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CN113773984B - 提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌 - Google Patents

提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌 Download PDF

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CN113773984B CN202110963072.6A CN202110963072A CN113773984B CN 113773984 B CN113773984 B CN 113773984B CN 202110963072 A CN202110963072 A CN 202110963072A CN 113773984 B CN113773984 B CN 113773984B
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Abstract

本发明公开了提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌，及发酵黄精提取多糖在屏障修复和免疫调节的应用。此发明以黄精原料为唯一碳源，添加了增殖因子和有利于促进鼠李糖乳杆菌增殖的微量元素，使鼠李糖乳杆菌能够在黄精原料发酵液中快速增殖，以此方式发酵一定时间，发酵液中的鼠李糖乳杆菌增殖超过8.3×108cfu/mL，发酵后提取黄精多糖含量较未发酵提取黄精多糖含量有显著提升，且在皮肤屏障修复和免疫调节方面均较未发酵多糖具有显著提高。

Description

提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌
技术领域
本发明涉及提高黄精多糖得率并调节皮肤屏障与免疫的鼠李糖乳杆菌，属于发酵工程领域。
背景技术
黄精又名鸡头黄精、大黄精、姜形黄精，始载于《名医别录》。黄精作为一味传统的滋补中药，黄精性甘、平，质滋润，归肾、脾、肺经，具有强身健体、延缓衰老，补脾益气，滋肾润肺的功效。研究表明，黄精中含有多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱和多种氨基酸等化合物，其中多糖是黄精最主要的生物活性成分，多糖含量的高低决定黄精生物活性的强弱，其具有增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗菌抗炎、抗肿瘤、降血糖血脂等作用，在化妆品原料开发中具有很好的应用前景。目前主要通过酶提法、酸提法、碱提法、水提法、超声提取等多种方法提取多糖并应用于化妆品。
通过微生物法发酵黄精提高多糖的提取量近几年亦有研究，微生物在生长代谢过程中分泌大量的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、糖苷酶、淀粉酶、果胶酶等胞外酶，可使植物细胞破裂，细胞间隙增大，加快中药中有效成分的溶出，有效提高中药有效成分的提取率。通过微生物发酵不仅可以提高多糖的提取率，而且通过微生物的生物转化作用，可以将原有的植物多糖转化成活性更高的新型发酵多糖；另，部分微生物在发酵过程中，可利用小分子碳水化合物自身合成胞外多糖，尤其一些乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌，利用该微生物发酵黄精不仅可以纯化黄精多糖，而且产生的菌体胞外多糖与黄精多糖起到协同增效作用。但微生物的上述作用依赖于菌株的代谢酶系，具有很强的株特异性，有的菌株无法利用黄精原料进行发酵增殖，有的菌株即使增殖亦无法进行多糖的生物转化，有的菌株甚至会降低多糖的活性，能够产胞外多糖的菌株亦具有很强的特异性。
近年来肠道益生菌被广泛研究，被证明具有绝对的安全性和广泛的功效潜能。利用益生菌发酵黄精原料，挖掘能够发酵黄精提高其多糖得率，提高发酵后多糖活性的菌株和发酵工艺，不但可以节约黄精资源，还可以提高黄精的有效性及应用范围。
黄精多糖在皮肤健康的应用一直被关注，其在皮肤免疫、抗氧化、抗衰老、抗菌抗炎和抗疲劳等方面都有应用。皮肤作为人体的第一道防线，对抵御外界有害因素的损伤以及维持人体内环境的稳态有着至关重要的作用。皮肤是防止外界物质进入人体和体内水分丢失的主要屏障，皮肤屏障受损和皮肤免疫应答反应同时发生。皮肤屏障受损导致皮肤免疫应答失调，而皮肤免疫应答失调会加重皮肤屏障受损，从而恶性循环。只有在维持皮肤屏障完整性的同时促使皮肤免疫应答正常化，才能有效保证皮肤健康。而黄精多糖既可以修复皮肤屏障功能，又能用于调节皮肤免疫。
目前尚无能够有效发酵黄精原料，在提高发酵多糖得率的同时，对皮肤屏障修复和皮肤免疫调节功效均提高的菌株和发酵工艺。因此，利用现代发酵工程技术使发酵过程中限制性因素得到解决，使中药原料得到充分的开发利用，提高其有效成分多糖得率，筛选出一株益生菌能够发酵黄精原料，且发酵后提取多糖在屏障修复和免疫调节功效方面均提高，具有重要价值。
发明内容
[技术问题]
目前尚无能够有效发酵黄精原料，在提高发酵多糖得率的同时，对皮肤屏障修复和皮肤免疫调节功效均提高的菌株和发酵工艺。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精原料与发酵后提取多糖的方法，及发酵黄精提取多糖在屏障修复和免疫调节的应用。
本发明的第一个目的是提供一种鼠李糖乳杆菌CCFM1161(Lactobacillusrhamnosus)于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61714，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供上述鼠李糖乳杆菌CCFM1161在提取中药多糖方面的应用。
本发明的第三个目的提供一种发酵黄精原料及提取发酵多糖的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)将上述鼠李糖乳杆菌CCFM1161接种至以黄精为唯一碳源的培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)超声处理步骤(1)中的发酵液，离心并收集发酵上清液；在发酵上清液中加入三氯乙酸，孵育后离心并收集上清液；在上清液中加入乙醇混合，孵育后离心获得沉淀；
(3)用超纯水复溶步骤(2)中的沉淀后，真空冷冻干燥，获得发酵多糖粉末。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述培养基的组成包括干重40～80g/L的黄精原料，10～40g/L的增殖因子，0.1～0.8g/L的微量元素和0.5～1.5mL/L的吐温。
在本发明的一种实施方式中，所述黄精原料的制备方法为将干黄精粉碎至至60目以下。
在本发明的一种实施方式中，所述增殖因子选自酵母浸粉、酵母提取物、酵母蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素包括硫酸镁和/或硫酸锰。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的初始pH值为5.5～7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述灭菌的条件为温度115-121℃，时间15～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述鼠李糖乳杆菌的接种量为1×106～1.0×107cfu/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述发酵的条件为：温度为32～38℃，pH为5.5～7.0，发酵时间为15～24h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述离心的条件为：6000～10000g，时间为5～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述超声处理的条件为：温度25～80℃，超声功率200～500w，时间为10～30min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述三氯乙酸浓度为750～850g/L，以质量比2％～5％的添加量添加至发酵上清液中，孵育时间为30～60min，温度为0～4℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述乙醇的浓度为90～95％，以体积比1:9的比例添加至发酵上清液中。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述真空冷冻干燥条件为预冻温度为-60～-55℃，时间为3～5h；一次干燥温度为-25～-35℃，压力为180～220μbar，时间为22～26h；二次干燥温度为20～30℃，压力为0μbar，时间为15～20h。
本发明的第四个目的是提供利用上述方法制备得到的黄精多糖或含有黄精多糖的组合物。
本发明还提供所述黄精多糖或含有黄精多糖的组合物或在在制备预防或治疗皮肤屏障修护和/或皮肤免疫调节的产品中的应用。
有益效果：
(1)本发明考察了鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖的得率，结果显示，鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵多糖结合超声法，发酵后黄精多糖的得率相比未发酵黄精多糖的得率提高了200％-250％。
(2)本发明考察了鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖对皮肤屏障修复的影响，结果显示，发酵黄精多糖提高了SDS诱导的HaCaT的细胞存活率，是未发酵黄精多糖的1.11～1.23倍。
(3)本发明考察了鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖对皮肤免疫调节的影响，结果显示发酵多糖降低了LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量，是未发酵黄精多糖的0.69倍，较未发酵黄精粗多糖更有效的降低NO含量。
(4)本发明考察了鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖的分子量分布，结果显示，发酵后黄精多糖中的较大分子量多糖较未发酵黄精多糖中的较大分子量多糖有所减小。
(5)本发明考察了鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖的单糖组成，结果显示，发酵后黄精多糖的单糖组份较未发酵黄精多糖的单糖组份增加，且各单糖组分含量也有所差别。
生物保藏证明
鼠李糖乳杆菌CCFM1161(Lactobacillus rhamnosus)于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61714，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1是鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖图片。
图2是鼠李糖乳杆菌CCFM1161、酵母A5、粪拟杆菌FNMHLBEI-K-4发酵黄精提取多糖和未发酵黄精多糖含量变化。
图3是鼠李糖乳杆菌CCFM1161、酵母A5发酵黄精提取多糖在屏障修复的应用。
图4是鼠李糖乳杆菌CCFM1161、粪拟杆菌FNMHLBEI-K-4发酵黄精提取多糖免疫方面的应用。
图5是黄精未发酵多糖分子量分布图。
图6是鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精多糖分子量分布图。
图7是黄精未发酵多糖单糖组成图。
图8是鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精多糖单糖组成图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。
1)提取率计算方法：按照以下公式计算发酵黄精提取多糖的提取率：
提取率＝(发酵后提取多糖含量/未发酵黄精原料含量)×100％
2)活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
3)细胞存活率＝(给药组OD-空白组OD)/(阴性组OD-空白组OD)*100％。
4)细胞抑制率＝1-细胞存活率。
5)MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H20 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1ml/L，pH 6.2～6.4。
6)MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加20g/L的琼脂。
下述实例中涉及的人永生化皮质形成细胞(HaCaT细胞)购自中国典型培养物保藏中心；下述实例中涉及的DMEM培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；下述实例中涉及的胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的MTT工作液购自北京索莱宝科技有限公司。下述实施例中所涉及的黄精购自北京东方淼森生物科技有限公司。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
样本来源于江苏南京，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀并吸取0.5mL样本加到4.5mL生理盐水中，以含有9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取鼠李糖乳杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株，命名为CCFM1161；其中，鼠李糖乳杆菌的典型菌落呈现乳白色，不透明、表面光滑、凸起、边缘整齐，直径1～2mm。
2、鉴定
提取菌株CCFM1161的基因组，将菌株CCFM1161的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行)，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM1161为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
实施例2黄精粗多糖的提取
具体步骤如下：
(1)配制黄精原料发酵培养基：80g/L黄精原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL/L的吐温80后混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄精原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄精原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄精原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入鼠李糖乳杆菌CCFM1161，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15-16h，此时，活菌数达到8.3×108cfu/mL；继续发酵至24h，达到发酵终点，获得黄精原料发酵液。
(3)提取黄精多糖：将步骤(2)中的黄精原料发酵液在超声清洗机中以400w功率，80℃，超声30min后，8000g离心5min，除掉菌体和黄精原料发酵液残渣，得到黄精原料发酵液上清；将浓度为800g/L的三氯乙酸以质量体积比5％的添加量加入黄精原料发酵液上清中，在4℃冰箱中放置30min，然后8000g离心5min，除掉黄精原料发酵液上清中的蛋白质。将去除蛋白质的黄精原料发酵液上清与无水乙醇以体积比1:9的比例沉淀多糖，在4℃冰箱中放置过夜，8000g离心5min，得到黄精粗多糖，用超纯水以体积比1:1的比例复溶黄精粗多糖至无明显固体沉淀，放置在平板中，在真空冷冻干燥机中干燥46h，得到黄精粗多糖粉末。(发酵黄精提取粗多糖图片可见图1)
未发酵多糖的提取方法为不发酵直接使用超声法，具体步骤同步骤(3)。
根据图2，可见发酵后超声法提取黄精粗多糖较未发酵提取黄精粗多糖提取率显著提高，发酵后黄精多糖的提取率是未发酵多糖提取的2.14倍。
实施例3黄精发酵多糖在皮肤屏障修复的应用
(1)细胞培养：于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养人角质形成细胞HaCaT细胞，待细胞达到90％融合时传代培养。弃去培养基，PBS洗去残余培养基，经浓度为2.5g/L的胰酶消化，添加完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％胎牛血清+100U/mL青链霉素)终止消化，吹打并收集细胞悬液，1000rpm离心5min，完全培养基重悬细胞，传代培养。取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)MTT法检测细胞活率：实验分组为空白组、阴性对照组、SDS模型组和多糖干预组，除空白组不含细胞外其它3组均接种细胞，每组设3个重复孔。将步骤(1)中的HaCaT细胞以每孔5000个细胞密度接种于96孔板中培养24h，阴性对照组更换新鲜完全培养基，SDS模型组和多糖干预组弃去原培养液并更换含50μg/mL SDS的完全培养基(称取SDS粉末，溶于PBS缓冲液，过滤除菌，使用时用完全培养基稀释到使用浓度)继续培养24h；阴性对照组和SDS模型组更换新鲜完全培养基，多糖干预组更换含不同浓度的实施例2中的黄精粗多糖的完全培养基继续孵育24h。弃去培养液，PBS洗去残余培养液，每孔添加MTT工作液(称取MTT试剂溶于PBS配制成5mg/mL的储存液，过滤除菌后，于-20℃冰箱避光保存。使用时，将100μL MTT储存液按1：9的比例添加到无血清培养基中配制MTT工作液)，于培养箱中继续孵育3～4h，弃去MTT工作液，每孔加入150μL DMSO溶液，于振荡器上中速震荡5min后，酶标仪检测570nm波长处吸光度(OD值)。
表1发酵黄精粗多糖和未发酵黄精粗多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率的影响
根据图3、表1，发酵后黄精粗多糖对HaCaT细胞在中、高、低浓度下对皮肤屏障的修复效果比未发酵黄精粗多糖对皮肤屏障的修复效果都有显著的提升。表明本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖在屏障修复的方面有潜在的价值。
实施例4黄精发酵多糖在皮肤免疫调节的应用
(1)细胞培养：于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞，待细胞达到90％融合时传代培养。弃去培养基，PBS洗去残余培养基，加入2mL完全培养基(90％DMEM高糖培养基+10％胎牛血清+100U/mL青链霉素)，用细胞刮刀将细胞刮打下来，吹打均匀收集至离心管，1200rpm离心3min，收集细胞沉淀，完全培养基重悬细胞，传代培养。取对数生长期且状态良好的细胞用于实验。
(2)NO含量评价发酵多糖的效果：实验分组为阴性对照组、LPS模型组和多糖干预组。将步骤(1)中培养的RAW264.7细胞接种于6孔板中培养，每孔1×105个细胞，培养24h。阴性对照组更换新鲜完全培养基，LPS模型组和多糖干预组更换含5μg/ml LPS的完全培养基，继续培养24h。阴性对照组和LPS模型组更换新鲜完全培养基，多糖干预组更换含不同浓度的实施例2中的黄精多糖的完全培养基，继续培养24h。细胞处理后，分别取各组培养上清50μL于96板中，加入格里斯试剂检测NO含量。酶标仪检测540nm波长吸光度(OD)，制作标准曲线，计算NO含量。
表2发酵黄精粗多糖和未发酵黄精粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
分组 NO含量(μM)
LPS模型组 42.859
阴性对照组 13.420
黄精多糖的浓度(μg/mL) 1000
未发酵黄精粗多糖 22.541
鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精粗多糖 15.556
根据图4、表2，发酵后黄精粗多糖在高浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的免疫效果比未发酵黄精粗多糖在高浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的免疫效果好。表明本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1161发酵黄精提取多糖在免疫的应用。
实施例5黄精多糖分子量分布
具体步骤如下：
(1)准确称取50mg不同分子量的葡聚糖标准品，分别为Dextran T-2000(Mw2000000)、Dextran T-300(Mw 300600)、Dextran T-150(Mw 135030)、Dextran T-10(Mw9750)、Dextran T-5(Mw 2700)和葡萄糖(Mw 180)，将标准品置于10mL容量瓶中，以0.1MNaNO3溶解并定容至10mL，随后使用0.22μm的滤膜过滤。
(3)采用高效液相色谱仪和2410示差折光检测器，进样量为5μL，色谱柱(UltrahydrogelTMLinear 300mm×7.8mmid×2)与保护柱(Agilent，PL aquagel-OH Guard8μm，50mm×7.5mm)串联，流动相为0.1M硝酸钠溶液，流速0.8mL/min，柱温箱40℃。根据标准样品的保留时间以及峰面积，积分计算未发酵黄精多糖和实施例2中的黄精多糖的分子量分布范围。
表3黄精未发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 13.637 324603 1054166 609931 99564 18.00
2 18.633 1324 5706 1340 453482 82.00
表4黄精发酵多糖分子量分布
保留时间 Mn Mw MP 面积 ％面积
1 14.200 241711 675080 306105 80096 14.01
2 18.425 1550 4526 1730 491783 85.99
根据图5、图6、表3、表4，发酵后黄精多糖中的较大分子量多糖较未发酵黄精中的较大分子量多糖减小，表明本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1161可以将黄精原料中大分子多糖分解成小分子多糖。
实施例6黄芪多糖的单糖组分
具体步骤如下：
(1)准确称取10mg实施例2中的黄精多糖样品于安瓿管中，加入浓度4mol/L的三氟乙酸(TFA)1mL，真空封管。在120℃高温条件下水解反应2h，氮气吹干，水解后的溶液分别加入0.3mol/L NaoH和0.5mol/L PMP(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮，甲醇溶解)各0.5mL，70℃水浴1h，冷却至室温，加0.3mol/L HCl 0.5mL后，加0.5mL氯仿，振荡摇匀后静置20min，弃去下层氯仿层，萃取三次，水层过膜上机。
(3)Agilent 1200配紫外检测器，检测波长245nm；色谱柱：SHISEIDO C18(4.6mm*250mm*5urn)；流动相洗脱液：水，0.1M KH2PO4，乙腈。柱温：25℃；进样体积：10μL，流速：1mL/min。
表5黄精未发酵多糖单糖组成
表6黄精发酵多糖单糖组成
组别 名称 保留时间 相对面积 面积 浓度
min ％ nC*min Mg/L
1 鼠李糖 6.484 1.01 0.2993 12.2541
2 阿拉伯糖 6.95 4.72 1.3975 38.4261
3 半乳糖 8.875 20.55 6.0846 150.4269
4 葡萄糖 10.267 24.79 7.3386 245.0702
5 木糖 12.834 45.69 13.5279 326.0610
6 半乳糖醛酸 22.317 2.94 0.8713 47.6989
7 葡萄糖醛酸 23.1 0.3 0.0887 3.9272
最多 45.69 13.5279
最少 0.3 0.0887
总和 100 29.6079
根据图7、图8、表5、表6，发酵后黄精多糖中的单糖组份较未发酵黄精中的单糖组份组分增加，且各单糖组份含量也有所差别，表明本发明鼠李糖乳杆菌CCFM1161可以将黄精原料中的多糖转变成更新型多糖。
对比例1
具体步骤如下：
(1)配制黄精原料发酵培养基：80g/L黄精原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰和1mL的吐温80后混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄精原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄精原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄精原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入保加利亚乳杆菌13-1，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵15-16h，此时，未发现有菌株存活；
表7发酵黄精原料菌株增殖活菌数
菌株 活菌数(cfu/mL)
初始接种活菌数 1.0×106
鼠李糖乳杆菌CCFM1161 8.3×108
保加利亚乳杆菌13-1 ND
根据表7，以同样条件接入保加利亚乳杆菌13-1，但是却未有增殖，可见保加利亚乳杆菌13-1未能发酵黄精原料。
对比例2
具体步骤如下：
(1)配制黄精原料发酵培养基：80g/L黄精原料、10g/L的酵母浸粉和10g/L的胰蛋白胨后混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄精原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄精原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄精原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入酵母A5，在温度30℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH发酵36-48h；
(3)提取黄精多糖的方法同实施例2，得到黄精粗多糖粉末；
(4)检测步骤(3)的黄精粗多糖在皮肤屏障修护的应用，具体实施方式同实施例3。
表8发酵黄精粗多糖和未发酵黄精粗多糖对SDS诱导的HaCaT细胞存活率的影响
根据图2，可见利用A5发酵的黄精原料发酵后多糖较未发酵前提取率显著提高，发酵后黄精粗多糖提取率是未发酵黄精粗多糖提取率的2.35倍。但是，根据图3、表8，发酵后黄精粗多糖对HaCaT细胞在皮肤屏障的修复效果和未发酵黄精粗多糖对皮肤屏障的修复效果未有提升。表明本发明酵母A5发酵黄精提取多糖在屏障修复方面未有效果。
对比例3
(1)配制黄精原料发酵培养基：80g/L黄精原料、10g/L的酵母浸粉、0.58g/L的七水硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1g/L的半胱氨酸盐酸盐和1mL的吐温80后混合均匀，添加纯净水定容，调节pH值至7.0，于115℃条件下加热20min灭菌；
(2)制备黄精原料发酵液：将步骤(1)中灭过菌的黄精原料发酵培养基冷却到40℃以下，于无菌环境下，在黄精原料发酵培养基中以1×106cfu/mL的添加量加入粪拟杆菌FNMHLBEI-K-4，在温度37℃，pH值为7.0条件下恒温恒pH厌氧发酵15-16h，此时，活菌数达到1.9×108cfu/mL；
(3)提取黄精多糖的方法同实施例2，得到黄精粗多糖粉末
(4)检测步骤(3)的黄精粗多糖在免疫的应用，具体实施方式同实施例4。
表9发酵黄精粗多糖和未发酵黄精粗多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞NO含量的影响
根据图2，可见利用粪拟杆菌FNMHLBEI-K-4的黄精原料发酵后多糖较未发酵前提取率明显降低，发酵后黄精粗多糖提取率是未发酵黄精粗多糖提取率的0.14倍。但是根据图4、表9，发酵后黄精粗多糖对RAW264.7细胞在所有浓度下对皮肤免疫的缓解效果比未发酵黄精粗多糖对皮肤免疫的缓解效果有显著提升。表明粪拟杆菌FNMHLBEI-K-4发酵黄精提取多糖在调节皮肤免疫的应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌CCFM1161（Lactobacillus rhamnosus）于2021年06月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61714，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一种发酵黄精原料及提取发酵多糖的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
（1）将权利要求1所述鼠李糖乳杆菌CCFM1161接种至以黄精为唯一碳源的培养基中进行发酵，得到发酵液；
（2）超声处理步骤（1）中的发酵液，离心并收集发酵上清液；在发酵上清液中加入三氯乙酸，孵育后离心并收集上清液；在上清液中加入乙醇混合，孵育后离心获得沉淀；
（3）用超纯水复溶步骤（2）中的沉淀后，真空冷冻干燥，获得发酵多糖粉末。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述培养基的组成为干重40~80 g/L的黄精原料，10~40 g/L的增殖因子，0.1~0.8 g/L的微量元素和0.5~1.5 mL/L的吐温，所述增殖因子选自酵母浸粉、酵母提取物、胰蛋白胨中的一种或多种；所述微量元素为硫酸镁和/或硫酸锰。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述黄精原料的制备方法为将新鲜或干燥的黄精粉碎至60目以下。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述鼠李糖乳杆菌的接种量为1.0×106~1.0×107 cfu/mL；发酵的条件为：发酵温度为32~38℃；发酵pH为5.5~7.0；发酵时间为15~24 h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述超声处理的条件为：温度25~80℃，超声功率200~500 w，时间为10~30 min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述三氯乙酸浓度为750~850g/L，以质量比2%~5%的添加量添加至发酵上清液中，孵育时间为30~60 min，温度为0~4℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙醇的浓度为90~95%，孵育时间为12~16 min，温度为0~4℃。
9.利用权利要求2~8任一所述方法制备得到的含有黄精多糖的组合物。
10.权利要求9所述含有黄精多糖的组合物在制备预防或治疗皮肤屏障修护和/或皮肤免疫调节的产品中的应用。
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