CN113817743A - IgDR基因、IgDR单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IgDR基因、IgDR单克隆抗体及其制备方法与应用。其中，IgDR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；IgDR单克隆抗体系以上述IgDR基因的编码蛋白作为抗原，利用杂交瘤单克隆抗体技术制备得到。本发明提供了IgDR基因的核苷酸和氨基酸序列，以及利用IgDR基因制备得到高特异性、高亲和力的IgDR单克隆抗体。利用IgDR单克隆抗体制备检测IgDR的相关产品，可以提供对IgDR进行准确定性、定量、定位的手段，可广泛应用于临床诊断及科研工作，为医学、药学和生物学领域进行IgD及IgDR的研究提供一种新的思路和解决途径。

Description

IgDR基因、IgDR单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备及免疫应用技术领域，尤其涉及IgDR基因、IgDR单克隆抗体及其应用，以及IgDR单克隆抗体的制备方法。

上述IgDR基因以下简称为IgDR。

背景技术

免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)也称为抗体，由B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞产生，是介导体液免疫的重要效应分子，并参与免疫系统的调节。根据Ig重链恒定区免疫原性不同，目前已知有五类包括IgM、IgG、IgA、IgE和IgD，各个Ig及效应细胞的微妙平衡共同维持人体正常生理，一旦平衡打破可能导致自身免疫性疾病发生。目前免疫学对IgM、IgG、IgA和IgE功能已有较深入的研究，但对IgD的了解仍然有限。IgD最早是由Rowe和Fahey于1965年在一名骨髓瘤患者的血清中发现，主要包括膜结合型IgD(membrane IgD,mIgD)和分泌型IgD(secreted IgD,sIgD)。在人、小鼠中作为B细胞表面受体以膜结合型的形式发挥作用，mIgD参与B细胞发育、免疫功能和耐受。sIgD可作为抗体发挥作用。sIgD的血清浓度变异较大，并且在人类鼻、鼻咽、口腔和泪液中也有少量分泌。已有研究发现sIgD参与粘膜免疫反应，可通过定植在粘膜部位，与共生菌群建立相互作用来调节粘膜稳态。异常升高的sIgD可能在IgD骨髓瘤、皮肤过敏、各种感染性和自身免疫性疾病等患者出现。

免疫反应中，Ig等抗体通过其Fab段识别特定抗原，抗体介导的生物活性需要其Fc部分。决定免疫球蛋白类别的Fc段可通过与在各种细胞的膜上表达的Fc受体(FcR)结合发挥不同类别免疫球蛋白介导的多样生物活性。体内和体外研究表明，表达在不同免疫细胞上的IgDR如同“效应器”对外周循环中IgD发挥生理、病理等功能起到重要的调节作用。免疫学家已通过分子生物学等技术证明IgM、IgG、IgA和IgE均存在特异性的FcR，并进行了大量结构和免疫功能的相关研究。1980年首次发现人类外周血T细胞和非T细胞表达IgDR。然而神秘IgD的特异性FcR(FcδR,IgDR)至今尚未被克隆，仅通过绵羊红细胞玫瑰花结实验、放射免疫技术和流式细胞术等方法间接证明其存在。由于IgDR的氨基酸序列至今未知，成为深入研究IgD及IgDR生理功能和病理作用的瓶颈问题，也是医学、药学和生物学领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种IgDR基因。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种IgDR单克隆抗体。

本发明还要解决的一个技术问题是提供一种IgDR单克隆抗体的制备方法。

本发明还要解决的一个技术问题是提供了一种体外检测/诊断试剂盒。

对于IgDR基因，本发明采用的技术方案是，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选，IgDR基因为特异性与人源IgD的Fc段结构域结合的Fc受体(FcR)。

对于IgDR单克隆抗体，本发明采用的技术方案是，系以IgDR基因的编码蛋白(下称IgDR蛋白)作为抗原，利用杂交瘤单克隆抗体技术制备得到。

对于IgDR单克隆抗体的制备方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：

(1)利用大肠杆菌表达系统，采用亲和层析，离子交换柱和分子筛三步纯化获得原核表达纯化的IgDR蛋白；

(2)以IgDR蛋白作为抗原，应用杂交瘤单克隆抗体技术通过小鼠免疫及抗血清检测、细胞融合、杂交瘤筛选、建立稳定细胞株、制备腹水与纯化抗体，得到IgDR单克隆抗体。

对于体外检测/诊断试剂盒，本发明采用的技术方案是，包括IgDR单克隆抗体。

本发明还包括：

IgDR单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达IgDR的流式细胞术检测的试剂中的应用。

IgDR单克隆抗体在制备用于细胞或组织中IgDR的Westernblot检测的试剂中的应用。

IgDR单克隆抗体在制备用于组织中IgDR表达的免疫组织化学检测测试剂中的应用。

IgDR单克隆抗体在制备用于IgDR的ELISA、化学发光免疫检测或荧光免疫检测的试剂中的应用。

本发明的有益效果是：

提供了IgDR基因的核苷酸和氨基酸序列，以及利用IgDR基因制备得到高特异性、高亲和力的IgDR单克隆抗体。

利用IgDR单克隆抗体制备检测IgDR的相关产品，可以提供对IgDR进行准确定性、定量、定位的手段，包括通过流式细胞术标记细胞表面或胞内IgDR蛋白表达、激光共聚焦技术展示细胞内IgDR蛋白定位、蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白质混合物中IgDR蛋白表达量、及酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)外周血样本中IgDR表达量等，可广泛应用于临床诊断及科研工作，为医学、药学和生物学领域进行IgD及IgDR的研究提供一种新的思路和解决途径。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的IgDR同源建模3D图。圆圈部分表示IgD-IgDR结合肽段。

图2是本发明实施例1的分子模拟对接分析IgDR与IgD的Fc结构域主要对接位点。

图3是本发明实施例2的IgDR蛋白纯化产物SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图。

图4是本发明实施例3的IgDR单克隆抗体标记健康对照者和RA患者CD4⁺T细胞上IgDR的表达。

图5是本发明实施例3的IgDR单克隆抗体和生物素标记的IgD两种方法标记IgD诱导的Jurkat细胞上IgDR的表达。

具体实施方式

实施例1：确定IgDR的核苷酸序列和氨基酸序列：

1.实验方法：

1.1质谱检测IgD-IgDR结合肽段：

取PMA刺激8h后的对数生长期Jurkat细胞(10⁷/mL)，加入蛋白裂解液，4℃条件下，12000×g离心20min，收集蛋白上清。将人源天然IgD蛋白与6FF琼脂糖凝胶微珠4℃摇床孵育2h，离心收集微珠，再将收集后的微珠与蛋白上清，4℃摇床孵育2h，离心收集微珠。4℃条件下，蛋白洗脱液(含300mM咪唑)洗涤3次，10min/次，分别收集3次洗脱蛋白。将3次洗脱蛋白加入5mL超滤管(截留蛋白10～30kD)离心收集蛋白，加入蛋白置换液(低盐蛋白缓冲液)于5mL超滤管，离心置换蛋白缓冲液，得到脱盐后的蛋白，将此蛋白溶液进行质谱检测。

1.2筛选与IgD结合的膜蛋白确定IgDR核苷酸序列和氨基酸序列：

(1)根据质谱检测结果，通过uniprot网站检索蛋白库，初步筛选出可能的几个膜蛋白受体即为IgDR候选蛋白，利用免疫共沉淀法初步检测Jurkat细胞上这几个膜蛋白受体与IgD蛋白的结合能力。

免疫沉淀法：离心收集Jurkat细胞，加入免疫共沉淀(co-IP)裂解液，充分混匀冰上裂解30min，反复冻融3次后，高速离心收集蛋白上清，利用候选膜蛋白受体抗体免疫沉淀细胞蛋白后，western blot法用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10检测磷酸化膜蛋白受体蛋白的表达，抗IgD抗体检测IgD与受体蛋白的结合情况。

(2)利用Discovery studio client软件通过同源建模得到受体蛋白的三维结构。从RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)中下载IgD蛋白的结构(PDB ID:1ZVO)。运行Discovery studio 2020client程序对受体蛋白与配体IgD蛋白进行分子模拟对接，运行“Z-DOCK”模块获得的最适复合体结构通过Discovery Studio的“R-DOCK”模块进行可视化的优化处理，通过筛选获得相互作用活性位点的信息。

2.实验结果：

通过LC-MS质谱检测从6FF琼脂糖凝珠上洗脱下来的PMA持续诱导的Jurkat细胞裂解蛋白与人源IgD蛋白的混合溶液。使用无标记定量蛋白质分析(LFQ)来确定IgD与IgDR结合之间未知的肽段。共筛选出5种最有可能的候选受体蛋白。

用Discovery Studio 2020Client分子模拟对接软件对5种候选受体蛋白进行氨基酸一级序列的同源建模，利用ZDOCK模块将5种候选受体蛋白的同源模型与人源IgD蛋白(PDB ID：1ZVO)一一进行模拟对接。经过RDOCK模块的优化分析后，排除其中四种候选蛋白，因为它们与IgD模拟对接的氨基酸序列并不包含在质谱检测结果显示的结合肽段的序列中。根据uniprot网站检索结果，最终初步确定了IgDR胞外结合部分蛋白为TRβV12-4。IgDR的核苷酸序列和氨基酸一级序列分别如SEQ ID NO.1所示和如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

IgDR基因的核苷酸序列如下：

IgDR基因的氨基酸序列如下：

IgDR基因的核苷酸序列和氨基酸一级序列同源建模的有效性分析如图1。进一步通过软件筛选出了IgD-IgDR的主要对接位点(图2)。

实施例2：确定IgDR与IgD结合的亲和力和特异性：

1.实验方法：

1.1利用大肠杆菌表达系统构建、表达和纯化出IgDR蛋白：

按照IgDR的氨基酸一级序列，通过标准聚合酶链反应(PCR)扩增得到目标蛋白片段，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用Nco I和Xho I限制性内切酶或BamH I和Xho I限制性内切酶消化。载体pET-28a(+)和pcDNA3.1(+)-His通过相同的酶组合线性化，随后使用T4 DNA连接酶(5U/μL)连接载体与消化的IgDR蛋白片段以生成质粒构建体。正向和反向的引物序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，具体如下：

IgDR Nco I forward：

5′-aattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggtgtgattcagagtccgcgccatgaagtg-3′,

IgDR Xho I Reverse：

5′-agccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagcagactactggcacaaaaataaactgcac-3′；

IgDR BamH I forward：

5′-cccaagcttatggactcctggaccctctg-3′,

IgDR Xho I reverse：

5′-cgggatccgctaaactgctggcacagaagt-3′。

在Luria-Bertani(LB)培养基中，使用PET-28a(+)真核表达载体在大肠杆菌体系中表达IgDR。而后使用蛋白质纯化装置纯化IgDR表达的蛋白，使用“PBS”缓冲液+8M尿素缓冲液体系(pH＝7.4)，亲和层析色谱柱以及阴离子交换柱的组合进行蛋白纯化。最后用0.5MArg，0.2/0.02GSSH/GSH，2mM DTT，20％GLY PBS缓冲液(pH＝7.4)对蛋白进行广泛透析，纯化后的蛋白于-80℃冻存。同时，使用SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度(纯度>90％)(图3)。

1.2构建、表达和纯化IgD-Fc段蛋白：

提取人外周血PBMC提取总RNA并逆转录获得cDNA文库，用EcoR I和Nhe I限制酶消化得到IgD-Fc基因片段。载体pGMT-easy和PET28a(+)通过相同的酶组合线性化，随后使用T4 DNA连接酶与消化的IgD-Fc蛋白片段连接以生成构建体。正向和反向引物的序列如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示，具体如下：

IgD-Fc forward：5'-gctagcatgttgtccgagcc-3'，

IgD-Fc Reverse：5'-tctgagctagttgagcagagtccg-3'。

在Luria-Bertani(LB)培养基中，使用PET-28a(+)真核表达载体在大肠杆菌体系中表达IgD-Fc。而后使用蛋白质纯化装置纯化IgD-Fc表达的蛋白，使用“Na₂HPO₄”磷酸盐缓冲液体系(pH＝7.4)，亲和层析色谱柱以及阴离子交换柱的组合进行蛋白纯化。最后用0.5MArg，0.2/0.02GSSH/GSH，2mM DTT，20％GLY PBS缓冲液(pH＝7.4)对蛋白进行广泛透析，纯化后的蛋白于-80℃冻存。同时，使用SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度(纯度>90％)。

1.3IgDR的结合特异性研究：

(1)利用等温滴定量热法(ITC)检测通过纯化收集得到的IgDR蛋白与IgD蛋白、IgD-Fc段蛋白的亲和力(KD值)大小。

ITC法：将IgDR蛋白、IgD蛋白和IgD-Fc段蛋白分别用PBS稀释成合适的上样浓度，IgDR蛋白在样品池中(上样体积70μL，适宜浓度10μM)，IgD蛋白和IgD-Fc段蛋白为配体蛋白分别与IgDR蛋白发生反应(上样体积200μL，适宜浓度100μM)，检测结合的亲和力(KD值)以及焓变值(ΔH值)大小。

(2)检测IgDR蛋白与其他免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)的结合特点，证明受体蛋白结合的特异性。

ITC法：IgDR蛋白在样品池中(上样体积70μL，适宜浓度10μM)，免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)在细胞池中均为配体蛋白分别与受体蛋白发生反应(上样体积200μL，适宜浓度100μM)，设置好一系列的参数后，机器检测受体蛋白与免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)的亲和力(KD值)以及焓变值(ΔH值)大小。

1.4IgD-IgDR结合的活性作用位点研究：

通过免疫共沉淀(co-IP)法和pull-down技术观察IgDR蛋白，IgDR突变体和人IgD之间的蛋白-蛋白相互作用。

(1)构建、表达和纯化四点突变蛋白：

已知IgDR的氨基酸一级序列，根据质谱检测和分子模拟对接的结果，利用定点突变试剂盒构建了H29R、T32A、M34A、T39A和H29R/T32A/M34A/T39A五种IgDR突变质粒。而后通过PCR扩增IgDR H29R/T32A/M34A/T39A蛋白片段，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用Nco I和Xho I限制性内切酶消化。载体pET-28a(+)通过相同的酶组合线性化，随后使用T4 DNA连接酶(5U/μL)连接载体与消化的IgDR H29R/T32A/M34A/T39A蛋白片段以生成质粒构建体。正向和反向的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，具体如下：

IgDR H29R/T32A/M34A/T39A Nco I forward：

5′-ttgtttaactttaagaaggagatataccatgggtgtgattcagagtccgcgccgtgaag-3′

IgDR H29R/T32A/M34A/T39A Xho I Reverse：

5′-ccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagcagactactggcacaaaaataaact-3′

在Luria-Bertani(LB)培养基中，使用PET-28a(+)真核表达载体在大肠杆菌体系中表达IgDR突变蛋白。而后使用蛋白质纯化装置纯化IgDR突变蛋白，使用“PBS”缓冲液+8M尿素缓冲液体系(pH＝7.4)，亲和层析色谱柱以及阴离子交换柱的组合进行蛋白纯化。最后用300mM NaCl,10％Glycerol PBS缓冲液(pH＝7.4)对蛋白进行广泛透析，纯化后的蛋白于-80℃冻存。同时，使用SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度(纯度>90％)。

(2)免疫共沉淀和pull-down技术检测IgDR突变蛋白与IgD蛋白的结合：

通过加入co-IP裂解液，4℃条件下，12000×g离心15分钟后获取蛋白上清，蛋白样品用于免疫共沉淀实验，以IgD为探针，通过protein A/G微珠，形成蛋白-蛋白偶联复合物，通过Western blot法检测膜蛋白受体蛋白与IgD蛋白的结合。

将构建的IgDR质粒与IgDR突变质粒分别转染HEK 293T细胞，收集转染后的细胞，加入蛋白裂解液，通过细胞破碎仪破碎细胞后，4℃条件下，12000×g离心20min，将带有His标签的IgDR与6FF琼脂糖凝胶微珠，4℃摇床孵育2h，离心收集微珠，4℃条件下，蛋白洗液(含20mM咪唑)洗涤3次，30min/次，离心收集微珠。将人天然IgD蛋白与处理的微珠，4℃摇床孵育12～16h。离心收集微珠，加入20～30μL的蛋白上样缓冲液，沸水煮10min，Westernblot检测IgDR与IgD的共表达。

(3)ITC法检测IgDR突变蛋白与IgD蛋白的结合情况：

将IgDR突变蛋白洗脱，加在样品池中(上样体积70μL，适宜浓度10μM)，IgD蛋白为配体蛋白加在细胞池中(上样体积200μL，适宜浓度100μM)，设置好一系列的参数后，机器检测突变质粒蛋白与IgD蛋白的亲和力(K_D值)以及焓变值(ΔH值)大小。

2.实验结果：

TRβV12-4为IgDR胞外结合部分蛋白，分子量为11.9kDa。通过ITC实验获得的各项参数表明(见表1)：人IgD蛋白以及IgD-Fc段蛋白与IgDR结合的K_D值均为10^-12M左右，具有高亲和力结合特征。为了进一步确认IgDR的受体特征，首先使用ITC检测IgDR蛋白与各种免疫球蛋白亚型(IgD、IgA、IgE、IgM、IgG)之间的结合亲和力。观察热力学参数(K_D、ΔG、ΔH和-TΔS)，结果表明：IgDR与IgA、IgE、IgM和IgG结合的K_D值较大，表明除了IgD，其他几种免疫球蛋白亚型与IgDR的亲和力都很低。ITC实验数据表明IgD的Fc结构域可特异性与IgDR结合，配体受体结合的亲和力较高，K_D为10^-12M。实验结果进一步证明IgDR与IgD结合具有高亲和力和高特异性的特性。

表1.亲和力实验的热力学参数

IgDR突变蛋白与人IgD的蛋白-蛋白相互作用显著降低，其中，H29R/T32A/M34A/T39A位点突变导致IgDR与人IgD的蛋白-蛋白相互作用降低最为明显。

鉴于上述实验结果，进一步利用大肠杆菌表达系统构建、表达和纯化了IgDR的H29R/T32A/M34A/T39A四点突变蛋白，并与野生型蛋白的K_D值进行比较，IgDR的H29R/T32A/M34A/T39A四点突变蛋白与IgD结合的K_D值为10^-3M左右，亲和力大大降低(表1)。以上结果证明IgDR的H29、T32、M34和T39四个氨基酸位点可能是与人IgD Fc结构域结合的关键结合位点。

实施例3：单克隆抗体的制备及性能评估：

1.实验方法：

利用纯化的IgDR蛋白作为制备IgDR单克隆抗体的抗原，应用细胞融合技术将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，通过筛选，克隆化，选择出既具有分泌抗体功能，又能无限增殖的杂交瘤细胞，通过将杂交瘤腹腔注射BALB/c小鼠，制备小鼠腹水，最后从腹水中纯化出高纯度的IgDR单克隆抗体(IgDR mAb)。并进一步利用流式细胞术对IgDRmAb进行作用评估。

1.1小鼠免疫及抗血清检测：

免疫：选取BALB/c小鼠5只(雌性，鼠龄6～8周)，对小鼠进行标记并编号，尾静脉采血30～50μl，凝血后离心收集免疫前血清。按每只小鼠免疫量200μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫。两周后进行第二次免疫，按每只小鼠免疫量100μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫。两周后进行第三次免疫，按每只小鼠免疫量100μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫。三免后一周，尾静脉采血30～50μl，凝血后离心收集血清，ELISA检测血清效价。

检测效价：CBS包被IgDR抗原，包被浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜，用抗体封闭液进行封闭，室温封闭1h后洗板，小鼠血清起始稀释度为1:1000，倍比稀释，PBS为阴性对照，ELISA检测血清效价，酶标仪测定OD450读数。

1.2细胞融合：

至少融合前一周准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，调整细胞状态至对数生长期，选择ELISA效价最高的小鼠，融合前3天对小鼠进行加强免疫，50μg/只，腹腔注射。

融合：取小鼠脾脏，机械破碎后收集脾细胞，200目筛网过滤，PBS洗涤3次；收集SP2/0细胞，PBS洗涤3次；细胞计数后按SP2/0:脾细胞＝1:5的比例进行混合，离心后弃去PBS，使用PEG进行细胞融合。融合结束，进行细胞离心并加入含HAT的完全培养基，重悬混匀细胞后铺板于96孔板中。

换液：融合后7天进行一次半换液。

1.3杂交瘤筛选

ELISA检测：包被IgDR抗原，包被浓度1μg/ml，00μl/孔，融合后7天吸取细胞培养上清进行ELISA检测，记录读数大于0.5的孔，做好标记并进行换液。

ELISA复检：次日对进行换液的阳性孔进行复检，记录效价稳定的克隆号。

1.4稳定细胞株建立：

首次亚克隆：从上步中选择12株进行亚克隆筛选，完全培养基，按照有限稀释法，铺板于1个96孔板中。7天后镜下观察，标记出单克隆孔，进行一次半换液，次日进行ELISA检测，舍弃转为阴性的克隆号，对于阳性克隆，挑选生长旺盛的孔进行一次半换液。

二次亚克隆：从上步中选择10株进行亚克隆筛选，按每孔1个细胞的数量铺板于半个96孔板中。7天后镜下观察，标记出单克隆孔，进行一次半换液，次日进行ELISA检测，亚克隆至ELISA检测阳性率为100％时，挑选生长旺盛的孔进行扩大培养，冻存保种。

1.5腹水制备与抗体纯化：

小鼠致敏：液体石蜡致敏BALB/c小鼠，以经产鼠为宜，注射体积500ul/只。10天后可注射杂交瘤细胞制备腹水。

注射细胞：收集杂交瘤细胞并用PBS洗涤两遍，取100到150万细胞注射于小鼠腹腔，一周后可见小鼠状态不活跃并且小鼠的腹腔肿大，10天后小鼠腹腔明显膨胀后处死小鼠，取出腹水，ELISA检测腹水效价。

纯化腹水中抗体：腹水采用Protein A亲和纯化抗体，取样并SDS-PAGE电泳验证纯度，使用超微量分光光度计检测抗体浓度值并记录。纯化后的抗体用超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，超净台内0.22μM孔径滤膜无菌过滤，-20℃保存备用。

抗体效价检测：CBS包被IgDR蛋白，包被浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜后用封闭液进行封闭，室温封闭1h后洗板，抗体起始稀释度为1:2000，倍比稀释，PBS为阴性对照，ELISA检测抗体效价，酶标仪测定OD450读数。

抗体纯度检测：SDS-PAGE检测抗体纯度。

浓度测定：使用Nano-500测定抗体浓度。

1.6IgDR mAb性能评估

(1)收集类风湿关节炎(RA)患者和健康对照者外周血，通过密度梯度离心法获取健康对照者和RA患者外周血中的PBMC细胞，PBMC细胞与BV421-CD4流式抗体和IgDR单克隆抗体在冰上避光孵育50min后，再与Alexa Fluor 488-羊抗鼠荧光二抗在冰上避光孵育30min，流式细胞仪检测健康对照者和RA患者CD4⁺T细胞上IgDR的表达。

(2)Jurkat细胞与不同浓度的IgD(0.03,0.1,0.3,1,3,10,30μg/mL)在37℃，5％CO₂的孵育箱中共同孵育24h后，分别以荧光生物素标记的IgDR和IgDR单克隆抗体作为一抗标记Jurkat细胞，通过流式细胞术检测并比较两种一抗标记Jurkat细胞上IgDR的表达差异。

2.实验结果

BALB/c小鼠皮下多点免疫IgDR抗原，利用小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，HAT筛选培养，包被抗原，ELISA筛选阳性克隆，最终获得5株杂交瘤细胞株，通过杂交瘤注射小鼠腹腔，诱导生成小鼠腹水，纯化腹水获得单克隆抗体，Nano-500测定抗体浓度、考马斯亮蓝法测定抗体纯度、ELISA法检测抗体效价，成功制备了IgDR mAb，纯度大于85％，浓度调整为2mg/ml。

与已有报道一致，IgDR在RA患者和健康对照者外周血CD4⁺T细胞上均有明显表达，并且IgDR在RA患者中表达显著高于健康对照者(P<0.05)(图4)。Jurkat细胞表明IgDR表达在IgD(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30μg/mL)刺激24小时后显著升高(P<0.01)。作为对IgDR进行准确定性、定量、定位的特异性抗体，IgDR单克隆抗体的特异性与敏感性均高于生物素标记的IgD(图5)。利用此产品可进一步制备体外检测/诊断试剂盒，对IgDR蛋白进行准确定性、定量、定位等，包括但不仅限于化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒。综上，IgDR单克隆抗体可用于流式细胞术检测人类细胞表面IgDR表达，Western blot检测细胞或组织中IgDR表达，免疫组织化学检测组织中IgDR表达，以及ELISA、化学发光免疫或荧光免疫等多种检测方法用于人类样本中IgDR的表达检测的应用。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请保护的范围。

序列表

<110> 魏 伟

<120> IgDR基因、IgDR单克隆抗体及其制备方法与应用

<130> NO

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccatgggtgt gattcagagt ccgcgccatg aagtgaccga aatgggccag gaagtgaccc 60

tgcgttgcaa accgattagc ggtcatgatt atctgttttg gtatcgccag accatgatgc 120

gtggcctgga actgctgatc tattttaata ataacgtgcc gattgacgat agtggtatgc 180

cggaagatcg ctttagtgcc aaaatgccga atgcaagctt tagtaccctg aaaattcagc 240

cgagcgaacc gcgtgatagt gcagtttatt tttgtgccag tagtctgctc gag 293

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala

1 5 10 15

Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr

20 25 30

Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His

35 40 45

Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu

50 55 60

Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro

65 70 75 80

Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu

85 90 95

Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Leu

115

<210> 3

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatgggtgt gattcagagt ccgcgccatg 60

aagtg 65

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agccggatct cagtggtggt ggtggtggtg ctcgagcaga ctactggcac aaaaataaac 60

tgcac 65

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccaagctta tggactcctg gaccctctg 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccgc taaactgctg gcacagaagt 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctagcatgt tgtccgagcc 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctgagctag ttgagcagag tccg 24

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gggtgtgatt cagagtccgc gccgtgaag 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccggatctca gtggtggtgg tggtggtgct cgagcagact actggcacaa aaataaact 59

Claims (10)

1.IgDR基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的IgDR基因，其特征在于，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的IgDR基因，其特征在于，为特异性与人源IgD的Fc段结构域结合的Fc受体。

4.IgDR单克隆抗体，其特征在于，系以如权利要求1所述IgDR基因的编码蛋白作为抗原，利用杂交瘤单克隆抗体技术制备得到。

5.如权利要求4所述的IgDR单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用大肠杆菌表达系统，采用亲和层析，离子交换柱和分子筛三步纯化获得原核表达纯化的如权利要求1所述IgDR基因的编码蛋白；

(2)以IgDR基因的编码蛋白作为抗原，应用杂交瘤单克隆抗体技术通过小鼠免疫及抗血清检测、细胞融合、杂交瘤筛选、建立稳定细胞株、制备腹水与纯化抗体，得到IgDR单克隆抗体。

6.体外检测/诊断试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的IgDR单克隆抗体。

7.如权利要求4或5所述的IgDR单克隆抗体在制备用于人类细胞表面表达IgDR的流式细胞术检测的试剂中的应用。

8.如权利要求4或5所述的IgDR单克隆抗体在制备用于细胞或组织中IgDR的Westernblot检测的试剂中的应用。

9.如权利要求4或5所述的IgDR单克隆抗体在制备用于组织中IgDR表达的免疫组织化学检测测试剂中的应用。

10.如权利要求4或5所述的IgDR单克隆抗体在制备用于IgDR的ELISA、化学发光免疫检测或荧光免疫检测的试剂中的应用。

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