CN113801910A

CN113801910A - 一种纯天然核黄素的制备方法

Info

Publication number: CN113801910A
Application number: CN202111001697.0A
Authority: CN
Inventors: 郭韶智; 高峰; 洪果媛; 陈志远; 黎艳华; 柯伯雄; 伍文俊
Original assignee: Hubei Guangji Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hubei Guangji Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明属于发酵法生产核黄素技术领域，特别是一种纯天然核黄素的制备方法，采用的阿氏假囊酵母菌且未经过任何基因重组、诱变、构建或改造，所得核黄素成品完全满足国家非转基因产品法律法规要求，并且所得核黄素产品能满足EP10.0、中国药典CP2020的标准规定，且核黄素产品呈球状晶型具有良好的加工性能。

Description

一种纯天然核黄素的制备方法

技术领域

本发明属于发酵法生产核黄素技术领域，特别是一种纯天然核黄素的制备方法。

背景技术

核黄素又称维生素B₂，是一种含有核糖醇基的异咯嗪衍生物，其通过各种微生物和植物的生物合成来制备。

目前，主要生产核黄素的方法是微生物发酵法，适于发酵法生产的微生物可以是任何存在于自然界的产生核黄素的微生物或通过遗传工程、化学或物理方法转化的过量生产核黄素的微生物。将这些微生物在适当的条件下培养，以生产核黄素。从培养物中重新获得生产的核黄素。

欧洲专利NO.EP0821063公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌生产核黄素的方法。美国专利NO.5837528公开了一种过量生产核黄素枯草芽孢杆菌的重组菌株，其通过重组技术，将rib操纵子引入到亲株中而获得。另外还有WindhoIz报道的阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)子囊真菌作为生产核黄素的微生物，但这些方法均存在共同的缺点：必须先对生产菌株进行基因重组、诱变、构建或改造，因此核黄素的生产过程并非纯天然，同时目前市场正逐渐排斥菌株基因重组后生产的核黄素，对纯天然不经过基因改造的菌种生产的制备核黄素的需求越来越大。

但利用纯天然不经过基因改造的菌种来生产核黄素，如何使质量标准达到各国药典标准杂质限度要求一直是行业难题，尤其是在中国药典CP2020对核黄素标准规定要求进一步提示的背景下。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用纯天然不经过基因改造的菌种来生产核黄素的制备方法，满足国家非转基因产品法律法规要求、同时所得核黄素产品能满足EP10.0、中国药典CP2020的标准规定，且核黄素产品呈球状晶型具有良好的加工性能。

具体技术方案为一种纯天然核黄素的制备方法，其特征在于制备步骤为：

步骤1.将阿氏假囊酵母菌接种在摇瓶培养基中代谢培养，得到含核黄素的孢子悬浮液；

步骤2.将孢子悬浮液通过微孔进入种子罐中，在种子培养基中进行代谢培养，得到种子液；

步骤3.将种子液移到发酵罐中，在发酵培养基中代谢培养，得到含核黄素的发酵液；

步骤4.将发酵液用碱溶解并调节PH至11.0-12.0，使核黄素搅拌溶解，经过滤和洗涤得到含核黄素的过滤液；

步骤5.向含核黄素的过滤液中加入无机酸调节PH至5.0-6.0.静置使核黄素从溶液中结晶析出，得到含核黄素晶体的结晶液；

步骤6.将含核黄素晶体的结晶液过滤和浓缩得到含核黄素的浓缩液；

步骤7.将含核黄素的浓缩液喷雾干燥，得到球状晶型核黄素成品。

而且，步骤1中摇瓶培养基成分至少含有3.5％-4.0％植物油、0.5％饴糖、2％骨胶、2％-3％玉米浆、1％鱼粉、0.2％氯化钠、0.1％氯化钙、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁，摇瓶培养基的培养条件为培养温度28-29度、培养时间3-5天。

而且，步骤2中种子培养基成分至少含有2％植物油、1％-2％葡萄糖、2％骨胶、2％-3％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾、0.5％饴糖、0.1％氯化钙、0.1％硫酸镁，种子培养基的培养条件为培养温度29-31度、培养时间40小时。

而且，步骤3中发酵培养基成分至少含有2％植物油，1％-2％葡萄糖，2％骨胶、2％-3％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾和＜0.1％的消泡剂，发酵培养基的培养条件为培养温度28-30度、培养时间160小时。

而且，步骤4中碱为30％氢氧化钠溶液。

而且，步骤4中过滤和洗涤采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备，膜的孔径为10-500nm，全过程温度控制在25度以下，洗涤所用的洗涤液是PH为11.0-12.0的氢氧化钠溶液和水。

而且，步骤5中无机酸为盐酸和/或双氧水。

而且，步骤6中过滤和浓缩采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备，膜的孔径为100nm-1μm，全过程温度控制在35度以下。

本技术方案的有益效果在于：

①阿氏假囊酵母菌来源于中国科学院上海植生所且未经过任何基因重组、诱变、构建或改造，所得核黄素成品完全满足国家非转基因产品法律法规要求，并且产品质量达到各国药典要求，杂质低。

②通过优化培养基的配方解决了传统由阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)菌发酵发酵液粘度大、提取难的问题。

③解决了传统由阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)菌发酵液提取工艺(2-羟基-3-萘甲酸法)流程长，环境污染严重的问题。

④本发明得到的核黄素是一种球状结晶核黄素，具有良好加工性能，流动性好，方便其应用，提升了核黄素产品品质。

⑤直接由发酵液提取制备高纯度核黄素成品，减少了污水排放，缩短了提取流程，避免了核黄素在提取过程中的降解和损耗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。

实施例1

(1)阿氏假囊酵母菌来源于中国科学院上海植生所，用阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株(亲菌株指未经任何诱变育种的菌株)制备孢子悬浮液：将植有阿氏假囊酵母菌的斜面摇瓶接种后在摇瓶培养基中培养，摇瓶接种后培养温度28-29度，培养时间3-5天。摇瓶培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐。每升摇瓶培养基至少含有3.5％植物油、0.5％饴糖、2％骨胶、2.5％玉米浆、1％鱼粉、0.2％氯化钠、0.1％氯化钙、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁。挑选菌落较大的用来制备孢子悬浮液。

(2)在种子罐里用阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株发酵培养种子液：

将步骤(1)得到的孢子悬浮液，采用微孔接种法，通过压力变化使孢子悬浮液流入种子罐中，种子培养基的培养条件为培养温度29-31度、培养时间40小时，在通气和搅拌的情况下维持种子的正常生长繁殖。种子培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐，每升培养基中至少含有2％植物油、1％葡萄糖、2％骨胶、2％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾、0.5％饴糖、0.1％氯化钙、0.1％硫酸镁。待菌株浓度达到种子培养基整体体积的10-15％时准备移种。

(3)发酵液的制备：在发酵罐里用阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株发酵培养生产核黄素的方法:

在一个6T的发酵罐中用阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株发酵培养生产核黄素来确定阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)菌生产核黄素的能力水平。将步骤(2)得到的种子液按10-15％的移种量移入到发酵罐中，发酵培养温度28-30度、时间160小时。发酵培养过程中防止污染。发酵培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐，每升培养基中至少含有2％植物油，1％葡萄糖，2％骨胶、3％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾和少量消泡剂。用氢氧化钠调pH到6.4。待发酵结束后准备放罐。

(4)发酵结束，通过HPLC测量阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株核黄素的生产力。利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5％冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(比例85：10：5)为流动相；在波长为444nm的条件下测定。依照实验结果，该菌株产核黄素的能力达到实际生产要求，具有实际生产价值。

(5)从发酵液中提取核黄素：在4T核黄素发酵液中加入30％氢氧化钠溶液，调节PH至11.5，温度25度条件下搅拌让核黄素溶解。后将料液进多级连续膜过滤设备，进行除杂，具体可采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备。膜孔径100-500nm，操作温度控制在25度以下。多级连续膜过滤液加盐酸调节PH至5.5-6.0.后加入料液体积0.2％的双氧水。搅拌30min后，静置12小时让核黄素晶体析出，后再次将含有核黄素晶体的料液进多级连续膜设备进行浓缩分离晶体。所有膜的孔径为200nm-800nm，在此过程中维持料液的温度在35度以下。喷雾干燥该核黄素浓缩液即得到球形结晶核黄素颗粒。经分析，产品质量达到核黄素EP10.0，核黄素CP2020版药典要求。

表1实施例1所得核黄素成品杂质分析结果

实施例2

(1)将植有阿氏假囊酵母菌的斜面摇瓶接种后在摇瓶培养基中培养，摇瓶接种后培养温度28-29度，培养时间3-5天。摇瓶培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐。每升摇瓶培养基至少含有3.5％植物油、0.5％饴糖、2％骨胶、2％玉米浆、1％鱼粉、0.2％氯化钠、0.1％氯化钙、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁。挑选菌落较大的用来制备孢子悬浮液。

将步骤(1)得到的孢子悬浮液，采用微孔接种法，通过压力变化使孢子悬浮液流入种子罐中，种子培养温度29-31度、时间40小时，在通气和搅拌的情况下维持种子的正常生长繁殖。种子培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐，每升培养基中至少含有2％植物油、2％葡萄糖、2％骨胶、2％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾、0.5％饴糖、0.1％氯化钙、0.1％硫酸镁。待菌浓达到一定的时候准备移种。

在一个30T的发酵罐(放大生产进一步体现本方案的效果稳定性)中用阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株发酵培养生产核黄素来确定阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)菌生产核黄素的能力水平。将步骤(2)得到的种子液按10-15％的移种量移入到发酵罐中，发酵培养温度28-30度、时间160小时。发酵培养过程中防止污染。发酵培养基以混合碳源、混合氮源为主培养基，加上少量无机盐，每升培养基中至少含有2％植物油，2％葡萄糖，2％骨胶、2％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾和少量消泡剂。用氢氧化钠调pH到6.4。待发酵结束后准备放罐。

(4)发酵结束，通过HPLC测量阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)亲菌株核黄素的生产力。利用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5％冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(比例85：10：5)为流动相；在波长为444nm的条件下测定。依照实验结果，该菌株产核黄素的能力达到实际生产要求。具有实际生产价值。

(5)从发酵液中提取核黄素：在30T核黄素发酵液中加入30％的碱液，调节PH11.8，温度25度条件下搅拌，让核黄素溶解。后将料液进多级连续膜过滤设备，进行除杂，具体可采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备。膜孔径50-300nm,操作温度控制在25度以下。多级连续膜过滤液加盐酸调节PH至5.8-6.0.后加入料液体积0.3％的双氧水。搅拌30min后，静置12小时让核黄素晶体析出，后再次将含有核黄素晶体的料液进多级连续膜设备进行浓缩分离晶体。所有膜的孔径为100nm-900nm.在此过程中维持料液的温度在35度以下。喷雾干燥该核黄素浓缩液。得到球形结晶核黄素颗粒。产品质量达到核黄素EP10.0，核黄素CP2020版药典要求。

Claims

1.一种纯天然核黄素的制备方法，其特征在于制备步骤为：

2.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤1中摇瓶培养基成分至少含有3.5％-4.0％植物油、0.5％饴糖、2％骨胶、2％-3％玉米浆、1％鱼粉、0.2％氯化钠、0.1％氯化钙、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁，摇瓶培养基的培养条件为培养温度28-29度、培养时间3-5天。

3.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤2中种子培养基成分至少含有2％植物油、1％-2％葡萄糖、2％骨胶、2％-3％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾、0.5％饴糖、0.1％氯化钙、0.1％硫酸镁，种子培养基的培养条件为培养温度29-31度、培养时间40小时。

4.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤3中发酵培养基成分至少含有2％植物油，1％-2％葡萄糖，2％骨胶、2％-3％玉米浆、0.5％蛋白胨、0.2％氯化钠、0.1％磷酸二氢钾和＜0.1％的消泡剂，发酵培养基的培养条件为培养温度28-30度、培养时间160小时。

5.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤4中碱为30％氢氧化钠溶液。

6.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤4中过滤和洗涤采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备，膜的孔径为10-500nm，全过程温度控制在25度以下，洗涤所用的洗涤液是PH为11.0-12.0的氢氧化钠溶液和水。

7.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤5中无机酸为盐酸和/或双氧水。

8.根据权利要求1所述的纯天然核黄素的制备方法，其特征在于：步骤6中过滤和浓缩采用陶瓷膜、多级微滤、超滤膜分离设备，膜的孔径为100nm-1μm，全过程温度控制在35度以下。