CN113711037A

CN113711037A - 抗体效力测定

Info

Publication number: CN113711037A
Application number: CN202080029365.0A
Authority: CN
Inventors: A·D·邓克尔; J·希姆; S·X·华莱士; L·G-M·陈; C·克鲁兹; M·T·易贝
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2021-11-26
Also published as: WO2020214963A1; JP2022528804A; EP3956664A1; US20220137067A1

Abstract

本发明提供一种用于测量抗体效力的基于细胞的测定。与表面结合的抗原与所述抗体接触，所述抗体又与报告细胞接触。还设想了组合物和试剂盒。

Description

抗体效力测定

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月18日提交的美国临时申请第62/835,960号的权益，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。

以ASCII文本文件提交序列表

以下提交的以ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：146392046740SeqList.txt，记录日期：2020年4月17日，大小：1,112字节)。

技术领域

本发明提供用于分析多肽(例如，抗体或免疫粘附素)效力的方法。还设想了组合物和试剂盒。

背景技术

最佳抗体效力测定应准确、精确并且用户友好，周转时间短且适合自动化和高吞吐量缩放。有几种反映ADCP和相关作用机制的传统生物测定，例如基于PBMC的方法、基于FACS的方法和分泌细胞因子的ELISA。遗憾的是，这些测定中的许多测定产生差异很大的结果且/或耗时。本文所述的新型效力测定使用利用反映ADCP活性的报告细胞的基于细胞的方法，并且可用于检测抗体-抗原结合相互作用。

本文引用的所有参考文献(包括专利申请及公布)全部以引用的方式并入。

发明内容

在一些方面，本发明提供一种用于确定多肽的活性的方法，其中所述多肽结合靶抗原并且所述多肽包含Fc受体结合结构域，所述方法包括a)使固定化靶抗原与多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答；其中报告子的表达指示多肽的活性。

在一些方面，本发明提供一种用于定量多肽制剂的效力的方法，其中所述多肽结合靶抗原，所述方法包括a)使多个固定化靶抗原群体与不同浓度的所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，c)测量报告子的表达，和d)确定所述多肽制剂的EC₅₀并将所述多肽制剂的EC₅₀与已知效力的所述多肽的参考标准品的EC₅₀进行比较。在一些实施例中,所述方法进一步包括使用针对参考标准品的多参数逻辑拟合，基于多肽制剂的EC50计算效力。在一些实施例中，多参数逻辑拟合是3参数、4参数或5参数逻辑拟合。在一些实施例中，参考标准品的EC₅₀与多肽制剂的EC₅₀同时确定。

在上述方面的一些实施例中，报告子是荧光素酶或荧光蛋白。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，对借由Fcγ受体的活化作出应答的应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子(例如Elk1)。

在上述方面的一些实施例中，吞噬细胞是单核细胞。在一些实施例中，吞噬细胞来自细胞系。在一些实施例中，细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。在一些实施例中，Fcγ受体是FcγRI(CD64)或FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。在一些实施例中，吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。在一些实施例中，吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。在一些实施例中，吞噬细胞不表达FcγRIII。

在上述方面的一些实施例中，靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。在一些实施例中，靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)。在一些实施例中，Aβ是人Aβ。在一些实施例中，Aβ包含单体和/或寡聚Aβ。在一些实施例中，人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。在一些实施例中，多肽包含全长Fc结构域或Fc结构域的FcR结合片段。在一些实施例中，多肽特异性结合Aβ。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施例中，多肽在克雷奈珠单抗中。

在上述方面的一些实施例中，靶抗原被固定在表面上。在一些实施例中，表面是板。在一些实施例中，板是多孔板。在一些实施例中，抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近并且在其C末端或附近固定到所述表面。在一些实施例中，使用生物素-链霉亲和素系统将靶抗原固定在表面上。在一些实施例中，靶抗原与生物素结合，并且表面包含结合的链霉亲和素。在一些实施例中，靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近并且在其C末端或附近与生物素结合。

在上述方面的一些实施例中，在抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时或大于24小时中的任何一者或多者之后检测报告子。

在一些方面,本发明提供一种用于确定多肽制剂的效力的试剂盒，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域，所述试剂盒包含固定化靶抗原和吞噬细胞，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，其中所述报告子的表达指示所述多肽的效力。

在一些方面,本发明提供一种用于定量多肽制剂的效力的试剂盒，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域，所述试剂盒包含固定化靶抗原、吞噬细胞和参考标准品，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，其中所述报告子的表达指示所述多肽的效力；且其中所述参考标准品包括已知效力的所述多肽的制剂。

在试剂盒的一些实施例中，报告子是荧光素酶或荧光蛋白。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，对借由Fcγ受体的活化作出应答的应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子(例如Elk1)。

在试剂盒的一些实施例中，吞噬细胞是单核细胞。在一些实施例中，吞噬细胞来自细胞系。在一些实施例中，细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。在一些实施例中，Fcγ受体是FcγRI(CD64)或FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。在一些实施例中，吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。在一些实施例中，吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。在一些实施例中，吞噬细胞不表达FcγRIII。

在试剂盒的一些实施例中，靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。在一些实施例中，靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)。在一些实施例中，Aβ是人Aβ。在一些实施例中，Aβ包含单体和/或寡聚Aβ。在一些实施例中，人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。在一些实施例中，多肽包含全长Fc结构域或Fc结构域的FcR结合片段。在一些实施例中，多肽特异性结合Aβ。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施例中，多肽在克雷奈珠单抗中。

在试剂盒的一些实施例中，靶抗原被固定在表面上。在一些实施例中，表面是板。在一些实施例中，板是多孔板。在一些实施例中，抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近并且在其C末端或附近固定到所述表面。在一些实施例中，使用生物素-链霉亲和素系统将靶抗原固定在表面上。在一些实施例中，靶抗原与生物素结合，并且表面包含结合的链霉亲和素。在一些实施例中，靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近并且在其C末端或附近与生物素结合。在一些实施例中，使用生物素-链霉亲和素系统将靶抗原固定在表面上。在一些实施例中，靶抗原与生物素结合，并且表面包含结合的链霉亲和素。

附图说明

图1是示出CD32A表达载体的构造的图。

图2是示出NF-κB荧光素酶表达载体的构造的图。

图3示出吞噬作用报告细胞上的FcγR表达。示出CD16、CD32和CD64在亲本U-937细胞、U-937吞噬作用报告细胞和THP-1吞噬作用报告细胞上的表达。阴影直方图是未染色的细胞(包括仅用于U-937)，实线是CD16/CD32/CD64，并且虚线是同种型对照品。使用不同仪器在不同日检查U937细胞和THP-1细胞。

图4A-4C示出掺入Aβ肽的不同形式的评价。使用克雷奈珠单抗和不同形式的Aβ以及测定板针对活性筛选THP-1吞噬作用报告细胞(THP-1)。图4A示出与克雷奈珠单抗和THP-1细胞一起孵育的可溶性非生物素化Aβ。图4B示出吸附到高结合板上的非生物素化Aβ，随后与克雷奈珠单抗稀释系列，然后是细胞一起孵育。图4C示出与和生物素Aβ结合的链霉亲和素(SA)高结合板相比具有吸附的Aβ肽的高结合板。没有Aβ的SA高结合板用作阴性对照品。图4A和图4B评价了不同的克隆(“系XXX”)。图4C利用THP-1系416。

图5是效力测定的示意图。

图6示出克雷奈珠单抗的代表性标准曲线。

图7示出吞噬作用报告细胞测定中的奥瑞组单抗活性。呈现代表性标准曲线，其示出如藉由荧光素酶报告基因表达测量的，奥瑞组单抗在与CD20肽结合时活化U-937吞噬作用报告细胞的能力。

图8示出不同接种密度的THP-1的生长。基于靶标3天培养来接种细胞，并使用Incucyte Zoom来监测。数字表示接种密度×10⁵个细胞/ml。

图9示出重组与合成Aβ的THP-1克隆的剂量应答。重组Aβ的内毒素测试结果表明912EU/mg的细菌脂多糖(LPS)，而合成肽低于检测极限。

图10示出影响EC₅₀的因素。

图11示出影响斜率的因素。

图12示出影响折叠应答的因素。

图13示出影响效力(平均值和标准偏差)的因素。

具体实施方式

在一些方面，本发明提供用于确定多肽的活性的方法，其中所述多肽结合靶抗原并且所述多肽包含Fc受体结合结构域，所述方法包括a)使固定化靶抗原与所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答；其中报告子的表达指示多肽的活性。在一些方面，本发明提供用于定量多肽制剂的效力的方法，其中所述多肽结合靶抗原，所述方法包括a)使多个固定化靶抗原群体与不同浓度的所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答，c)测量报告子的表达，和d)确定所述多肽制剂的EC₅₀并将所述多肽制剂的EC₅₀与已知效力的所述多肽的参考标准的EC₅₀进行比较。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。还提供了组合物和试剂盒。

定义

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可间插有非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组分或毒素缀合。在定义内还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”具体包括抗体。

如本文所使用，“纯化的”多肽(例如抗体或免疫粘附素)意指已经提高纯度的多肽，使得其以比存在于自身天然环境中和/或在实验室条件下初始合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语并且不一定意指绝对纯度。

术语“拮抗剂”以最广泛的意义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”在最广泛的意义上使用，并且包括模拟天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子具体包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。

“结合”感兴趣抗原的多肽是以足够高的亲和力结合抗原的多肽，由此使得所述多肽可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且与其他多肽不发生显著的交叉反应。在此类实施例中，通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测得，多肽与“非靶”多肽的结合程度将小于多肽与其特定靶标多肽结合程度的约10％。

关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合相比于对照分子的结合来测量，该对照分子通常为具有类似结构但不具有结合活性的分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子(过量的无标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合受到过量无标记靶标的竞争性抑制，则表明存在特异性结合。

本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，包括TDB的双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与抗体可互换使用。

抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，全部都基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体有两条“重”链和两条“轻”链，它们进行二硫键结以形成功能性抗体。每个重链和轻链本身都包含“恒定”(C)和“可变”(V)区。V区确定抗体的抗原结合特异性，而C区在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。

抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性在可变结构域的110个氨基酸之间并非均匀分布。相反，V区由相对不变的、由15-30个氨基酸组成的框架区(FR)的区段组成，这些框架区由变化极大的较短区域隔开，这些较短的区域称为“高变区”(HVR)，其各自长9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采用β折叠结构，由三个高变区连接，这三个高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各自效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。

每个V区通常包含三个HVR，例如互补决定区(“CDR”，每个都包含一个“高变环”)和四个框架区。因此，抗体结合位点，即以实质上的亲和力结合特定所需抗原所需的最小结构单元，将典型地包括三个CDR，以及散布在其间的至少三个，优选四个框架区，以保持和呈现适当构象的CDR。经典的四链抗体具有由V_H和V_L结构域共同定义的抗原结合位点。某些抗体，诸如骆驼和鲨鱼抗体，缺乏轻链，并且仅依赖于由重链形成的结合位点。可以制备其中结合位点由重链或轻链单独形成的单一结构域工程化免疫球蛋白，而无需V_H与V_L之间的合作。

术语“可变的”是指以下事实：可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的可变结构域中均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中的三个称为高变区的区段中。可变结构域中保守性更高的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采用β折叠结构，由三个高变区连接，这三个高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各自效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。

如本文所用的术语“高变区”(HVR)是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在V_L中为约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)周围，在V_H中为约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)周围(Kabat等人.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如V_L中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，V_H中的残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。

“框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双体抗体；串联双体抗体(taDb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实例2；Zapata等人.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单一可变结构域抗体、微小抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、双-scFv、联-scFv或串联(二、三)-scFv)；和双特异性T细胞接合物(BiTE)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其是否容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab')₂片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。

“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密、非共价结合的二聚体组成。以此构型，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在V_H-V_L二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同对抗体赋予抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。

Fab片段亦含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离硫醇基的Fab'的命名。F(ab')₂抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生的。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。

来自任何脊椎动物物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明显不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分为不同的类别。存在五大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施例中，Fv多肽进一步在V_H和V_L结构域之间包括多肽连接基，使得scFv能形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见Plückthun的The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。

术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包含与同一多肽链(V_H-V_L)中的轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的连接基，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如：EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448(1993)。

术语“多特异性抗体”在最广泛的意义上使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。这种多特异性抗体包括但不限于，包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性，具有两个或更多个V_L和V_H结构域的抗体，每个V_HV_L单元结合不同表位，具有两个或更多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同表位，全长抗体，抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性二抗体、三抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶位上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。根据一个实施例，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与各自表位结合的IgG抗体。

“单结构域抗体”(sdAbs)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常是指单可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单个可变结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括来源于骆驼(lamas和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的抗体和来源于人和小鼠抗体的重组方法的抗体(Nature(1989)341:544-546；DevComp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；TrendsBiotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。

如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了在单克隆抗体的生产过程中可能产生的可能的变体之外，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除特异性以外，单克隆抗体的优势还在于它们不受其他免疫球蛋白污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人，《自然》(Nature)，352:624-628(1991)以及Marks等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到。

本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类源化”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体为包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区中的残基被来自非人类物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人类物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物，其具有所需的特异性、亲和力和功能。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰旨在进一步完善抗体性能。总体上，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的FR，除了上面提到的FR取代之外。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，该免疫球蛋白通常为人免疫球蛋白。更多详情参见Jones等人，《自然》(Nature)321:522-525(1986)；Riechmann等人，《自然》(Nature)332:323-329(1988)；以及Presta，《结构生物学新见》(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。

出于本文的目的，“完整抗体”是包含重可变结构域和轻可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，其后是多个恒定结构域。每条轻链的一端具有可变结构域(V_L)，另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

“裸抗体”是不与异源分子如细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体(如本文所定义)。

本文所用的术语“效应子功能”或“Fc介导的效应子功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合亲和力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可实施体外ADCC分析，例如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如，在动物模型(诸如在Clynes等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所公开的)中评估。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应子功能的白细胞。在一些实施例中，这些细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下分子裂解靶的能力。补体活化途径由补体系统第一组分(C1q)与一种和同源抗原复合的分子(如多肽(如抗体))结合而启动。为评估补体活化，可实施CDC测定，例如如以下文献所述：Gazzano-Santoro等人，《免疫法杂志》(J.Immunol.Methods)202:163(1996)。

术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指抗体包被的细胞被与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞或树突细胞)全部或部分内化的过程。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施例中，FcR为天然序列人FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两者具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见

《免疫学年评》(Annu.Rev.Immunol.)15:203-234(1997)。)有关FcR的综述见：Ravetch和Kine，《免疫学年评》(Annu.Rev.Immunol.)9:457-92(1991)；Capel等人，《免疫方法》(Immunomethods)4:25-34(1994)；以及de Haas等人，《实验室与临床医学杂志》(J.Lab.Clin.Med.)126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，其中包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)117:587(1976)；以及Kim等人J.Immunol.24:249(1994))。

此处的术语“Aβ(X-Y)”是指人淀粉样β蛋白包括从氨基酸X位到氨基酸Y位的氨基酸序列。X和Y均指氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ IDNO.:1)中从氨基酸X位到氨基酸Y位的氨基酸序列或其任何天然存在的变体，特别是具有至少一种选自由A2T、H6R、D7N、A21G("Flemish")、E22G("Arctic")、E22Q("Dutch")、E22K("Italian")、D23N("Iowa")、A42T和A42V组成的组的突变的氨基酸序列，其中数字是相对于Aβ肽的起始位置，包括X位和Y位或具有最多三个附加氨基酸取代的序列，这些氨基酸取代都不能阻止球粒的形成。“附加”氨基酸取代在本文中定义为自然界中没有发现的与标准序列的任何偏离。

更具体地，本文中的术语“Aβ(1-42)”是指人淀粉样β蛋白的氨基酸1位至氨基酸42位的氨基酸序列，包括1和42，特别是指氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO.:1)(对应于氨基酸1至42位)从氨基酸1位至氨基酸42位的氨基酸序列或其任何天然变体。这种变体可以是，例如，具有选自由A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒”)、E22G(“北极”)、E22Q(“荷兰”)、E22K(“意大利”)、D23N(“爱荷华”)、A42T和A42V组成的组的至少一个突变的那些，其中数字是相对于Aβ肽的起始点，包括氨基酸1位和氨基酸42，或者具有最多三个附加氨基酸取代的序列，这些氨基酸取代都不能阻止球粒的形成。同样，本文中的术语“Aβ(1-40)”是指人淀粉样蛋白的氨基酸1位至氨基酸40位的氨基酸序列，包括氨基酸1位和氨基酸40位，特别是指氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.:2)的氨基酸1位至氨基酸40位的氨基酸序列或其任何天然变体。这种变体包括例如，具有选自由A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒”)、E22G(“北极”)、E22Q(“荷兰”)、E22K(“意大利”)、和D23N(“爱荷华”)组成的组的至少一个突变的那些，其中数字是相对于Aβ肽的起始位置，包括氨基酸1位和氨基酸40，或者具有最多三个附加氨基酸取代的序列，这些氨基酸取代都不能阻止球粒的形成。

“污染物”是指与所需多肽产物不同的材料。在本发明的一些实施例中，污染物包括多肽的电荷变体。在本发明的一些实施例中，污染物包括抗体或抗体片段的电荷变体。在本发明的其他实施例中，污染物包括但不限于：宿主细胞材料，例如CHOP；浸出的蛋白质A；核酸；所需多肽的变体、片段、骨料或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，污染物可以是宿主细胞蛋白(HCP)，例如但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、真菌细胞。

如本文所用，术语“免疫粘附素”表示将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应子功能组合的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合，该所需结合特异性不同于抗体的抗原识别和结合位点结合特异性(即“异源”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的接续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以获自任何免疫球蛋白，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。

本说明书中使用的“报告分子”是指通过其化学性质提供允许检测抗体活性的分析可识别信号的分子。这类分析中最常用的报告分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

本文使用的“基本上相同”表示值或参数没有被显著的效果改变。例如，如果离子强度没有显著变化，则层析柱出口处层析流动相的离子强度与流动相的初始离子强度基本上相同。例如，在初始离子强度的10％、5％或1％之内的层析柱出口处的离子强度与初始离子强度基本上相同。

在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的变型。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“或”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。应当理解，本文描述的本发明的方面和变型包括“由方面和变型组成”和/或“基本由方面和变型组成”。

基于细胞的效力测定

本发明提供基于细胞的测定，以确定多肽制剂的活性或效力，其中所述多肽包括抗原结合结构域和Fc受体结合结构域。多肽的抗原结合结构域与固定化抗原结合，然后与包含Fc受体的吞噬细胞接触，使得当Fc受体与多肽的Fc结构域结合时，报告子被活化。然后将与报告子表达相关的报告子的活性与由已知活性或效力的多肽活化的报告子活性进行比较。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。基于细胞的测定尤其可用于检测组合物中的多肽、定量组合物中多肽的量、确定组合物中多肽的特异性和/或确定多肽组合物的效力。

报告子

报告子测定是一种分析方法，通过监测细胞中报告子表达的诱导，能够对刺激进行生物学表征。刺激导致细胞内信号通路的诱导，从而导致细胞应答，所述细胞应答通常包括基因转录的调节。在一些实例中，刺激细胞信号通路导致通过调节和募集转录因子至DNA的上游非编码区来调节基因表达，所述非编码区是引发导致蛋白质产生的RNA转录所需的。需要控制对刺激作出应答的基因转录和翻译，以引发大多数生物学应答，诸如细胞增殖、分化、存活和免疫应答。DNA的这些非编码区，也被称为应答元件，包含特定的序列，这些序列是转录因子的识别元件，这些转录因子调节基因转录的效率，从而调节由细胞对刺激作出应答而产生的蛋白质的数量和类型。在报告子测定中，使用标准分子生物学方法，对应答元件和对刺激作出应答的最小启动子进行工程设计以驱动报告基因的表达。然后将DNA转染或转导至细胞中，所述细胞含有对刺激作出特异性应答的所有机制，并且测量报告基因转录、翻译或活性的水平作为生物应答的替代测量。

在一些方面，本发明提供用于确定多肽制剂的活性的方法，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域(例如，Fcγ受体结合结构域)，所述方法包括a)使固定化靶抗原与所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对Fcγ受体的活化进行作出应答；其中报告子的表达指示多肽的活性。在一些方面，本发明提供用于定量多肽制剂的效力的方法，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域(例如，Fcγ受体结合结构域)，所述方法包括a)使多个固定化靶抗原群体与不同浓度的所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对所述Fcγ受体的活化作出应答，c)测量报告子的表达，和d)确定所述多肽制剂的EC₅₀并将所述多肽制剂的EC₅₀与已知效力的所述多肽的参考标准的EC₅₀进行比较。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。报告子可以是任何分子，可以对其进行测定以测量细胞对刺激作出应答而产生的该分子的量。例如，报告子可以是由对刺激作出应答的报告基因(例如，与Fc受体结合的多肽)编码的报告蛋白。报告分子的常用实例包括但不限于发光蛋白，如荧光素酶，其发出的光可以作为底物催化的副产物进行实验测量。荧光素酶是一类源自多种来源的发光蛋白，并且包括萤火虫荧光素酶(来自物种萤火虫)、海三色堇属海肾萤光素酶(动物海肾)、磕头虫荧光素酶(来自巴西产发光叩甲虫)、海洋桡足类高斯荧光素酶(来自海洋桡足类动物)和深海虾纳米荧光素酶(来自深海虾)。萤火虫荧光素酶催化荧光素氧化为氧化荧光素，导致发光，而其他荧光素酶(诸如海肾)通过催化腔肠素的氧化发光。使用不同的过滤系统可以读取由不同荧光素酶形式和变体发出的光的波长，这有利于复用。发光的量与细胞中表达的荧光素酶的量成比例，并且荧光素酶基因已经被用作灵敏报告子以定量地评价刺激的效力以引发生物应答。多年来，报告基因测定已被广泛用于各种目的，包括基础研究、HTS筛选和效力测定(Brogan J,et al.,2012,Radiat Res.177(4):508-513；Miraglia LJ,et al.,2011,Comb Chem High Throughput Screen.14(8):648-657；Nakajima Y,and Ohmiya Y.2010,Expert Opin Drug Discovery,5(9):835-849；Parekh BS,et al.,2012,Mabs,4(3):310-318；Svobodova K,and Cajtham L T.,2010,Appl Microbiol Biotechnol.,88(4):839-847)。

在一些实施例中，本发明提供基于细胞的测定，以确定多肽的活性和/或效力，其中多肽-抗原复合物与包含报告复合物的工程化吞噬细胞接触。在一些实施例中，报告构建体包含荧光素酶。在一些实施例中，荧光素酶是一种萤火虫荧光素酶(例如，来自物种萤火虫)、来自海肾的海肾荧光素酶(例如，来自物种动物海肾)、磕头虫荧光素酶(例如，来自物种巴西产发光叩甲虫)、海洋桡足类高斯荧光素酶(例如，来自物种海洋桡足类动物)或深海虾纳米荧光素酶(例如，来自物种深海虾)。在一些实施例中，工程化吞噬细胞中的荧光素酶的表达指示多肽或免疫粘附蛋白与吞噬细胞的结合活性。在其他方面，报告构建体编码β-葡糖醛酸酶(GUS)；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或其变体；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；β-半乳糖苷酶；β-内酰胺酶；或分泌的碱性磷酸酶(SEAP)。

在一些实施例中，提供了工程化细胞，其包含编码可操作连结至控制序列的报告分子(例如，报告蛋白，诸如荧光素酶)的核酸，所述控制序列包含对Fc结构域与细胞表面上的Fc受体的结合作出应答的启动子和/或元件。可以从本领域已知对FcR活化作出应答的任何那些选择任何启动子和/或元件序列。在一些实施例中，核酸稳定地整合到细胞基因组中。

在一些实施例中，提供了工程化细胞(例如，吞噬细胞)，其包含在可操作连结到一个或多个FcR活化应答元件的最小启动子的控制下编码报告分子的核酸。在一些实施例中，最小启动子是胸苷激酶(TK)最小启动子、来自巨细胞病毒(CMV)的最小启动子、SV40衍生的启动子或最小伸长因子1α(EF1α)启动子。在一些实施例中，最小启动子是最小TK启动子。在一些实施例中，最小启动子是最小CMV启动子。在一些实施例中，活化应答元件包括NFAT(活化T细胞的核因子)应答元件、AP-1(Fos/Jun)应答元件、NFAT/AP1应答元件、NFκB应答元件、FOXO应答元件，STAT3应答元件、STAT5应答元件或IRF应答元件。在一些实施例中，FcR活化应答元件被布置为串联重复(诸如约2、3、4、5、6、7、8或更多串联重复)。FcR活化应答元件可以定位在报告子编码序列的5’或3’处。在一些实施例中，FcR活化应答元件位于来自最小启动子的位点5'。在一些实施例中，FcR活化应答元件是NFκB应答元件。在一些实施例中，报告分子是荧光素酶，例如萤火虫或海肾荧光素酶。在一些实施例中，核酸稳定地整合到巨噬细胞基因组中。

细胞

在一些实施例中，提供了通过以下方式确定多肽制剂的活性和/或效力的方法，其中多肽包含抗原结合结构域和Fc受体结合结构域(例如，FcγR结合结构域)：使多肽-抗原复合物与细胞群体接触，所述细胞群体包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答。在一些实施例中，细胞为吞噬细胞。在一些实施例中，吞噬细胞是单核细胞。在一些实施例中，吞噬细胞来自细胞系。在一些实施例中，吞噬细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

在一些实施例中，报告细胞包含Fc受体。在一些实施例中，所述Fc受体为Fcγ受体。在一些实施例中，Fcγ受体是FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)和/或FcγRIII(CD16)。在一些实施例中，报告细胞被工程设计成表达FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)中的一种或多种。在一些实施例中，报告细胞被工程设计成过表达FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)中的一种或多种。在一些实施例中，报告细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。在一些实施例中，报告细胞不表达FcγRIII。

在一些实施例中，报告细胞包含编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答。在一些实施例中，报告子包括编码荧光素酶的多核苷酸。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，编码报告子(例如，荧光素酶)的多核苷酸与FcR活化应答调节元件(例如，FcR活化应答启动子和/或元件)可操作连结。在一些实施例中，对FcR活化作出应答的启动子和/或元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施例中，报告细胞包含编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由Fcγ受体的活化作出应答，并且其包含FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII中的一者或多者。

在一些实施例中，本发明提供了用编码可操作连结到控制序列的报告分子的FcR活化报告构建体工程设计的细胞的组合物，所述控制序列包含对FcR活化作出应答的启动子和/或元件。在一些实施例中，本发明提供了用编码可操作连结到控制序列的报告分子的FcγR活化报告构建体工程设计的细胞的组合物，所述控制序列包含对FcγR活化作出应答的启动子和/或元件。在一些实施例中，报告分子是荧光素酶，荧光蛋白(例如，GFP、aYFP等)、碱性磷酸酶或β半乳糖苷酶。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，对FcR(例如FcγR)活化作出应答的启动子和/或元件是NFAT启动子、AP-1启动子、NFκB启动子、FOXO启动子、STAT3启动子、STAT5启动子或IRF启动子。在一些实施例中，对FcR信号传导作出应答的元件包括NFκB元件。

在一些实施例中，报告细胞是吞噬细胞，其包含一种或多种Fc受体，并且还包含在通过FcR信号传导活化的启动子和/或元件的控制下编码报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞，其包含一种或多种Fc受体，并且还包含在通过FcR信号传导活化的启动子和/或元件的控制下编码报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞，其包含FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII中的一种或多种，并且还包含在通过FcR信号传导活化的启动子和/或元件的控制下编码报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞，其包含一种或多种Fc受体，并且还包含在NF-κB启动子的控制下编码荧光素酶报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞，其包含FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII中的一种或多种，并且还包含在NF-κB启动子的控制下编码荧光素酶报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是THP-1细胞，其包含FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII，并且还包含在NF-κB启动子的控制下编码荧光素酶报告子的核酸。在一些实施例中，报告细胞是U-937细胞，其包含FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII，并且还包含在NF-κB启动子的控制下编码荧光素酶报告子的核酸。

抗体活性或效力测定

在一些方面，本发明提供了多肽制剂的活性或效力的方法，其中多肽包含抗原结合结构域和Fc受体结合结构域。在一些实施例中，所述方法包括使多肽的制剂与固定化抗原接触，然后使固定化抗原-多肽复合物与包含Fc受体和编码可操作连结到启动子和/或元件的报告子的核酸的细胞群体接触，所述启动子和/或元件对Fc受体活化作出应答。报告子的表达指示多肽制剂的活性或效力。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施例中，报告子是荧光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，对单核细胞活化作出应答的启动子和/或元件是NFAT启动子、AP-1启动子或NFκB启动子。在一些实施例中，对Fc受体活化作出应答的启动子和/或元件包括来自NFAT、AP-1和NFκB中任一个或多个的Fc受体活化应答元件。在一些实施例中，报告细胞为吞噬细胞。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞。在一些实施例中，报告细胞来自细胞系。在一些实施例中，细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。在一些实施例中，靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)或CD-20。在一些实施例中，Aβ是人Aβ。在一些实施例中，Aβ包含单体和/或寡聚Aβ。在本发明的一些实施例中，单体与寡聚Aβ的比率为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10中的任一者。在一些实施例中，人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。在一些实施例中，多肽在克雷奈珠单抗中。

在本发明的一些实施例中，抗原被固定在表面上。在一些实施例中，表面是板。在一些实施例中，表面是具有孔的板。在一些实施例中，表面是具有约96、182、288、384、480、576或672个孔中的任一者的板。在一些实施例中，抗原通过粘附固定在表面上。在一些实施例中，抗原使用链霉亲和素-生物素系统固定在表面上。在一些实施例中，链霉亲和素与表面连结，且生物素与抗原连结，并且由于生物素对链霉亲和素的高亲和力，抗原随后被固定。在一些实施例中，表面是链霉亲和素包被的板(例如，市售的链霉亲和素包被的板)。在一些实施例中，表面是链霉亲和素包被的96孔板。

在一些实施例中，抗原在抗原的N末端或其附近被固定在表面上。在一些实施例中，抗原在抗原的C末端或其附近被固定在表面上。在一些实施例中，抗原在抗原的N末端或附近和抗原的C末端或附近固定在表面上，使得抗原在表面上处于相反的取向。在一些实施例中，抗原在抗原的N末端或附近和抗原的C末端或其附近固定在表面上，使得抗原在表面上形成环。在一些实施例中，链霉亲和素连结到表面，并且抗原在其N末端包含生物素，其中生物素结合链霉亲和素通过其N末端固定抗原。在一些实施例中，链霉亲和素连结到表面，并且抗原在其C末端包含生物素，其中生物素结合链霉亲和素通过其C末端固定抗原。在一些实施例中，链霉亲和素连结到表面，并且抗原在其N末端和其C末端包含生物素，使得抗原在表面上处于相反的取向.在一些实施例中，链霉亲和素连结到表面，并且抗原在其N末端和其C末端包含生物素，其中两个生物素部分通过其N末端和其C末端结合链霉亲和素以固定抗原，使得抗原在表面上形成环。

在一些实施例中，抗原与生物素缀合以形成生物素化的抗原。在一些实施例中，生物素化的抗原与链霉亲和素包被的表面接触，其中生物素化的抗原的浓度小于约以下的任何浓度：0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL、3.0μg/mL、3.5μg/mL、4.0μg/mL、4.5μg/mL、5.0μg/mL、5.5μg/mL、6.0μg/mL、6.5μg/mL、7.0μg/mL、7.5μg/mL、8.0μg/mL、8.5μg/mL、9.0μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL或50μg/mL。在一些实施例中，使生物素化的抗原与链霉亲和素包被的多孔板接触，其中向每个孔中加入约任何下列量的生物素化的抗原：10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg或大于1.0μg或其之间的任何值。

在一些实施例中，使固定化的抗原与包含约以下任何量的浓度范围的多肽的组合物接触：0.01ng/mL至约30,000ng/mL、约0.01ng/mL至约20,000ng/mL、约0.01ng/mL至约10,000ng/mL、约0.05ng/mL至约10,000ng/mL、约0.1ng/mL至约10,000ng/mL、约0.5ng/mL至约10,000ng/mL、约1ng/mL至约10,000ng/mL、约5ng/mL至约10,000ng/mL、约10ng/mL至约10,000ng/mL、约0.01ng/mL至约5000ng/mL、约0.01ng/mL至约4000ng/mL、约0.01ng/mL至约3000ng/mL、约0.01ng/mL至约2000ng/mL、约0.01ng/mL至约1000ng/mL、约0.01ng/mL至约500ng/mL、约0.01ng/mL至约100ng/mL、约0.01ng/mL至约50ng/mL、约0.01ng/mL至约10ng/mL、约0.01ng/mL至约5ng/mL、约0.1ng/mL至约1000ng/mL、约0.5ng/mL至约1000ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约1000ng/mL或约5ng/mL至约5000ng/mL。

在一些实施例中，使将固定化抗原-多肽复合物与报告细胞接触。在一些实施例中，使固定化抗原-多肽复合物与约1×10⁴、5×10⁴、7.5×10⁴、1×10⁵、1.25×10⁵、1.5×10⁵、1.75×10⁵、2×10⁵、2.25×10⁵、2.5×10⁵、2.75×10⁵、3×10⁵、3.25×10⁵、3.5×10⁵、3.75×10⁵、4×10⁵、4.25×10⁵、4.5×10⁵、4.75×10⁵、5×10⁵、5.5×10⁵、6×10⁵、6,5×10⁵、7×10⁵、7.5×10⁵、8×10⁵、8.5×10⁵、9×10⁵、9.5×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶或5×10⁶中任何量的报告细胞接触。在一些实施例中，使固定化抗原-多肽复合物与约1×10⁴和5×10⁶、5×10⁴和1×10⁶、1×10⁵和1×10⁶、1×10⁵和2×10⁵、2×10⁵和3×10⁵、3×10⁵和4×10⁵、4×10⁵和5×10⁵、5×10⁵和6×10⁵、6×10⁵和7×10⁵、7×10⁵和8×10⁵、8×10⁵和9×10⁵或9×10⁵和1×10⁶中任两个量之间的报告细胞接触。在一些实施例中，使固定化抗原-多肽复合物与报告细胞接触，其中报告细胞的浓度小于约以下量中的任一者：约1×10⁵个细胞/ml,2×10⁵个细胞/ml、3×10⁵个细胞/ml、4×10⁵个细胞/ml、5×10⁵个细胞/ml、6×10⁵个细胞/ml、7×10⁵个细胞/ml、8×10⁵个细胞/ml、9×10⁵个细胞/ml、1×10⁶个细胞/ml、2×10⁶个细胞/ml、2.5×10⁶个细胞/ml、3×10⁶个细胞/ml、4×10⁶个细胞/ml、5×10⁶个细胞/ml、6×10⁶个细胞/ml、7×10⁶个细胞/ml、7.5×10⁶个细胞/ml、8×10⁶个细胞/ml、9×10⁶个细胞/ml或1×10⁷个细胞/ml。在一些实施例中，使固定化抗原-多肽复合物与报告细胞接触，其中报告细胞的浓度为约1×10⁵个细胞/ml和1×10⁷个细胞/ml、1×10⁵个细胞/ml和1×10⁶个细胞/ml、5×10⁵个细胞/ml和5×10⁶个细胞/ml或1×10⁶个细胞/ml和1×10⁷个细胞/ml之间的任一者。

在一些实施例中，在固定化抗原-多肽复合物与报告细胞接触后超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、24小时、28小时、30小时或36小时后检测报告子。在一些实施例中，在固定化抗原-多肽复合物与报告细胞接触后约1小时和约36小时、约1小时和约24小时、约1小时和约12小时、约1小时和约8小时、约1小时和约6小时、约1小时和约4小时、约1小时和约2小时、约4小时和约24小时、约4小时和约12小时、约4小时和约8小时、约8小时和约24小时、约8小时和约12小时、约16小时和约24小时、约16小时和约20小时、或约20小时和约24小时中任两者之间的时间检测报告子。

在一些方面，本发明提供用于定量多肽制剂的效力的方法，其中所述多肽结合靶抗原，所述方法包括a)使多个固定化靶抗原群体与不同浓度的所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，c)测量报告子的表达，和d)确定所述多肽制剂的EC₅₀并将所述多肽制剂的EC₅₀与已知效力的所述多肽的参考标准品的EC₅₀进行比较。在一些实施例中，多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施例中，报告子是荧光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，启动子和/或元件对Fc受体活化(例如，Fcγ受体活化)作出应答，其中对Fc受体活化作出应答的启动子和/或元件包含NFAT、AP-1或NFκB中任何一者或多者的Fc受体活化应答元件。在一些实施例中，报告细胞为吞噬细胞。在一些实施例中，报告细胞为吞噬细胞。在一些实施例中，报告细胞是单核细胞。在一些实施例中，报告细胞来自细胞系。在一些实施例中，细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。在一些实施例中，靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)或CD-20。在一些实施例中，Aβ是人Aβ。在一些实施例中，Aβ包含单体和/或寡聚Aβ。在一些实施例中，人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。在一些实施例中，多肽在克雷奈珠单抗中。

在一些实施例中，将多肽制剂的EC₅₀与已知活性或效力的多肽制剂(例如，参考标准或参考制剂)的EC₅₀进行比较。如本文所用，EC₅₀是指多肽的浓度，其诱导基线和规定曝光时间后的最大值之间半程的应答。在一些实施例中，已知活性或效力的多肽制剂的EC₅₀通过在固定化抗原-参考多肽复合物与报告细胞接触后产生报告活性的标准曲线来测定。在一些实施例中，通过使细胞群与约0.01ng/mL至约30,000ng/mL范围内的多个浓度的参考多肽制剂接触来产生标准曲线。在一些实施例中，通过使细胞群与约0.01ng/mL至约10,000ng/mL范围内的多个浓度的参考多肽制剂接触来产生标准曲线。在一些实施例中，通过使细胞群与约0.01ng/mL至约15,000ng/mL范围内的多个浓度的参考多肽制剂接触来产生标准曲线。在一些实施例中，通过使细胞群与约0.01ng/mL至约5,000ng/mL范围内的多个浓度的参考多肽制剂接触来产生标准曲线。在一些实施例中，所述参考多肽制剂的多种浓度包括约0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL或500μg/mL中的任一者。在一些实施例中，所述参考多肽制剂的多种浓度包括约10μg/mL、40μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL、1600μg/mL、4000μg/mL或10000μg/mL中的任一者。在一些实施例中，参考多肽制剂的多个浓度是约三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或超过十五个浓度。

在一些实施例中，在细胞与组合物接触后超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、26小时、28小时、30小时或36小时后检测报告子。在一些实施例中，在细胞与组合物接触后约1小时和约24小时、约1小时和约12小时、约1小时和约8小时、约1小时和约6小时、约1小时和约4小时、约1小时和约2小时、约4小时和约24小时、约4小时和约12小时、约4小时和约8小时、约8小时和约24小时、约8小时和约12小时、约16小时和约24小时、约16小时和约20小时、或约20小时和约24小时中任两个之间的时间检测报告子。

在本发明的一些实施例中,所述方法进一步包括使用针对参考标准品的多参数逻辑拟合，基于多肽制剂的EC₅₀计算效力。在一些实施例中，多参数逻辑拟合是3参数、4参数或5参数逻辑拟合。这种多参数拟合的方法是我们本领域已知的。

在一些实施例中，多肽制剂的效力基于多肽制剂的EC₅₀，使用如下4参数逻辑拟合：

使用以每个单独孔的相对光单位(RLU)测量的发光值、每个标准品(ST)和测试制品(对照品和样品；TA)的平均孔值计算浓度，其中测试重复孔。

通过绘制y轴(线性标度)上的每种浓度与x轴(对数标度)上的浓度的平均孔值，产生标准品、对照品和样品的剂量应答曲线。

4参数逻辑曲线拟合程序用于产生ST和每个TA的单独曲线。4参数逻辑曲线拟合方程是：

其中：

x＝ST或TA的浓度

y＝平均孔值应答(RLU)

A＝零剂量应答(下渐近线＝LA)：

B＝斜率

C＝EC₅₀(半最大有效浓度)

D＝最大剂量应答(上渐近线＝UA)

计算每个曲线的确定系数(R²)。

计算标准品、产物对照品和样品曲线的折叠应答。

折叠应答＝UA÷LA

斜率比计算如下：

上渐近线百分比差异计算如下：

下渐近线百分比差异计算如下：

使用4参数并行曲线分析来计算测试制品的相对效力。为ST和每个TA产生约束的4-P平行曲线，具有常见的参数集：斜率(参数B)、上渐近线(参数D)和下渐近线(参数A)。标准品(ST)和测试制品(TA)所得到的曲线方程是：

其中：

X＝抗体浓度

yST＝标准RLU

yTA＝测试制品RLU

A＝共同下渐近线

B＝共同斜率

CST＝标准EC₅₀

D＝共同上渐近线

ρ＝样品相对效力(相对效力是ST的EC₅₀与TA的EC₅₀之比)

根据方程计算测试制品的效力：

效力＝ρ*参考标准品的活性

试剂盒

在本发明的一些方面，提供了用于确定多肽制剂的活性或效力的测定的试剂盒或制品，其包括容器，所述容器容纳包含工程化细胞的组合物，所述工程化细胞包含编码与如本文所述对Fc受体活化作出应答的的启动子和/或元件可操作连结的报告子的核酸，并且任选地提供了其使用说明。在一些实施例中，所述试剂盒还包括装有参考多肽制剂测定标准品(已知活性或效力的多肽制剂)的容器，和/或装有多肽制剂参考标准品的容器。在一些实施例中，试剂盒还包括包含固定化抗原的容器或表面。在一些实施例中，报告子是荧光素酶、荧光蛋白、碱性磷酸酶、β内酰胺酶或β半乳糖苷酶。在一些实施例中，荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。在一些实施例中，对Fc受体活化作出应答的启动子和/或元件包括来自NFAT、AP-1、NFκB、FOXO、STAT3、STAT5和IRF中任一者或多者的Fc受体活化应答元件。在一些实施例中，报告细胞为吞噬细胞。在一些实施例中，吞噬细胞是单核细胞。在一些实施例中，吞噬细胞来自细胞系。在一些实施例中，吞噬细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品可以进一步包括从商业和用户角度出发期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、培养器皿、用于检测报告分子的试剂和带有使用说明的包装插页。

在本发明的一些方面，提供了一种试剂盒或制品，其包括容器，所述容器容纳包含与生物素缀合的抗原的组合物，并且任选地提供其使用说明。在一些实施例中，试剂盒进一步提供参考多肽测定标准品(已知活性或效力的多肽制剂)和/或抗原结合对照品。容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品可以进一步包括从商业和用户角度出发期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、培养器皿、用于检测报告分子的试剂和带有使用说明的包装插页。

多肽

使用本文所述的方法分析的多肽通常使用重组技术来生产。用于生产重组蛋白的方法描述在例如美国专利号5,534,615和4,816,567中，所述美国专利通过引用具体地并入本文。在一些实施例中，感兴趣的蛋白在CHO细胞中产生(参见，例如WO 94/11026)。在一些实施例中，感兴趣的多肽在大肠杆菌细胞中产生。参见，例如，美国专利号5,648,237；美国专利号5,789,199，和美国专利号5,840,523，其描述了翻译起始区(TIR)和用于优化表达和分泌的信号序列。另请参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,N.J.,2003)，第245--254页，其描述多肽片段在大肠杆菌中的表达。当使用重组技术时，多肽可以在细胞内在周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。

多肽可以从培养基或从宿主细胞裂解物中回收。在多肽的表达中所采用的细胞可通过各种物理或化学手段，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂被破坏。如果多肽在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992)中描述了分离分泌到大肠杆菌周质间隙中的多肽的方法。简而言之，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。可以通过离心移除细胞碎片。在多肽被分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购的多肽浓缩过滤器，例如

或Millipore

超滤单元，浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可以包含在前述任何步骤中以抑制蛋白水解作用并且抗生素可以包含在内以防止外来污染物的生长。

在一些实施例中，在通过本发明的方法分析之前，包含多肽和一种或多种污染物的组合物中的多肽已被纯化或部分纯化。例如，所述方法的多肽在来自亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、混合模式层析和疏水相互作用层析的洗脱液中。在一些实施例中，所述多肽是来自蛋白质A层析的洗脱液。

可通过本发明的方法分析的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、酶、激素、融合蛋白、含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。

(A)抗体

在本文所述任何方法的一些实施例中，用于通过本文所述方法分析多肽和包含多肽的制剂的任何方法的多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施例中，本发明的多肽的抗原靶标是A-β或CD20。

其它示例性抗体包括选自以下但不限于以下的那些：抗雌激素受体抗体、抗孕酮受体抗体、抗p53抗体、抗HER-2/neu抗体、抗EGFR抗体、抗组织蛋白酶D抗体、抗Bcl-2抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖蛋白抗体、抗CEA抗体、抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗ras癌蛋白抗体、抗Lewis X抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD10抗体、抗CD11a抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD39抗体、抗CD100抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD106抗体、抗泛素抗体、抗CD71抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗人乳头瘤病毒(HPV)蛋白抗体、抗κ轻链抗体、抗λ轻链抗体、抗黑素小体抗体、抗前列腺特异性抗原抗体、抗S-100抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗TebB2抗体、抗STEAP抗体、和抗Tn抗原抗体。

(i)单克隆抗体：

在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体从基本上同质的抗体群体获得，即，除了在单克隆抗体的生产过程中产生的可能的变体之外，包含所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，这些变体通常以少量存在。因此，修饰语“单克隆的”表明抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。

例如,单克隆抗体可使用首先由Kohler等人，Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可借由重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制得。

在杂交瘤方法中，如本文所述对小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)进行免疫以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将与多肽特异性结合以用于免疫。可替代地，可以体外免疫淋巴细胞。接着使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)融合淋巴细胞与瘤细胞以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。

将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或生存的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤及胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。

在一些实施例中，骨髓瘤细胞是有效融合的那些，支持选定抗体产生细胞稳定高水平地产生抗体，并对诸如HAT培养基等培养基敏感。其中，在一些实施例中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，例如源自可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和源自可从American Type CultureCollection,Rockville,Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

关于针对抗原的单克隆抗体的产生而分析其中生长杂交瘤细胞的培养基。在一些实施例中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，便可通过有限稀释法对该克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice pp.59-103(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为动物的腹水瘤在体内生长。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，诸如，例如，多肽A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，适当地将亚克隆物分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。

编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离并测序。在一些实施例中，这些杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染至不另外产生免疫球蛋白多肽的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在编码抗体的DNA的细菌中的重组表达的综述论文包括Skerra等人.,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

在一个进一步的实施例中，抗体或抗体片段可自使用McCafferty等人，Nature348:552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类抗体及人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于构建极大噬菌体文库(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))的策略。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。

DNA也可以被修饰，例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或者通过共价联接至免疫球蛋白编码序列的全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。

典型地，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，该抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。

在本文所述的任何方法的一些实施例中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施例中，抗体是IgG单克隆抗体。

(ii)人源化抗体

在一些实施例中，抗体为人源化抗体。人源化非人抗体的方法在本领域中已有描述。在一些实施例中，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和其同事的方法进行(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人类可变结构域已被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

用于制备人源化抗体的人类可变结构域的轻链和重链的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后将最接近啮齿动物的人类序列作为人源化抗体的人类框架区(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一方法使用来自轻链或重链可变区特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.AcadSci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))。

进一步重要的是将抗体人源化，同时保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物特性。为了实现该目的，在所述方法的一些实施例，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是常规可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。提供计算机程序，其说明并显示了选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和导入序列中选择并结合FR残基，从而获得所需的抗体特性，诸如对靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最大程度地参与影响抗原结合。

(iii)人抗体

在一些实施例中，抗体为人抗体。作为人源化的替代方法，可产生人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的完整谱。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。人类种系免疫球蛋白基因阵列在这种种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击后产生人类抗体。参见,例如,Jakobovits等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等人.,Year in Immuno.7:33(1993)；以及美国专利号5591669；5,589,369；和5,545,807。

替代性地，噬菌体展示技术(McCafferty等人.,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因全集生产人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳多肽基因中，并在噬菌体颗粒表面上显示为功能性抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体功能特性的选择也导致选择编码表现出这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模仿了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；其有关综述参见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Current Opinion in StructuralBiology 3:564-571(1993)。几种来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾的V基因小随机组合文库中分离出多种抗

唑酮抗体。基本上按照Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734(1993)所述的技术，可以构建来自未免疫的人供体的V基因文库，并可分离针对不同抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。还参见例如美国专利号5,565,332和5,573,905。

人抗体也可通过体外活化的B细胞产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。

(iv)抗体片段

在一些实施例中，抗体为抗体片段。在一些实施例中，抗体是包含Fc受体结合结构域的抗体片段。已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而获得(参见，例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science 229:81(1985))。但是，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。例如，可以从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。

在一些实施例中，提供本文所述的抗体的片段。在一些实施例中，所述抗体片段是抗原结合片段。在一些实施例中，抗体片段是包含Fc受体结合结构域的抗原结合片段。在一些实施例中，抗体片段是包含Fcγ受体结合结构域的抗原结合片段。

(v)双特异性抗体

在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合两个不同表位。替代性地，双特异性抗体结合臂可与结合白细胞上的触发分子的臂结合，所述触发分子例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，从而将细胞防御机制集中于细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')₂双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机多样性，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤完成的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物产率低。在WO93/08829和Traunecker等人.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的过程。

根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在一些实施例中，融合使用免疫球蛋白重链恒定结构域，包含铰链的至少一部分、CH2和CH3区。在一些实施例中，包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当在构建中使用的三个多肽链的不相等比例提供最佳产量时，这在实施例中提供了调节三个多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等的比率表达导致高产量或当比率没有特别意义时，有可能在一个表达载体中插入两条或全部三条多肽链的编码序列。

在该方法的一些实施例中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一臂中具有杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已经发现，这种不对称结构促进了所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种简便的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。对于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人，Methods in Enzymology，121:210(1986)。

根据美国专利号5,731,168中描述的另一种方法，可以对一对抗体分子之间的界面进行工程化以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。在一些实施例中，界面包含抗体恒定结构域的C_H3结构域的至少一部分。在该方法中，用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。具有与大侧链相同或相似大小的补偿性“腔”是通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面上创建。这提供了一种机制，可以提高异源二聚体而不是其他不需要的最终产物(诸如同二聚体)的产量。

双特异性抗体包括交联抗体或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已经提出了这样的抗体以将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 0308936)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂是本领域众所周知的，并在美国专利号4,676,980以及许多交联技术中描述。

从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229:81(1985)描述了一种程序，其中完整的抗体被蛋白水解地切割以产生F(ab')₂片段。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将生成的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物之一转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作选择性固定酶的试剂。

还已经描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos蛋白和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的Fab'部分。抗体同源二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。该方法也可以用于抗体同源二聚体的生产。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过连接基连接至轻链可变结构域(V_H)的重链可变结构域(V_L)，该连接基太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一片段的互补的V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。

考虑了具有两个以上价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)。

(v)多价抗体

在一些实施例中，抗体为多价抗体。通过表达抗体结合的抗原的细胞，多价抗体可以比二价抗体更快地内化(和/或分解代谢)。本文提供的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不是IgM类的抗体)(例如，四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包括Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基末端的抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含三至约八个，但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(和优选两个多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一个多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可以包括：VH-CH1-柔性连接基-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两个(和优选四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地，还包含CL结构域。

在一些实施例中，抗体为多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于，包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性，具有两个或更多个V_L和V_H结构域的抗体，每个V_HV_L单元结合不同表位，具有两个或更多个一单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同表位，全长抗体，抗体片段诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双抗体、三体抗体、三功能抗体、共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施例中，抗体具有多表位特异性；例如特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。在一些实施例中，抗体是单特异性的；例如只结合一个表位的抗体。根据一个实施例，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与各自表位结合的IgG抗体。

(vi)其他抗体修饰

可能期望在效应子功能方面修饰本文提供的抗体，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区引入一个或多个氨基酸取代来实现。替代性地或另外地，半胱氨酸残基可以在Fc区中引入，从而允许在该区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体，如Wolff等人,CancerResearch 53:2560-2565(1993)中所述。替代性地，可对抗体进行工程设计，使其具有双Fc区，从而可具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人,Anti-CancerDrug Design 3:219-230(1989)。

为了增加抗体的血清半衰期，可以如US 2006/0067930中所述在抗体中进行氨基酸改变，该专利通过引用全文并入本文。

(B)多肽变体和修饰

本文所述的多肽(包括抗体)的氨基酸序列修饰可用于纯化本文所述的多肽(例如抗体)的方法中。

(i)变体多肽

“多肽变体”是指如本文所定义与多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、多肽(具有或不具有信号肽)的胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性的多肽，优选活性多肽。此类多肽变体包括例如多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。通常，TAT多肽变体与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列，多肽(有或没有信号肽)的胞外结构域将具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者的氨基酸序列同一性。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守性氨基酸取代，或与天然多肽序列相比，包含不超过约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个中任一个保守性氨基酸取代。

例如，与全长天然多肽相比，变体多肽可能在N末端或C末端被截断，或者可能缺少内部残基。某些变体多肽可能缺少对所需生物活性不是必需的氨基酸残基。这些具有截断、缺失和插入的变体多肽可以通过许多常规技术中的任何一种来制备。所需的变体多肽可以化学合成。另一种合适的技术包括通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增编码所需变体多肽的核酸片段。在PCR中的5’和3’引物处使用定义核酸片段的所需末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共用至少一种生物和/或免疫活性。

氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与增加抗体的血清半衰期的酶或多肽的抗体的N末端或C末端的融合。

例如，可能期望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物特性。多肽的氨基酸序列变体是通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成而制备的。此类修饰包括例如多肽氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特性。氨基酸变化还可以改变多肽(例如抗体)的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。

通过将多肽序列与同源的已知多肽分子的序列进行比较，并将高同源性区中氨基酸序列变化的数量降至最低，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指南。

可用于鉴定多肽(例如抗体)的某些残基或区域(它们是诱变的优选位置)的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)所述。此处，鉴定残基或一组靶标残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电氨基酸(最优选为丙氨酸或多丙氨酸)替换以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在取代位点或针对取代位点引入进一步的或其他变体，对那些对取代表现出功能敏感性的氨基酸位置进行精制。因此，虽然预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点，但是不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点的突变的表现，在靶标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并且筛选表达的抗体变体的所需活性。

另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至一个氨基酸残基被不同的残基替换。替代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。保守型取代显示在下表1的“示例性取代”标题下。如果此类取代导致生物活性的变化，则可以引入在表1中命名为“取代”或者如以下参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并筛选产物。

表1.

多肽的生物学特性的实质性修饰是通过以下方式完成的：选择对维持(a)该取代区域中的多肽骨架的结构，例如作为片状或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的影响显著不同的取代。氨基酸可根据其侧链特性的相似性进行分组(A.L.Lehninger,Biochemistry second ed.,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)中)：

(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

替代性地，天然存在的残基可基于常见的侧链特性分为以下几类：

(1)疏水性；正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。

通常还可以用丝氨酸取代不参与维持抗体的适当构型的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可将一个或多个半胱氨酸键添加至多肽以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。

一种特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。产生这种取代变体的方便方式涉及使用噬菌体噬菌体展示进行亲和成熟。简言之，几个高变区位点(例如6-7个位点)发生突变，以在每个位点产生所有可能的氨基取代。如此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒中展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。替代性地或另外地，可能有益于分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与靶标之间的接触点。根据本文阐述的技术，此类接触残基和邻近残基是用于取代的候选物。一旦产生这种变体，就如本文所述对变体组进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。

另一种类型的多肽氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可以在多肽在宿主细胞或宿主生物体中表达期间自然发生，或者可以是由人类干预引起的故意修饰。改变是指使多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或添加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常是N-连结或O-连结的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列以使它含有上述三肽序列中的一者或多者(对于N-连结的糖基化位点)，会方便地向多肽添加糖基化位点。这种改变也可以通过在原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(对于O-连结的糖基化位点)。

除去多肽上存在的碳水化合物部分可以通过化学或酶法或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。

其他修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化，N末端胺的乙酰化以及任何C末端羧基的酰胺化。

(ii)嵌合多肽

本文所述的多肽可以以形成嵌合分子的方式进行修饰，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施例中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合体，所述标签多肽提供抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常置于多肽的氨基或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体来检测这种表位标记形式的多肽的存在。此外，表位标签的提供使得多肽能够通过使用抗标签抗体或与表位标签结合的另一种类型的亲和基质进行的亲和纯化而容易地纯化。

在替代实施例中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合。嵌合分子的二价形式被称为“免疫粘附素”。

Ig融合优选包括在Ig分子中至少一个可变区的位置取代可溶性(跨膜结构域缺失或失活)形式的多肽。在一个特别优选的实施例中，免疫球蛋白融合体包括IgG1分子的铰链区CH₂和CH₃，或铰链区CH₁、CH₂和CH₃。

(iii)多肽缀合物

用于多肽制剂的多肽可以与细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)缀合。

可以使用可用于产生这种缀合物的化学治疗剂。此外，可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。多种放射性核素可用于产生放射性缀合多肽。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备多肽和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至多肽。

本文还考虑了多肽与一种或多种小分子毒素(诸如卡奇霉素、美登木素类、trichothene和CC1065)以及具有毒素活性的这些毒素衍生物的缀合物。

美登木素类是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素I首先从东非灌木Maytenus serrata分离。随后，发现某些微生物也产生美登木素类，诸如美登醇和C-3美登醇酯。还考虑了合成的美登醇及其衍生物和类似物。本领域中已知许多用于制备多肽-美登木素缀合物的连结基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开的那些。连结基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如上述专利中所公开的，二硫化物和硫醚基团是优选的。

连接基可以在不同的位置与美登木素分子连接，这取决于连结的类型。例如，可以使用常规的偶联技术通过与羟基基团反应形成酯键。反应可以在具有羟基的C-3位、经羟甲基修饰的C-14位、经羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位进行。在一个优选的实施例中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成连结。

感兴趣的另一个缀合物包含与一种或多种卡奇霉素分子缀合的多肽。卡奇霉素抗生素家族能够在亚微微摩尔浓度下产生双链DNA断裂。关于卡奇霉素家族的缀合物的制备，参见，例如，美国专利号5,712,374。可以使用的卡奇霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ₁ ^I。抗体可以缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，其是抗叶酸剂。卡奇霉素和QFA都具有细胞内作用位点，且不容易穿过质膜。因此，通过多肽(例如，抗体)介导的内化作用细胞摄入这些药剂大大提高了它们的细胞毒性作用。

可以与本文所述的多肽缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星、长春新碱和5-氟尿嘧啶(统称为LL-E33288复合物的药剂家族)以及埃斯培拉霉素。

在一些实施例中，多肽可以是多肽与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间的缀合物。

在又一个实施例中，多肽(例如抗体)可与“受体”(例如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将多肽受体缀合物施用于患者，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如亲和素)。

在一些实施例中，多肽可以与前药活化酶缀合，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂)转化为活性抗癌药物。免疫缀合物的酶组分包括能够以这种方式作用在前药上的任何酶，以便将其转化为其更活跃的细胞毒性形式。

可用的酶包括但不限于碱性磷酸酶，可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶,可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷氏蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰基羧肽酶，可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；和青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可用于将在其胺氮处衍生化成具有苯氧基乙酰基或苯基乙酰基的药物分别转化为游离药物。替代性地，具有酶活性的抗体，在本领域中也称为“抗体酶”，可用于将前药转化为游离活性药物。

(iv)其他

多肽的另一类共价修饰包括将多肽连结到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。多肽还可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,Gennaro,A.R.,编辑,(1990)中。

获得用于制剂和方法的多肽

本文所述的分析方法中使用的多肽可以使用本领域熟知的方法(包括重组方法)获得。以下部分提供有关这些方法的指导。

(A)多核苷酸

本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。

编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于由被认为具有多肽mRNA并以可检测水平表达该多肽的组织制备的cDNA文库。因此，可以方便地从由人组织制备的cDNA文库中获得编码多肽的多核苷酸。多肽编码基因也可以从基因组文库或通过已知的合成程序(例如，自动核酸合成)获得。

例如，多核苷酸可以编码整个免疫球蛋白分子链，例如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(V_H)，还包括重链恒定区(C_H)，所述重链恒定区通常包括三个恒定结构域：C_H1、C_H2和C_H3；以及“铰链”区。在一些情况下，希望存在恒定区。在一些实施例中，多核苷酸编码TDB的一种或多种免疫球蛋白分子链。

其他可以由多核苷酸编码的多肽包括抗原结合抗体片段，例如单结构域抗体(“dAbs”)、Fv、scFv、Fab’和F(ab')₂以及“微小抗体”。微小抗体是(通常)已切除C_H1和C_K或C_L结构域的二价抗体片段。由于微小抗体比平常抗体小，它们在临床/诊断使用中应实现更好的组织穿透，但作为二价体，它们应保持比单价抗体片段(诸如dAb)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，否则本文所用的术语“抗体”不仅包括整个抗体分子，还包括上述类型的抗原结合抗体片段。优选地存在于编码的多肽中的每个框架区将包含相对于相应的人受体框架的至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体框架区，框架区总共包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。

示例性实施例

1.一种用于确定多肽的活性的方法，其中所述多肽结合靶抗原并且所述多肽包含Fc受体结合结构域，所述方法包括

a)使固定化靶抗原与多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，

b)使所述抗原-多肽复合物与吞噬细胞接触，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码可操作连结到应答元件的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答；

其中所述报告子的表达指示所述多肽的活性。

2.一种用于定量多肽制剂的效力的方法，其中所述多肽结合靶抗原，所述方法包括

a)将多个固定化靶抗原群体与不同浓度的所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，

c)测量报告子的表达，以及

d)确定所述多肽制剂的EC₅₀，并将所述多肽制剂的所述EC₅₀与已知效力的所述多肽的参考标准品的EC₅₀进行比较。

3.根据实施例2所述的方法，其进一步包括使用针对所述参考标准品的多参数逻辑拟合，基于所述多肽制剂的所述EC₅₀计算所述效力。

4.根据实施例3所述的方法，其中所述多参数逻辑拟合是3参数、4参数或5参数逻辑拟合。

5.根据实施例2-4中任一项所述的方法，其中所述参考标准品的所述EC50与所述多肽制剂的所述EC₅₀同时确定。

6.根据实施例1-5中任一项所述的方法，其中所述报告子是荧光素酶或荧光蛋白。

7.根据实施例6所述的方法，其中所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

8.根据实施例1-7中任一项所述的方法，其中对借由所述Fcγ受体的活化作出应答的所述应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子(例如Elk1)。

9.根据实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞是单核细胞。

10.根据实施例1-9中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞来自细胞系。

11.根据实施例10所述的方法，其中所述细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

12.根据实施例1-11中任一项所述的方法，其中所述Fcγ受体是FcγRI(CD64)或FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。

13.根据实施例1-12中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。

14.根据实施例13所述的方法，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。

15.根据实施例1-14中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞不表达FcγRIII。

16.根据实施例1-15中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。

17.根据实施例16所述的方法，其中所述靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)。

18.根据实施例17所述的方法，其中所述Aβ是人Aβ。

19.根据实施例17或18所述的方法，其中所述Aβ包括单体和/或寡聚Aβ。

20.根据实施例17所述的方法，其中所述人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。

21.根据实施例1-20中任一项所述的方法，其中所述多肽包含全长Fc结构域、或Fc结构域的FcR结合片段。

22.根据实施例1-21中任一项所述的方法，其中所述多肽特异性结合Aβ。

23.根据实施例1-22中任一项所述的方法，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素。

24.根据实施例22或23所述的方法，其中所述多肽在克雷奈珠单抗中。

25.根据实施例1-24中任一项所述的方法，其中所述靶抗原固定在表面上。

26.根据实施例25所述的方法，其中所述表面是板。

27.根据实施例26所述的方法，其中所述板是多孔板。

28.根据实施例25-27中任一项所述的方法，其中所述抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近固定到所述表面。

29.根据实施例25-28中任一项所述的方法，其中使用生物素-链霉亲和素系统将所述靶抗原固定在所述表面上。

30.根据实施例29所述的方法，其中所述靶抗原与生物素结合，并且所述表面包含结合的链霉亲和素。

31.根据实施例29或30所述的方法，其中所述靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近与生物素结合。

32.根据实施例1-31中任一项所述的方法，其中在所述抗原-多肽复合物与所述吞噬细胞接触后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时或大于24小时中的任一者或多者之后检测所述报告子。

33.一种用于确定多肽制剂的效力的试剂盒，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域，所述试剂盒包含固定化靶抗原和吞噬细胞，其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码与应答元件可操作连结的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，

其中所述报告子的表达指示所述多肽的效力。

34.一种用于定量多肽制剂的效力的试剂盒，其中所述多肽结合靶抗原并包含Fc受体结合结构域，所述试剂盒包含固定化靶抗原、吞噬细胞和参考标准品；

其中所述吞噬细胞包含Fcγ受体和编码与应答元件可操作连结的报告子的核酸，所述应答元件对借由所述Fcγ受体的活化作出应答，其中所述报告子的表达指示所述多肽的效力；且

其中所述参考标准品包括已知效力的所述多肽的制剂。

35.根据实施例33或34所述的试剂盒，其中所述报告子是荧光素酶或荧光蛋白。

36.根据实施例35所述的试剂盒，其中所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

37.根据实施例33-36中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含检测所述报告子的表达的试剂。

38.根据实施例33-37中任一项所述的试剂盒，其中对借由所述Fcγ受体的活化作出应答的所述应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子(例如Elk1)。

39.根据实施例33-38中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞来自细胞系。

41.根据实施例39所述的试剂盒，其中所述细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

41.根据实施例33-40中任一项所述的试剂盒，其中所述Fcγ受体是FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。

42.根据实施例33-41中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。

43.根据实施例42所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。

44.根据实施例33-43中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞不表达FcγRIII。

45.根据实施例33-44中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。

46.根据实施例33-45中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原是β淀粉样蛋白(Aβ)。

47.根据实施例46所述的试剂盒，其中所述Aβ是人Aβ。

48.根据实施例46或47所述的试剂盒，其中所述Aβ包括单体和/或寡聚Aβ。

49.根据实施例48所述的试剂盒，其中所述人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。

50.根据实施例33-49中任一项所述试剂盒，其中所述多肽包含全长Fc结构域、或Fc结构域的FcR结合片段。

51.根据实施例33-50中任一项所述的试剂盒，其中所述多肽特异性结合Aβ。

52.根据实施例33-51中任一项所述的试剂盒，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素。

53.根据实施例52所述的试剂盒，其中所述多肽在克雷奈珠单抗中。

54.根据实施例33-53中任一项所述试剂盒，其中所述靶抗原固定在表面上。

55.根据实施例54所述的试剂盒，其中所述表面是板。

56.根据实施例55所述的试剂盒，其中所述板是多孔板。

57.根据实施例55或56所述的方法，其中所述靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近与生物素结合。

58.根据实施例54-57中任一项所述的试剂盒，其中使用生物素-链霉亲和素系统将所述靶抗原固定在所述表面上。

59.根据实施例58所述的试剂盒，其中所述靶抗原与生物素结合，并且所述表面包含结合的链霉亲和素。

本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可由用于相同、等效或类似目的的替换特征来代替。因此，除非另外明确说明，否则所公开的每个特征仅是一通用系列的等同或类似特征的实例。

本发明的进一步的细节通过以下非限制性实例说明。在本说明书中所有参考文献的公开内容通过引用明确地并入本文。

实例

以下实例意在仅是本发明的示例，且因此不应被认为以任何方式限制本发明。以下实例及详细说明仅以说明而非限制的方式提供。

实例1.

材料和方法

吞噬报告细胞产生

首先化学合成(GeneArt^TM基因合成)人FCGR2A(CD32A)cDNA(protein_id＝NP_067674.2；编码方式＝NM_021642.3；HIS变体)。将限制位点(EcoRI,5’端；NotI,3’端)以及紧接ATG起始密码子5’的Kozak序列(GCCACC)添加到cDNA模板中。使用EcoRI和NotI将cDNA亚克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-IRES-Puro中(图1)。对所得构建体pCDH-CMV-CD32A-IRES-Puro进行测序，以确认完整的cDNA插入。通过将核因子-κB(NF-κB)应答元件(RE)克隆到萤火虫荧光素酶(Luc)基因上游的慢病毒载体中来产生报告子构建体(图2)。使用这些构建体来产生慢病毒颗粒，并且使用这些来转导U-937和THP-1单核细胞系。通过以1μg/mL嘌呤霉素(Clontech)进行选择来产生亲本池，并使用也活化NF-κB的TNFα作为阳性对照品确认发光活性。进行限制性稀释以分离克隆，并筛选具有克雷奈珠单抗和淀粉样蛋白β(Aβ)活性的克隆。在具有10％热灭活胎牛血清(HI FBS)(Gibco)、1x谷氨酰胺(Gibco)和1x青霉素-链霉素(Gibco)的RPMI(Gibco)中培养细胞，然后在90％HI FBS、10％二甲基亚砜(DMSO)(ATCC)中冷冻。

试剂和缓冲液

通过首先向每瓶0.5mg的肽中加入40μL室温DMSO，来重构非生物素化Aβ肽(rPeptide或Anaspec)和生物素β淀粉样蛋白1-42肽(生物素-Aβ)(Anaspec)。将瓶壁洗涤2-3次，然后加入960μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)以调整到pH 8.0。将小瓶涡旋约1分钟，直至试剂溶解，然后合并试剂，等分并储存在≤-60℃下直到使用。另一种肽包括CD20的51氨基酸肽，每个末端带有生物素(CD20生物素)(CPC Scientific)。以类似方式在DMSO中重建该肽，并用PBS使其储备浓度达到1mg/mL。

TBS结合缓冲液由Tris缓冲盐水(10mM Tris pH 8.0、150mM NaCl)组成。洗涤缓冲液由PBS以及1mM CaCl₂、1mM MgCl₂的组成。测定培养基为RPMI(Gibco)，其含有10％HI-FBS(Gibco)、1x谷氨酰胺(Gibco)和1x青霉素-链霉素(Gibco)。在早期开发和奥瑞组单抗版本的测定中，使用低IgG HI FBS(Hyclone超低IgG或Gibco)作为HI-FBS的替代品。荧光素酶表达的定量使用发光试剂(Promega，

荧光素酶测定系统)。ELISA阻断缓冲液为Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)，其含有1mM CaCl₂和1mM MgCl₂+0.5％牛血清白蛋白(BSA)。ELISA测定稀释剂为PBS、0.5％BSA、0.05％、聚山梨酯20。

克雷奈珠单抗参考标准品和样品由Genentech制造。制剂缓冲液是200mM琥珀酸精氨酸酯、0.05％(w/v)、聚山梨醇酯20，pH 5.5±0.3。为了产生光应力样品，将25mL克雷奈珠单抗置于玻璃瓶中，并置于经过校准的灯箱中，历时16小时累积曝光量为240万勒克斯小时；在铝箔中包裹光对照品用于曝光。

流式细胞术

将细胞在PBS或FACS Wash(PBS中0.5％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠溶)中洗涤，并重新悬浮在FACS Wash中。对于U-937实验，首先用活体染料(Invitrogen)对细胞染色，并与Fc阻断抗体(eBioscience，抗CD16：16-0166-85，抗CD32：16-0329-85，抗CD64：14-0649-82)预孵育10-15min。然后用下列抗FcγR抗体或同种型对照品对细胞染色30-60分钟：CD16-藻红蛋白(PE)(eBio,12-0167-42)、CD32-PE(BD Pharmingen,550586)、CD64-PE(eBio,12-0649)、CD64-FITC(eBio,11-0649-42)、FITC-小鼠IgG1κ(eBio,11-4714-42)、PE-小鼠IgG1κ(eBio,12-4714-42)、PE-小鼠IgG2bκ(BD Pharmingen,555743)。洗涤细胞并重新悬浮在FACS Wash中，并且使用流式细胞仪(BD、LSR II或FACSCaliber)来检测荧光。

Aβ肽的评价和板形式

将5μg/mL(25μL)的可溶性非生物素化Aβ与1/3稀释系列的克雷奈珠单抗(25μL，起始浓度600,000ng/mL)和THP-1吞噬作用报告细胞(50μL，500,000个细胞/mL)在37℃下在白色组织培养处理的测定板(Costar)中的测定培养基中孵育5小时。加入发光试剂

(100μL)(Promega)，摇晃20min，且使用发光板读取器(Perkin-Elmer,EnVision)检测发光。替代性地，在4℃下，将100μL在PBS中1μg/mL的非生物素化Aβ吸附到高结合度白色板(Thermo,Maxisorp)上过夜。用PBS洗涤板，用200μL测定培养基阻断30min，然后再次洗涤。然后，将板与100μL 1/3稀释系列的克雷奈珠单抗在测定培养基(起始浓度50,000ng/mL)中在37℃下孵育30min。再次洗涤板，且将100μL 200,000个细胞/mL的THP-1吞噬作用报告细胞在37℃下孵育5小时。加入发光试剂Steady-

(100μL)(Promega)，摇晃20min，且使用发光板读取器(Perkin-Elmer,EnVision)检测发光。还使用程序的这种变化来首先评价生物素-Aβ和链霉亲和素高结合能力96孔白色板(图4)。

克雷奈珠单抗Aβ结合ELISA

重组人淀粉样β1-42肽(rPeptide)在DMSO中重建，并以一次性等分试样冷冻。对于测定，将肽在DPBS中稀释至1μg/mL，并将100μL加入到高结合聚苯乙烯板(Nunc)上。将板在2-8℃下孵育16-72小时，然后倾倒并用200μL ELISA阻断缓冲液在25℃下阻断1-2小时。用PBS+0.05％聚山梨酯20洗涤这些板，并加入100μL克雷奈珠单抗参考标准品和ELISA测定稀释剂中的样品稀释液。将板在25℃下孵育1小时，然后再次洗涤。在25℃下将2ng/mL的山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson Immunoresearch)溶液加入板中40min，然后洗涤。添加比色TMB检测试剂(SureBlue Reserve,KPL)，并且展开板，摇晃10-30min，然后加入0.6N硫酸。使用板读取器(Molecular Devices)检测450nm处的吸光度，并将650nm处的吸光度用作参考吸光度。使用平行线分析曲线拟合程序计算相对于克雷奈珠单抗参考标准品的效力。

克雷奈珠单抗吞噬作用报告方法

将生物素-Aβ在TBS结合缓冲液中稀释至1.5μg/mL的浓度，并在25℃下与链霉亲和素高结合能力包被的96孔白色板(Pierce,Thermo Scientific)结合16-72小时。使用板洗涤器(Biotek)用洗涤缓冲液洗涤板三次，并在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃下用温热的测定培养基平衡1-2.5小时，所述培养箱上覆盖有可透气板密封器(Aeraseal,Sigma)或盖子。在制剂缓冲液中稀释参考标准品和样品，以便通过UV SpecScan进行蛋白质定量。针对在10,000ng/mL、4000ng/mL、1600ng/mL、750ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、40ng/mL和10ng/mL目标浓度的温热测定培养基中的参考标准品、测定对照品(参考标准品的独立稀释液)和样品制备了8点稀释曲线。通过离心分离从烧瓶中收集吞噬作用报告细胞，重新悬浮在温热的测定培养基中，计数，并稀释至2.5×10⁶个细胞/mL。再次洗涤板，并加入各50μL的样品稀释液和细胞制剂。在含有5％CO₂且覆盖有可透气板密封器或盖子的加湿培养箱中，将板在37℃下孵育3-5小时。然后在25℃培养箱中冷却测定板15-20min，然后加入100μL发光试剂。使用台式摇床在室温下摇晃板，然后在发光板读取器(Molecular Devices，配有LUM96盒的Paradigm或i3x)上检测发光信号。根据EC50比，使用4P约束拟合针对克雷奈珠单抗参考标准品来计算效力。使用软件(Molecular Devices,

Pro v6.5)进行板读数和效力计算。

奥瑞组单抗吞噬作用报告方法

奥瑞组单抗测试方法类似于克雷奈珠单抗测试方法，且具有以下修改。将CD20-生物素肽在pH 6.5的PBS中稀释至8μg/mL，以在2-8℃下与板结合16-72小时。洗涤缓冲液是PBS+0.05％聚山梨醇酯20。肽结合后，洗涤板6次，用测定培养基平衡，洗涤，并在37℃下用100μL奥瑞组单抗稀释液孵育1.5小时。奥瑞组单抗浓度为100,000ng/mL、30,000ng/mL、15,000ng/mL、8000ng/mL、4000ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL和100ng/mL。然后洗涤板，且加入100μL浓度为1.5×10⁶个细胞/mL的U-937吞噬作用报告细胞。将板在37℃下孵育2小时40分钟。低IgG HI FBS用于测定培养基。

结果

吞噬作用报告细胞

吞噬作用报告细胞测定法最早是针对克雷奈珠单抗开发的，克雷奈珠单抗与可溶性Aβ寡聚物结合，并促进小胶质细胞摄取免疫复合物(Adolfsson等人)。这种机制类似于抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，因为它涉及吞噬细胞并由Fcγ受体(FcγR)介导。为了最佳地反映ADCP的生物学，选择吞噬性人单核细胞系THP-1和U-937作为亲本细胞系来产生吞噬作用报告细胞系。如材料和方法中所述，在NF-κB应答元件的控制下，对THP-1和U-937细胞系进行工程改造以表达萤火虫荧光素酶基因。NF-κB是通过FcγR等免疫受体进行信号传导而诱导的转录调节因子。虽然特定的Fcγ受体涉及由克雷奈珠单抗对Aβ进行小胶质细胞清除尚不清楚，但克雷奈珠单抗，IgG4以最高的亲和力与CD64(FcγRI)结合。CD32A(也称为FcγRIIa)被认为与ADCP相关，因为其偏好免疫复合物而非单体IgG，并且该受体对Fc半乳糖化也很敏感，Fc半乳糖化是抗体治疗的潜在产物变体。因此，使用附加CD32A构建体对细胞进行工程改造，以最大限度地提高对潜在产物变体的敏感性。U-937和THP-1细胞还表达CD64，但低至没有CD16(FcγRIIIa)(图3)。U-937和THP-1报告细胞均表示吞噬作用模式，且针对每种特异性抗体和靶标优化效力测定，包括细胞系的选择。由于该抗体/靶标的测定精度和一致性更好，最终选择了THP-1细胞进行克雷奈珠单抗效力测定。

Aβ肽的评价和板形式

评价三种方法以将Aβ肽寡聚物引入测定中(图4)。可在水溶液中形成寡聚物的首次使用的可溶性Aβ肽制剂与克雷奈珠单抗和报告细胞混合。这种方法未能产生发光信号，可能是由于Aβ寡聚复合物的形成不完全或效率低下。为了模拟Aβ复合物和/或为复合物的形成提供种子，探索了板结合形式，其中克雷奈珠单抗和报告细胞被层叠到包被有Aβ肽的板上。吸附在高结合板上的Aβ肽显示出在报告细胞中呈阳性，但不一致的信号。为了改善Aβ与板表面结合的信号和一致性，使用了链霉亲和素(SA)-生物素系统，其中生物素化的Aβ与链霉亲和素包被的板结合。测定形式和克雷奈珠单抗标准曲线

吞噬作用报告细胞测定的形式涉及生物素化肽与链霉亲和素包被的板的结合(图5)。肽特异性抗体与肽靶标结合并触发FcγR的群聚和活化。这导致NF-κB的活化和报告基因,即荧光素酶的表达，这允许在添加底物时定量发光。克雷奈珠单抗参考标准品的代表性剂量应答曲线如图6所示。

克雷奈珠单抗效力测定的实例：降解的样品

使用测定来确定克雷奈珠单抗样品的效力。为了证明吞噬作用报告细胞测定可以检测由于产物降解引起的效力变化，测试光应力研究中的克雷奈珠单抗应力样品的活性。这些样品表现出通过ELISA测量的Aβ结合活性丧失，且使用吞噬作用报告细胞测定观察到类似的效力丧失(表2)，表明报告细胞测定可以检测Aβ结合活性丧失引起的效力丧失。

表2.克雷奈珠单抗光应力样品的效力

样品	Aβ结合效力	吞噬作用报告细胞效力
			光对照品	107	99
光应力2.4M lux h	84	86

结果是％相对效力，将克雷奈珠单抗参考标准品指定为100％，并且是三项独立测定的平均值。

将测定形式应用于其他产物/靶标

为了确定吞噬作用报告子测定是否可应用于其他抗体产物，对格式进行了调整，以适应其他肽靶标/抗体组合。奥瑞组单抗是一种CD20结合抗体，ADCP作为提出的作用机制。因此，生物素化的CD20肽与链霉亲和素板结合，且使奥瑞组单抗与肽结合，以模拟奥瑞组单抗与CD20表达细胞表面的结合。使用U-937吞噬作用报告细胞，观察到发光信号以产生剂量应答曲线。这允许评估奥瑞组单抗的ADCP效力(图7)。

开发了一种使用报告细胞系和板结合肽测量克雷奈珠单抗效力的测定(图5)。该测定用作FcγR介导的免疫复合物/ADCP摄取的替代形式。它反映了作用模式，因为它利用吞噬性单核细胞系，并通过克雷奈珠单抗和Aβ肽的免疫复合物测量FcγR的结合和活化。使用克雷奈珠单抗应力样品证明该测定对效力损失敏感。此外，测定形式可以应用于其他靶标和产物，如针对奥瑞组单抗(CD20结合)所证明的。

实例2.

上面描述了吞噬作用报告细胞和测定形式的开发。此处，描述关于优化克雷奈珠单抗测定的测定条件的额外数据。

细胞系优化

对THP-1和U-937细胞系进行工程改造，以在核因子-(NF-κB)应答元件的控制下表达萤火虫荧光素酶基因，从而过表达CD32，以使对潜在产物变体的敏感性最大化。

基于更高的折叠应答和更快的生长，最初选择了工程化的U-937细胞系用于克雷奈珠单抗测定。然而，在对克雷奈珠单抗测定性能进行额外比较后，选择了THP-1吞噬作用报告细胞。进行了一项实验，以评估细胞接种密度对THP-1吞噬作用报告细胞生长的影响，从而改善细胞生长并提高测定的产率。THP-1细胞在较低的细胞接种密度下生长较慢(图8)，因此将相对高的接种浓度纳入细胞培养程序中。

试剂的选择和优化

NF-κB在几种免疫受体的下游被活化，因此一个潜在的问题是污染物例如重组Aβ肽制剂中的细菌脂多糖(LPS)对报告细胞的脱靶活化。因此，比较了重组和合成来源的Aβ肽在不存在克雷奈珠单抗的情况下活化报告细胞的能力(图9)。选择合成Aβ肽以最小化内毒素介导的报告细胞活化的可能性。

测定参数的实验优化设计

为了进一步优化测定并评价测定因素对测定读数的影响，采用了Plackett-Burman设计。评价的测定因素包括测定细胞浓度、Aβ肽浓度、孵育时间、细胞生长浓度(烧瓶中的接种密度)、

孵育时间和FBS类型(HI与低IgG FBS)(表3)。此外，将两个批次的Aβ肽制剂和多个分析员纳入设计。在主要影响分析中，评价了测定因素对EC₅₀、斜率、折叠应答、效力平均值和效力标准差(SD)的影响(图10至13)。

表3.

序列表

<110> 基因泰克公司 (Genentech, Inc.)

<120> 抗体效力测定

<130> 14639-20467.40

<140> 尚未分配

<141> 与此同时

<150> US 62/835,969

<151> 2019-04-18

<160> 2

<170> 用于 Windows 的 FastSEQ，4.0 版

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

Claims

a)使固定化靶抗原与所述多肽制剂接触以形成抗原-多肽复合物，

其中所述报告子的表达指示所述多肽的活性。

c)测量报告子的表达，以及

3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括使用针对所述参考标准品的多参数逻辑拟合，基于所述多肽制剂的所述EC₅₀计算所述效力。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多参数逻辑拟合是3参数、4参数或5参数逻辑拟合。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述参考标准品的所述EC₅₀与所述多肽制剂的所述EC₅₀同时确定。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述报告子是荧光素酶或荧光蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中对借由所述Fcγ受体的活化作出应答的所述应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞是单核细胞。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞来自细胞系。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述Fcγ受体是FcγRI(CD64)或FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述吞噬细胞不表达FcγRIII。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述Aβ是人Aβ。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述Aβ包括单体和/或寡聚Aβ。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述多肽包含全长Fc结构域、或Fc结构域的FcR结合片段。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述多肽特异性结合Aβ。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述多肽在克雷奈珠单抗(crenezumab)中。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述靶抗原固定在表面上。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述表面是板。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述板是多孔板。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近固定到所述表面。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中使用生物素-链霉亲和素系统将所述靶抗原固定在所述表面上。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶抗原与生物素结合，并且所述表面包含结合的链霉亲和素。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近与生物素结合。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在所述抗原-多肽复合物与所述吞噬细胞接触后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时或大于24小时中的一者或多者之后检测所述报告子。

其中所述报告子的表达指示所述多肽的效力。

其中所述参考标准品包括已知效力的所述多肽的制剂。

35.根据权利要求33或34所述的试剂盒，其中所述报告子是荧光素酶或荧光蛋白。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或纳米荧光素酶。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含检测所述报告子的表达的试剂。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的试剂盒，其中对借由所述Fcγ受体的活化作出应答的所述应答元件是NFκB应答元件、NFAT应答元件、AP-1应答元件或ERK应答转录因子。

39.根据权利要求33-38中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞来自细胞系。

40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述细胞系是THP-1细胞系或U-937细胞系。

41.根据权利要求33-40中任一项所述的试剂盒，其中所述Fcγ受体是FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)或FcγRIII(CD16)。

42.根据权利要求33-41中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达Fcγ受体。

43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞被工程设计成过表达FcγRIIa。

44.根据权利要求33-43中任一项所述的试剂盒，其中所述吞噬细胞不表达FcγRIII。

45.根据权利要求33-44中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)或CD20。

46.根据权利要求33-45中任一项所述的试剂盒，其中所述靶抗原是β-淀粉样蛋白(Aβ)。

47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述Aβ是人Aβ。

48.根据权利要求46或47所述的试剂盒，其中所述Aβ包括单体和/或寡聚Aβ。

49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述人Aβ是Aβ1-40或Aβ1-42。

50.根据权利要求33-49中任一项所述试剂盒，其中所述多肽包含全长Fc结构域、或Fc结构域的FcR结合片段。

51.根据权利要求33-50中任一项所述的试剂盒，其中所述多肽特异性结合Aβ。

52.根据权利要求33-51中任一项所述的试剂盒，其中所述多肽是抗体或免疫粘附素。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述多肽在克雷奈珠单抗中。

54.根据权利要求33-53中任一项所述试剂盒，其中所述靶抗原固定在表面上。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中所述表面是板。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述板是多孔板。

57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述靶抗原在其N末端或附近、在其C末端或附近、或在其N末端或附近和在其C末端或附近与生物素结合。

58.根据权利要求54-57中任一项所述的试剂盒，其中使用生物素-链霉亲和素系统将所述靶抗原固定在所述表面上。

59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述靶抗原与生物素结合，并且所述表面包含结合的链霉亲和素。