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CN113817025A - Sle抗原表位多肽在鉴别sle和其他自身免疫疾病中的作用 - Google Patents

Sle抗原表位多肽在鉴别sle和其他自身免疫疾病中的作用 Download PDF

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CN113817025A
CN113817025A CN202110720643.3A CN202110720643A CN113817025A CN 113817025 A CN113817025 A CN 113817025A CN 202110720643 A CN202110720643 A CN 202110720643A CN 113817025 A CN113817025 A CN 113817025A
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Abstract

一种SLE抗原表位多肽在鉴别SLE和其他自身免疫疾病中的作用，本发明先通过噬菌体展示肽技术筛选出SLE相关多肽，再经过多肽芯片验证和ELISA法验证获取具有诊断价值的抗原表位多肽。且不仅是通过SLE患者组与健康人群组进行筛选，还通过与具有其他自身免疫疾病的疾病对照组进行筛选，多次验证过程中也通过与具有其他自身免疫疾病的对照组比较进一步验证上述抗原表位多肽区分SLE与其他自身免疫疾病的效果，结果表明，上述抗原表位多肽能有效区分SLE与其他自身免疫疾病，所以，该抗原表位多肽有利于应用于诊断过程中实现SLE与其他自身免疫疾病的区分，提供准确的诊断结果，以便及时制定相应治疗策略，实现有效治疗。

Description

SLE抗原表位多肽在鉴别SLE和其他自身免疫疾病中的作用
技术领域
本发明涉及免疫学诊断技术领域，更具体地，涉及一种SLE抗原表位多肽在鉴别SLE和其他自身免疫疾病中的作用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的、复杂的自身免疫性疾病，亦被称为自身免疫性疾病的“原型”，临床表现复杂多样，且往往会累及全身多系统，包括肾、皮肤、关节、神经系统、浆膜等，致使相关组织、器官受损。严重时，还会引起多器官衰竭、中枢神经系统损伤等症状而导致患者死亡。所以，早期诊断对及时减轻或避免重要器官受累、改善患者预后、提高患者生存率显得至关重要。
然而，由于SLE的发病机制目前还没有完全阐明，SLE的诊断效果往往有限。如，常规的依据患者临床表型诊断虽然能获取一定的诊断结果，但由于SLE早期仅表现为一个或两个系统受累，容易与其他疾病发生混淆，所以诊断可能会发生误诊的状况；而当多个器官已经发生受累时，此时虽然诊断并不困难，但患者可能已经发展至疾病中晚期，器官受累严重，不利于改善患者的预后、治疗效果。所以，仅依据临床表型往往难以实现早期诊断，需要更为有效的诊断方式。
为此，在自身免疫形疾病的重要特征之一是出现大量自身抗体的病理基础上，现有技术提供有通过自身抗体的检测而实现SLE诊断的方式，且该方式也是目前常用的诊断方式；自身抗体的检测包括对ANA(抗核抗体)、抗核小体抗体、抗dsDNA抗体(抗双链DNA抗体)、抗Sm抗体等的检测，虽然通过自身抗体检测相比于仅通过临床表型而诊断的效果更好，但是，其也存在较多缺陷。如，部分除SLE外的其他自身免疫疾病同样会出现阳性结果，从其他自身免疫疾病中确诊SLE存在难度，难以满足SLE诊断的需求。
所以，现有技术亟需一种能有效区分SLE与其他自身免疫疾病或结合自身抗体检测以有效区分SLE与其他自身免疫疾病的靶标、方法，以满足SLE临床诊断的需求，弥补现有SLE诊断技术的空缺。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的至少一种不足，提供SLE抗原表位多肽在区分SLE和其他自身免疫疾病上的应用，该抗原表位多肽能为SLE的诊断提供新的靶标，有效区分SLE与其他自身免疫疾病；便于应用在SLE诊断试剂的制备中，以获得能有效区分SLE与其他自身免疫疾病的诊断试剂、相应诊断策略，弥补现有技术中部分SLE自身抗体检测在区分SLE与其他自身免疫疾病上所存在的缺陷。
本发明的一个目的在于提供一种SLE抗原表位多肽或其衍生肽在制备区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的诊断试剂中的应用，所述SLE抗原表位多肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的多肽中的一种或多种。在本发明的一个实施例中，发明人通过噬菌体展示技术筛选有特异性的SLE相关多肽，并经多肽芯片、ELISA法验证，获取到诊断效能好的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的系统性红斑狼疮抗原表位多肽，抗原表位多肽能特异性的区分SLE与其他自身免疫疾病，有利于单独检测或结合其他SLE自身抗体检测实现SLE的有效诊断。
进一步地，衍生肽为SLE抗原表位多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸衍生的且具有与系统性红斑狼疮患者IgG抗体反应的抗原表位活性的多肽。当衍生多肽具有与系统性红斑狼疮IgG抗体特异性反应的抗原表位活性时，其也能作为SLE的特异诊断靶标，以区分SLE与其他自身免疫疾病，促进SLE诊断方面的研究。
进一步地，其他自身免疫疾病包括类风湿关节炎、结缔组织病、自身免疫性肝病、干燥症、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎、ANCA相关性血管炎、自身免疫性溶血性贫血。在本发明的一个实施例中，上述抗原表位多肽均能有效区分SLE与上述其他自身免疫疾病。
上述提及的抗原表位多肽能单独或互相结合或结合其他SLE抗原表位多肽用于制备抗原，但其在与抗体反应的检测过程中或是抗原表位多肽之间的连接中都可能需要载体蛋白，所以上述SLE抗原表位多肽与载体蛋白所形成的偶联物在制备区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的诊断试剂中的应用也应被保护。可预期的，本发明上述抗原表位多肽还能应用于系统性红斑狼疮的治疗研究中，利用本发明抗原多肽有助于为治疗SLE的研究提供基础；而与载体蛋白偶联则有助于抗原表位多肽准确、快速的运输，促进机体快速应激，所以，上述抗原表位多肽相应的载体蛋白偶联物的应用应被保护。
编码上述SLE抗原表位多肽的核苷酸序列有助于在基因层次制备靶向特异性或特异性高低表达的核苷酸序列的诊断试剂，且在核苷酸序列层面也能更为准确的获得抗原表位多肽的结构、特性。因此编码上述SLE抗原表位多肽的核苷酸序列及其应用也应被保护，进一步地，包括核苷酸序列在制备区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的诊断试剂中的应用。
通过抗原表位多肽或相应的核苷酸序列作为靶标，利于依据其结合位点以研究靶向诊断试剂，从而克服现有技术中自身抗体检测非特异性的缺陷，提高区分SLE与其他自身免疫疾病的准确性；也便于实现早期诊断，及时确认SLE并采取有效的治疗方式，改善患者预后，提高治疗效果和生存率。
进一步地，应用于核苷酸序列的检测或对上述抗原表位多肽的进一步研究，往往需要利用到含有上述核苷酸序列的表达载体或表达载体的宿主细胞，以此便于进行关于该抗原表位多肽的多方面研究；而该类研究有利于SLE发生机理以及SLE与其他自身免疫疾病的区别体现的揭示和阐述，所以，表达该核苷酸序列的表达载体及包含表达载体的宿主细胞也应被保护。同样的，基于上述核苷酸序列的表达载体及表达载体的宿主细胞，也有助于为诊断、治疗SLE提供研究基础，甚至能应用于诊断、治疗SLE试剂的制备中。
ELISA法能够很好的检测抗原表位多肽与相应抗体的反应，所以，上述提及的系统性红斑狼疮抗原表位多肽还能作为酶联免疫吸附法的竞争/固相抗原以应用。
一种检测血清样本中是否含有与上述系统性红斑狼疮抗原表位多肽反应的抗体的方法，将上述的SLE抗原表位多肽作为抗原，通过多肽芯片或ELISA法对血清内抗体进行检测。
本发明的另一目的在于提供含有上述抗原表位多肽和/或上述核苷酸序列的用以区分SLE和其他自身免疫疾病的试剂盒。进一步地，其他自身免疫疾病包括类风湿关节炎、结缔组织病、自身免疫性肝病、干燥症、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎、ANCA相关性血管炎、自身免疫性溶血性贫血。
本发明的再一目的在于提供上述抗原表位多肽的筛选检测方法，包括步骤：S1、利用噬菌体展示技术对SLE组、健康组、其他疾病组血清IgG类抗体进行检测，以筛选、获取仅出现于SLE组的多肽及其序列；S2、依据拷贝数数值进行高低排序，筛选排名在前的M条高拷贝数多肽，进行M条多肽与人源性、病毒源性蛋白数据库的匹配，筛选有匹配结果的N条多肽并拟纳入验证多肽集合，其中N≤M；S3、将剩余的M-N条多肽进行拷贝数数值高低排序，筛选排名在前的P条高拷贝数多肽并拟纳入验证多肽集合，其中P≤M-N；S4、将所述验证多肽集合中的多肽作为多肽芯片位点信息构建相应的多肽芯片，并利用SLE组、健康组、其他疾病组血清标本进行多肽芯片检测，在检测结果基础上通过AUC筛选获得具有诊断价值的系统性红斑狼疮抗原表位多肽；
其中，M、N、P根据所需的准确性确定。
进一步地，在步骤S4后还包括：
步骤S5、利用ELISA法在SLE组、健康组、其他疾病组的基础上进行步骤S4获得的系统性红斑狼疮抗原表位多肽诊断价值鉴定和诊断效能评估，确定最终能有效区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的抗原表位多肽。
进一步地，ELISA检测实验条件为：氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的多肽作为抗原包被的浓度分别为0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL，二抗为Goat anti-Human IgG，二抗稀释比例为1:2000，样本血清稀释倍数为1：1000倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明首先通过噬菌体展示肽技术筛选出SLE相关多肽，在获取SLE相关多肽后还依据拷贝数以及数据库比对进一步获取具有潜在诊断价值的最终SLE相关多肽。然后经过多肽芯片验证和ELISA法验证获取具有诊断价值的抗原表位多肽，包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽。上述的抗原表位多肽经过多重筛选，结果可信度高；且在上述过程中，不仅是通过SLE患者组与健康人群组进行筛选，还通过SLE患者组与具有其他自身免疫疾病的疾病对照组进行筛选，多次验证过程中也通过与具有其他自身免疫疾病的对照组比较进一步验证上述抗原表位多肽区分SLE与其他自身免疫疾病的效果，结果表明，上述抗原表位多肽能够有效的区分SLE与其他自身免疫疾病，所以，基于该抗原表位多肽有利于应用于诊断过程中弥补现有技术如SLE自身抗体检测的不足，应用于区分SLE与其他自身免疫疾病的诊断试剂制备，实现有效的区分。从而及时确认是SLE还是其他自身免疫疾病，方便及时采取措施，制定相应治疗策略，改善预后和治疗效果。仅需要血清标本即能实现有效的区分过程，快速而简便。所以，基于本发明提供的抗原表位多肽，便于提供特异性、敏感性高的区分SLE与自身免疫疾病的诊断试剂、诊断技术，弥补现有技术中SLE检测技术的空缺。且上述的抗原表位多肽也有利于为SLE发生机理的阐述提供基础，以便基于该抗原表位多肽进行发生机理的深入研究，促进区分SLE与自身免疫疾病的诊断方面发展。
附图说明
图1为实施例中多肽芯片位点信息图；
图2为实施例多肽芯片检测过程中多肽芯片装载示意图；
图3为实施例中SLE相关多肽的芯片检测结果示意图；
图4为实施例SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29以及联合诊断的ROC曲线图；
图5为实施例SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29在不同自身免疫性疾病中ROC曲线图；
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
实施例
一、初步筛选
1、SLE相关多肽筛选
利用噬菌体展示随机十二肽库技术分别通过SLE组、健康对照组、其他自身免疫性疾病对照组血清IgG类抗体进行结合多肽的筛选、比较。具体的，本实施例采用Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒(NEW ENGLAND BIOLABS公司)进行筛选。
其中，SLE组、健康对照组、其他自身免疫性疾病对照组三组标本信息如表1、表2所示。
表1三组标本基本信息
Figure BDA0003136767180000061
表2疾病对照组自身免疫性疾病构成比
Figure BDA0003136767180000062
即分别筛选出各组的阳性克隆，然后进行测序比较，获取仅出现于SLE组的多肽及其序列；具体的，将SLE组得到的多肽序列与健康对照组、疾病对照组相比，去掉重复序列，即去掉出现在对照组的序列；并删去拷贝数小于500的多肽序列，初步得到SLE相关的多肽序列共计1374条多肽。然后，根据多肽拷贝数(read count#)数值进行由大到小的排序，挑选前100条拷贝数数值大的多肽作为确定的SLE相关多肽，并依此进行生物信息学分析。
2、SLE相关多肽的生物信息学分析
因本试验目的是为了获取新的靶抗原，所以，将获得的100条多肽进行与人源性、病毒源性蛋白数据的比对(由南芯医疗生物公司完成)，其中，通过与人源性蛋白数据比较，有望获得人体自身抗原或相关蛋白以进行进一步研究；同时，部分研究表明SLE发病与病毒感染有关，所以，也与病毒源性蛋白数据比对以获取相关病毒蛋白。具体的，将100条多肽序列分别在Ensemble及NCBI数据库里进行比人源性及病毒源性蛋白数据比对，其操作指令为：“blastp-task blastp-short-query data.fasta-db database_index-outfmt"6qseqid qlen sseqid slen evalue score pident length mismatch gapopen positiveqstart qend sstart send"-evalue 1e-5”。
比对结果如表3、表4所示；
表3初步筛选多肽与人源性蛋白数据比对结果(其中，qseqid:多肽序列编号；pident:正确鉴定概率；length:正确匹配多肽长度；mismatch：误配多肽数；gene_ID：基因ID号；transcript_ID：转录RNA ID号；gene_symbol：基因标签；description：描述；)
Figure BDA0003136767180000071
Figure BDA0003136767180000081
表4初步筛选多肽与病毒源性蛋白数据比对结果(qseqid:多肽序列编号；pident:正确鉴定概率；length:正确匹配多肽长度；mismatch：误配多肽数；dis：蛋白名称；species：物种名称；)
Figure BDA0003136767180000082
Figure BDA0003136767180000091
生物信息学分析结果发现，100条SLE相关多肽中最终有9条多肽和人源性蛋白数据匹配较好(其中一条多肽序列(seq-12422)能同时与两个蛋白匹配)、12条多肽和病毒源性蛋白数据匹配较好。随后，将该类能匹配蛋白数据的多肽(共计21条)先纳入待验证多肽，剩下79条多肽则按照拷贝数高低排序后筛选排名在前的高拷贝数多肽(共29条)，再纳入待验证多肽中，总共纳入50条多肽，拟作为后续构建的多肽芯片中的位点信息。
二、多肽芯片验证
1、多肽芯片构建
根据筛选出来的待验证多肽构建一款多肽芯片以进行后续验证，具体的，拟将筛选的50条多肽作为纳入多肽芯片的位点信息；本实施例中的多肽芯片是通过广州南芯医疗有限公司制作，16人份/张，其中芯片基质片购自美国Arrayit公司(Arrayit001)，多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成。具体实施中，由噬菌体展示技术挑选出来的50条多肽其中有7条多肽(seq-36882、seq-41138、seq-15708、seq-42780、seq-22436、seq-7683、seq-22783)因为无法溶解而放弃，最终共点样44条多肽，包括一条随机肽(序列：DIHRHVVGARTL)。
此外，为保证实验结果质量，将两个浓度的牛血清白蛋白偶联生物素，即Biotin-BSA-250X，biotin-BSA-500X作为阳性对照；1xPBS作为空白对照，随机肽作为阴性对照；每个多肽做2个复孔以保证质量，具体多肽芯片信息如图1所示。
构建完多肽芯片后，利用644例血清标本进行验证(其中，SLE组标本296例，疾病对照组标本168例，健康对照组180例)，标本信息如表5、6、7所示。
表5三组标本基本信息
Figure BDA0003136767180000101
表6 SLE组基本临床信息
Figure BDA0003136767180000102
Figure BDA0003136767180000111
表7疾病对照组自身免疫性疾病构成比
Figure BDA0003136767180000112
2、多肽芯片检测验证过程：
(1)主要实验材料：
仪器设备：高速低温冷冻离心机：德国赫默公司(HERMLE Labortechnik GMbH)；SK-D1807-E三维脱色摇床：美国赛洛捷克公司；晶芯LuxScan 10K/B微阵列芯片扫描仪：博奥生物有限公司；
主要试剂：多肽，吉尔生化(上海)有限公司合成；多肽芯片，自美国Arrayit公司(Arrayit001)；封闭液，生工生物工程(上海)股份有限公司；生物素标记山羊抗人IgG，生工生物工程(上海)股份有限公司；荧光素标记链霉亲和素，生工生物工程(上海)股份有限公司；25x洗液Ⅰ(PBST)，生工生物工程(上海)股份有限公司；25x洗液Ⅱ(PBS)，生工生物工程(上海)股份有限公司。
(2)血清样本的收集
样本均来自南方医科大学南方医院检验科剩余标本，其采集静脉血标本后以3500r/min条件离心10min；挑选的标本均无脂血、溶血现象，每个患者剩余血清分装2-3管，200-400μL/管，标本留取后，放至-80℃冰箱保存。
(3)多肽芯片检测
1)试剂配制：①按图2所示，装配构建的SLE多肽芯片；②稀释洗液准备：分别用去离子水稀释25×洗液I到1×至1L，稀释25×洗液II到1×至1L，做好标记备用。
2)实验步骤：①将芯片装载后，芯片每个阵列加入90μL的1x封闭液，放摇床上室温孵育1小时；②拍去封闭液，每个阵列中添加用封闭液2倍比稀释的样品共90μL，放在摇床上震荡4小时；③拍去样品，清洗玻片。首先用1x洗液I反复清洗5次，每次5min，然后用1x洗液Ⅱ反复清洗5次，每次5min，最后拍干；④用封闭液将biotin-human IgG稀释106倍，混合均匀。每孔加入90μL稀释后的biotin-human IgG，放摇床上室温震荡孵育3小时，避免产生气泡；⑤清洗，同步骤③；⑥用封闭液将荧光标记链霉亲和素稀释2000倍，混合均匀，每孔加入90μL稀释后的应该标记链霉亲和素，用铝箔密封条贴住玻片，然后再摇床上室温孵育1小时；⑦清洗，同步骤③；⑧把芯片基质从框架中取出，荧光扫描仪扫描。
3、多肽芯片检测验证结果分析：按上述检测过程进行三组标本的多肽芯片检测后，采用晶芯LuxScan 10K/B微阵列芯片扫描仪对芯片结果进行扫描，其中激发光波长为555nm；然后，采用芯片分析软件GenePix Pro 6.0software提取数据，阳性对照Biotin-BSA点信号值＞1000表示实验合格，随机肽的曲线下面积在0.5附近视为阴性对照有效，每个血清样本检测结果为两个复孔荧光信号值的均值减去空白对照信号值，具体的，SLE相关多肽芯片检测结果代表图如图3所示。
4、多肽诊断效能分析：根据荧光信号值进行ROC曲线绘制，分别计算SLE组与健康对照组，SLE组与疾病对照组，SLE组与健康对照合并疾病对照组的曲线下面积(Area UnderCurve，AUC)以评估诊断效能，挑选AUC>0.650且P<0.05的多肽作为后续第二轮验证多肽，本实施例中共挑选出5条多肽，为；SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29，其氨基酸序列分别为SLE_P19：NSLLNLEKTMVR；SLE_P20：DSTCPMVTAPCS；SLE_P27：GLYHSNASFRVP；SLE_P28：LTNPGLGSSPKA；SLE_P29：SCYPAVPQCSTT。
并将挑选出来的多肽根据约登指数(Younden's index，YI)确定cut-off值，并由此计算相应诊断试验常用评价指标：灵敏度(Sensitivity，SEN)、特异度(Specificity，SPE)、阳性预测值(Positive predictive value,PPV)、阴性预测值(Negative predictivevalue，NPV)、阳性似然比(positive likelihood ration，PLR)、阴性似然比(negativelikelihood ration，NLR)、准确度(accuracy，Ac)；并基于Spss 23.0通过logistic回归对挑选出来的多肽进行联合诊断价值评估；结果如表8、9所示。
表8初筛多肽诊断价值分析结果
Figure BDA0003136767180000131
表9SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29及联合诊断的相关诊断试验评价指标；
Figure BDA0003136767180000132
Figure BDA0003136767180000141
多肽芯片筛选结果显示，有5条抗原表位多肽(SLE_P19，SLE_P20，SLE_P27，SLE_P28，SLE_P29，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示，即分别为NSLLNLEKTMVR、DSTCPMVTAPCS、GLYHSNASFRVP、LTNPGLGSSPKA、SCYPAVPQCSTT)具有较好的诊断效能，与健康对照组相比，SLE_P20表现最优，其AUC为0.864，与疾病对照组相比SLE_P27的AUC最大，为0.844，5条多肽联合诊断后的AUC为0.956，准确度为92.80％，如图4所示。
三、ELISA法验证
采用ELISA法，用500例血清标本(SLE组标本200例，疾病对照组标本150例，健康对照组150例)对上述5条多肽继续验证。标本信息如表10～12所示。
表10三组标本基本信息
Figure BDA0003136767180000142
表11 SLE组基本临床信息
Figure BDA0003136767180000143
Figure BDA0003136767180000151
Figure BDA0003136767180000161
表12疾病对照组自身免疫性疾病构成比
Figure BDA0003136767180000162
具体试验过程包括：
1、主要试剂：抗原多肽，由吉尔生化(上海)有限公司合成；高吸附酶标板，北京四正柏生物科技有限公司；包被液，北京四正柏生物科技有限公司；封板膜，北京四正柏生物科技有限公司；样本稀释液，北京四正柏生物科技有限公司；封闭液，北京四正柏生物科技有限公司；浓缩洗涤液，北京四正柏生物科技有限公司；酶结合物稀释液，北京四正柏生物科技有限公司；显色液/单组分超灵敏TMB，北京四正柏生物科技有限公司；终止液，北京四正柏生物科技有限公司；Goat anti-Human IgG(H+L)，HRP，北京四正柏生物科技有限公司；抗ds-DNA抗体检测试剂盒(ELISA法)，德国Askeu公司；抗Sm抗体检测试剂盒(ELISA法)，德国欧蒙医学有限公司。
2、多肽检测条件的确定
(1)试剂准备
1)洗涤液：量取25mL 20×浓缩洗涤液，用纯水稀释至500mL；2)用包被缓冲液抗原多肽分别稀释至0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL；3)三组血清样本，每组三例，用样本稀释液分别稀释至100倍、1000倍、2000倍；4)用酶结合物稀释液对二抗(Goatanti-Human IgG)按照1：2000进行稀释；
(2)实验步骤
1)包被抗原多肽：将稀释好的不同浓度的抗原多肽加入酶标板凹孔中，每孔加入100ul，4℃过夜；2)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液300μL，洗3次，每次30s；3)每孔加入200μL封闭液，贴上封板膜，放入37℃电热鼓风干燥箱中孵育1h；4)洗涤；移去封闭液，按照步骤2)进行洗涤；5)每凹孔加入100μL不同稀释比例血清，贴好封板膜，放入37℃电热鼓风干燥箱中孵育1h；6)洗涤：移去稀释样本，按照步骤2)进行洗涤；7)每凹孔加入100μL显色剂，避光，室温孵育30分钟；8)每凹孔加入终止液100μL；9)酶标仪对酶标板在30分钟内进行OD值检测，波长设置为405nm。
(3)结果分析方法
1)尽可能在统一实验条件下SLE组OD值大于两组对照组，疾病对照组与健康组无差别；2)同一样本，比较不同抗原包被浓度差异，尽可能选择OD值大的包被浓度(OD值随着包被浓度增加而减小时，说明抗原饱和)；3)尽量选择SLE组OD值在1左右的条件，疾病对照组与健康OD值尽可能小，但需与空白孔有差别；4)在上述条件满足的情况下，样本稀释倍数尽量统一。
最终确定的五条多肽检测实验条件为：二抗稀释比例为1:2000，血清稀释倍数为1：1000倍，五条多肽作为抗原包被的浓度分别为：SLE_P19为0.1μg/mL，SLE_P20为0.05μg/mL，SLE_P27为0.05μg/mL，SLE_P28为0.02μg/mL，SLE_P29为0.02μg/mL。
3、继多肽芯片的多肽第二轮验证实验
(1)试剂准备
1)25mL 20×浓缩洗涤液用去离子水稀释至500mL；2)抗原多肽根据前期确定的检测实验条件浓度，用包被稀释液分别将SLE_P19稀释至0.1μg/mL，SLE_P20稀释至0.05μg/mL，SLE_P27稀释至0.05μg/mL，SLE_P28稀释至0.02μg/mL，SLE_P29稀释至0.02μg/mL；3)样本稀释：将样本用样本稀释液按照1：1000比例进行稀释；4)二抗：用酶结合物稀释液按照1：2000比例进行稀释；
(2)实验步骤：
1)抗原包被：酶标板每个凹孔加入100μL稀释好的抗原多肽，4℃孵育过夜；2)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液300μL，洗3次，每次30s；3)每孔加入200μL封闭液，贴上封板膜，放入37℃电热鼓风干燥箱中孵育1h；4)洗涤；移去封闭液，按照步骤2)进行洗涤；5)每凹孔加入100μL不同稀释比例血清，每个标本做两个复孔贴好封板膜，放入37℃电热鼓风干燥箱中孵育1h；6)洗涤：移去稀释样本，按照步骤2)进行洗涤；7)每凹孔加入100μL显色剂，避光，室温孵育30分钟；8)每凹孔加入终止液100μL；9)30分钟内，在酶标仪上对酶标板进行OD值检测，波长设置在405nm处；
4、统计方法
本轮实验数据统计及绘图由IBM SPSS statistics 23.0、Graphpad prism8.0完成。
1)标本OD值结果：将每个标本OD值取两个重复测量OD值的均值减去该板的空白对照OD值均值，作为最终OD值结果；
2)样本临床资料统计描述：计量资料如为正态分布采用Mean±SEM进行描述，若为偏态资料则采用M(P25，P75)进行描述，定性资料采用构成比、阳性率表示。描述对象包括三组基线资料(年龄、性别)，SLE组基本临床特征资料包括疾病活动度构成比、病程、ANA阳性率、ds-DNA抗体阳性率、Sm抗体阳性率、累及不同系统器官阳性率、常用风湿病治疗药物(包括使用情况糖皮质激素、羟氯喹、环磷酰胺、甲氨蝶呤类、他克莫司、环孢菌素、麦考酚酸吗乙酯、骨化三醇)。疾病对照组包括非SLE自身免疫性疾病构成比情况、ds-DNA抗体阳性率，抗Sm抗体阳性率。具体的，本实施例中样本统计描述如上表10～12所示。
3)诊断效能评估：同多肽芯片验证中第4步骤中的结果处理分析；具体的，本实施例结果如表13、14所示。具体的，SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29在不同自身免疫性疾病中诊断效能的分析结果如表15所示，其ROC曲线图如图5所示。
4)进一步地，拟比较五条多肽结果在三组的之间水平有无统计学差异：对数据结果进行正态方差齐性检验，如果方差齐采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，如果方差不齐，采用非参数检验，进行Kruskal-Wails秩和检验，并绘制散点图；进一步地，拟初步探讨多肽与SLE临床症状的相关性，五条多肽与其它临床资料相关性分析：将根据cut-off值将多肽结果转变为定性资料(阴性结果和阳性结果)，分析多肽阳性与阴性结果之间疾病活动度、器官累及发生率有无相关性，主要采用过Mann-Whitney U检验进行分析及卡方(Chi-Squre)检验；
5)进一步地，本实施例还探索五条多肽联合临床常用的两个SLE特异性标志物-抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体后能否提高对SLE的诊断效能。以疾病对照组为参照，分别描绘抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体的ROC曲线，并得到对应AUC值；随后将5条多肽分别与抗ds-DNA抗体和/或抗Sm抗体联合诊断，得到相应的AUC值；结果如表16所示(其中SLE_P19/P20/P27/P28/P29代表SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29联合)。
结果以P<0.05视为有统计学意义。
表13SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29诊断价值验证结果
Figure BDA0003136767180000191
表14 SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29及联合诊断的相关诊断试验评价指标
Figure BDA0003136767180000192
Figure BDA0003136767180000201
表15 SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29在不同自身免疫性疾病中诊断效能分析
Figure BDA0003136767180000202
Figure BDA0003136767180000211
表16SLE_P19、SLE_P20、SLE_P27、SLE_P28、SLE_P29与抗ds-DNA抗体和/或抗Sm抗体联合诊断结果
Figure BDA0003136767180000212
结果显示：如表13～15所示，ELISA实验验证结果显示，5条抗原表位多肽的AUC均大于0.7，其联合检测后AUC为0.943。5条多肽验证结果趋势与多肽芯片结果一致，五条多肽均具有诊断价值，能作为抗原表位多肽而存在，且均能有效区分SLE与其他自身免疫疾病。且其中SLE_P27的AUC分别为0.938，灵敏度为76.00％，特异性为92.70％，阳性似然比为10.411，阴性似然比为0.259，准确为84.40％；SLE_P27在鉴别诊断SLE与RA方面诊断效能优于其它四条多肽，AUC为0.842；SLE_P29在区分SLE与其它自身免疫性疾病上性能优于其它四条多肽。具体的，现有技术中常见于以健康对照组和疾病组作为对比以筛选有效的抗原表位多肽，但实际上忽视了其他自身免疫疾病给诊断结果带来的误差，因此，需要提供能够有效区分SLE与其他自身免疫疾病的SLE抗原表位多肽，更具体的，需要确认其能有效区分哪些自身免疫疾病，从而在其难以应用直接诊断或需辅助其他诊断方式诊断时，以结合其他诊断方式进一步有效区分SLE与其他自身免疫疾病，提高整体诊断准确性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Figure BDA0003136767180000231
Figure BDA0003136767180000241
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> SLE抗原表位多肽在鉴别SLE和其他自身免疫疾病中的作用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<400> 1
Asn Ser Leu Leu Asn Leu Glu Lys Thr Met Val Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<400> 2
Asp Ser Thr Cys Pro Met Val Thr Ala Pro Cys Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<400> 3
Gly Leu Tyr His Ser Asn Ala Ser Phe Arg Val Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<400> 4
Leu Thr Asn Pro Gly Leu Gly Ser Ser Pro Lys Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 未知
<400> 5
Ser Cys Tyr Pro Ala Val Pro Gln Cys Ser Thr Thr
1 5 10

Claims (10)

1.一种SLE抗原表位多肽或其衍生肽在制备区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的诊断试剂中的应用，所述SLE抗原表位多肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的多肽中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，衍生肽为SLE抗原表位多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸衍生的且具有与系统性红斑狼疮患者IgG抗体反应的抗原表位活性的多肽。
3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，其他自身免疫疾病包括类风湿关节炎、结缔组织病、自身免疫性肝病、干燥症、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎、ANCA相关性血管炎、自身免疫性溶血性贫血。
4.编码权利要求1中SLE抗原表位多肽的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的核苷酸序列在制备区分系统性红斑狼疮与其他自身免疫疾病的诊断试剂中的应用。
6.含有权利要求1中SLE抗原表位多肽和/或权利要求4中核苷酸序列的用以区分SLE和其他自身免疫疾病的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其他自身免疫疾病包括类风湿关节炎、结缔组织病、自身免疫性肝病、干燥症、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、强直性脊柱炎、ANCA相关性血管炎、自身免疫性溶血性贫血。
8.权利要求1中抗原表位多肽的筛选检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、利用噬菌体展示技术对SLE组、健康组、其他疾病组血清IgG类抗体进行检测，以筛选、获取仅出现于SLE组的多肽及其序列；
S2、依据拷贝数数值进行高低排序，筛选排名在前的M条高拷贝数多肽，进行M条多肽与人源性、病毒源性蛋白数据库的匹配，筛选有匹配结果的N条多肽并拟纳入验证多肽集合，其中N≤M；
S3、将剩余的M-N条多肽进行拷贝数数值高低排序，筛选排名在前的P条高拷贝数多肽并拟纳入验证多肽集合，其中P≤M-N；
S4、将所述验证多肽集合中的多肽作为多肽芯片位点信息构建相应的多肽芯片，并利用SLE组、健康组、其他疾病组血清标本进行多肽芯片检测，在检测结果基础上通过AUC筛选获得具有诊断价值的系统性红斑狼疮抗原表位多肽；
其中，M、N、P根据所需的准确性确定。
9.根据权利要求8所述的筛选检测方法，其特征在于，在步骤S4后还包括：
步骤S5、利用ELISA法在SLE组、健康组、其他疾病组的基础上进行步骤S4获得的系统性红斑狼疮抗原表位多肽诊断价值鉴定和诊断效能评估，确定最终的系统性红斑狼疮抗原表位多肽。
10.根据权利要求9所述的筛选检测方法，其特征在于，ELISA检测实验条件为：氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的多肽作为抗原包被的浓度分别为0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.02μg/mL，二抗为Goat anti-Human IgG，二抗稀释比例为1:2000，样本血清稀释倍数为1：1000倍。
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