CN113692446A - 用于鉴定黑果越橘的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法和专门设计用于该方法实施的试剂盒。本发明的方法基于使用PCR扩增对黑果越橘基因组区域中的核酸片段的检测，其中所述基因组区域为内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因组区和内部转录间隔子2中的基因组区域。
Description
技术领域
本发明提供了一种基于使用PCR扩增检测特定基因组片段用于鉴定植物组合物中的黑果越橘(Vaccinium myrtillus)的方法。本发明还提供了专门设计用于实施本发明方法的试剂盒。
发明背景
植物提取物广泛用于医疗、保健品、化妆品和食品工业。处理植物提取物时遇到的主要问题之一是不仅要确定其化学组成，还要确定其植物来源，以排除假冒风险。
用于确定植物材料的植物来源的基于遗传的方法是本领域已知的(Parker,T,etal,Field-based species identification o fclosely-related plants using real-time nanopore sequencing.Sci Rep,2017.7(1):p.8345；Group,C.P.W.,A DNA barcodefor land plants.Proc Natl Acad Sci U S A,2009.106(31):p.12794-7；Fazekas,A.J.,et al.,DNA barcoding methods for land plants.Methods Mol Biol,2012.858:p.223)。此类方法基于植物材料中存在的DNA与公开可用数据库中存在的已知DNA序列的比较。例如，WO 2006/020147(The Regents of the University of California)公开了一种用于鉴定存在于植物混合物中的单独生物学遗传成分的方法，所述方法基于基因组座位特异性PCR、单链构象多态性(SSCP)和序列分析的组合。据称该方法能够提供关于组合物的生物成分的信息，而无需事先了解可能存在哪些植物，并能够检测和识别混合物中可能存在的未知生物成分。
从植物样品中遗传鉴定植物的方法也公开于CN102146477,CN106119394,CN1372005,CN107142329,CN107653330,CN105624291,CN105603107,ES2176066,CN104673930,CN102222969,CN102732513,CN105063203,JP2007282626。在一些情况下，用于鉴定植物物种的方法基于PCR扩增检测位于细胞核核糖体RNA编码基因座中包含内部转录间隔子(ITS)区域ITS-1和/或ITS-2的特定序列。在一些情况下(CN1052429、CN105603107、ES2176066)，这些方法旨在识别含有植物材料的商业产品中的掺假。
Jaakola L等人，Food Chemistry vol.123,no.2(2010)pp.494-500，公开了通过DNA条形码和HRM(高分辨率熔解)分析的组合方式，使用能够对野生浆果进行物种特异性鉴定的设计引物对，鉴定商业上重要的浆果物种。黑果越橘使用引物ITSVm2f和ITSVm2r获得位于ITS(内部转录间隔子)区域中的扩增子，并对该扩增子进行HRM分析来鉴定。
CN108642207公开了越桔植物等位基因图谱的构建，以及利用引物特异性PCR扩增鉴定蓝莓品种和相关物种的方法。
Marieschi M.等人，Food Chemistry vol.202(2016)pp.438-444公开了一种可用于多批次分析的、基于序列特征性扩增区域(SCAR)的方法，用于检测黑果越橘和掺假物种的存在。
Koskima Ki JJ等人，European Journal of Plant Pathology,Kluwer AcademicPublishers-vol.125no.4(2009)pp.629-640公开，使用SYBR-绿作为荧光报告分子，通过实时PCR定量越橘基因的相对表达。
在对植物材料加工，特别是进行提取操作时，DNA会降解，根据提取方法产生大小和数量不同的片段，这些片段无法直接与已知的DNA序列进行比较，因此即使不是实际上不可能，也难于将可用于起始材料的基因组鉴定方法应用于提取物。
黑果越橘提取物因其已知的有益健康的特性而广泛用于医药、化妆品、营养保健品和膳食产品。黑果越橘作为膳食补充剂和治疗剂的临床益处已经归因于大量黄酮类化合物和花青素类化合物的存在。对于提取物制造商而言，确保黑果越橘提取物在化学成分和声明的纯植物来源方面具有所需的规格，是非常重要的。因此，希望提供一种允许在植物组合物，例如植物提取物中鉴定黑果越橘的方法，从而特别是在黑果越橘与亲缘关系紧密的污染物种混合时，确保高水平的准确性和物种特异性。
发明详述
这些目的通过本发明得以实现，本发明提供了一种通过检测黑果越橘提取物残留DNA中包含的核酸片段来特异和准确地鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法。
具体地，本发明的方法包括在植物组合物样品中检测黑果越橘特异性核酸片段，所述核酸片段位于内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因和内部转录间隔子2中，其中所述核酸片段由SEQ ID NO:1组成或由选自SEQ ID NO:2、3和4的包含SEQ ID NO:1的序列组成。
在一个优选实施方案中，用于PCR扩增的引物选自以下引物对：
(i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
在一个特别优选的实施方案中，PCR是实时PCR(rtPCR)并且本发明的方法包括以下步骤：
(a)从植物组合物的样品中分离核酸；
(b)在分离的核酸上进行rt-PCR，其中使用：
-选自以下的引物对:
(i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
和
-在引物扩增的核酸区域内退火的探针，所述探针具有序列SEQ ID NO:13；
(c)确定扩增产物的存在,
其中，检测到扩增产物表明植物组合物中存在黑果越橘。
根据本发明，植物组合物是旨在用于食用或治疗用途的植物或其部分(例如叶、果实、树皮、根)的混合物，包括植物提取物，特别是果实提取物。在一个优选的实施方案中，植物组合物是含有单独的或与相关物种组合的黑果越橘的果实提取物的产品，其中所述相关物种为例如岩高兰(Empetrum nigrum)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、高丛越橘(Vaccinium corymbosum)和大果越橘(Vacciniummacrocarpon)。
核酸的分离涉及将它们从植物混合物或提取物的其他成分中分离和纯化出来，这可以使用市售试剂盒通过常规技术进行。特别地，基因组DNA可以使用提取-沉淀方案、基于二氧化硅膜或阴离子交换的程序进行分离。
实时PCR技术在本领域中是已知的，它将聚合酶链反应化学与荧光报告分子的使用相结合，以在PCR反应的每个循环期间监测扩增产物的产生。目标DNA的扩增，通过重复如下的循环来实现：变性，然后是引物和探针退火、然后是DNA聚合酶催化的引物延伸。在每个PCR循环中通过测量荧光信号来监测DNA扩增，该荧光信号可以例如由嵌入双链DNA的非特异性荧光染料或由序列特异性DNA探针产生，其中所述探针由荧光报告分子标记的寡核苷酸组成，以允许在探针与其互补的DNA靶标杂交后实现检测。合适的嵌入染料包括
(绿I、绿II、金)、LC
SYTO-(9、13、16、60、62、64、82)、BOBO-3、LC
POPO-3、BEBO、T0-PR03、Pico
SYTOX橙和类似的市售荧光染料(荧光团)。
寡核苷酸探针在一端用荧光报告分子(荧光团)标记，在探针的另一端用荧光猝灭剂标记。聚合酶的5'核酸外切酶活性切割探针，释放报告分子，导致荧光强度增加。荧光团的例子包括5-或6-羧基荧光素(5-或6-FAM)、四氯荧光素(TET)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(JOE)、四甲基罗丹明(TAMRA)、5-羧基四甲基罗丹明(TAMRASE)、羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸(DABCYL)。猝灭剂的例子包括BHQ(Black Hole
)系列、NFQ-MGB(非荧光猝灭剂和小沟结合剂)、QSY 7或21羧酸琥珀酰亚胺酯。
rtPCR的参数和条件，例如每个循环的变性和退火的温度和长度，如本领域技术人员所知，可以根据要扩增的核酸片段、扩增中使用的引物组和其他变量进行调整。在本发明的一个优选实施方案中，本文公开的核酸片段用引物(i)至(iv)在以下条件下扩增：
-初始变性步骤95℃180秒；
-95℃15秒(第一步)和62-68.5℃15秒(第二步)的两步骤循环，重复四十(40)至五十(50)次。
根据本发明的引物和探针的特定组合允许在包含密切相关物种例如如岩高兰(Empetrum nigrum)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、高丛越橘(Vaccinium corymbosum)和大果越橘(Vaccinium macrocarpon)的植物组合物中特异性鉴定黑果越橘。如实验部分所报告，使用与上文公开相同的引物和rt-PCR条件，使用不同于黑果越橘特异探针SEQ ID NO:13的探针并同样与片段SEQ ID NO:1-4退火，会破坏该系统识别与岩高兰混合的黑果越橘的能力。这表明了根据本发明所选择的引物和探针组合的特异性和根据本发明的rtPCR条件的有效性。
本发明的另一方面涉及用于鉴定植物组合物中的黑果越橘的试剂盒。本发明的试剂盒包含选自(i)至(iv)的至少一对引物和如上定义的探针。此外，试剂盒可以在单独的容器中包含运行(rt)PCR所需的试剂，特别是脱氧核苷酸和DNA聚合酶，以及用于分离、纯化和任选地定量DNA的试剂。该试剂盒还可以包含黑果越橘DNA作为阳性对照、和无核酸酶的水或缓冲液作为阴性对照，以及带有执行所述PCR检测的说明书的印刷品。
在本发明的一个优选实施方案中，试剂盒包含：
-一个管子或小瓶，其中包含进行所述分析所需的所有试剂(DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、探针化学、引物和探针)；
-一个管子或小瓶，其中含有阳性对照(黑果越橘DNA)；
-一个管子或小瓶，其中含有阴性对照DNA(无核酸酶的水)。
试剂盒可用于所有市售的实时荧光定量PCR系统。
附图说明
图1：rt-PCR扩增方案。
图2：从黑果越橘冷冻果实中分离的基因组DNA的rt-PCR扩增结果(a)和熔解曲线分析(b)。
图3：黑果越橘的标准曲线分析。
图4：基于探针的rt-PCR扩增，其中使用特异于黑果越橘的M-FAM探针。NTC：阴性对照。
图5：(a)在具有图例中报告的比率的混合样品中，使用特异于黑果越橘的M-FAM探针，进行基于探针的rt-PCR扩增。NTC：阴性对照；(b)在具有图例中报告的比率的混合样品中，使用特异于岩高兰的E-HEX探针，进行基于探针的rt-PCR扩增。NTC：阴性对照。
图6：对于黑果越橘，Cq平均值与目标物种百分比之间的相关性。
图7：用于干提取物样品的rt-PCR分析的实验方案。
图8：从黑果越橘干提取物样品中分离出的残留DNA的rt-PCR扩增。阳性对照为从黑果越橘冷冻果实中提取的gDNA。a)引物组L；b)引物组S。
图9：rt-PCR扩增子的琼脂糖凝胶分析。
图10：测序的扩增子的比对分析(顶部)和相对序列同一性矩阵(底部)。
图11：黑果越橘E.ET 36％的rt-PCR。扩增曲线和熔解曲线。
图12：黑果越橘E.ET 36％的rt-PCR，其中使用基于探针的方法。PTC：阳性对照(从黑果越橘冷冻果实中提取的gDNA)；NTC：阴性对照。
实验部分-一般程序
基因组DNA(gDNA)的提取
使用供应商描述的
Plant II方案(Macherey nagel.Cat.740770.250-2014年7月/Rev.09)，进行DNA提取。
从干提取物中纯化残留DNA
第一纯化使用供应商描述的
plant II Maxi方案(Machereynagel.Cat.740770.250-2014年7月/Rev.09)，其中进行下述的一些修改。
-在50毫升锥形管中称取3-5克干提取物
-加入3毫升蒸馏水
-添加9ml裂解缓冲液
-涡旋30秒
-将样品转移到
Filter Maxi
-以4500x g离心5分钟，收集澄清的穿流物，并丢弃NucleoSpin Filter Maxi
-添加20ml结合缓冲液
-涡旋30秒
-将样品上样到
Plant II Maxi柱上
-以4500x g离心3分钟，并丢弃穿流物
-对所有余下样本重复该上样
-将4ml洗涤缓冲液(PW1)添加到
Plant II Maxi柱
-以4500x g离心3分钟，并丢弃穿流物
-将10ml洗涤缓冲液(PW2)添加到
Plant II Maxi柱
-以4500x g离心3分钟，并丢弃穿流物
-将2ml洗涤缓冲液(PW2)添加到
Plant II Maxi柱
-以4500x g离心12分钟并丢弃穿流物
-将
Plant II Maxi柱放入新的收集管(50毫升)
-将1000ml洗脱缓冲液(PE)(65℃)移液至该膜上
-在65℃孵育
Plant II Maxi柱5分钟
-以4500x g离心3分钟以洗脱DNA。
第二纯化使用试剂盒ReliaPrepTMDNA Clean-UP和供应商描述的浓缩系统方案(Promega.Cat.A2893)。
DNA的定量
通过NanoQuant PlateTM仪器对DNA进行定量。该定量使用UV法进行。260nm吸光度用于量化DNA，其中260nm处的1OD对应于50μg/ml DNA。确定260nm/280nm吸光度比值，以评估DNA纯度。
rt-PCR和熔解曲线分析
rt-PCR扩增通过使用供应商描述的基于SYBR绿或探针的化学(SsoAdvancedTMUniversal
绿Supermix，BioRad Cat.N.1725272；SsoAdvancedTMUniversal Probes Supermix，BioRad Cat.N.1725281)，采用3步扩增方案实施，如图1所示。
实时PCR
如下准备混合物，最终体积为20μl:
| 探针Mastermix(BioRad或等同物)2X | 10μl |
| 引物F10μM | 0.5μl |
| 引物R10μM | 0.5μl |
| 探针M-FAM 10μM | 0.5μl |
| DNA 0.5–30ng/μl | 2μl |
| 无核酸酶的水 | 6.5μl |
将样品上样到实时仪器(BioRad或等同仪器)并设置以下方法：
在循环的第二步后采集。
DNA测序
扩增的DNA在琼脂糖凝胶上纯化，纯化的片段行测序，为每个样品生成两个序列：一个是使用正向引物生成的序列，另一个是使用反向引物生成的序列。通过混合纯化的DNA和TRIS-HCl 5mM pH 8.0来准备每个测序管，以获得测序所需的浓度(取决于序列的长度，2-5ng/μL)。
使用BioEdit或BLAST软件分析序列，以进行这些序列的比较和鉴定。
实施例
实施例1-方法验证
对黑果越橘冷冻果实及其污染/相关物种的gDNA进行纯化和定量(表1)，见下文描述：
表1.在本报告测试的所有物种上提取的gDNA的定量
rt-PCR反应参数的设置，就Cq(定量循环)和Tm(熔解温度)峰值而言，最初通过使用从黑果越橘冷冻果实中提取的gDNA进行了评估(图2)。rt-PCR结果表明，对于所有引物组，设计的引物允许扩增单个DNA区域(表2和3)。
表2
表3
还对从黑果越橘污染/相关物种中分离的DNA进行了rt-PCR，结果表明，通过使用所述引物组，特别是小2引物，可以区分不同的DNA(表4)。
表4-熔解曲线峰值结果
| 样品 | 大2 | 小2 | 大 | 小 |
| 黑果越橘 | 90.50 | 90.50 | 90.50 | 89.50 |
| 岩高兰 | 88.50 | 88.00 | 90.50 | 89.00/89.50 |
| 西洋接骨木 | 88.50 | 87.50 | 89.50 | 87.50 |
| 红莓苔子 | 91.00 | 91.00 | 91.00 | 89.50/90.00 |
| 高丛越橘 | 89.00 | 89.00 | 89.00 | 88.00 |
| 大果越橘 | 91.50 | 91.50 | 91.00 | 90.50 |
扩增曲线的线性也通过使用小2引物组生成黑果越橘标准曲线，进行了评估(图3)。可以看出，在测试的浓度范围内(大约0.0625-8.00ng/μl)，确保了线性。
为了提高区分黑果越橘和污染/相关物种的方法能力，rtPCR使用小沟结合探针(M-FAM-SEQ ID NO:13)进行，该探针专门设计以允许扩增黑果越橘序列。
在对比实验中，同时使用小沟结合探针SEQ ID NO:13(M-FAM)和SEQ ID NO:14(E-HEX)进行了rtPCR。
为了测试该基于探针的方法，已经进行了不同亚组的实验，总结在下表中。
表5
扩增结果与目标物种的含量成正比(图6)。
实施例2-黑果越橘干提取物残留DNA鉴定
对于每个样本，进行了两次独立的残留DNA分离(生物学重复)；并对每个提取的DNA，进行了三个技术重复测试，图7。
整个过程最初对四个样品进行：32549/H76、32549/H80、32549/H83、32549/H84。在残留DNA分离和定量后(表6)，与阳性对照相比，分析了这些样品的rt-PCR扩增特征(Cq和Tm)(图8和表7)。
表6-残留DNA定量
表7-rt-PCR结果总结
| 样品 | DNA(ng/μL) | Cq.平均值 | Cq.标准偏差 | 熔解温度 |
| 32549/H76_2 | 1.0 | 32.05 | 0.180 | 89.50 |
| 32549/H83_1 | 0.7 | 35.26 | 0.181 | 89.00 |
| 32549/H84_1 | 10.3 | 28.96 | 0.119 | 89.50 |
| 32549/H84_2 | 10.6 | 28.44 | 0.092 | 89.50 |
| 阴性对照 | 0.0 | 无 | 无 | 无 |
| 阳性对照 | 24.8 | 23.60 | 0.040 | 89.50 |
所有样品的rt-PCR扩增结果显示：
-阳性对照和所有测试样品的DNA均得以扩增；
-阴性对照(无DNA)显示无扩增信号；
-阳性对照和样品显示了相当的Tm峰值。
该结果表明，这些扩增子在长度和/或核苷酸碱基组成方面具有相同的特征。
此外，Cq结果与测试的DNA量相关，这意味着扩增对所选目标具有特异性。
为了验证生成的扩增子是否具有与阳性对照相同的序列，所有扩增的序列都在琼脂糖凝胶上纯化(图9)并对纯化的片段进行测序(图10)。
琼脂糖凝胶分析证实了扩增子长度的差异：引物组S产生的片段长度显示约为130bp，而引物组L产生的片段长度显示约为270bp。此外，从凝胶琼脂糖分析中还可以看到非特异性rt-PCR产物的存在，如图9所示，样品32549/H83_1的泳道4，其中可见两条带，这与Tm峰值结果良好吻合(图8、b)。
通过仅考虑具有高质量测序参数的部分，比对了所有生成的序列。测序结果(图10)显示，所有扩增子序列(小和大)都与黑果越橘标准参考的序列相同。
实施例3-黑果越橘36％干乙醇提取物(E.ET.)残留DNA鉴定
也对在干粉混合阶段后具有Indena代码9042202,MIRTILLO(黑果越橘)E.ET.36％的样品，32788/M1、32786/M2、32788/M2，进行了残留DNA分析。之前的样品32549/H76、32549/H80和32549/H83作为对照样品再次进行了测试。
为了优化纯化程序，在第一步DNA纯化之后，用ReliaPrepTM试剂盒(Promega)处理分离的残留DNA。在该两个纯化步骤上DNA数量(ng/μL)和质量(260/280比值)的结果(表8)表明，引入第二步，浓度和纯化更好。
表8–残留DNA定量-E.ET.36％
根据上述方案，通过使用SYBR绿(图11)和基于探针的方法(图12)进行了rt-PCR分析。
结果表明：
(a)当使用SYBR绿方法分析时，所有测试样品都显示出与阳性对照相同的Tm峰值(图11和表9)：
表9-rt-PCR结果总结，SYBR绿方法-E.ET.36％
| 样品 | DNA(ng/μL) | Cq.平均值 | Cq.标准偏差 | 熔解温度 |
| 32549/H76 | 2.3 | 31.59 | 0.099 | 89.50 |
| 32549/H80 | 0.2 | 31.87 | 0.107 | 89.50 |
| 32549/H83 | 2.1 | 33.61 | 0.276 | 89.50 |
| 32788/M1 | 3.4 | 31.85 | 0.286 | 89.50 |
| 32786/M2 | 2.5 | 31.88 | 0.011 | 89.50 |
| 32788/M2 | 3.6 | 31.36 | 0.144 | 89.50 |
| 阴性对照 | 0 | 0 | 0 | 无 |
| 阳性对照 | 24.8 | 23.75 | 0.016 | 89.50 |
(b)当使用基于探针的方法进行分析时，使用对黑果越橘序列特异的探针，所有测试样品均获得检测(图12和表10)。
表10-rt-PCR结果总结，基于探针的方法-E.ET.36％
| 样品 | DNA(ng/μL) | Cq.平均值 | Cq.标准偏差 |
| 32549/H76 | 2.3 | 31.52 | 0.306 |
| 32549/H80 | 0.2 | 31.38 | 0.073 |
| 32549/H83 | 2.1 | 33.44 | 0.326 |
| 32788/M1 | 3.4 | 31.10 | 0.098 |
| 32786/M2 | 2.5 | 31.52 | 0.156 |
| 32788/M2 | 3.6 | 30.53 | 0.197 |
| 阴性对照 | 0 | 0 | 0 |
| 阳性对照 | 7.45 | 24.84 | 0.177 |
实施例4-用于分析的试剂盒
试剂盒由以下部分组成：
-一个1.5ml试管，包含进行分析所需的所有试剂(DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、探针化学、引物和探针)
-一个1.5ml试管，包含阳性对照(黑果越橘DNA)
-一个1.5ml试管，包含阴性对照DNA(无核酸酶的水)。
试剂盒可用于所有市售的实时PCR系统(尤其是：BioRad CFX96TM、BioRadCFX96TM、
Roche
480等)。
Claims (7)
1.一种鉴定植物组合物中的黑果越橘的方法，包括通过PCR扩增从其样品检测黑果越橘核酸片段，所述核酸片段位于内部转录间隔子1、5.8S核糖体RNA基因组区和内部转录间隔子2中，所述方法包括以下步骤：
(a)从所述样品中分离核酸；
(b)在分离的核酸上进行实时PCR，其中使用：
-选自以下的引物组:
(i)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(ii)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
(iii)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(iv)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；
和
-在引物扩增的核酸区域内退火的探针，所述探针由序列SEQ ID NO:13组成；
(c)确定扩增产物的存在,
其中，检测到扩增产物表明植物组合物中存在黑果越橘。
2.权利要求1的方法，其中引物组(i)用于步骤(b)。
3.权利要求1-2的方法，其中所述rt-PCR在以下条件进行：
-初始变性步骤95℃180秒；
-95℃15秒(第一步)和62-68.5℃15秒(第二步)的两步骤循环，重复四十(40)至五十(50)次。
4.权利要求1-3的方法，其中植物组合物是植物提取物。
5.用于在植物组合物中鉴定黑果越橘的试剂盒，其包含权利要求1中定义的引物组合探针。
6.权利要求5的试剂盒，还包含DNA聚合酶、脱氧核苷酸(dNTP)混合物、缓冲溶液。
7.权利要求5-6的试剂盒，还在分开的容器中包含黑果越橘核酸样品作为阳性对照和无核酸酶的水或缓冲溶液作为阴性对照。
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