化梭菌液体培养基中，37℃厌氧条件下选择性富集培养48h；
4)抽取100uL培养液进行梯度稀释，然后选取合适的稀释梯度分别涂布于经改良的强化梭菌固体培养基平板中，置于厌氧培养箱中，37℃培养48h；
5)选取菌落形态、培养特性、生化特性和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的革兰氏阳性菌株进行随后的试验；
6)通过种子发酵培养基对符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行发酵培养24h，取发酵液离心(4℃,12000r/min,10min)处理得到上清液后，采用高效液相色谱法测定发酵上清中γ-氨基丁酸、多巴胺、胆碱等神经递质类物质的含量，筛选出产神经递质类物质的能力最强的菌株，并进行保存。
2、丁酸梭菌鉴定
1)形态特征和生理生化特性鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法，对产γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质能力最强的菌株进行形态特征和生理生化特性鉴定。
2)16S rDNA序列分析
提取其基因组总DNA，用16S rRNA通用引物27F，5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R，5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’扩增菌株的16S rRNA片段。
PCR反应体系(25μL)为：2×Taq Mix 12.5μL，上游引物27F(10μmol/L)1μL，下游引物1492R(10μmol/L)1μL，细菌DNA2.5μL，无菌水8μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，28个循环；72℃延伸10min。
PCR产物用2％的TAE琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物大小，然后将16S rDNA基因产物交上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST，并构建进化树分析序列同源性。
3、结果与分析
共筛选出12株符合丁酸梭菌培养特征的菌株，分别对这12株菌株的种子发酵液进行产γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的能力的检测，结果显示，6号菌株产生γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质的能力最强。因此选择06号菌株进行后续实验，命名为丁酸梭菌F06。丁酸梭菌CCTCC NO：M2019962，菌落(图1)呈圆形，浊白色。镜检(图2)菌体为短杆状，革兰氏阳性，有芽孢，孢子卵圆。
经PCR扩增得到菌株F06的16S rDNA基因序列，测序在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列并进行系统发育分析，测序结果见SEQ ID NO.1。结果表明，菌株F06与丁酸梭菌(CP016332.1CP013352.1LN828942.1LN828931.1AB687551.1NR113244.1X68177.1)16S rDNA同源性达到100％，结合生理生化特征，判定菌株F06为梭状芽孢杆菌，命名为丁酸梭菌F06。
以上结果表明，丁酸梭菌F06能高产γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱等神经递质类物质，因此于2019年11月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCCNO：M2019962，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。
实施例2丁酸梭菌F06在生产神经递质类物质中的应用
该实施例提供了实施例1所述的丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸及胆碱。
1、丁酸梭菌F06生长曲线测定
将实验室保存的产神经递质类物质能力最强的菌株丁酸梭菌F06接种于改良的RCM固体培养基，37℃厌氧条件下静置培养24h，随后将活化的菌种接到改良的强化梭菌培养基内37℃，180rpm，厌氧条件下培养过夜作为种子液。
取6支盛有3.9mL RCM培养基的试管，用记号笔标明培养时间，即0、4、8、12、24、48h。使用移液枪每次准确地吸取100μL种子液，分别接种到已编号的6支试管中。接种后37℃厌氧静置培养，分别在0、4、8、12、24、48h将编号为对应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存。
最后用未接种RCM液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定以确定丁酸梭菌F06的生长曲线。并使用高效液相色谱法检测各时间点γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)等神经递质类物质的含量。
结果如图3所示，培养时间为24h时测得的菌落数及γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)等神经递质类物质的含量最多。
2、丁酸梭菌F06发酵培养基最佳pH、温度、接种量的确定
以4mol/L的HCl和20％NaOH溶液将种子培养基起始pH分别调节为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6和7.8，接入2％的种子液，37℃，180rpm，厌氧条件下培养24h。用血球计数法测定菌数。将2％的丁酸梭菌F06菌液接种于将100mL的改良的RCM培养基中接入，分别于30℃、37℃、40℃和45℃，180rpm，厌氧条件下恒温培养24h。按0.5％、1％、2％、4％、6％和8％的接种量接种丁酸梭菌F06种子液后，37℃，180rpm，厌氧条件下培养24h。随后分别使用血球计数法和高效液相色谱法测定各个pH、温度和接种量条件下菌落数和γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)等神经递质类物质的含量。
结果如图4、图5、图6所示，最佳培养条件如下：pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时测得的菌落数及γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)等神经递质类物质的含量最多。
3、丁酸梭菌F06培养基成分的优化
葡萄糖、豆粕、玉米浆是影响培养基的主要成分。因此，试验设计L16(34)正交试验，确定丁酸梭菌F06培养基成分，试验设计如下：葡萄糖(100g，120g，140g)，豆粕(10g，15g，20g)，玉米浆(20g，30g，40g)。随后分别使用血球计数法和高效液相色谱法测定各种成分条件下菌落数和γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)等神经递质类物质的含量。
表1培养基成分正交试验对GABA含量影响的结果
注：ⅠA值反映了B、C每个因子的1、2、3各一次的水平对A1水平的影响(A、B、C分别代表葡萄糖、豆粕、玉米粉)。同样，ⅠA反映了B、C每个因子的三个水平各一次对A2(A3)水平的影响。当比较ⅠA、ⅡA、ⅢA之间的差异时，可以认为B、C对ⅠA、ⅡA、ⅢA的影响是大体相同的。因之,可以把ⅠA、ⅡA、ⅢA之间的差异看作是由于因子A取了三个不同水平而引起的。按照此方法，可以计算出ⅠB、ⅡB、ⅢB和IC、ⅡC、ⅢC。随后计算各列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中最大值和最小值之差，这个差值就是极差，记作R。每一列的极差值反映了该列所对应的因子选取的水平变动对GABA含量影响的大小。值越大，表明该因子对GABA含量影响的程度就越大。表2、表3和表4同理。
表2培养基成分正交试验对Glu含量影响的结果
表3培养基成分正交试验对DA含量影响的结果
| 编号 | 葡萄糖(g) | 豆粕(g) | 玉米粉(g) | DA含量(g) |
| 1 | 100 | 10 | 20 | 3.89 |
| 2 | 100 | 15 | 30 | 4.38 |
| 3 | 100 | 20 | 40 | 5.14 |
| 4 | 120 | 10 | 30 | 5.24 |
| 5 | 120 | 15 | 40 | 3.86 |
| 6 | 120 | 20 | 20 | 4.26 |
| 7 | 140 | 10 | 40 | 4.32 |
| 8 | 140 | 15 | 20 | 5.08 |
| 9 | 140 | 20 | 30 | 3.69 |
| Ⅰ | 13.41 | 12.07 | 13.23 | |
| Ⅱ | 13.36 | 13.32 | 13.31 | |
| Ⅲ | 13.09 | 13.09 | 13.32 | |
| R | 0.32 | 1.02 | 0.09 |
表4培养基成分正交试验对Choline含量影响的结果
结果如表1～表4所示，丁酸梭菌F06在培养基成分为葡萄糖，140g；豆粕，15g；玉米粉，20g；培养条件为pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时测得的γ-氨基丁酸(GABA)的含量最多(表1)。丁酸梭菌F06在培养基成分为葡萄糖，140g；豆粕，20g；玉米粉，30g；培养条件为pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时测得的谷氨酸(Glu)的含量最多(表2)。丁酸梭菌F06在培养基成分为葡萄糖，130g；豆粕，10g；玉米粉，30g；培养条件为pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时测得的多巴胺(DA)的含量最多(表3)。丁酸梭菌F06在培养基成分为葡萄糖，140g；豆粕，10g；玉米粉，40g；培养条件为pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时测得的胆碱(Choline)的含量最多。由于上述结果为实验室条件下的组合没有进行生产实践，因此还需进行进一步实验验证该组合条件下丁酸梭菌F06的菌落数及相关神经递质类物质的含量。由表1～表4可知影响GABA含量的主要成分为葡萄糖，影响Glu含量的主要成分为葡萄糖，影响DA含量的主要成分为豆粕，影响Choline含量的主要成分为玉米淀粉。因此在考虑到试验结果及生产成本问题，本试验选择丁酸梭菌F06在培养基成分为葡萄糖，140g；豆粕，15g；玉米粉，40g；培养条件为pH为7.4，温度为37℃，接种量为4％，培养时间为24h时检测发酵液中神经递质类物质的含量。由图7可知，在该条件下测得的丁酸梭菌发酵液中的γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、胆碱含量分别达到4.78g，135.9g，5.82g和3.78g/L。
实施例3丁酸梭菌F06模拟消化道发酵产物代谢组学分析
该实施例对实施例1提供的丁酸梭菌F06进行了模拟消化道发酵产物代谢组学的分析具体试验方法如下：
发酵液接种丁酸梭菌F06后，分别于2、4、6、8、12、24小时取样，依次编号为A、B、C、D、E、F。然后，基于超高效液相色谱-Q-TOF MS的非靶向代谢组学分析，获得一级质谱和二级质谱数据，采用XCMS对数据进行峰提取和代谢物鉴定。
在检测结果中发现，A、B、C、D(2、4、6、8小时)样品中，也就是在丁酸梭菌F06繁殖期：γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、乙酰胆碱、胆碱、L-色氨酸、L-酪氨酸、酪胺和牛磺酸等与神经系统信号传导相关的递质明显丰富。试验结果如表5所示。
表5丁酸梭菌F06模拟消化道发酵产物代谢组学分析结果
注：mzmed是median of m/z，即质荷比的中间数。rtmed是median of retentiontime，即保留时间的中间数，这个和mzmed一起是标明这种物质的特征。POS A、B、C、D、E、F分别表示在2、4、6、8、12、24小时取样正离子模式下的分析结果(POS为positive的缩写，即正离子或阳性)。
实施例4
该实施例为实施例1所述的丁酸梭菌在制备药品中的应用。
在实际应用中，上述的药品中均包含保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌。
将上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌饲喂小白鼠，试验设置为4组(分别为阴性对照组、低剂量5000CFU、中剂量10000CFU和高剂量50000CFU)，每组10只重复。连续饲喂1周后，心脏采血分离血浆。基于LC-MS/GC—MS技术进行靶向代谢组学分析，发现饲喂保藏号为CCTCC NO：M2019962丁酸梭菌的小白鼠，γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)、L-色氨酸、L-酪氨酸、牛磺酸、乙酰胆碱、酪胺在其血浆中的含量水平，均高于不添加该菌的小白鼠。
实施例5
该实施例为实施1所述的丁酸梭菌在制备兽药、饲料添加剂或微生态制剂中的应用。
在实际应用中，上述的兽药、饲料添加剂和微生态制剂中均包含保藏号为CCTCCNO：M2019962的丁酸梭菌F06。
将上述保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06饲喂肉鸡和猪，靶向代谢组学分析检测血液中γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、胆碱(Choline)、L-色氨酸、L-酪氨酸、牛磺酸、乙酰胆碱、酪胺的含量水平，发现饲喂保藏号为CCTCC NO：M2019962的丁酸梭菌F06的鸡和猪，其血液中的含量均高于不饲喂该菌的含量。
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<221> 16s rDNA
<400> 1
gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgagcg 60
atgaagctcc ttcgggagtg gattagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 120
ctcatagagg ggaatagcct ttcgaaagga agattaatac cgcataagat tgtagtaccg 180
catggtacag caattaaagg agtaatccgc tatgagatgg acccgcgtcg cattagctag 240
ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300
cacattggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 360
caatggggga aaccctgatg cagcaacgcc gcgtgagtga tgacggtctt cggattgtaa 420
agctctgtct ttagggacga taatgacggt acctaaggag gaagccacgg ctaactacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttactg ggcgtaaagg 540
gagcgtaggt ggatatttaa gtgggatgtg aaatacccgg gcttaacctg ggtgctgcat 600
tccaaactgg atatctagag tgcaggagag gaaaggagaa ttcctagtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagaga ttaggaagaa taccagtggc gaaggcgcct ttctggactg taactgacac 720
tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780
cgatgaatac taggtgtagg ggttgtcatg acctctgtgc cgccgctaac gcattaagta 840
ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcagcgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacct agacttgaca 960
tctcctgaat tactctgtaa tggaggaagc cacttcggtg gcaggaagac aggtggtgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tattgttagt tgctaccatt tagttgagca ctctagcgag actgcccggg ttaaccggga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatgt ctagggctac acacgtgcta 1200
caatggtcgg tacaatgaga tgcaacctcg cgagagtgag caaaactata aaaccgatct 1260
cagttcggat tgtaggctga aactcgccta catgaagctg gagttgctag taatcgcgaa 1320
tcagaatgtc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag 1380
agttggcaat acccaaagtt cgtgagctaa ccgca 1415
Claims (8)
1.一种丁酸梭菌，其特征在于，所述丁酸梭菌分类命名为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）F06，保藏号为CCTCC NO：M2019962。
2.如权利要求1所述的丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，其特征在于，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、乙酰胆碱、胆碱、L-色氨酸、L-酪氨酸、牛磺酸、酪胺中的一种或任意组合。
3.根据权利要求2所述的丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，其特征在于，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、乙酰胆碱、胆碱、L-色氨酸、L-酪氨酸、酪胺。
4.如权利要求2所述的丁酸梭菌在生产神经递质类物质中的应用，其特征在于，所述神经递质类物质包括γ-氨基丁酸、多巴胺、谷氨酸、胆碱。
5.如权利要求1所述的丁酸梭菌在制备药品中的应用。
6.包含如权利要求1所述的丁酸梭菌的药品。
7.如权利要求1所述的丁酸梭菌在制备兽药或微生态制剂中的应用。
8.包含如权利要求1所述的丁酸梭菌的兽药或微生态制剂。
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|---|---|
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