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CN113754744B - 一种牛支原体蛋白sbp-2及其应用 - Google Patents

一种牛支原体蛋白sbp-2及其应用 Download PDF

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CN113754744B CN202111109156.XA CN202111109156A CN113754744B CN 113754744 B CN113754744 B CN 113754744B CN 202111109156 A CN202111109156 A CN 202111109156A CN 113754744 B CN113754744 B CN 113754744B
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Abstract

本申请提供一种牛支原体蛋白及其应用。本申请提供一种牛支原体脂膜蛋白家族中牛支原体蛋白(SBP‑2)，编码该蛋白的基因为P48基因，其核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO:1所示。所述的牛支原体蛋白SBP‑2，所述牛支原体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本申请采用原核表达技术构建pET‑28a‑P48重组质粒并导入BL21大肠杆菌，然后筛选IPTG高效表达条件，并利用镍柱亲和层析技术进行SBP‑2蛋白的纯化。结果表明SBP‑2为可溶性膜蛋白其蛋白大小为51KDa。Western blot结果表明原核表达的SBP‑2蛋白具有很好的反应原性。本申请提供一种牛支原体疫苗，该疫苗可以激起犊牛产生明显的特异性免疫反应，并达到很高的抗体水平。

Description

一种牛支原体蛋白SBP-2及其应用
技术领域
本申请涉及重组蛋白技术领域，尤其涉及一种牛支原体蛋白SBP-2及其应用。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis)是柔膜体纲、支原体目、支原体科以及支原体属中的一员，是牛重要的致病性病原体之一。牛支原体结构较简单，无细胞壁，没有细胞核，仅有核糖体，能通过0.22μm的滤膜。牛支原体的基因序列约为1080kbp，具有较低的G+C含量，约为27.8％～32.9％。牛支原体的毒力因子和致病性的机制仍然在很大程度上未知，但是牛支原体膜表面蛋白(Vsp)家族高频率改变的表达能力在牛支原体致病性中具有重要的作用。牛支原体基因组中，有多个能表达一组具有黏附功能的膜蛋白基因(至少有13个基因编码可以表达可变表面脂蛋白)。目前在牛支原体己经鉴定了多个膜蛋白(Vsp)，如VspA、VspB、VspC、VspF、VspO和VspL。这些基因通过各种机制操作，包括Vsp基因座内的DNA转座和染色体内重组，改变其表面组分的抗原特性，可以起到增强定殖、附着和逃避宿主免疫防御系统的作用，并且具有很强的免疫原性，能够诱导黏膜免疫。
牛支原体P48基因表达蛋白是一个保守蛋白，具有特异性，是牛支原体主要的免疫原性所在的膜蛋白之一。该蛋白是牛支原体感染后引起免疫调节的一个主要蛋白，与牛支原体感染的致病机理有密切关系。在试验感染或者自然感染牛支原体病原的动物体内也有发现了针对该蛋白的抗体。但国内无商品化疫苗并且国外的灭活疫苗免疫效果不明显，也没有膜蛋白疫苗可以用来预防牛支原体病原的感染。
发明内容
本申请提供了一种牛支原体蛋白SBP-2及其应用，以解决国内无商品化疫苗并且国外的灭活疫苗免疫效果不明显，也没有膜蛋白疫苗可以用来预防牛支原体病原的感染的问题。
第一方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2，编码所述牛支原体蛋白的基因为P48基因，所述牛支原体蛋白的核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO:1所示；其中，所述核苷酸是通过将牛支原体P48基因中表达色氨酸的TGA碱基优化为TGG得到。
优选的，上述的牛支原体蛋白SBP-2，所述牛支原体蛋白SBP-2的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
第二方面，本申请提供一种重组质粒，所述质粒为包含上述的牛支原体蛋白SBP-2的pET-28a-P48质粒。
第三方面，本申请提供一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含上述的重组质粒，分类命名为：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，所述大肠杆菌保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏日期为2021年8月9日，保藏号为CGMCC NO:23133。
第四方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2在制备用于预防由牛支原体引起的疾病的药物中的应用。
第五方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2在制备牛支原体疫苗中的应用。
第六方面，本申请提供一种牛支原体疫苗，所述疫苗包括上述SBP-2蛋白及免疫佐剂。
本申请提供一种牛支原体蛋白及其应用。本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2，编码该蛋白的基因为P48基因，其核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO:1所示。所述的牛支原体蛋白SBP-2，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本申请采用原核表达技术构建pET-28a-P48重组质粒并导入BL21大肠杆菌，然后筛选IPTG高效表达条件，并利用镍柱亲和层析技术进行SBP-2蛋白的纯化。结果表明SBP-2为可溶性膜蛋白其蛋白大小为51KDa。Western blot结果表明原核表达的SBP-2蛋白具有很好的反应原性。
本申请提供上述SBP-2蛋白在制备牛支原体疫苗中的应用。本申请提供一种牛支原体疫苗，所述疫苗包括上述SBP-2蛋白及免疫佐剂。本申请为了探究SBP-2重组蛋白疫苗是否对牛支原体疾病的发生起到预防的作用，制备SBP-2重组蛋白疫苗，并以牛支原体灭活疫苗为对照，然后进行犊牛免疫试验研究，并在免疫结束后第15天进行感染试验，感染28天后进行病理组织学观察。结果发现：NC组犊牛抗体水平一直维持较为稳定的阴性状态；蛋白疫苗组犊牛在蛋白疫苗注射一周后抗体水平升高呈阳性，之后维持较为稳定的阳性状态；灭活疫苗组在第1次免疫后，牛支原体抗体水平开始升高，可在第15天达到阳性，第3周达到最大值，之后抗体水平较为稳定。蛋白疫苗组在第一次免疫后的第2周IgA含量与NC组相比差异显著(P<0.05)。第一次免疫后第2周和感染后1周，IgM含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)。第一次免疫后1周和感染后1周，IgG含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)。对犊牛进行病理剖检时发现：蛋白疫苗组的肺脏出现较为轻的病理变化；PC组牛发生严重的病理变化；灭活疫苗组和NC组均未见肉眼可见病理变化。说明了SBP-2蛋白疫苗可以激起犊牛产生明显的特异性免疫反应，并达到很高的抗体水平；SBP-2蛋白疫苗激起了犊牛的体液免疫系统，进一步说明SBP-2蛋白作为牛支原体保守的表面脂蛋白，作为疫苗进行动物免疫时可产生针对牛支原体膜蛋白的抗体，并在一定程度上可减轻牛支原体病原的侵入。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的pET-28a(+)质粒图谱图；
图2为本申请实施例中pET-28a-P48质粒双酶切图；
图3为本申请实施例中0.6mmol/L和0.8mmol/L条件下的诱导表达图；
图4为本申请实施例中1.0mmol/L和1.2mmol/L条件下的诱导表达图；
图5为本申请实施例中蛋白纯化结果图；
图6为本申请实施例中Western blot结果图；
图7为本申请实施例中犊牛免疫和感染前后体温变化图；
图8为本申请实施例中特异性抗体变化图；
图9为本申请实施例中蛋白疫苗组病理剖检结果图；A胸腔积液；B肺脏实质性肉变；C正常肾脏；D正常肝脏；E肺脏淤血，实质性肉变；F正常喉头；G正常气管；
图10为本申请实施例中PC组病理剖检病变组织图；A肺脏组织黏连；B肺脏出血淤血；C肺脏组织发生实质性肉变及大小不等的灰白色干酪样或化脓性坏死灶；D肺脏组织内部出血并有化脓性和干酪样坏死灶；
图11为本申请实施例中灭活疫苗组病理剖检结果图；
图12为本申请实施例中蛋白疫苗组气管组织切片图；A气管结构正常；B透明软骨结构正常；
图13为本申请实施例中蛋白疫苗组肺脏组织切片图；A支气管上皮增生、有炎性渗出物和鼻疽结节100×；B肺气肿-肺泡代偿性扩张：肺泡扩张、肺泡壁变薄、有些肺泡已经破裂合成大囊腔100×；C支气管上皮严重增生100×；D终末支气管出血，有炎性渗出物400×；E肺气肿：肺泡扩张400×；F肺泡隔上皮细胞脱落、肺泡隔断裂400×；G肺泡塌陷、增厚400×；H实质性肉变，出血；
图14为本申请实施例中PC组肺脏图；
图15为本申请实施例中PC组肺脏图；
图16为本申请实施例中灭活疫苗组气管组织切片图；
图17为本申请实施例中灭活疫苗组肺脏组织切片图；
图18为本申请实施例中IgA、IgM、IgG含量变化趋势图。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
第一方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2，编码所述牛支原体蛋白的基因为P48基因，所述牛支原体蛋白的核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO:1所示；其中，所述核苷酸是通过将牛支原体P48基因中表达色氨酸的TGA碱基优化为TGG得到。
优选的，上述的牛支原体蛋白SBP-2，所述牛支原体蛋白SBP-2的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
第二方面，本申请提供一种重组质粒，所述质粒为包含上述的牛支原体蛋白SBP-2的pET-28a-P48质粒。
第三方面，本申请提供一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含上述的重组质粒，所述大肠杆菌保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年8月9日，保藏号为CGMCCNO:23133。
第四方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2在制备用于预防由牛支原体引起的疾病的药物中的应用。
第五方面，本申请提供一种牛支原体蛋白SBP-2在制备牛支原体疫苗中的应用。
第六方面，本申请提供一种牛支原体疫苗，所述疫苗包括上述SBP-2蛋白及免疫佐剂。
下面通过实施例介绍牛支原体蛋白SBP-2的获取以及SBP-2蛋白疫苗的免疫实验。
实施例
S1、牛支原体P48基因工程重组SBP-2蛋白的构建和表达纯化
S11、P48基因克隆质粒的构建
通过BioEdit软件进行DNA和氨基酸的序列分析，用Primer5.0软件进行引物设计。
S111、调取P48基因以及目的基因提取
合成P48蛋白基因引物序列，PCR扩增35个循环反应(其中，PCR扩增体系见表1-1)，然后吸取5μL扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳，观察反应。
表1-1 PCR扩增体系
Figure BDA0003273638300000041
Figure BDA0003273638300000051
将扩增的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳并进行目的基因的回收。
S112、酶切
利用EcolI和BamHI限制性内切酶进行PCR扩增目的基因和pET-28a(+)第192位和198位酶切位点进行质粒双酶切，如图1所示。
在离心管中配制50μL质粒酶切体系(其中，质粒酶切体系见表1-2)，于37℃、0.5h完成质粒酶切。
表1-2 质粒酶切体系
Figure BDA0003273638300000052
质粒酶切后，在离心管中配制20μL目的DNA酶切体系(其中，目的DNA酶切体系见表1-3)，37℃ 0.5h完成双酶切。
表1-3 目的DNA双酶切体系
Figure BDA0003273638300000053
S113、回收DNA片段
完成双酶切后回收Kit以及回收DNA片段，其中步骤为：
切下含有P48目的基因的凝胶，放入离心管中，然后加入S1溶胶液，水浴加热溶解(大致需要10-15分钟)，充分混匀。然后再加三分之一体积的异丙醇，混匀，水浴1分钟。
将上述产物加入核酸吸附柱中，1min，2000rpm离心，弃去离心管中的液体。
加入450μL的洗涤液至吸附柱中，静置1min后，30s，12000rpm离心。留取上面的分离柱，弃去离心管中的液体。
重复清洗。
1min，2000rpm离心，然后留取上面的分离柱放置到新的离心管中。加入30μL洗脱液，等待1-3分钟，离心收集液体(1min，12000rpm)。
离心管中的液体即为P48 DNA。PCR产物经扩增后得到一个片段大小为1400左右的产物，与P48蛋白基因碱基序列数相符。
使用乙醇沉淀法回收线性化的质粒DNA后利用OD30进行DNA含量测定，之后利用T4DNA连接酶按照载体与目的片段的相对浓度比例1:3进行重组质粒的构建。
在0.5mL离心管中配制10μL重组DNA构建体系(其中，重组DNA构建反应体系见表1-4)，然后14-16℃连接12小时，得到pET-28a-P48重组质粒。
表1-4 重组DNA构建反应体系
Figure BDA0003273638300000061
S114、连接反应
连接产物转化E.coli感受态细胞，包括以下步骤：
取连接产物5μL、感受态细胞40μL进行混匀，冰浴30min。
42℃热休克90s，迅速冰浴120s。
加入400μL LB液体培养基(含卡那霉素，Kan)，37℃振荡培养50min。
取200μL培养液涂板，37℃培养10-14hr。
S115、转化细胞以及培养
质粒DNA转化E.coli感受态细胞包括以下步骤：
取100μL感受态细胞置于冰上，待溶解后加入10μL连接产物，冰浴30min。
42℃热休克90s，冰浴120s。
加入800μL LB培养基(无抗生素)，37℃、180r/min振荡培养40-50min，复苏细胞。
将复苏菌液8000r/min常温下离心2min。
吸除上清液700μL，再将细胞吹散成细胞悬液。
取100μL细胞悬液涂布于LB平板上将平皿正置约30min至液体被吸收，再倒置平皿，37℃培养12h-16h至出现菌落。
抗性选择平板培养，将转化的菌株接种在抗性固体培养基。37℃倒置培养24小时。观察是否有菌落出现，如果出现菌落，则可以挑选单菌落进行扩增培养。
液体培养包括以下步骤：
当抗性选择平板上有菌落后，选择挑选单菌落加入到液体15mL加入抗性的液体LB培养基中。
密封，放入37℃摇床培养12h。
观察是否出现细菌生长状态，如果液体出现浑浊说明大肠杆菌开始正常生长。
S116、酶切鉴定
对于最终液体培养成功的大肠杆菌，进行小量质粒提取，并且进行相应酶切进行鉴定。
在0.5mL离心管中配制20μL酶切体系(其中，重组质粒酶切体系见表1-5)，37℃反应30min，后通过琼脂糖电泳判断酶切是否正确，以此判断培养的大肠杆菌是否含有特异性质粒。从图2可知，在液体培养基上扩增后提取的质粒中，经酶切后含有两断基因片段，最大的片段在4500bp以上与酶切的空质粒大小一致，小片段在1500bp左右与P48蛋白目的基因片段一致。其中图2中的1、2表示pET-28a-P48重组质粒双酶切后的电泳结果；3、4表示pET-28a空质粒双酶切后的电泳结果。
表1-5 重组质粒酶切体系
Figure BDA0003273638300000071
S12、基因工程重组蛋白的表达、纯化及鉴定
S121、小量表达：
转化入表达质粒的大肠杆菌，加入到2mL添加Kan的LB培养基中，放到37℃培养箱中振荡培养过夜。
随后获得的过夜培养菌中吸取200μL，加入到2mL不加抗性的LB培养基，放到37℃培养箱中振荡培养2小时左右，测定其OD600值，大约达到OD＝0.8。
加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)进行诱导，放到37℃培养箱中振荡培养4小时。
取1mL菌液，离心获得菌体。
用50μL H2O悬浮菌体，加入50μL 2×蛋白电泳上样缓冲液，然后煮沸2分钟。随后进行蛋白SDS-PAGE电泳，用来鉴定是否有蛋白表达。由图3和图4可知：加入IPTG后终浓度为0.6mmol/L，0.8mmol/L，1mmol/L，1.2mmol/L的菌液在诱导过程中1mmol/L、1.2mmol/L的菌液比0.6mmol/L、0.8mmol/L的菌液表达的蛋白含量高；1mmol/L、1.2mmol/L的菌体蛋白含量差别不大，而1mmol/L的菌液表达4h和5h的含量几乎没有差别。因此IPTG终浓度为1mmol/L，表达4h为最佳表达条件。
S122、工程菌的大量表达：
1)挑取单菌落于2mL LB培养基(含Kan抗生素)中振荡培养至OD600达0.5左右。
2)按1：1000的比例转接扩大培养。
3)培养至OD600达1.5左右，加入IPTG至0.4mM，37℃诱导4h。
4)收集菌体，4℃，8000r/min离心10min。
5)弃上清。菌体沉淀用40mL裂解液重悬。
6)冰浴，采用超声破碎仪处理或高压均质机处理破碎细胞。超声条件如下：工作时间15min；脉冲：打2s，停5s；输出功率：70％。
7)12000r/min离心10min。储存上清液和沉淀，然后进行SDS-PAGE分析。
S123、SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1)安装玻璃制胶板于致胶架上，用去离子水检验凝胶板密封情况。
2)配制5mL的10％分离胶。依次加入以下成分：
去离子水，1.9mL；30％Acr-Bis(29:1)，1.7mL；1.5mol/L Tris-HCl(pH＝8.8)1.3mL；10％SDS，0.05mL；10％过硫酸铵，0.05mL；TEMED，0.002mL。
3)轻轻混匀后将分离胶沿玻璃板边缘缓缓加入制胶槽，加至距离梳齿约1cm处，留出浓缩胶的空间。
4)用1mL微量移液枪加入1mL去离子水作为覆盖层，静置约30min左右，使凝胶完全凝聚。
5)凝胶凝聚后，倒去覆盖层中的去离子水，然后加入2mL，5％的浓缩胶。依次加入以下成分：去离子水，1.4mL；30％Acr-Bis(29:1)，0.33mL；1mol/L Tris-HCl(pH＝6.8)，0.25mL；10％SDS，0.02mL；10％过硫酸铵，0.02mL；TEMED，0.002mL。
6)轻轻混匀后将浓缩胶沿玻璃板边缘缓缓加在分离胶上面，插入1mm梳子，静置约30min左右，使凝胶完全聚合。
7)将制脚架放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液约200mL左右，使其完全浸泡凝胶，轻轻拔出梳子，并用微量移液枪轻轻冲洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺和凝胶碎片，之后用细针拨直凝胶齿，备用。
8)点样：分别取5μL上述表达的可溶性蛋白和包涵体蛋白于PCR管中，然后每管加入5μL 2×SDS加样缓冲液，在100℃沸水中加热3min后，用微量移液枪在加样孔中加入10μL样品，并在相邻泳道加入蛋白MARKER。
9)电泳：起始电压80V，40分钟，随后提高电压为120V，电泳时间1.5小时。
10)当溴酚蓝前沿到达电泳槽底部时停止电泳，然后取出含有凝胶的玻璃板。从玻璃板上取下来含有SBP-2蛋白的凝胶，并切掉浓缩胶。
11)将切割下来的分离胶放入大的培养皿中，倒入考马斯亮蓝染色，把有考马斯亮蓝的培养皿放在摇床上缓慢摇动，染色4h。
12)染色后倒出染色液，然后使用脱色液浸没凝胶进行脱色，分别间隔20min、40min、60min更换洗脱液，然后过夜脱色直至背景蓝色淡去，此时可见到清楚的蛋白条带。
S124、重组蛋白高效诱导表达
1)将含有重组质粒的BL21大肠杆菌接种于含有50μg/mL Kan的LB平板，37℃静置培养12h。
2)用无菌枪头挑取生长出来的菌落，接于2mL LB液体培养基(含有50μg/mL Kan)，37℃，220r/min振荡培养，过夜，作为种子液。
3)取1500μL种子液于50mL LB液体培养基(含有50μg/mLKan)，5个样品，振荡培养3h，(OD600≈0.8)。
4)取1.0mL细菌培养物于1.5mL离心管中，作为IPTG诱导前的样品(0h)，往剩余49mL培养物中添加(19.14μL 50mg/mL(210mmol/L))IPTG至终浓度0.6mmol/L，0.8mmol/L，1mmol/L，1.2mmol/L继续37℃，220r/min振荡培养。
5)分别在1h，2h，3h，4h，5h时，从培养液中取出1mL细菌培养物于1.5mL离心管中。
6)将0h，1h，2h，3h，4h，5h取出的培养物室温下8000r/min离心10min，弃去上清液。
7)在各沉淀物中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，200W，10s(间隔10s)，处理20次。然后10000r/min离心10min，将上清液移到一个新的1.5mL离心管中(可溶性重组蛋白)，4℃保存(-20℃保存)，备用。
S125、大量表达蛋白的镍亲和层析柱纯化
1)按照上述中的最优条件进行SBP-2蛋白的诱导表达后，将培养好的菌液倒入离心桶中，5000rpm、30min进行离心收集菌体，去上清然后每600mL的菌液用50mL溶液A(20mMTris、500mM NaCl、10mM咪唑、5％甘油，pH 8.2)将菌体重悬、混匀。
2)在冰水混合物中对菌体进行超声处理，功率为200W，超声破碎时间20min。
3)12000rpm、10min离心超声破碎后的菌体，然后分离上清，4℃保存。
4)取适量的镍柱填料(用于特异性结合含有His标签的重组蛋白)于重力柱中，待填料沉实，轻轻盖上上面的垫片，用纯水过柱10个柱床体积，随后用溶液A过柱10个柱床体积。
5)上样：将超声破碎的上清液过柱，上样100mL样品，上样时流速不宜过快。
6)再平衡：用溶液A过柱25个柱床体积。
7)洗杂：用洗杂液(pH＝7.9Tris-HCl 20mmol/L；咪唑10mmol/L；氯化钠0.5mol/L)冲洗25个柱床体积。
8)洗脱：用15mL溶液B进行洗脱，注意分管收集。加入溶液B(pH＝7.9Tris-HCl20mmol/L；咪唑500mmol/L；氯化钠0.5mol/L)后，分管收集洗脱蛋白；依次使用10倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子后，用3倍柱体积的20％乙醇平衡4℃保存。
由图5可知，通过Ni柱纯化试剂盒纯化后发现，纯化的蛋白在55kD蛋白Marker左右。
S126、Western blot
1)转移电泳
①将融合蛋白进行SDS-PAGE，整齐地切下待转移部位的凝胶，浸泡于电转缓冲液中。剪取6张同样大小的滤纸(面积较凝胶块略大)，同两张海绵一起浸泡于缓冲液中。
②取一块滤纸同样大小的PVDF膜，在甲醇溶液中浸泡10s后，浸入转移缓冲液中3min；
③电转“三明治”顺序如：正极(白色)/海绵/3层滤纸/硝酸纤维膜/GE胶/3层滤纸/海绵/负极(黑色)；
2)电转：将“三明治”夹子放入预装有电转膜缓冲液的电泳槽中，恒流75V，1h；
3)转膜后的PVDF膜用ddH2O冲洗一下，放入封闭液中温育30min，洗涤液洗3次，每次5min；
4)加入一抗(牛支原体阳性血清，用封闭液稀释至1:100)，温育1h，洗膜3次，每次5min；
5)加入1:1000稀释的二抗(HRP标记鼠抗牛IgG血清)，温育1h，洗膜3次，每次5min；
6)配制AEC显色液，室温避光平缓摇动显色，当特异性印迹条带颜色深度达到要求(大约10min)，即用ddH2O漂洗终止反应。
通过Western blot结果即图6可以看出，SBP-2蛋白可以与鼠抗SBP-2蛋白多克隆抗体发生特异性免疫印迹反应，在55KDa左右出现相应的条带。Western blot表明SBP-2蛋白具有良好的反应原性。
S13、分析
本实施例成功的利用DNA重组技术进行表达载体的构建和原核表达。在重组质粒构建过程中选用10微升体系，目的DNA和载体质粒物理的量之比为6:2时可成功的构建表达质粒，并且导入BL21表达菌株后可成功获得阳性表达菌株。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在构建的pET-28a-P48表达载体通过导入BL21大肠杆菌进行原核表达，在菌体密度OD600达0.8左右时，在1MM的IPTG诱导剂的诱导下，4h为最佳的表达时间，而且产生的SBP-2蛋白为可溶性蛋白。Western blot结果表明原核表达的SBP-2蛋白具有很好的反应原性。
S2、SBP-2蛋白免疫疫苗制备及免疫效果
S21、实验材料以及实验预处理
S211、菌株与试验动物
宁夏大学农学院保存的从犊牛肺脏分离的牛支原体Ningxia-1株；12头2月龄无支原体感染的荷斯坦公牛，购买于中宁某荷斯坦奶牛场。
主要试剂
Figure BDA0003273638300000121
S212、引物的设计与合成
参考Mycoplasma bovis HB0801基因全序列分别设计：16S rRNA通用引物和uvrC特异性引物，引物由上海生工有限责任公司合成。引物如下：
Figure BDA0003273638300000122
S22、SBP-2重组蛋白疫苗的制备和牛支原体灭活疫苗的制备
S221、重组蛋白疫苗的制备
将原核表达并纯化后的SBP-2蛋白利用D30核酸蛋白测定仪进行蛋白质含量测定，并使用ddH2O将其稀释为1.0mg/mL，-20℃保存备用。
第一次免疫使用的蛋白疫苗的制备：取7.5mL上述保存备用的蛋白浓度为1.0mg/mL蛋白于50mL离心管中，然后取等量的弗氏完全佐剂(7.5mL)加入离心管；然后浸在冰盒内超声乳化。乳化条件见表2-1。
表2-1 乳化条件
Figure BDA0003273638300000123
第二次免疫使用的蛋白疫苗的制备：取7.5mL上述保存备用的蛋白浓度为1.0mg/mL蛋白于50mL离心管中，然后取等量的弗氏不完全佐剂(7.5mL)加入离心管；然后浸在冰盒内超声乳化。乳化条件与第一次乳化条件相同。
S222、牛支原体灭活疫苗的制备
将牛支原体分离株Ningxia-1株以1：100的比例接种到牛支原体Thiaucourt’s液体培养基中，5％CO2，37℃条件下培养3d得第一代菌液，再以1:100接种到液体培养基中，5％CO2，37℃条件下培养3d得到第二代，再以1:10接种到液体培养基中，5％CO2，37℃条件下培养3d得到第三代；然后测定第三代菌液浓度(CCU/mL)并加入甲醛溶液，使菌液中甲醛终浓度为0.4％，37℃条件下灭活，2d后抽取灭活菌液接种于Thiaucourt’s固体培养基进行检活。
将灭活后并未检测到活菌的灭活菌液16000r/min离心30min，将得到的沉淀物经用生理盐水缓冲液洗涤3次，然后用生理盐水将沉淀物稀释至原来浓度。洗涤后的灭活菌液与白油佐剂进行等体积混合，100W，间隔2s，10min超声乳化。
S23、动物免疫试验和感染试验
试验前采集荷斯坦公犊牛鼻拭子进行牛支原体的分离鉴定并采集血液样本分离血清，用牛支原体抗原检测试剂盒进行牛支原体抗体检测。选取血清检测为阴性并未检测到支原体病原的2月龄公犊牛12头作为试验对象，饲养地点在宁夏银川永宁县某肉牛饲养场。
将12头阴性的公犊牛分为4组，每组3头。分别为阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)、蛋白疫苗组和灭活疫苗组。蛋白疫苗组的每头牛均间隔两周肌肉注射5mL蛋白含量为2.5mg的重组蛋白疫苗1次，共2次；灭活疫苗组的每头牛均间隔两周肌肉注射5mL 1×1010CCU/mL的Ningxia-1灭活疫苗1次，共2次；PC组在试验开始前3天连续通过肌肉注射接种5mL 1×1010CCU/mL剂量的牛支原体Ningxia-1毒株进行感染，连续感染3次。NC组在其他组免疫接种时肌肉注射5mL生理盐水。
在第2次疫苗免疫后第15天，蛋白疫苗组和灭活疫苗组均通过肌肉注射5mL 1×1010CCU/mL剂量的牛支原体Ningxia-1毒株进行感染试验，连续感染3d，NC组肌肉注射同等剂量的Thiaucourt’s液体培养基，持续观察28天。
在0～15天，每天7:00～8:00测量体温，15天以后每隔一天测一次体温，直至感染试验结束；0天(第一次免疫)前一周采集血清1次，0天后，每隔7天分别对4组试验牛采集血液1次并分离血清，直至感染结束后4周结束。感染后第28天，将PC、NC和试验组牛只进行病理剖检，并采集牛只肺脏、气管、喉头、心脏、肾脏组织固定于10％福尔马林溶液。
动物感染后开始，每周对3组试验牛采集鼻拭子1次，并用PBS进行稀释。将鼻拭子接种在Thiaucourt’s液体培养基中和固体培养基CO2培养箱5％CO2 37℃培养，并于2d后镜检观察菌落形态；利用0.22μm细菌过滤器过滤菌液，并接种于液体培养基进行培养，培养2d后提取培养物DNA并利用16S rRNA引物进行支原体鉴定和uvrC引物进行牛支原体和无乳支原体鉴定。
动物感染试28天后进行牛只病理剖检，采集牛只关节液、胸腔积液、心包液和肺脏组织。将采集的肺脏组织表面用火焰灭菌，剪取肺脏深部组织一小块，然后无菌操作条件下接种于牛支原体Thiaucourt’s液体筛选培养基中和牛支原体Thiaucourt’s固体筛选培养基。固体培养基置于5％CO2 37℃的CO2培养箱培养2天后，显微镜下观察菌落形态；液体培养基放于37℃恒温摇床培养2天后观察培养基颜色变化情况，将变黄的培养液用0.22um除菌滤膜过滤，重复培养过滤液后提取DNA进行牛支原体分子生物学鉴定。
将采集的组织浸泡于10％的福尔马林溶液，固定7天后，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察。
按照比利时牛支原体ELISA抗体检测试剂盒、Bovine IgM ELISA Kit、Bovine IgGELISA Kit和Bovine IgA ELISA Kit的说明书对采集的血清进行血清学试验，所得数据参考说明书进行阴阳性检测和含量标准曲线计算，并将数值换算为含量。
S24、结果分析
由图7可知，在试验期间，NC组体温一直维持39.10℃～39.50℃之间，在牛正常体温之内；PC组体温从第14天开始高于39.50℃，并呈升高的趋势，最高体温40.40℃，与NC组的最大体温差为1.15℃，差异显著(P<0.05)；蛋白疫苗组在免疫前体温与NC组相比无差异，但在牛支原体病原感染后1周左右犊牛体温开始升高，最后与PC组最大体温相近，与NC组相比差异显著(P<0.05)；灭活疫苗组第1次接种疫苗体温变化不明显，第2次接种疫苗后体温略有升高，最高体温39.60℃，与NC组差异不显著(P>0.05)，感染试验后最高体温39.6℃，与NC组相比差异不显著(P>0.05)。
由图8可知，蛋白疫苗组、NC组和PC组试验前特异性抗体检测均为阴性，组间差异不显著(P>0.05)；蛋白疫苗组犊牛在蛋白疫苗注射一周后抗体水平升高呈阳性，之后维持较为稳定的阳性状态；PC组在攻毒感染后一周抗体水平上升呈阳性，然后维持三周后有所降低，之后处于较稳定的阳性状态；NC组在整个试验阶段牛支原体抗体检测均为阴性且抗体水平较稳定，差异不显著(P>0.05)；NC组与蛋白疫苗组和PC组差异极显著(P<0.01)；蛋白疫苗对牛进行免疫后机体的抗体水平与阳性组的抗体水平差异不显著(P>0.05)。灭活疫苗组在接种牛支原体灭活疫苗后1周抗体水平开始升高，与0周差异不显著(P>0.05)，第2周牛支原体抗体呈阳性并持续升高，与0周差异极显著(P<0.01)，第3周达到最大值，第4周～第6周牛支原体抗体水平处于较为稳定状态；第6周牛支原体病原感染以后，牛支原体抗体水平继续升高，之后处于稳定状态。
由图9对蛋白疫苗组犊牛进行病理剖检可知：肾脏、肝脏、喉头、气管均无肉眼可见病理变化，胸腔有大量淡黄色积液，肺脏出血淤血，肺脏与胸腔黏连，明显的实质性病变。由图10可知，对PC组剖检发现：肺脏组织黏连、肺脏出血淤血、肺脏组织发生实质性肉变及大小不等的灰白色干酪样或化脓性坏死灶、肺脏组织内部出血并有化脓性和干酪样坏死灶，其他组织均无肉眼可见病理变化。由图11可知，对灭活疫苗组剖检发现：肺脏、喉头、心脏、肝脏、气管、肾脏和关节组织均无肉眼可见病变。
由图12可知，蛋白疫苗组犊牛气管组织结构正常，肺脏组织中，细支气管上皮增生、有炎性渗出物、鼻疽结节、出血、有炎性渗出物；肺气肿-肺泡代偿性扩张：肺泡扩张、肺泡壁变薄、有些肺泡已经破裂合成大囊腔；肺泡隔上皮细胞脱落、肺泡隔断裂、肺泡塌陷、增厚，肺泡实质性增生，出血。由图13-图15可知，PC组的细支气管缩小，皱襞增多，官腔内有少量脱落的上皮细胞，肺泡塌陷、肺泡隔增厚，组织增生，肺泡腔内有少量细胞脱落。由图16-图17可知，灭活疫苗组:肺脏和气管组织无明显病理组织学变化。
其中，图13，A为支气管上皮增生、有炎性渗出物和鼻疽结节100×；B为肺气肿-肺泡代偿性扩张：肺泡扩张、肺泡壁变薄、有些肺泡已经破裂合成大囊腔100×；C为支气管上皮严重增生100×；D为终末支气管出血，有炎性渗出物400×；E为肺气肿：肺泡扩张400×；F为肺泡隔上皮细胞脱落、肺泡隔断裂400×；G为肺泡塌陷、增厚400×；H为实质性肉变，出血。
其中，图14分别为PC组肺脏100×和400×，可以看出PC组肺脏：细支气管缩小，皱襞增多，官腔内有少量脱落的上皮细胞；图15分别为PC组肺脏100×和400×，可以看出PC组肺脏：肺泡塌陷，肺泡隔增厚，肺泡腔内有少量细胞脱落；图16分别为灭活疫苗组气管组织切片100×和400×；图17分别为灭活疫苗组肺脏组织切片100×和400×。
从图18中可以得知，蛋白疫苗组在第1次免疫1周后IgA含量开始上升，第2周达到最大，然后开始下降，之后维持在稳定状态；蛋白疫苗组的整体IgA含量均比NC组的IgA稍高，第一次免疫后第2周的IgA含量与NC组相比差异显著(P<0.05)，NC组一直维持较稳定状态。
从图18中可以得知，蛋白疫苗组在第1次免疫后1周IgG含量开始上升，第2周达到最大；在牛支原体病原感染后1周IgG含量又显著性升高，第一次免疫后第2周和感染后1周，IgG含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)，NC组一直维持较稳定状态。
从图18中可以得知，蛋白疫苗组在第1次免疫后第2周IgM达到最大；在牛支原体病原感染后1周IgM含量又显著性升高，第一次免疫后1周和感染后1周，IgM含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)，NC组一直维持较稳定状态。
在对感染后每周采集的灭活疫苗组、蛋白疫苗组NC组和PC组鼻拭子进行支原体的分离鉴定发现：PC组从感染后1周开始均从采集的病料中分离鉴定到了牛支原体病原；NC组整个试验周期内均没有分离鉴定到牛支原体病原；灭活疫苗组在感染后1周分离鉴定到牛支原体病原，第3周后未分离鉴定到牛支原体病原，蛋白疫苗组在感染后1周开始均能分离到牛支原体病原。
对PC组犊牛通过3次连续肌肉注射5mL 1×1010CCU/mL剂量的牛支原体Ningxia-1毒株进行感染，结果发现：PC组在临床上表现出体温升高、呼吸困难、咳嗽等临床症状；体温从第14d开始高于39.50℃，并呈升高的趋势，最高体温40.40℃，与NC组的最大体温差为1.15℃，差异显著(P<0.05)，整个试验过程中均可从采集的鼻拭子中分离到牛支原体；PC组在攻毒感染后一周抗体水平上升呈阳性，然后维持三周后有所降低，之后处于较稳定的阳性状态；病例剖检发现：肺脏组织黏连、肺脏出血淤血、肺脏组织发生实质性肉变及大小不等的灰白色干酪样或化脓性坏死灶、肺脏组织内部出血并有化脓性和干酪样坏死灶，其他组织均无肉眼可见病理变化；组织学观察结果可见细支气管缩小，皱襞增多，官腔内有少量脱落的上皮细胞，肺泡塌陷、肺泡隔增厚，组织增生，肺泡腔内有少量细胞脱落。以上结果均与牛支原体感染牛只引起的临床症状、病理组织学病变一致，因此可以得出：通过肌肉3次连续注射5mL1×1010CCU/mL剂量的牛支原体毒株可成功复制出牛支原体病例模型。
蛋白疫苗组、NC组和PC组试验前特异性抗体检测为阴性，组间差异不显著(P>0.05)，具有统计学意义，说明本试验选取的试验动物符合试验条件。蛋白疫苗组犊牛在蛋白疫苗注射一周后抗体水平升高呈阳性，之后维持较为稳定的阳性状态；PC组在攻毒感染后一周抗体水平上升呈阳性，然后维持三周后有所降低，之后处于较稳定的阳性状态；NC组在整个试验阶段牛支原体抗体检测均为阴性且抗体水平较稳定，差异不显著(P>0.05)，与蛋白疫苗组和PC组差异极显著(P<0.01)。说明SBP-2蛋白疫苗可以激起犊牛产生明显的特异性免疫反应，并达到很高的抗体水平。
蛋白疫苗组在第一次免疫后第2周的IgA含量与NC组相比差异显著(P<0.05)，NC组一直维持较稳定状态。第一次免疫后第2周和感染后1周，IgG含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)，NC组一直维持较稳定状态。蛋白疫苗组在第1次免疫后第2周达到最大；在牛支原体病原感染后1周IgM含量又显著性升高，第一次免疫后1周和感染后1周，IgM含量与NC组相比差异极显著(P<0.01)，NC组一直维持较稳定状态。说明SBP-2蛋白疫苗激起了犊牛的体液免疫系统，进一步说明SBP-2蛋白作为牛支原体保守的表面脂蛋白，制成蛋白疫苗进行动物免疫时可产生针对牛支原体膜蛋白的抗体。
对蛋白疫苗组犊牛进行病理剖检时发现：肾脏、肝脏、喉头、气管均无肉眼可见病理变化，胸腔有大量淡黄色积液，肺脏出血淤血，肺脏与胸腔黏连，明显的实质性病变。PC组剖检发现：肺脏组织黏连、肺脏出血淤血、肺脏组织发生实质性肉变及大小不等的灰白色干酪样或化脓性坏死灶、肺脏组织内部出血并有化脓性和干酪样坏死灶，其他组织均无肉眼可见病理变化；在组织学分析中，蛋白疫苗组犊牛气管组织结构正常，肺脏组织中，细支气管上皮增生、有炎性渗出物、鼻疽结节、出血、有炎性渗出物；肺气肿-肺泡代偿性扩张：肺泡扩张、肺泡壁变薄、有些肺泡已经破裂合成大囊腔；肺泡隔上皮细胞脱落、肺泡隔断裂、肺泡塌陷、增厚，肺泡实质性增生，出血与PC组组织病变相似。说明，牛支原体病原进行肌肉注射后主要引起犊牛肺脏器官发生实质性病理变化，而其他器官组织均正常；蛋白疫苗组发生的肺脏组织变化与PC组相比相对较轻，说明SBP-2蛋白在一定程度上可减轻牛支原体病原的侵染，但是不能完全阻挡病原的致病。因此SBP-2蛋白是牛支原体病原侵入机体的主要致病蛋白之一，可以作为蛋白疫苗候选蛋白之一。
通过2次5mL 1×1010CCU/mL灭活疫苗的肌肉注射发现：牛支原体灭活疫苗在第1次免疫后，牛支原体抗体水平开始升高，可在第15天达到阳性，第3周达到最大值，之后抗体水平较为稳定。第4周进行感染，抗体含量有所下降，之后保持平稳状态。感染后的灭活疫苗组犊牛体温在正常体温范围，与NC组对比差异不显著(P>0.05)，无咳嗽等呼吸道症状；病理剖检肺脏、喉头、心脏、肝脏、气管、肾脏和关节组织均无肉眼可见病理变化；组织学分析未见肺脏，气管产生组织学病变。说明本研究本试验研制的牛支原体灭活疫苗可以预防牛支原体病菌的侵害。
序列表
<110> 宁夏农林科学院动物科学研究所（宁夏草畜工程技术研究中心）
<120> 一种牛支原体蛋白SBP-2及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 1
gaattcatga aaaaaaataa attctacctg ttcctgggtg ccgccccggt cctgtcggtc 60
ccgctggtcg ctgcaagctg tggtgacaaa tactttaaag aaaccgaagt tgatggtgtc 120
aaaacggtga ccacgctgtc acatattgtc tcgcgtaaag gtctgaaact gcgcgatggt 180
ctgaccgtgg acaacgcacc gcgtgcagcc tttattacgg atgaaggttc cgttcatgac 240
gaaagcttca atcagtctgg ctgggaagcc gtccacaaaa tcagttatga actgggtctg 300
gataaagcac aagtttccgg caacaaaaat ctgcgcaaca aagtctacga accgaaaaaa 360
ggtgaactgg cgagctctta taaaaatgcc attgacagtt cctttcgtta catcgttctg 420
tgcggtttca cccacaaagc agctctgtat ggcctggaac cggaatacat taagaaaatt 480
aaagataaca acatcgtgtt catcaccgtt gatttcgaca ttcagcaaga tgcatctacg 540
ggcgaaccgg cggccaaagc ttttgtggac aaaatcggcc agggtcgtct gattccggtt 600
atcttcgata ccaaacaagc agcttatatt gcgggtcgcg cactggctga ttacttcagc 660
aaaatctaca aagacaaccc ggaaaaacgt accattggtg cattcggcgg tatcccgtgg 720
ccggcagtgt ctgattttat tgctggcacg ttccagggta ttatcgactg gaataaagaa 780
catccggaag cgaaaaccaa aagtctgaac aatacgatcg aactgaaaac cagttttacg 840
tccggtgaac cggtggcagt tgcagcaatt aacagcgtca tcaaagcaac cgcatcatat 900
ccggtggcag gctcgctgtc atcggatacg gccaaagaaa tcaaaaaact gggtgacaaa 960
aacaaattca tcatcggcgt tgatgcagac cagaaaaatg ctctgaaagg tcaccgtatt 1020
ttcacctcag tgatgaaact gatcggccag gcggtttata acgtcctggc cgatctgtac 1080
tcgcagggtg aaaatagcct gtctctgcaa ccgggctttg aaattggcaa gaaaaacggc 1140
gaagcgaaag tgttcggcta tggtgaaaat ggcgcaagca aatacgtcgg tgtggctacc 1200
agtggcctgc tggattccaa aaacgacgaa attgcaaata aagctctgga agaagcaacc 1260
aaatattacg aaagcaaaaa agcggaaatc cagaaaacgc tgtctggtca actggaagaa 1320
gcgaaaaaag ccctgggcac caaatggccg gatcaaccgg cggaccaatt cggcaaaatg 1380
attaactggc tggcaaaaga aacgcaaaaa taaggatcc 1419
<210> 2
<211> 468
<212> PRT
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 2
Met Lys Lys Asn Lys Phe Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Ala Pro Val Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Leu Val Ala Ala Ser Cys Gly Asp Lys Tyr Phe Lys Glu
20 25 30
Thr Glu Val Asp Gly Val Lys Thr Val Thr Thr Leu Ser His Ile Val
35 40 45
Ser Arg Lys Gly Leu Lys Leu Arg Asp Gly Leu Thr Val Asp Asn Ala
50 55 60
Pro Arg Ala Ala Phe Ile Thr Asp Glu Gly Ser Val His Asp Glu Ser
65 70 75 80
Phe Asn Gln Ser Gly Trp Glu Ala Val His Lys Ile Ser Tyr Glu Leu
85 90 95
Gly Leu Asp Lys Ala Gln Val Ser Gly Asn Lys Asn Leu Arg Asn Lys
100 105 110
Val Tyr Glu Pro Lys Lys Gly Glu Leu Ala Ser Ser Tyr Lys Asn Ala
115 120 125
Ile Asp Ser Ser Phe Arg Tyr Ile Val Leu Cys Gly Phe Thr His Lys
130 135 140
Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Glu Pro Glu Tyr Ile Lys Lys Ile Lys Asp
145 150 155 160
Asn Asn Ile Val Phe Ile Thr Val Asp Phe Asp Ile Gln Gln Asp Ala
165 170 175
Ser Thr Gly Glu Pro Ala Ala Lys Ala Phe Val Asp Lys Ile Gly Gln
180 185 190
Gly Arg Leu Ile Pro Val Ile Phe Asp Thr Lys Gln Ala Ala Tyr Ile
195 200 205
Ala Gly Arg Ala Leu Ala Asp Tyr Phe Ser Lys Ile Tyr Lys Asp Asn
210 215 220
Pro Glu Lys Arg Thr Ile Gly Ala Phe Gly Gly Ile Pro Trp Pro Ala
225 230 235 240
Val Ser Asp Phe Ile Ala Gly Thr Phe Gln Gly Ile Ile Asp Trp Asn
245 250 255
Lys Glu His Pro Glu Ala Lys Thr Lys Ser Leu Asn Asn Thr Ile Glu
260 265 270
Leu Lys Thr Ser Phe Thr Ser Gly Glu Pro Val Ala Val Ala Ala Ile
275 280 285
Asn Ser Val Ile Lys Ala Thr Ala Ser Tyr Pro Val Ala Gly Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Asp Thr Ala Lys Glu Ile Lys Lys Leu Gly Asp Lys Asn Lys
305 310 315 320
Phe Ile Ile Gly Val Asp Ala Asp Gln Lys Asn Ala Leu Lys Gly His
325 330 335
Arg Ile Phe Thr Ser Val Met Lys Leu Ile Gly Gln Ala Val Tyr Asn
340 345 350
Val Leu Ala Asp Leu Tyr Ser Gln Gly Glu Asn Ser Leu Ser Leu Gln
355 360 365
Pro Gly Phe Glu Ile Gly Lys Lys Asn Gly Glu Ala Lys Val Phe Gly
370 375 380
Tyr Gly Glu Asn Gly Ala Ser Lys Tyr Val Gly Val Ala Thr Ser Gly
385 390 395 400
Leu Leu Asp Ser Lys Asn Asp Glu Ile Ala Asn Lys Ala Leu Glu Glu
405 410 415
Ala Thr Lys Tyr Tyr Glu Ser Lys Lys Ala Glu Ile Gln Lys Thr Leu
420 425 430
Ser Gly Gln Leu Glu Glu Ala Lys Lys Ala Leu Gly Thr Lys Trp Pro
435 440 445
Asp Gln Pro Ala Asp Gln Phe Gly Lys Met Ile Asn Trp Leu Ala Lys
450 455 460
Glu Thr Gln Lys
465

Claims (7)

1.一种牛支原体蛋白SBP-2，其特征在于，编码所述牛支原体蛋白的基因为P48基因，所述牛支原体蛋白的核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO:1所示；其中，所述核苷酸是通过将牛支原体P48基因中表达色氨酸的TGA碱基优化为TGG得到。
2.根据权利要求1所述的牛支原体蛋白SBP-2，其特征在于，所述牛支原体蛋白SBP-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒为包含如权利要求1所述的牛支原体蛋白SBP-2的pET-28a-P48质粒。
4.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含如权利要求3所述的重组质粒，所述大肠杆菌保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年8月9日，保藏号为CGMCC NO:23133。
5.一种牛支原体蛋白SBP-2在制备用于预防由牛支原体引起的疾病的药物中的应用。
6.一种牛支原体蛋白SBP-2在制备牛支原体疫苗中的应用。
7.一种牛支原体疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述SBP-2蛋白及免疫佐剂。
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