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CN113769081A - 一种稳定的高浓度抗人il-5单克隆抗体液体制剂 - Google Patents

一种稳定的高浓度抗人il-5单克隆抗体液体制剂 Download PDF

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CN113769081A
CN113769081A CN202010521390.2A CN202010521390A CN113769081A CN 113769081 A CN113769081 A CN 113769081A CN 202010521390 A CN202010521390 A CN 202010521390A CN 113769081 A CN113769081 A CN 113769081A
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human
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ser
polysorbate
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杨泗兴
杨芳
黄浩旻
朱祯平
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Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种稳定的高浓度抗人IL‑5单克隆抗体液体制剂，包括抗人IL‑5单克隆抗体、缓冲液、蛋白保护剂及表面活性剂。通过优化配方极大的改进了现有抗IL‑5单克隆抗体不能制备成高浓度液体制剂的缺陷。本发明的液体制剂药品成品在2‑8℃至少可保存36个月，25℃至少可保存6个月。因此，本发明的液体制剂能够提供抗人IL‑5单克隆抗体高浓度的制剂稳定性，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种稳定的高浓度抗人IL-5单克隆抗体液体制剂
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体地说，涉及一种稳定的高浓度抗人IL-5单 克隆抗体液体制剂。
背景技术
白细胞介素-5(IL-5)是一种由被激活的T细胞分泌的淋巴细胞活素，它对 B细胞和嗜酸性粒细胞具有生物学活性，有研究表明，抗人IL-5抗体通过与人 IL-5特异性结合，可以阻止或减小某些过敏性疾病(如哮喘病)相关的嗜酸性粒 细胞，进而达到治疗过敏性疾病目的。
目前已上市的以人IL-5为靶点的单克隆抗体药物有GSK公司开发的Nucala (美泊利单抗、mepolizumab、Bosatria)，TEVA公司开发的Cinqair(reslizumab、 Cinqaero，购自先灵公司)。Nucala为冻干制剂，给药前用1.2ml注射用水复溶做 成100mg/ml注射液皮下给药。Cinqair为液体制剂，采用10ml西林瓶灌装10ml 蛋白溶液，浓度为10mg/ml，给药方式为输液。同样是每次100mg的给药剂量， Nucala临床使用操作复杂，给药不方便；而Cinqair无法制备成高浓度蛋白溶液， 只能以低浓度通过静脉输液给药。因此，两个已上市的抗IL-5单克隆抗体药品 均存在临床给药方式上的缺陷。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种稳定的高浓度抗人IL-5 单克隆抗体液体制剂。该液体制剂由抗人IL-5单克隆抗体、缓冲液、蛋白保护 剂、表面活性剂组成，可以起到稳定蛋白的作用，使得目的蛋白在2-8℃至少保 存36个月，25℃至少保存6个月，具有优异的长期稳定性，并且临床使用时可 以直接通过皮下注射给药，相对于繁琐的冻干制剂复溶或静脉输液给药极大地拓 展了临床可及性。
为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种稳定的高浓度抗人IL-5单克隆抗体液体制 剂，所述的液体制剂包括抗人IL-5单克隆抗体、缓冲液、蛋白保护剂、表面活 性剂，其中，所述的抗人IL-5单克隆抗体的浓度为50-150mg/ml，所述的抗人IL-5 单克隆抗体包含如SEQ IDNO：9所示的重链和如SEQ ID NO：10所示的轻链。
其中，所述的抗人IL-5单克隆抗体的浓度为60-135mg/ml，优选的，所述的 抗人IL-5单克隆抗体的浓度为100mg/ml。
其中，所述的缓冲液为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，所述的缓冲液的浓度为 10-30mM，优选的，所述的缓冲液的浓度为20-30mM，更优选的，所述的缓冲 液的浓度为20mM。
其中，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖，所述的海藻糖或蔗糖的浓度为 60-90mg/ml，优选的，所述的蛋白保护剂为海藻糖，所述的海藻糖的浓度为 80mg/ml。
其中，所述的表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，所述的聚山梨酯80 或聚山梨酯20的浓度为0.2-1.0mg/ml，优选的，所述的表面活性剂为聚山梨酯 80，所述的聚山梨酯80的浓度为0.4mg/ml。
其中，所述的液体制剂pH范围为5.2-7.0，优选的，所述的液体制剂pH为 5.8。
其中，所述的液体制剂用于皮下注射给药。
本发明的第二个方面提供了所述的稳定的高浓度抗人IL-5单克隆抗体液体 制剂用于制备治疗嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病的药物中的用途。
其中，所述的嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病包括哮喘、伴随多发性血管炎 的肉芽肿病、慢性阻塞性肺病、鼻息肉、过敏性皮炎或高嗜酸性细胞增多综合征。 优选的，所述的嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病为哮喘。
有益效果：本发明通过优化配方极大的改进了现有的抗人IL-5单克隆抗体 不能制备成高浓度液体制剂的缺陷。本发明的液体制剂药品成品在2-8℃至少可 保存36个月，25℃至少可保存6个月，具有优异的长期稳定性，并且临床使用 时可以直接通过皮下注射给药，相对于繁琐的冻干制剂复溶或静脉输液给药极大 地拓展了临床可及性。因此，本发明的液体制剂能够提供抗人IL-5单克隆抗体 高浓度的制剂稳定性，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
图1为聚山梨酯80和pH DOE结果分析。
图2为缓冲液和蛋白保护剂浓度结果分析。
图3为SEC纯度推测有效期。
图4为IEC纯度推测有效期。
具体实施方式
以下实施例中使用的蛋白样品来源自WO2019/120060中公开的人源化抗人 IL-5单克隆抗体4-6-Humanized，其重链和轻链氨基酸序列如下所示。
4-6-Humanized的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHHINWVRQAPGQGLEWIGYI NPYNDYSRYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGNF WYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4-6-Humanized的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWIQQKPGKAPKTLIHRADRL IDGVPSRFSGSGSGQDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDDFPYTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以下实施例中使用的检测方法说明如下：
SEC纯度、聚体检测方法：
流动相：200mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8±0.1。经0.22μm滤膜过滤、超声脱 气后使用。色谱柱：TSK G3000SWxl，7.8×300mm 5μm，TOSOH 08541。高效 液相色谱仪：WatersAlliance e2695 2489紫外/可见光检测器，Dionex Ultimate 3000 VWD-3400(RS)Detector或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。
系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10 min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试品 浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。 色谱条件：柱温25±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 280nm；进样体积20 μL；流速0.5ml/min。
用色谱软件进行积分，峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比。系统适 用性可接受标准：6针系统适用性样品，聚体与单体的分离度均≥1.5，主峰的保 留时间RSD≤1.0％，主峰峰面积RSD≤2.0％，且主峰的不对称性均≤2.0，理论 塔板数均≥4000。供试品报告结果：样品的SEC纯度报告为单体主峰的峰面积百 分比，聚体含量为聚体峰的峰面积百分比。
IEC纯度检测方法：
流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05。经0.22μm滤膜过滤、超声 脱气后使用。流动相B：20mM磷酸盐缓冲液+200mM氯化钠，pH 6.5±0.05。经 0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。色谱柱：Propac WCX-10，4×250mm，Thermo Dionex 054993。高效液相色谱仪：Waters Alliance e2695，Dionex Ultimate 3000 系列或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。
系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心 10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试 品浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC 样品盘。色谱条件：柱温30±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 214nm；进 样体积20μL；流速1.0ml/min。流动相梯度如下：
Figure BDA0002532277670000041
Figure BDA0002532277670000051
纯度分析：用峰面积归一化法计算样品图谱上主峰、酸峰区和碱峰区的峰面 积百分比。IEC纯度结果报告为主峰的峰面积百分比。
除特别注明外，以下实施例中使用的原料组分皆市售可得。
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，但不以任何形式限制本 发明。
实施例1表面活性剂浓度和pH影响
如表1所示，本实施例采用DOE对聚山梨酯80和pH进行考察，蛋白浓度 为100mg/ml，聚山梨酯80浓度范围为0-1mg/ml，pH范围为4-7，海藻糖浓度 为80mg/ml，组氨酸浓度为20mM。考察指标为SEC纯度、IEC纯度、不溶性微 粒。考察条件为40℃高温放置5周。
表1、聚山梨酯80和pH DOE设计
Figure BDA0002532277670000052
结果如表2所示。
表2、聚山梨酯80和pH DOE试验结果
Figure BDA0002532277670000061
Figure BDA0002532277670000071
Figure BDA0002532277670000081
将表2中结果进行回归分析，得出每个配方的降解斜率，然后用JMP将斜 率进行DOE模型分析，结果如图1所示。由图1可知，pH较优范围为5.2-7.0， 聚山梨酯80浓度较优范围为0.2-1.0mg/ml。
实施例2缓冲液和蛋白保护剂浓度影响
本实施例考察缓冲液浓度和蛋白保护剂浓度对制剂影响，蛋白浓度为 100mg/ml，组氨酸缓冲液和蛋白保护剂海藻糖浓度如表3所示，聚山梨酯80浓 度为0.4mg/ml，pH为5.8。配制后放置40℃高温考察4周，考察指标为SEC纯 度、IEC纯度、不溶性微粒。
表3、缓冲液和蛋白保护剂浓度
编号 组氨酸浓度 海藻糖浓度
2-1 10mM 60mg/ml
2-2 20mM 60mg/ml
2-3 30mM 60mg/ml
2-4 20mM 90mg/ml
结果如表4所示。
表4、缓冲液和蛋白保护剂浓度结果
Figure BDA0002532277670000082
Figure BDA0002532277670000091
由表4及图2的结果可知，2-2、2-3两组结果无显著性差异，但是2-1样品 SEC纯度下降斜率大于2-2和2-3，因此组氨酸优选的含量范围为20-30mM；2-2 和2-4结果没有明显差异，考虑到注射液与人体等渗的原则，海藻糖浓度为 60-90mg/ml。
实施例3蛋白浓度影响
本实施例考察不同蛋白浓度对制剂影响。分别考察了60、100mg/ml的蛋白 溶液，组氨酸浓度为20mM，海藻糖浓度为80mg/ml，聚山梨酯80浓度为0.4mg/ml， pH为5.8。2-8℃震摇96h后检测SEC纯度和聚体含量。结果如表5所示。
表5、不同蛋白浓度对制剂影响
Figure BDA0002532277670000101
由表5的结果可知，不同蛋白浓度在液体制剂中的保护性没有发生明显变化。
实施例4液体制剂的成品加速稳定性
试制了3批蛋白成品，100mg/ml的规格，组氨酸浓度为20mM，海藻糖浓 度为80mg/ml，聚山梨酯80浓度为0.4mg/ml，pH为5.8。放置25℃进行加速稳 定性研究6个月，结果如表6所示。
表6、成品加速稳定性结果
Figure BDA0002532277670000102
由表6的结果可知，蛋白在该制剂的保护性加速6个月后SEC纯度、IEC 纯度、不溶性微粒仍能满足标准要求。
实施例5液体制剂的成品长期稳定性
试制了3批蛋白成品，100mg/ml的规格，组氨酸浓度为20mM，海藻糖浓 度为80mg/ml，聚山梨酯80浓度为0.4mg/ml，pH为5.8。放置2-8℃进行长期稳 定性研究，结果如表7所示。
表7、成品长期稳定性结果
Figure BDA0002532277670000111
由表7的结果可知，蛋白在该制剂的保护性长期稳定性过程中不溶性微粒没 有发生显著性变化，SEC纯度和IEC纯度分别如图3和图4所示。由分析可知， 按照ICH指导原则推测，SEC纯度支持制剂效期为66个月，IEC纯度支持的制 剂效期为46个月，因此本发明的液体制剂可以支持药品至少36个月的有效期。
实施例6液体制剂的原液加速稳定性
制备3批药品原液，蛋白浓度分别为127、135、127mg/ml，组氨酸浓度为 20mM，海藻糖浓度为80mg/ml，聚山梨酯80浓度为0.4mg/ml，pH为5.8。放 置2-8℃进行原液加速稳定性研究，结果如表8所示。
表8、原液加速稳定性
Figure BDA0002532277670000121
由表8的结果可知，经过6个月原液加速稳定性，原液的SEC纯度和IEC 纯度无显著性变化。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 一种稳定的高浓度抗人IL-5单克隆抗体液体制剂
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
20 25 30
His Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Ser Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
His Arg Ala Asp Arg Leu Ile Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (10)

1.一种稳定的高浓度抗人IL-5单克隆抗体液体制剂，所述的液体制剂包括抗人IL-5单克隆抗体、缓冲液、蛋白保护剂、表面活性剂，其中，所述的抗人IL-5单克隆抗体浓度为50-150mg/ml，所述的抗人IL-5单克隆抗体包含如SEQ ID NO：1所示的重链和如SEQ ID NO：2所示的轻链。
2.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述的抗人IL-5单克隆抗体的浓度为60-135mg/ml，优选的，所述的抗人IL-5单克隆抗体的浓度为100mg/ml。
3.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述的缓冲液为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，所述的缓冲液的浓度为10-30mM，优选的，所述的缓冲液的浓度为20-30mM，更优选的，所述的缓冲液的浓度为20mM。
4.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述的蛋白保护剂为海藻糖或蔗糖，所述的海藻糖或蔗糖浓度为60-90mg/ml，优选的，所述的蛋白保护剂为海藻糖，所述的海藻糖浓度为80mg/ml。
5.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述的表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，所述的聚山梨酯80或聚山梨酯20的浓度为0.2-1.0mg/ml，优选的，所述的表面活性剂为聚山梨酯80，所述的聚山梨酯80的浓度为0.4mg/ml。
6.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述的液体制剂pH范围为5.2-7.0，优选的，所述的液体制剂pH为5.8。
7.如权利要求1-6中任一项所述的液体制剂，其特征在于，所述的液体制剂用于皮下注射给药。
8.如权利要求1-7中任一项所述的液体制剂用于制备治疗嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病包括哮喘、伴随多发性血管炎的肉芽肿病、慢性阻塞性肺病、鼻息肉、过敏性皮炎或高嗜酸性细胞增多综合征。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的嗜酸性粒细胞过表达介导的疾病为哮喘。
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