CN113678828B

CN113678828B - 二水氧化三甲胺作为一种增效剂在芽孢杆菌类生物农药上的应用

Info

Publication number: CN113678828B
Application number: CN202110962838.9A
Authority: CN
Inventors: 刘连盟; 赵可菡; 黄世文; 章艺琳; 蔡鲁斌
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113678828A

Abstract

本发明公开了二水氧化三甲胺作为一种增效剂在芽孢杆菌类生物农药上的应用。本发明创新性的利用二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药的增效剂，二水氧化三甲胺可以通过提高芽孢杆菌类杀菌剂的抗逆性、环境中的定殖，提高生物杀菌剂的稳定性和防效，该成果是生物农药研究领域的一个创新，在生物农药产业上具有重大应用潜力。

Description

二水氧化三甲胺作为一种增效剂在芽孢杆菌类生物农药上的应用

技术领域

本发明属于农药生物技术领域，具体涉及一种二水氧化三甲胺作为一种增效剂在芽孢杆菌类生物农药上的应用。

背景技术

芽孢杆菌是最重要生防菌类型，其具有防治谱广、防效高、发酵成本低、环境适应性强等得天独厚的优点。因此，我国乃至世界农药市场上的活体微生物农药大多为芽孢杆菌，目前登记有效的有118个品种（2021年8月，中国农药信息网http://www.chinapesticide.org. cn），广泛应用于各种作物的真菌和细菌病害防控。据不完全统计，已报道的和正在研究的芽孢杆菌类生防潜力菌不低于200株，因此将来会有越来越多的芽孢杆菌类生物农药涌现出来。已经商业化或者具有商业化潜力的芽孢杆菌菌株多数为枯草芽孢杆菌，其次为蜡质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌属、贝莱斯芽孢杆菌等。在我国，枯草芽孢杆菌占了已登记芽孢杆菌类活体生物农药的50%以上。而美国现有经环保局(EPA)批准商品化或有限商品化生产应用许可的枯草芽孢杆菌菌株有13株，包括BU1814，AFS032321，QST713，FZB24，IAB/BS03，RTI477，CBS 133255，FMCH002，CX-9060，D747，GB03和MBI600，用于各种玉米、大豆、小麦、马铃薯等多种大田和经济作物的真菌和细菌性病害的生物防治（NPIRS，http://npirspublic.ceris.purdue.edu，至2020年2月）。

但是作为一种活体微生物农药，芽孢杆菌类生物农药也有其固有的缺陷。首先是防效不稳定，芽孢杆菌被引入工作环境后，必须要在环境中存活下来，并成功增殖以维持一定量的种群数量才能发挥作用。而自然环境不同于条件可控的实验室，其中广泛存在有害因子，如阳光尤其是紫外线、高温和干旱等，不利于芽孢杆菌的存活和增殖。这些不可控的不利因子使芽孢杆菌类的无法取得了稳定的防效。这同样也是大多数生防菌在实验室内性能优异，而在田间却无法取得理想防效的原因。要规避这些环境中的不利因子影响，除了对菌株性能提出更高的要求外，生防菌制剂技术的改进和创新是最有操作性的解决方案。然而，生防菌的制剂技术数十年来鲜有革新，是生物农药产业的短板，已无法满足产业需求。农药增效剂是农药制剂工艺中非常重要的助剂，它可以提高药剂防效的同时降低用药成本，减缓农药抗性，减少环境污染。而生物农药对助剂的要求更高，除了提高药剂的施用性能外，还需要对生防菌无毒害，并有提高其抗逆性、有利于其在环境中定殖。目前，市场上的生物农药增效剂多为微生物发酵产物、提取物、生物质等天然材料，不但成分不可控制，往往不能实现理想的效果。因此，生物农药产业迫切需要高效、稳定的生物农药增效剂。

生物膜（Biofilm）是一种细菌组成的群落结构，有助于其抵抗外界不良环境的影响，对生防菌有着重要的意义。芽孢杆菌被释放到田间后，尤其是像稻田这种潮湿的环境中会产生生物膜结构，有利于其降低紫外线、高温等不利因子对其生存和定殖的影响。研究表明，越早形成稳定、成熟的生物膜结构，越有利于芽孢杆菌在环境中的定殖，稳定的发挥生防效应。

二水氧化三甲胺（Trimethylamine-N-oxide dehydrate, CAS:62637-93-8）。分子式为(CH₃)₃NO•2H₂O，其应用比较广泛，因具有弱的氧化性而在有机合成工业中用作氧化剂，可以用作调味剂及工业辅料。该化合物天然广泛分布于海产硬骨鱼类的肌肉中，被认为起到蛋白质稳定剂的作用。在农药行业中该化合物查不到应用记录，更没有在生物农药生产上的应用及相关报道。

发明内容

针对现有技术中芽孢杆菌类活体生物农药不易在工作环境中定殖以及由此带来的防效不高、防效不稳定等诸多问题，本发明设计的目的在于利用二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药的增效剂，二水氧化三甲胺可以通过提高芽孢杆菌的抗逆性，促进其环境中的定殖，提高生物杀菌剂的稳定性和防效。

本申请具体通过以下技术方案实现：

二水氧化三甲胺作为一种增效剂的应用。

二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药的增效剂的应用。

二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药防治植物病害中的增效剂的应用。

二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌生长的增效剂的应用。

二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌防效提高的增效剂的应用。

二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌生物膜形成的增效剂的应用。

一种芽孢杆菌类复配生物农药，其特征在于含有二水氧化三甲胺和芽孢杆菌,所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌或芽孢杆菌属（Bacillus）内其他生防菌。

进一步，所述二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂中的添加比例m/m为0.1%～10%，所述芽孢杆菌含有1～1000亿芽孢/克。

二水氧化三甲胺可溶于水，作为一种生物农药添加剂，可以直接加入芽孢杆菌类各种剂型中而无需改动现有的制剂工艺，也可以直接加入配制好的工作液中。

二水氧化三甲胺对芽孢杆菌毒性极低，不会对芽孢杆菌的生长造成不利影响。

二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂中添加比例在0.1%-10%（m/m），会明显提高芽孢杆菌类生物农药的生防效果，同时对菌的活力无抑制作用。

添加一定比例的二水氧化三甲胺可以延长芽孢杆菌类生物药剂的持效期。

二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂中添加比例小于0.1%（m/m）和大于10%（m/m）也会提高芽孢杆菌类生物农药的生防效果。

二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂工作液中的浓度在1-100毫克/升时会明显提高芽孢杆菌类生物农药的生防效果，同时对菌的活力无抑制作用。

二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂工作液中的浓度在小于1毫克/升和大于100毫克/升时也会提高芽孢杆菌类生物农药的生防效果。

本发明创新性地利用二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药的增效剂，二水氧化三甲胺可以通过增强芽孢杆菌类杀菌剂的抗逆性、促进其环境中的定殖，以提高生物杀菌剂的稳定性和防效，该成果是生物农药研究领域的一个创新，在生物农药产业上具有重大应用潜力。

附图说明

图1为二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌发酵速度的影响；

图2为二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌定殖能力的影响；

图3为二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌生物膜形成的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，以便更好地理解本发明技术方案。

实施例1 ：二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌防治水稻纹枯病的增效作用

1、试验条件：试验地点在中国水稻研究所的试验田，供试作物为水稻（秀水134）。所有试验小区的培养条件均匀一致。

2、试验设计：试验共设计7个处理，每个处理设置3个重复，每个重复小区面积22平方米。

（1）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（2）5% 二水氧化三甲胺 WP 用量100克/亩；

（3）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克+0.1% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（4）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克+1% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（5）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克+5% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（6）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克+10% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（7）清水对照。

3、施药与调查

分别在分蘖期施药，用水量按照40公斤/亩，采用电动喷雾器，粗雾喷施在水稻中下部茎秆、叶鞘。采用国标《田间药效试验准则（一） GB/T 17980.20-2000 杀菌剂防治水稻纹枯病》，分别于药后10天和20天调查水稻纹枯病的发生状况，并统计防效。

4、试验结果

试验结果如表1所示，不论是在药后10天还是药后20天，添加了0.1%—10%的二水氧化三甲胺后，对枯草芽孢杆菌防效的提升作用明显。而二水氧化三甲胺本身对水稻纹枯病几乎没有任何作用效果，说明二水氧化三甲胺起到了增效剂的作用。

从增效作用来看，药后10天的增效作用为8.37-27.55%，药后20天增效作用更为明显，达到17.11-37.41%。

药后20天在无二水氧化三甲胺存在的情况下，枯草芽孢杆菌防效迅速下降至40.9%，而添加了二水三甲胺的各处理虽然防效也有一定程度的下降，但是下降幅度明显更低，说明二水氧化三甲胺可以延长枯草芽孢杆菌的持效期。

表1二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌防治水稻纹枯病的增效作用

实施例2：二水氧化三甲胺对芽孢杆菌防治水稻稻瘟病的增效作用

1、试验条件：试验地点在中国水稻研究所临安稻瘟病试验基地开展，供试作物为水稻（南粳46）。所有试验小区的培养条件均匀一致。

2、试验设计：试验共设计10个处理，每个处理设置3个重复，每个重复小区面积25平方米。

（1）5% 二水氧化三甲胺 WP 用量100克/亩；

（2）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（3）枯草芽孢杆菌H158 10亿芽孢/克+5% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（4）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（5）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克+5% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（6）蜡质芽孢杆菌 20亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（7）蜡质芽孢杆菌 20亿芽孢/克+5% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（8）解淀粉芽孢杆菌B102 100亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（9）解淀粉芽孢杆菌B102 100亿芽孢/克+5% 二水氧化三甲胺WP 用量100克/ 亩；

（10）清水对照。

3、施药与调查

分别在破口期和齐穗期各施药一次，用水量按照40公斤/亩，采用电动喷雾器，细雾喷施。采用国标《田间药效试验准则（一） GB/T 17980.19-2000杀菌剂防治水稻叶部病害》，待病害发生稳定时调查穗颈瘟的发生状况，并统计防效。

4、试验结果见表2。

表2二水氧化三甲胺对芽孢杆菌防治水稻稻瘟病的增效作用

试验结果如表2所示，加入5%二水氧化三甲胺对芽孢杆菌防治水稻稻瘟病的防效提升作用明显，其中对贝莱斯芽孢杆菌W1682防效的增效作用最明显，达到了27.20%。对其他三种芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的增效作用也分别达到了11.54%，22.06%和18.38%，说明二水氧化三甲胺对多种芽孢杆菌的防病效果都表现出优异的增效作用。

实施例3：二水氧化三甲胺对芽孢杆菌防治水稻稻曲病的增效作用

1、试验条件：试验地点在中国水稻研究所富阳试验基地开展，供试作物为水稻籼粳杂交稻品种（甬优12）。所有试验小区的培养条件均匀一致。

（1）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克 WP 用量100克/ 亩；

（2）二水氧化三甲胺至工作浓度100毫克/升；

（3）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克用量100克/ 亩，稀释成工作液后加入二水氧化三甲胺至1毫克/升；

（4）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克用量100克/ 亩，稀释成工作液后加入二水氧化三甲胺至10毫克/升；

（5）贝莱斯芽孢杆菌W1682 10亿芽孢/克用量100克/ 亩，稀释成工作液后加入二水氧化三甲胺至100毫克/升；

（6）清水对照。

3、施药与调查

分别在破口期前5-7天和齐穗期各施药一次，用水量按照40公斤/亩，采用电动喷雾器，细雾喷施。采用国标《NYT 1464.54-2014 农药田间药效试验准则第54部分：杀菌剂防治水稻稻曲病》，待病害发生稳定时调查稻曲病的发生状况，并统计防效。

4、试验结果见表3。

表3二水氧化三甲胺对贝莱斯芽孢杆菌防治水稻稻曲病的增效作用

试验结果如表3所示，工作液中加入1-100毫克/升的二水氧化三甲胺可以将贝莱斯芽孢杆菌W1682的防效提高9.67-18.87%。说明二水氧化三甲胺直接添加到芽孢杆菌工作液中，同样可以明显提高防治效果。

实施例4：二水氧化三甲胺对芽孢杆菌发酵状况的影响

配制NB培养基，每250mL三角瓶（Corning）中盛50mL，将二水氧化三甲胺加入NB培养基中，配制成浓度梯度，0、0.2、2、20、200和400mgL^-1，每个浓度配制3瓶。每瓶接种50NTU的H158种子液50μL。28℃200rpm培养12h后，浊度仪（2100N，美国哈希）测浊度。以下列公式计算相对浊度值。

结果如图1所示，从中可以看出二水氧化三甲胺在0.2、2、20、200和400 mg/L等五个浓度下相较对照浊度都有一定提升，说明二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌具有一定的促生长作用。尽管这种促生长作用并不明显，但至少可以说明二水氧化三甲胺即使在400 mg/L的高浓度下也不会对枯草芽孢杆菌表现出毒性。

实施例5 ：二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌定殖能力的影响

将H158菌株浓度调整至1×10⁸cfu/mL，加入二水氧化三甲胺至终浓度100mg/L，喷施在水稻植株表面（甬优12分蘖末期），不加二水氧化三甲胺直接喷施菌悬液作为对照。分别于施药后0（施药2h等喷施的液体自然蒸发）、1、3、6、10、15和21d采集叶片标本。提取DNA，根据Jørgensen和Leser发表的方法开展qPCR，探针和引物为上海博尚生物公司合成，定量PCR试剂盒Promega采用GoTaq Probe qPCR Master Mix，定量PCR平台采用7500系统，利用CT值计算单位质量的叶片中含有的枯草芽孢杆菌的量（cfu g^-1）。

结果如图2所示，不论是否加入二水氧化三甲胺在喷施后的第一天，枯草芽孢杆菌H158菌株的留存量都大幅下降。在前3天，是否加入二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌水稻表面的留存量差别不大。但是从第六天开始加入二水氧化三甲胺使枯草芽孢杆菌菌株的留存量大大高于对照，乃至到了21天加入二水氧化三甲胺处理的枯草芽孢杆菌菌株的留存量已是未加对照的千倍以上。这说明二水氧化三甲胺可以促进枯草芽孢杆菌菌株在水稻表面的定殖，这应该是其大幅提高芽孢杆菌防效并延长其持效期的主要机制。

实施例6：二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌生物膜形成的影响

将二水氧化三甲胺加入MSGG培养基中至终浓度0，50和100mg/L，H158接种NB培养基，37℃培养至对数生长期，稀释到50NTU，按照1%的比例接种含不同浓度二水氧化三甲胺的MSGG培养基，加入96孔培养板（200μL每孔用于定量研究），置于28℃黑暗培养。分别在培养24，36，48，72，96和120h观察MSGG培养基上生物膜的形成，并按照下列方法对形成的生物膜开展定量研究：用排枪吸去培养基，加入200 μL 0.1%的结晶紫溶液（上海源叶生物）染色20min，吸去结晶紫，用200 μL PBS缓冲液清洗两次，采用200 μL无水乙醇脱色20min，采用TECAN酶标仪，在581nm下测吸光值，根据吸光值对生物膜定量。

二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌生物膜形成的影响结果如图3所示，在24h有无二水氧化三甲胺对枯草芽孢杆菌生物膜的形成影响不大；在36h和48h，不同浓度的二水氧化三甲胺都表现出对枯草芽孢杆菌生物膜的形成的促进作用；72h和96h二水氧化三甲胺对生物膜形成的影响已经不明显。从结果来看，二水氧化三甲胺可以促进枯草芽孢杆菌更早的形成生物膜结构。从图2可以看出，芽孢杆菌施用后的初期，菌量下降最为明显。生物膜是芽孢杆菌对抗外界不利因素的重要结构，越早形成稳定、成熟的生物膜结构，越有利于芽孢杆菌在环境中的定殖，稳定的发挥生防效应。这可能是二水氧化三甲胺对芽孢杆菌增效作用的主要机制。

Claims

1.二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药的增效剂的应用。

2.二水氧化三甲胺作为芽孢杆菌类生物农药防治植物病害中的增效剂的应用。

3.二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌生长的增效剂的应用。

4.二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌防效提高的增效剂的应用。

5.二水氧化三甲胺作为促进芽孢杆菌生物膜形成的增效剂的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂中的添加比例m/m为0.1%～10%。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于二水氧化三甲胺在芽孢杆菌类生物药剂工作液中的浓度为1～100毫克/升。