CN113801107B - 一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物及其Ni(II)配合物的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物及其Ni(II)配合物的制备和应用，所述柚皮素衍生物分子式为C₂₄H₁₉N₃O₄，其配合物分子式为[Ni(C₂₄H₁₉N₃O₄)(C₂₄H₁₈N₃O₄)^‑]·ClO₄·1.5CH₃OH·H₂O。本发明通过MTT法研究了柚皮素‑4‑喹啉腙及其Ni(II)配合物的抗肿瘤活性。结果表明，本发明制备的柚皮素‑4‑喹啉腙衍生物对人胃癌细胞BGC‑823和人肝癌细胞BEL‑7402的增殖均具有抑制作用，与柚皮素本身相比，抑制活性分别提高了2倍、6.5倍，说明本发明柚皮素‑4‑喹啉腙衍生物的抗肿瘤活性比原料药有明显改善。本发明制备的柚皮素‑4‑喹啉腙Ni(II)配合物对BGC‑823和BEL‑7402同样具有明显的抑制作用，且抑制活性明显强于柚皮素本身。因此本发明柚皮素‑4‑喹啉腙衍生物及对应的Ni(II)配合物具有潜在应用价值。

Description

一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物及其Ni(II)配合物的制 备和应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物及其Ni(II)配合物的制备和应用，属于医药领域。

背景技术

柚皮素是一种广泛存在于自然界中的黄酮类化合物。近年来，柚皮素被发现具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂等多种生物活性，是一种有效、安全、耐受性好、口服可用的天然产物活性成分。但由于柚皮素自身较差的脂溶性和水溶性，导致其生物利用率不高，因此对其进行化学修饰以获得高效、低毒、溶解性好的药物分子一直是众多研究者关注的重点。

目前对柚皮素的结构修饰主要集中在7位、4'位的酚羟基，但在4位羰基部位通过化学反应构筑喹啉腙类抗肿瘤衍生物还未见相关文献报道。喹啉也是具有潜在药理活性的重要氮杂环化合物。据报道，许多喹啉类衍生物都具有良好的抗结核、抗菌、抗HIV、抗疟疾等生物活性。目前，尚未见以柚皮素和肼基喹啉合成柚皮素腙类衍生物的报道，因此对柚皮素-4- 喹啉腙的设计合成和抗肿瘤活性研究具有重要意义。

顺铂类药物于1978年获FDA批准，被称为“抗癌药里的青霉素”，顺铂的发现开辟了无机抗肿瘤药物研究的新领域。铂类抗肿瘤药物在临床上的成功应用，极大推动了金属药物化学的发展。药理学研究表明：金属离子与具有生物活性的有机配体配位后，形成螯合环，能够提升化合物的稳定性，减少药物在血液循环过程中的水解。另外配体本身具有一定的生理活性，在到达肿瘤细胞后，能与金属离子形成协同效应，从而提升抗肿瘤活性。关于金属基抗肿瘤药物，最初的研究大多是以顺铂类药物为代表的铂族金属配合物，但铂族金属配合物存在毒副作用明显、耐药性强等弊端，非铂族过渡金属配合物的构筑开始受到更多的关注。多种过渡金属元素，诸如Cu、Fe、Zn等都是生物体必需的微量元素，是很多生物反应酶的辅助因子，也是重要的抗氧化成分，且有良好的配位能力。本发明合成的柚皮素-4-喹啉腙含有 N、O强配位原子，可以与金属离子螯合形成对应的配合物。本发明以Ni(II)作为中心金属离子，通过溶液中的自组装反应制备结构新颖的NNO型喹啉腙Ni(II)配合物，改变其抗肿瘤活性和抗肿瘤机理，在医药、生物等方面有重要的应用价值。目前，尚未见以本发明合成的柚皮素-4-喹啉腙构筑对应Ni(II)配合物的合成方法，抗肿瘤活性研究也未见相关文献报道。因此，对柚皮素-4-喹啉腙的Ni(II)配合物的抗肿瘤活性研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物及其对应的Ni(II)配合物的制备和应用，该衍生物及配合物制备步骤简单，反应条件温和，产率高，且对人胃癌细胞BGC-823和人肝癌细胞BEL-7402的增殖具有明显抑制作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物，其为柚皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₄H₁₉N₃O₄，分子结构式为：

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2-氯喹啉溶于无水乙醇中，加入过量的80％水合肼，回流温度反应，得到中间体粗品；

(2)中间体粗品用无水乙醇重结晶，得到橘色片状晶体2-肼基喹啉中间体；

(3)将2-肼基喹啉中间体和柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出深黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4-喹啉腙粗品。

步骤(1)中反应的时间为6h～8h；2-肼基喹啉中间体和柚皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

所述柚皮素衍生物的制备方法，还包括将柚皮素-4-喹啉腙粗品在无水乙醇中重结晶数次，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4-喹啉腙。

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素衍生物对应的Ni(II)配合物，其为柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物，分子式为[Ni(C₂₄H₁₉N₃O₄)(C₂₄H₁₈N₃O₄)^-].ClO₄.1.5CH₃OH.H₂O；分子结构示意为：

本发明的技术方案之一是：一种Ni(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将柚皮素-4-喹啉腙加入甲醇中，得到黄色混悬液；

(2)将高氯酸镍加入到混悬液中，搅拌加热反应，得到棕黄色澄清液；

(3)过滤，滤液室温挥发，2天后析出棕色块状晶体，即为柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物。

柚皮素-4-喹啉腙和高氯酸镍的摩尔比为2:1；加热温度为35～45℃。

本发明的技术方案之一是：一种柚皮素衍生物或Ni(II)配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823和人肝癌细胞BEL-7402。

优选的，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞BEL-7402。

本发明柚皮素-4-喹啉腙的合成路线如下：

本发明的有益效果：

1、本发明新型柚皮素衍生物柚皮素-4-喹啉腙与目前报道的柚皮素羟基甲基化、醚化、酯化、卤代、羰基酰化及生成配合物的结构明显不同，本发明是基于柚皮素4位羰基与2-肼基喹啉缩合制备的N杂环腙类衍生物，该衍生物尚未见文献报道，该衍生物的抗肿瘤活性研究也未有文献报道，衍生物合成方法简单，无需大型仪器设备，产率较高，易于产业化。

2、本发明通过2-肼基喹啉对4位羰基进行修饰，构筑了新型的喹啉N杂环柚皮素腙衍生物，克服了文献报道的柚皮素酰肼类衍生物中氨基对机体毒性的问题，且腙键的形成提高了化合物的抗氧化活性，进而对提高其抗肿瘤活性起到了促进作用。N杂环化合物通常可以造成DNA损伤，触发DNA-损伤-修复机制响应，引起细胞周期阻滞和/或诱导细胞凋亡，因此本发明同时拓宽了柚皮素衍生物抗肿瘤的作用靶点和作用机制，显著提高其抗肿瘤活性。

3、本发明将具有抗肿瘤活性的天然药物活性成分柚皮素与抗肿瘤活性官能团喹啉N杂环利用药物拼合原理统一在一个分子中，通过发挥双官能团及中西药的共同疗效，协同其抗肿瘤活性，同时保留了分子主体骨架中的酚羟基结构，保证其好的抗肿瘤活性。

4、本发明新型柚皮素-4-喹啉腙衍生物中5位酚羟基上的O原子，喹啉环上N原子、C＝N 双键上的N原子均可以与金属离子配位，进而形成稳定的螯合结构，为构筑协同衍生物和金属离子的抗肿瘤配合物提供了可能。本发明以Ni(II)作为中心金属离子，通过溶液中的自组装反应制备结构新颖的NNO型喹啉腙Ni(II)配合物，改变其抗肿瘤活性和抗肿瘤机理。

5、本发明以柚皮素-4-喹啉腙为配体，以Ni(II)作为中心金属，2:1投料比，制备喹啉腙 Ni(II)配合物，有效解决了柚皮素-4-喹啉腙作为配体，与过渡金属Ni(II)的结合问题。

6、本发明通过MTT法研究了柚皮素-4-喹啉腙及其Ni(II)配合物的抗肿瘤活性。结果表明，本发明制备的柚皮素-4-喹啉腙衍生物对人胃癌细胞BGC-823和人肝癌细胞BEL-7402的增殖均具有抑制作用，IC₅₀值分别为19.25μM和12.24μM，与原料药柚皮素本身相比，抑制活性分别提高了2倍、6.5倍，说明本发明柚皮素-4-喹啉腙衍生物的抗肿瘤活性比原料药有明显改善。本发明制备的柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物对BGC-823和BEL-7402的IC₅₀分别为20.32μM和20.83μM，虽然并未表现出强于衍生物本身的抑制活性，但该配合物同样具有明显的抑制作用，且抑制活性明显强于柚皮素本身。可见，本发明柚皮素-4-喹啉腙衍生物及对应的Ni(II)配合物对BGC-823和BEL-7402两种肿瘤细胞均表现出明显的抑制活性，尤其是柚皮素-4-喹啉腙衍生物对BEL-7402的抑制活性比原料药柚皮素提高了近6.5倍，具有潜在应用价值，有望在抗肝癌研究中有出色表现。

7、本发明制备方法简单、反应条件温和，易于产业化，具有很好的社会和经济效益。

附图说明

图1为本发明柚皮素-4-喹啉腙的IR图谱。

图2为本发明柚皮素-4-喹啉腙的UV-vis图谱。

图3为本发明柚皮素-4-喹啉腙的HNMR图谱。

图4为本发明配合物[Ni(C₂₄H₁₉N₃O₄)(C₂₄H₁₈N₃O₄)^-]^.ClO₄·1.5CH₃OH·H₂O的晶体结构图。

图5为本发明柚皮素-4-喹啉腙及其Ni(II)配合物、柚皮素、Cisplatin对人胃癌细胞BGC-823 和人肝癌细胞BEL-7402的IC₅₀柱状图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物柚皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₄H₁₉N₃O₄，分子结构式为：

柚皮素-4-喹啉腙的制备方法，包括以下步骤：

(1)将20mmol 2-氯喹啉溶于无水乙醇中，加入质量分数80％的水合肼8mL(过量)，回流温度反应8h，得到中间体粗品；

(2)中间体粗品用无水乙醇重结晶，得到橘色片状晶体2-肼基喹啉中间体；

(3)将12mmol 2-肼基喹啉中间体与10mmol柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加2～5滴冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出深黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4-喹啉腙粗品；

(5)将柚皮素-4-喹啉腙粗品在无水乙醇中重结晶数次，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4- 喹啉腙。

本发明柚皮素-4-喹啉腙的IR光谱(cm^-1，KBr)：3322,3216,3106,1653,1331,1296,1194, 1079,1058,928,828(如图1所示)。

本发明柚皮素-4-喹啉腙的UV-vis图谱(如图2所示)：在220nm处有一吸收峰，该吸收峰来源于分子内部的n/π→π^*跃迁。

本发明柚皮素-4-喹啉腙的HNMR图谱(如图3所示)：¹HNMR(500MHz,DMSO)δ13.20(s,6H),9.81(s,6H),9.55(s,6H),8.08(s,5H),7.72(s,6H),7.59(s,11H),7.35(s,13H),7.27(s, 6H),7.12(s,5H),6.83(s,11H),5.97(s,5H),5.88(s,6H),5.13(s,3H),5.11(s,3H),4.55(s,1H)。

实施例2

一种柚皮素喹啉腙衍生物对应的Ni(II)配合物柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物，分子式为 [Ni(C₂₄H₁₉N₃O₄)(C₂₄H₁₈N₃O₄)^-]^.ClO₄·1.5CH₃OH·H₂O；其分子结构示意为：

一种柚皮素喹啉腙衍生物的Ni(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.2mmol柚皮素-4-喹啉腙加入8mL甲醇中，得到黄色混悬液；

(2)将0.1mmol高氯酸镍加入到混悬液中，搅拌加热至40℃左右反应10min，得到棕黄色澄清液；

(3)过滤，滤液室温缓慢挥发，2天后析出棕色块状晶体，即为柚皮素-4-喹啉腙Ni(II) 配合物，产率80％。

本发明柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物的X-射线单晶衍射结构的实验条件和结果如下：

单晶结构数据在带有石墨单色器的SuperNova Dual衍射仪上测定。选择合适大小(0.2×0.2×0.1mm³)的晶体固定在玻璃毛上收集晶体数据。采用CuKα射线

和ω扫描方式，在7.144<θ<130.188°范围内收集到55915个衍射点，其中独立衍射点个数为19948(R_int＝0.0592)。经验吸收校正采用SADABS程序。化合物的分子结构由直接法解出，用SHELXTL全矩阵最小二乘法精修。所有的非氢原子采用各向异性热参数精修，最后用理论加氢法确定氢原子的位置。

所制备的柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物的详细晶体数据见表1，重要的键长键角见表2，晶体结构见图4，该配合物为三斜晶系，P_-1空间群。中心Ni(II)原子采用六配位，分别与来自2个柚皮素-4-喹啉腙衍生物喹啉环上的N原子、C＝N双键上的N原子和柚皮素酚羟基上的O原子螯合配位。晶胞参数为

α＝99.759(2)°，β＝99.174(2)°，γ＝95.993(2)°，

表1柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物的晶体结构数据

表2柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物的的主要键长

和键角数据(°)

实验例

本发明用于体外抗肿瘤活性实验，测定方法(MTT法)如下：

1、细胞培养

本实验所选择进行实验的人胃癌细胞BGC-823和人肝癌细胞BEL-7402在含1％(v/v) 双抗生素(100U/mL链霉素和100U/mL青霉素)、89％(v/v)1640基础培养液和10％(v/v)胎牛血清的完全培养基中培养。在37℃下含5％CO₂的培养箱中培养，第二天换液，第三天传代，实验研究取对数时期的稳定生长的细胞。

2、细胞传代

观察细胞的密度，当细胞增殖到80％左右，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液，均匀分成三份，将细胞种在三个培养皿中，标记，置于培养箱中。

3、细胞计数

弃去原培养液，加PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液，取10μL滴加到计数板上。数出4个大方格内的细胞总数(每个大方格的体积为0.1μL)。细胞浓度的计算公式如下所示：

细胞浓度(细胞数/ml)＝(四大格细胞总数/4)×10⁴

4、细胞冻存

弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入1mL的冻存液，将细胞轻吹为单细胞悬液，再将重悬细胞转入冻存管，标记。将冻存管转到液氮罐中保存。

5、细胞复苏

将冻存管从液氮灌中拿出，置于37℃的水浴锅中轻轻摇晃。离心，弃上清液。用对应完全培养基重悬，种在新的培养皿中，标记，放置在培养箱中。

6、样品试剂对细胞活性的影响

(1)排板：取对数时期稳定生长细胞，弃去原培养液，加入无菌PBS溶液洗1～2次，加0.25％的胰酶，消化5min，再加完全培养基，轻吹细胞，将细胞收入2mL的离心管中，离心5min，弃去上清液。加入完全培养基，将细胞轻吹为单细胞悬液。计数，将细胞的密度调到3×10⁴个/mL，以每孔加200μL标准，加入96孔板中，培养箱中培养24h。

(2)分组：实验分别设对照组(加完全培养基)、加药组(加不同浓度柚皮素、Cisplatin、柚皮素-4-喹啉腙及其Ni(II)配合物的细胞组)。

(3)加药：将柚皮素、Cisplatin、柚皮素-4-喹啉腙及其Ni(II)配合物，分别用DMSO溶解，用完全培养基稀释至5个浓度梯度组：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.25 μg/mL。将原培养液吸出，依次加入含柚皮素、Cisplatin、柚皮素-4-喹啉腙及其Ni(II)配合物的培养液，每孔加200μL。培养48h后，避光，每孔加入20μL的MTT。

(4)检测：吸去原培养液，加DMSO。调整测量波长为490nm，酶标仪中测量各个孔的光密度值(OD)。

7、IC₅₀值计算

按照寇氏改良公式法计算药物的IC₅₀值其计算方法如下：

抑制率计算方法：抑制率＝1－加药组/对照组

寇氏改良法：lg IC₅₀＝X_m-I[P-(3-P_m-P_n)/4]

X_m:lg最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

P_m:最大阳性反应率 P_n:最小阳性反应率

通过以上公式可测出本发明的柚皮素-4-喹啉腙及Ni(II)配合物的体外抗肿瘤活性 IC₅₀(μM)，并与对照品柚皮素、Cisplatin的IC₅₀进行对比，结果见表3，柱状图见图5。

表3柚皮素、Cisplatin、本发明衍生物及配合物在BGC-823和BEL-7402中的IC₅₀(μM)

从体外抗肿瘤活性实验结果看，本发明制备的柚皮素-4-喹啉腙衍生物对BGC-823和 BEL-7402的增殖均具有抑制作用，IC₅₀值分别为19.25μM和12.24μM，与原料药柚皮素本身相比，抑制活性分别提高了约2倍、6.5倍，说明本发明柚皮素-4-喹啉腙衍生物的抗肿瘤活性比原料药有明显改善。本发明制备的柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物对BGC-823和BEL-7402的IC₅₀分别为20.32μM和20.83μM，虽然并未表现出强于衍生物本身的抑制活性，但该配合物同样具有明显的抑制作用，且抑制活性明显强于柚皮素本身。可见，本发明柚皮素-4-喹啉腙衍生物及对应的Ni(II)配合物对BGC-823和BEL-7402两种肿瘤细胞均表现出明显的抑制活性，尤其是柚皮素-4-喹啉腙衍生物对BEL-7402的抑制活性比原料药柚皮素提高了近6.5倍，具有潜在应用价值，有望在抗肝癌研究中有出色表现。

Claims (9)

1.一种具有抗肿瘤活性的柚皮素衍生物，其特征在于，所述的柚皮素衍生物为柚皮素-4-喹啉腙，分子式为C₂₄H₁₉N₃O₄，分子结构式为：

2.一种如权利要求1所述柚皮素衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将2-氯喹啉溶于无水乙醇中，加入过量的80％水合肼，回流温度反应，得到中间体粗品；

(2)中间体粗品用无水乙醇重结晶，得到橘色片状晶体2-肼基喹啉中间体；

(3)将2-肼基喹啉中间体和柚皮素分别溶于无水乙醇后混合，滴加冰醋酸催化，回流温度反应，TLC监测反应进程，随反应进行析出深黄色沉淀；

(4)反应结束后，趁热抽滤，无水乙醇洗涤，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4-喹啉腙粗品。

3.根据权利要求2所述柚皮素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中反应的时间为6h～8h；2-肼基喹啉中间体和柚皮素的摩尔比为1.2:1～1.5:1。

4.根据权利要求2所述柚皮素衍生物的制备方法，其特征在于，还包括将柚皮素-4-喹啉腙粗品在无水乙醇中重结晶，得到深黄色粉末，即为柚皮素-4-喹啉腙。

5.一种权利要求1所述柚皮素衍生物对应的Ni(II)配合物，其特征在于，所述的Ni(II)配合物为柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物，分子式为[Ni(C₂₄H₁₉N₃O₄)(C₂₄H₁₈N₃O₄)^-]^.ClO₄ ^.1.5CH₃OH^.H₂O；分子结构示意图为：

6.一种如权利要求5所述Ni(II)配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将柚皮素-4-喹啉腙加入甲醇中，得到黄色混悬液；

(2)将高氯酸镍加入到混悬液中，搅拌加热反应，得到棕黄色澄清液；

(3)过滤，滤液室温挥发，2天后析出棕色块状晶体，即为柚皮素-4-喹啉腙Ni(II)配合物。

7.根据权利要求6所述Ni(II)配合物的制备方法，其特征在于，柚皮素-4-喹啉腙和高氯酸镍的摩尔比为2:1；加热温度为35～45℃。

8.一种如权利要求1所述柚皮素衍生物或权利要求5所述Ni(II)配合物在制备抗肿瘤细胞药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人胃癌细胞BGC-823和人肝癌细胞BEL-7402。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞BEL-7402。

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