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CN113774157A - 一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法 - Google Patents

一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法 Download PDF

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CN113774157A
CN113774157A CN202110061034.1A CN202110061034A CN113774157A CN 113774157 A CN113774157 A CN 113774157A CN 202110061034 A CN202110061034 A CN 202110061034A CN 113774157 A CN113774157 A CN 113774157A
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plasmodium
primer
probe
group
positive
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CN202110061034.1A
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李秀林
张蓉
赵西浩
曹新文
钱俐
王政峰
崔东明
刘中华
王国强
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Jiangsu Bioperfectus Technologies Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Bioperfectus Technologies Co ltd
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Abstract

本发明公开了一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf‑P、pv‑P、po‑P、pm‑P、pk‑P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内；相比较扩增片段超过200bp的产品，本发明以减少扩增片段的方式减少延伸时间，能够在64分钟左右的时间内对对疑似疟疾患者做出精准、快速的临床辅助诊断，并对阳性患者做出5种疟原虫分型判断。

Description

一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法。
背景技术：
长期以来，人们认为只有四种疟原虫能感染人类，即恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫，而WHO疟疾专家有所提示：诺氏疟原虫早已开始在人类中传播，人类很有可能要面临第五种疟原虫感染的威胁。我国疟疾感染多发生在华中和华南地区，主要以恶性疟原虫和间日疟原虫的感染为主，疟疾是一种严重危害人类健康的疾病，因此疟疾的实验室检测技术有着至关重要的作用。
目前疟原虫常见的检测方法有镜检法、免疫层析技术、PCR 扩增法、环介导等温扩增等。镜检是检测疟原虫的金标准，但镜检需要显微镜进行检查，而且对人员要求、涂片及染色要求、镜检过程等，都需要较强的专业性；免疫层析法等免疫学检测疟原虫乳酸脱氢酶，操作简单，对人员要求较低，也完善了镜检重复性低的缺陷，但其检测准确度却远远不及核酸检测，对于部分虫数较低的样本，核酸检测技术以极高的准确性和灵敏度而有着重要的优势；核酸PCR扩增检测法拥有设计简单、产品性能稳定、检测通量多且不易出现假阳性等众多优点；目前市场上用于检测疟原虫的产品主要围绕恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫来设计的，往往忽略了诺氏疟原虫，而诺氏疟原虫的核苷酸序列跟间日疟原虫有着高度的相似性，因此在设计引物探针的时候不考虑诺氏疟原虫会很有可能导致间日疟原虫出现误检的风险；另一方面，根据部分专利及相关文献说明，市场上针对疟原虫核酸检测的常规产品，会设计扩增片段超过200bp以上的通用引物，而当扩增片段太长的时候引物需要更长的时间来延伸，因此在检测时间上会有一定程度的增加。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，从而克服上述现有技术中的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf-P、pv-P、po-P、pm-P、pk-P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内。
本发明为一种利用PCR扩增技术原理，在130bp的核苷酸序列内设计特异性引物探针。相比较扩增片段超过200bp的产品，本发明以减少扩增片段的方式减少延伸时间，能够在64分钟左右的时间内对对疑似疟疾患者做出精准、快速的临床辅助诊断，并对阳性患者做出5种疟原虫分型判断。
优选地，上述技术方案中，所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P按照一定的反应浓度组合成B组反应液。
优选地，上述技术方案中，还包括根据人源核糖核苷酸酶P基因设计的一对内参基因引物和探针分别为EF、ER、EP，所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成B组反应液。
优选地，上述技术方案中，用于检测五种疟原虫的通用引物和探针NF、NR、NP具体为：通用引物NF：5’-GAGGAATGCCTAGTAAGCATGATT-3’，
通用引物NR：5’-TCCAAACAATTCATCATATCTTTCA-3’，
通用探针NP：5’-CY5-TGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC-BHQ3-3’。
优选地，上述技术方案中，扩增恶性疟原虫、间日疟原虫的共用引物和特异性探针：
共用引物AF：5’-GTGCTACACTGATATRTATAACGAGTTWTT-3’，
共用引物AR：5’-AGATTACCTACRCYTTTCRGYGG-3’，
间日疟原虫探针pv-P：5’-VIC- ATTCAGCTTGCTGTTTCGTATTT-MGB-3’，
恶性疟原虫探针pf-P：5’-FAM-TTTGCATACTTTTCCTCCGCCGA-BHQ1-3’。
优选地，上述技术方案中，扩增三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫的共用引物和特异性探针，序列如下：
共用引物BF：5’-CACGCGTGCTACACTGATATG-3’，
共用引物BR：5’-ACGATATGTAYTGATAAAGATTACCTACAC-3’，
卵形疟原虫探针po-P：5’-VIC-CTCTTTCAAATTGTATAGTTTTCCTC-MGB-3’，
三日疟原虫探针pm-P：5’-CY5-TGCAAAGAATATATAGTTTTCCTCCA-MGB-3’，
诺氏疟原虫探针pk-P：5’-FAM-CGATTTTAGCTGCTTGCAGTTTA-BHQ1-3’。
优选地，上述技术方案中，扩增内参基因的引物和探针序列如下：
内参基因引物EF：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’，
内参基因引物ER：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’，
内参基因探针EP：5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’。
一种快速对五种疟原虫检测并分型的检测试剂盒，包括如前任一方案的引物探针组合物。
一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，具体按照如下步骤进行：
步骤1，模板DNA提取：使用细菌DNA提取试剂盒提取待检样本中的DNA；
步骤2，实时荧光PCR扩增反应：在100µl或200µl PCR管分别配制A组、B组反应体系：A组、B组引物探针混合液7.5µl，Taqman OneStep Buffer 7.5µl，酶混合液5µl，模板DNA5µl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤2.1，95℃×10min，1cycles；
步骤2.2，95℃×10sec，55℃×30sec，40cycles；
在步骤
Figure RE-3584DEST_PATH_IMAGE001
55℃，30s时对FAM、VIC、ROX、CY5通道的荧光信号进行采集；
步骤3，结果判读：
步骤3.1，阳性判断值：
通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数Youden index确定阳性判断值；
阳性：检测结果Ct≤38且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期；
阴性：Ct＞40或者未检出；
疑似：38＜Ct≤40，疑似样本需要重新复检，Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性；
步骤3.2，对结果进行判读：当A组CY5通道结果为阳性时，可判读该样本检测结果为阳性；当判读为疟原虫阳性时，可参考A组FAM、VIC和B组FAM、VIC、CY5通道判读结果对该阳性疟原虫进行分型；当A组、B组ROX通道信号为阳性，且两管其他通道均为阴性时，可判读该样本检测结果为阴性；当A组CY5通道结果为阴性时，且A组、B组ROX通道信号为阴性时，可判读为该样本检测结果不合格，需要重新采样并检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
a)本发明方法方便快捷，能在64min内鉴别出检测样本是否为疟原虫阳性的样本，并且对阳性样本做出疟原虫分型。
b)本发明根据五种疟原虫18S基因序列设计了共用引物，相比较其他常规PCR产品，本品减少了体系中的物料，大大提高了产品的稳定性。
c)本品结果判读为阳性、分型两步分开判读，判读结果更为准确。
d)具有较高的特异性，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其他病原体（弓形虫、嗜吞噬细胞无形体、布鲁氏菌、脑膜炎奈瑟菌、链球菌、钩端螺旋体、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌）以及人的总核酸无交叉反应。
e)检测灵敏度高，最低可检测出1000copies/ml的疟原虫核酸。本发明对普通疟疾、疑似疟疾的诊断与治疗具有较高的辅助诊断作用，适用于推广。
附图说明：
图1为阳性对照、阴性对照检测的荧光PCR扩增曲线图。
图2为全血样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测的恶性疟原虫阳性样本荧光PCR扩增曲线图。
图3为全血样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测的间日疟原虫阳性样本荧光PCR扩增曲线图。
图4为全血样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测的卵形疟原虫阳性样本荧光PCR扩增曲线图。
图5为全血样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测的三日疟原虫阳性样本荧光PCR扩增曲线图。
图6为全血样本硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测的诺氏疟原虫阳性样本荧光PCR扩增曲线图。
图7为特异性分析，分别对阳性弓形虫、嗜吞噬细胞无形体、布鲁氏菌、脑膜炎奈瑟菌、链球菌、钩端螺旋体、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌及其人类白细胞采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)提取检测。
图8为本发明所有引物探针设计模式示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明根据恶性疟原虫（pf）、间日疟原虫（pv）、卵形疟原虫（po）、三日疟原虫（pm）、诺氏疟原虫（pk）的18S基因保守片段设计一对用于检测疟原虫的通用型引物探针（NF、NR、NP）、两对用于区分五种疟原虫的共用引物（AF、AR、BF、BR）、五对用于区分五种疟原虫的水解探针（pf-P、pv-P、po-P、pm-P、pk-P）；再然后在区分根据人源核糖核苷酸酶P基因设计一对内参基因引物探针（EF、ER、EP），最后将AF、AR、NF、NR、pf-P、pv-P、NP、EF、ER、EP组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P、EF、ER、EP组合成B组反应液。A、B两组反应液加入样本后利用PCR扩增技术在荧光PCR仪上进行扩增，根据不同通道的扩增信号来判读样本中是否有疟原虫核酸，并对确定为疟原虫的核酸进行疟原虫分型。
3.2.1本发明所有引物探针设计模式如图8所示：
3.2.2：本发明所需特异性引物、探针包括：
（1）扩增五种疟原虫的共用引物探针，优选的引物探针反应终浓度分别为400nM、400nM、300 nM，序列如下：
通用引物NF：5’-GAGGAATGCCTAGTAAGCATGATT-3’
通用引物NR：5’-TCCAAACAATTCATCATATCTTTCA-3’
通用探针NP（CY5荧光素标记）：5’-CY5-TGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC-BHQ3-3’
（2）扩增恶性疟原虫、间日疟原虫的共用引物和特异性探针，优选反应终浓度分别为500nM、500nM、400 nM、300 nM，序列如下：
共用引物AF：5’-GTGCTACACTGATATRTATAACGAGTTWTT-3’
共用引物AR：5’-AGATTACCTACRCYTTTCRGYGG-3’
间日疟原虫探针pv-P（VIC荧光素标记）：5’-VIC- ATTCAGCTTGCTGTTTCGTATTT-MGB-3’
恶性疟原虫探针pf-P（FAM荧光素标记）：5’-FAM-TTTGCATACTTTTCCTCCGCCGA-BHQ1-3’
（3）扩增三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫的共用引物和特异性探针，优选反应终浓度分别为500nM、500nM、400 nM、400 nM、400 nM，序列如下：
共用引物BF：5’-CACGCGTGCTACACTGATATG-3’
共用引物BR：5’-ACGATATGTAYTGATAAAGATTACCTACAC-3’
卵形疟原虫探针po-P（VIC荧光素标记）：5’-VIC-CTCTTTCAAATTGTATAGTTTTCCTC-MGB-3’
三日疟原虫探针pm-P（CY5荧光素标记）：5’-CY5-TGCAAAGAATATATAGTTTTCCTCCA-MGB-3’
诺氏疟原虫探针pk-P（FAM荧光素标记）：5’-FAM-CGATTTTAGCTGCTTGCAGTTTA-BHQ1-3’
（4）扩增内参基因的引物探针，优选反应终浓度分别为300nM（200nM）、300nM（200nM）、200 nM（100 nM），序列如下：
内参基因引物EF：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
内参基因引物ER：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
内参基因探针EP:(ROX荧光素标记）：5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’
3.2.3：本发明还提供一种基于实时荧光RT-PCRC的疟原虫核酸分型检测试剂盒，包括上述的引物探针组合物。
进一步的，还包括RT-PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照。
优选地，所述RT-PCR反应液包括缓冲液、Mg2+、dNTPs。
优选地，所述酶混合液包括RNA酶抑制剂、DNA聚合酶。
优选地，所述阳性对照为人工合成的基因。
优选地，所述空白对照为灭菌的去RNA酶水。:
3.2.4：一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，具体包括如下步骤：
（1）模板DNA提取：提取待检样本中的DNA，可使用以下提取试剂，硕世生物公司的细菌DNA提取试剂盒（货号：SDK60108），凯杰公司的QIAamp DNA Mini Kit（货号：51304、51306）提取试剂盒提取核酸，按照试剂盒说明书操作。
（2）实时荧光PCR扩增反应：在100µl或200µl PCR管配制A组（B组）反应体系：A组（B组）引物探针混合液7.5µl，Taqman OneStep Buffer 7.5µl，酶混合液5µl，模板DNA 5µl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤
Figure RE-199205DEST_PATH_IMAGE002
95℃×5min（1cycles）
步骤
Figure RE-880853DEST_PATH_IMAGE001
95℃×10sec，55℃×30sec（40cycles）
在步骤
Figure RE-55482DEST_PATH_IMAGE001
55℃，30s时对FAM、VIC、ROX、CY5通道的荧光信号进行采集；ABI7500实时荧光 PCR仪不选 ROX 校正，淬灭基团选None。）
所述Taqman OneStep Buffer、酶混合液均为上海硕颖生物公司所购买，其中Taqman OneStep Buffer的货号为CSBF-006，酶混合液的货号为：CSEN-004L。
所述实时荧光PCR仪可选择ABI7500/7500 fast、QuantStudio™ 5、Bio-RadCFX96™、上海宏石SLAN-96P/S、Roche LightCycler480Ⅱ等荧光定量PCR仪。
（3）结果分析：ABI 7500、ABI Q7、ABI Q5：反应结束自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（可以根据实际情况自行调整，Start值可以在3~15、End值可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阀值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
（4）结果判读：
（4.1）阳性判断值：
本发明通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数（Youden index）确定阳性判断值。
阳性：检测结果Ct≤38且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期。
阴性：Ct＞40或者未检出。
疑似：38＜Ct≤40，疑似样本需要重新复检，Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性。
（4.2）对结果进行判读：
当A组CY5通道结果为阳性时，可判读该样本检测结果为阳性；当判读为疟原虫阳性时，可参考A组FAM、VIC和B组FAM、VIC、CY5通道判读结果对该阳性疟原虫进行分型。
当A组、B组ROX通道信号为阳性，且两管其他通道均为阴性时，可判读该样本检测结果为阴性。
当A组CY5通道结果为阴性时，且A组、B组ROX通道信号为阴性时，可判读为该样本检测结果不合格，需要重新采样并检测。
实施例1：引物、探针设计：
通过NCBI查找恶性疟原虫的18s基因序列、间日疟原虫的18s基因序列、三日疟原虫的18s基因序列、卵形疟原虫的18s基因序列、诺氏疟原虫的18s基因序列、人源核糖核苷酸酶P基因序列，通过BioEdit进行序列比较，Primer Express 3.0.1设计引物和探针，BLAST确认引物探针特异性，得到疟原虫的通用型引物探针、两对用于区分五种疟原虫的共用引物、五对用于区分五种疟原虫的水解探针、内参基因引物探针。
实施例2：模板DNA的提取：
（1）样本的采集，包括全血样本，具体采集方法如下：
建议使用含EDTA抗凝剂的采血管采集血液标本2ml，采集后颠倒混匀，使采血管内壁上的抗凝剂充分与血液混合。
（2）将上述采集好的全血样本按照核酸提取试剂盒说明书进行提取，可使用以下提取试剂盒：硕世生物公司的细菌DNA提取试剂盒（货号：SDK60108），凯杰公司的QIAampDNA Mini Kit（货号：51304、51306）。
实施例3：引物探针反应液和试剂盒反应液的配制：
（1）A组引物探针反应液的配制：
Figure RE-46441DEST_PATH_IMAGE003
。
（2）B组引物探针反应液的配制：
Figure RE-40942DEST_PATH_IMAGE004
。
（3）反应液的配制：
Figure RE-526281DEST_PATH_IMAGE005
。
实施例4：扩增程序：
（1）95℃×5min；1cycles，
（2）95℃×10sec，55℃×30sec——40cycles，
在第（2）步骤55℃，30s时对FAM、VIC、ROX、CY5通道的进行荧光信号采集；ABI7500实时荧光 PCR仪不选 ROX 校正，淬灭基团选None。
实施例5：结果判读：
阳性对照检测阳性、阴性对照检测阴性、样本检测结果A管ROX和B管ROX通道Rnasep检测阳性基础上，按照下表进行结果判读：
A管体系：
Figure RE-555417DEST_PATH_IMAGE006
。
管体系：
Figure RE-504828DEST_PATH_IMAGE007
。
实例6：
检测结果如表1所示，荧光PCR扩增曲线图如图7所示。
表1：特异性分析：
Figure RE-986625DEST_PATH_IMAGE008
。
基于事实荧光PCR检测的恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫最低检测限的确认，采用硕世生物的核酸提取试剂盒(SDK60108)分别提取恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫核酸，然后采用数字PCR技术对提取的核酸进行绝对定量，然后将确定浓度的核酸稀释至10000copies、1000copies、100copies进行检测，每个梯度做10个重复。检测结果如表2所示。
表2：最低检测限确认：
Figure RE-275655DEST_PATH_IMAGE009
。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (9)

1.一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf-P、pv-P、po-P、pm-P、pk-P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内。
2.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P按照一定的反应浓度组合成B组反应液。
3.根据权利要求2所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：还包括根据人源核糖核苷酸酶P基因设计的一对内参基因引物和探针分别为EF、ER、EP，所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成B组反应液。
4.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：用于检测五种疟原虫的通用引物和探针NF、NR、NP具体为：
通用引物NF：5’-GAGGAATGCCTAGTAAGCATGATT-3’，
通用引物NR：5’-TCCAAACAATTCATCATATCTTTCA-3’，
通用探针NP：5’-CY5-TGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC-BHQ3-3’。
5.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增恶性疟原虫、间日疟原虫的共用引物和特异性探针：
共用引物AF：5’-GTGCTACACTGATATRTATAACGAGTTWTT-3’，
共用引物AR：5’-AGATTACCTACRCYTTTCRGYGG-3’，
间日疟原虫探针pv-P：5’-VIC- ATTCAGCTTGCTGTTTCGTATTT-MGB-3’，
恶性疟原虫探针pf-P：5’-FAM-TTTGCATACTTTTCCTCCGCCGA-BHQ1-3’。
6.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫的共用引物和特异性探针，序列如下：
共用引物BF：5’-CACGCGTGCTACACTGATATG-3’，
共用引物BR：5’-ACGATATGTAYTGATAAAGATTACCTACAC-3’，
卵形疟原虫探针po-P：5’-VIC-CTCTTTCAAATTGTATAGTTTTCCTC-MGB-3’，
三日疟原虫探针pm-P：5’-CY5-TGCAAAGAATATATAGTTTTCCTCCA-MGB-3’，
诺氏疟原虫探针pk-P：5’-FAM-CGATTTTAGCTGCTTGCAGTTTA-BHQ1-3’。
7.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增内参基因的引物和探针序列如下：
内参基因引物EF：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’，
内参基因引物ER：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’，
内参基因探针EP：5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’。
8.一种快速对五种疟原虫检测并分型的检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-7任一权利要求的引物探针组合物。
9.一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，具体按照如下步骤进行：
步骤1，模板DNA提取：使用细菌DNA提取试剂盒提取待检样本中的DNA；
步骤2，实时荧光PCR扩增反应：在100µl或200µl PCR管分别配制A组、B组反应体系：A组、B组引物探针混合液7.5µl，Taqman OneStep Buffer 7.5µl，酶混合液5µl，模板DNA 5µl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：
步骤2.1，95℃×5min，1cycles；
步骤2.2，95℃×10sec，55℃×30sec，40cycles；
在步骤
Figure DEST_PATH_IMAGE002
55℃，30s时对FAM、VIC、ROX、CY5通道的荧光信号进行采集；
步骤3，结果判读：
步骤3.1，阳性判断值：
通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数Youden index确定阳性判断值；
阳性：检测结果Ct≤38且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期；
阴性：Ct＞40或者未检出；
疑似：38＜Ct≤40，疑似样本需要重新复检，Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性；
步骤3.2，对结果进行判读：当A组CY5通道结果为阳性时，可判读该样本检测结果为阳性；当判读为疟原虫阳性时，可参考A组FAM、VIC和B组FAM、VIC、CY5通道判读结果对该阳性疟原虫进行分型；当A组、B组ROX通道信号为阳性，且两管其他通道均为阴性时，可判读该样本检测结果为阴性；当A组CY5通道结果为阴性时，且A组、B组ROX通道信号为阴性时，可判读为该样本检测结果不合格，需要重新采样并检测。
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