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CN113677809A - 杀昆虫蛋白 - Google Patents

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CN113677809A
CN113677809A CN201980069739.9A CN201980069739A CN113677809A CN 113677809 A CN113677809 A CN 113677809A CN 201980069739 A CN201980069739 A CN 201980069739A CN 113677809 A CN113677809 A CN 113677809A
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Syngenta Participations AG
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Abstract

披露了用于控制植物有害生物的组合物和方法。特别是，提供了对至少鞘翅目昆虫有害生物具有毒性的新颖嵌合杀昆虫蛋白。还提供了编码所述新颖杀昆虫蛋白的核酸分子。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本发明的杀昆虫蛋白的核酸的方法，例如，在转基因植物中以赋予免于昆虫损害的保护。

Description

杀昆虫蛋白
技术领域
本发明涉及蛋白工程、植物分子生物学以及有害生物控制的领域。更具体地，本发明涉及具有杀昆虫活性的嵌合蛋白，其表达产生所述嵌合杀昆虫蛋白的核酸，以及制造这些嵌合杀昆虫蛋白和相应的核酸的方法和使用这些嵌合杀昆虫蛋白和相应的核酸来控制昆虫的方法。
背景技术
昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。
玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。单在美国，三个物种，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、以及黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)，在美国玉米带中，每年对玉米造成的损失超过十亿美元。美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae))。在南美洲，南美叶甲(DiabroticaSpeciosa)被认为是玉米的重要有害生物。西方玉米根虫于1992年传播到欧洲，自2008年以来一直在整个主要玉米种植地区造成经济损失。玉米根虫幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。
玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。由化学杀有害生物剂的广泛使用产生的另一个问题是出现了抗性昆虫品种。又另一个问题是由于下述事实：玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得施用杀昆虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀昆虫剂的施用是在种植时预防性地进行的。这种实践导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。
生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(Δ-内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，也已经施用至作物植物中，产生了针对昆虫有害生物的令人满意的结果。这些δ-内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白质，已知它们当被某些昆虫摄取时拥有杀昆虫活性。来自苏云金芽孢杆菌的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或eCry3.1Ab蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。
尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白质，与现有昆虫控制产品相比这些蛋白质具有不同的作用方式、以缓和抗性发展。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是令人希望的。
发明内容
鉴于这些需求，本发明提供了使用从沙雷氏菌属和相关细菌中的细菌中分离的蛋白质的结构域构建的新颖嵌合杀昆虫蛋白。衍生嵌合蛋白的结构域的杀昆虫蛋白是SproCRW(SEQ ID NO:1)、SplyCRW(SEQ ID NO:2)、SquiCRW(SEQ ID NO:3)、Plu1415(SEQOID NO：17)或WoodsCRW(SEQ ID NO:4)，它们的变体，和与SproCRW、SplyCRW、SquiCRW、Plu1415或WoodsCRW基本相同的蛋白质及它们的变体。本发明的嵌合杀昆虫蛋白对至少鞘翅目有害生物具有毒性，特别是玉米根虫(根萤叶甲属物种)有害生物。本发明进一步涉及编码嵌合杀昆虫蛋白和/或其变体的核酸分子，它们的互补序列，或编码与嵌合杀昆虫蛋白和/或其变体基本相同的蛋白的核酸分子，它们的互补序列。
本发明还提供了含有这样的重组(或与其互补的)核酸的载体；包括和能够表达这样的核酸的植物或微生物；用这样的核酸转化的植物，例如转基因玉米植物；这样的植物的后代，其含有稳定地掺入和以孟德尔方式遗传的核酸，和/或这样的植物的种子和这样的后代。本发明还包括育种的方法，以将包含本发明的核酸分子的转基因引入子代植物和各种种质中。
本发明还提供了包含本发明的嵌合杀昆虫蛋白或其变体的组合物和配制品，其能够抑制昆虫有害生物存活、生长和/或繁殖的能力，或限制与昆虫相关的对作物的损害或损失的能力，例如，将嵌合杀昆虫蛋白或其变体作为组合物或配制品的一部分施用于受昆虫侵染的区域或植物，或预防性处理易受昆虫侵染的区域或植物以赋予对昆虫有害生物的保护。
本发明进一步涉及制备本发明的嵌合杀昆虫蛋白或其变体的方法，以及使用这些核酸的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。
本文描述的新颖嵌合杀昆虫蛋白针对昆虫具有活性。例如，在一些实施例中，本发明的蛋白质可用于控制经济上重要的昆虫有害生物，包括鞘翅目昆虫，如西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)、北方玉米根虫(NCR；长角巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(SCR；黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(MCR；墨西哥玉米根萤叶甲)。本发明的嵌合杀昆虫蛋白可以单独使用或与其他昆虫控制策略组合使用，来以最小的环境影响赋予针对相同昆虫有害生物的增强的有害生物控制效率和/或增加靶昆虫的谱。
通过学习本发明的以下说明书和非限制性实例，本发明的其他方面和优点对于本领域的技术人员而言将变得清楚。
序列表中的序列简述
SEQ ID NO:1是变形斑沙雷氏菌SproCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是普利茅斯沙雷氏菌SplyCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是奎沃斯沙雷氏菌(Serratia Quinivorans)SquiCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是WoodsCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是SplyCRW/SproCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是SproCRW/SplyCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是SproCRW/WoodsCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是WoodsCRW/SproCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是SplyCRW/WoodsCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是WoodsCRW/SplyCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是SplyCRW/SproCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是SproCRW/SplyCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是SproCRW/WoodsCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是WoodsCRW/SproCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是SplyCRW/WoodsCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是WoodsCRW/SplyCRW大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是Plu1415氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是Plu1415/SproCRW嵌合氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是Plu1415/SplyCRW嵌合氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是Plu1415/SproCRW嵌合大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是Plu1415/SplyCRW嵌合大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是Plu1415/HmassCRW嵌合氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是Plu1415/Hmass嵌合大肠杆菌优化的核苷酸序列。
具体实施方式
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露，本文建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入本文。
在此提供的核苷酸序列以5’至3’方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37 CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述，例如：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。
氨基酸同样是使用WIPO标准ST.25来指示，例如：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。
除非上下文另外指示，否则明确地预期本文所述的本发明的不同特征能以任何组合使用。此外，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文陈述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
定义
为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：
当在此和所附权利要求书中使用时，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。
如在此使用的，词语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
术语“约”本文用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐述的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。
如本文使用的，术语“扩增的”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西索加的坎基尼公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications[诊断分子微生物学：原理与应用],PERSING等人编,华盛顿美国微生物学会(American Society for Microbiology,Washington,D.C.),(1993)。扩增产物被称为“扩增子”。
本发明的杀昆虫蛋白的“活性”意指杀昆虫蛋白作为口服活性的昆虫控制剂发挥作用，具有毒性作用、和/或能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本发明的杀昆虫蛋白被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以使该杀昆虫蛋白可达该昆虫的来源为食。“杀有害生物的”被定义为有毒的生物活性，其能够控制有害生物(如昆虫、线虫、真菌、细菌或病毒)，优选地通过杀死或破坏它们来进行控制。“杀昆虫的”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫，优选地通过杀死它们来进行控制。“杀有害生物剂”是具有杀有害生物活性的药剂。“杀昆虫剂”是具有杀昆虫活性的药剂。
如在此使用的术语“嵌合构建体”或“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”或“嵌合蛋白”(或类似术语)是指如下构建体或核酸分子或蛋白质，该构建体或核酸分子或蛋白质分别包含被组装进单个核酸分子或蛋白质中的不同来源的两个或更多个多核苷酸或氨基酸基序或结构域。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指如下任何构建体或分子，该构建体或分子含有但不限于(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，构建体中的至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白质部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸可以包含衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包含衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行布置的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本发明的一些实施例中，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包含表达盒，该表达盒包含在调节多核苷酸的控制下、特别地在植物或细菌中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本发明的多核苷酸。
术语“嵌合蛋白”是指包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的蛋白质：氨基酸序列，例如来自两个或更多个不同来源的基序或结构域。这些来源可以是来自不同杀昆虫蛋白的结构域或基序，当它们结合成一个嵌合蛋白时，就形成非天然存在的嵌合杀昆虫蛋白。
“编码序列”(也称为CDS)是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。
“控制”昆虫意指通过毒性作用抑制了昆虫有害生物存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物中的损失。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。
如在此使用的，“密码子优化的”序列意指如下核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由待优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)进行了密码子优化的序列。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014，通过引用并入本文。
“控制”昆虫意指通过毒性作用抑制昆虫有害生物存活、生长、摄食、或繁殖的能力，或者限制昆虫相关的作物植物损害或损失，或者保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时的作物的产量潜力。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。
术语“包含(comprises或comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。
如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
在本发明的上下文中，“对应于(corresponding to或corresponds to)”意指当杀昆虫蛋白或其变体或同源物的氨基酸序列与彼此比对时，“对应于”在该变体或同系物蛋白中某些枚举的位置的氨基酸是与参考蛋白中的这些位置比对的那些，但在相对于本发明的特定参考氨基酸序列而言的这些精确的数字位置中是不必要的。例如，如果SEQ ID NO:1是参考序列，并且与SEQ ID NO:2比对，则SEQ ID NO:2的位置420的氨基酸Asn(Asn420)“对应于”SEQ ID NO:1的位置421的Asn(Asn421)，或例如SEQ ID NO:2的Asn424“对应于”SEQ IDNO:1的Gly425。
“递送”组合物或毒性蛋白意指该组合物或毒性蛋白与昆虫接触，这促进该组合物或毒性蛋白的经口摄取，产生对昆虫的毒性作用和控制。可以按照许多公认的方式，包括但不限于转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、饵基(bait matrix)、或任何其他的领域公认的蛋白质递送系统来递送该组合物或毒性蛋白。
术语“结构域”是指沿着进化相关蛋白的序列的比对在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸可在同系物之间有所不同，但是在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能中很可能是必需的氨基酸。通过其在蛋白质同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽组。
“控昆虫有效量”意指杀昆虫蛋白的浓度，其通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“控昆虫有效量”可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。
如本文使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，该目的核苷酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含适当翻译该核苷酸序列所需要的序列。包含该目的核苷酸序列的表达盒可能具有其组分中的至少一种，该组分相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才引发转录。在多细胞生物体(例如植物)的情况下，该启动子对于特定组织、或器官、或者发育阶段也可以是特异的。
包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒还可以是包括驱动其天然基因的天然启动子，然而已经以对于异源表达有用的重组形式获得。表达盒的这种用途使它如此在其被引入的细胞中不是天然存在的。
表达盒还可以任选地包括在植物中发挥作用的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出目的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以是源自另一种来源(即，对于启动子、目的核苷酸序列、植物宿主、或其任何组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。任何已知在植物中发挥作用的可供使用的终止子均可以在本发明的上下文中使用。
当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义RNA或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。
“基因”是位于基因组内并且包含编码核酸序列的限定区域，并且典型地还包含其他负责控制该编码部分表达(也就是转录和翻译)的主要调节性核酸。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。如在自然界中所发现，基因的调节核酸序列在正常情况下可能不与该相关联的核酸序列进行可操作地连接，并因此不会是嵌合基因。
“目的基因”是指当转移至植物时，在该植物上赋予所希望的性状(如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、非生物胁迫耐受性、雄性不育、改性脂肪酸代谢、改性碳水化合物代谢、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力)的任何核酸分子。“目的基因”还可以是被转移至植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的基因。
“异源”核酸序列或核酸分子是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列或核酸分子，包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多个拷贝。异源核酸序列或核酸分子可以包含嵌合序列，如嵌合表达盒，在该表达盒中，启动子和编码区源自多源生物。启动子序列可以是组成型启动子序列、组织特异性启动子序列、化学诱导型启动子序列、伤口诱导型启动子序列、胁迫诱导型启动子序列、或发育阶段特异性启动子序列。
“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。
“同源重组”是在同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。
在两个核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“同一性”或“相同的”或“基本上相同的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、优选至少80％、更优选90％、甚至更优选95％、并且最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。优选地，该基本的同一性存在于整个具有长度为至少约50个残基或碱基的序列的区域中，更优选地在整个至少约100个残基或碱基的区域中，并且最优选地这些序列在至少约150个残基或碱基上是基本上相同的。在尤其优选的实施例中，在整个编码区域长度中的序列是基本上相同的。此外，基本上相同的核酸或氨基酸序列基本上执行相同的功能。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group),科学街575号(575ScienceDr.),麦迪逊,威斯康星州)，或通过目测检查(总体上参见Ausubel等人,下文)。
适合于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information，美国国家医学图书馆(U.S.National Library ofMedicine)，洛克维尔大道8600号(8600Rockville Pike)，贝塞斯达，马里兰州20894美国)可供公众使用的。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。
两个核酸序列基本上相同的另一个指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在所述序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“基本上结合”是指在探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，所述错配可以通过降低杂交介质的严格来容纳，以实现靶核酸序列的所希望的检测。
在核酸杂交实验(如DNA杂交和RNA杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”Elsevier[爱思唯尔集团],纽约。通常，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的靶子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格条件被选定为等于特定探针的Tm。对于互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2×SSC洗涤在65℃下持续15分钟(参见，Sambrook，下文，对于SSC缓冲液的说明)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的实例是1×SSC在45℃下持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是4-6×SSC在40℃下持续15分钟。对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0-8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且所述温度典型地是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。一般而言，相比于不相关的探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的信噪比就表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码子简并而创建核酸的拷贝时，则发生这种情况。
以下是可以用来克隆同源核苷酸序列(所述序列与本发明的参考核苷酸序列基本上相同)的杂交/洗涤条件的设置的实例：参考核苷酸序列在以下条件下优选地与所述参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在2×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在1×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；仍更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.5×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1×SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤。
两个核酸序列或蛋白质基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上相同的，例如其中这两种蛋白质仅在保守性取代上不同。
术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白质是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白质。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或蛋白质可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌或转基因植物中。因此，当核酸分子或多核苷酸包含在转基因植物基因组内或蛋白质在转基因植物中表达时，如本文所列举的对“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白质的权利要求涵盖了所述核酸分子、多核苷酸或蛋白质。
“核酸分子”或“核酸序列”或“多核苷酸”是可以从任何来源中分离的单链或双链DNA或RNA的区段。在本发明的上下文中，核酸分子、核酸序列或多核苷酸典型地是DNA的区段。在一些实施例中，分离本发明的核酸分子、核酸序列或多核苷酸。
“可操作地连接”是指在单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸或功能RNA的表达时(即，该编码多核苷酸或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码多核苷酸或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。
如在此使用的“杀有害生物”、“杀昆虫”等是指本发明的嵌合蛋白控制有害生物的能力或者可以控制如在此所定义的有害生物的嵌合蛋白的量。因此，杀有害生物嵌合蛋白可以杀死或抑制有害生物(例如，昆虫有害生物)存活、生长、摄食、或繁殖的能力。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(诸如像植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文所使用的，“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
“多核苷酸”是指由共价键合于链中的许多核苷酸单体构成的聚合物。此类“多核苷酸”包括DNA、RNA、经修饰的寡核苷酸(例如，包含对于生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另外指示，否则本发明的具体核酸或多核苷酸任选地包含或编码除明确指示的任何多核苷酸之外的互补多核苷酸。
“目的多核苷酸”是指任何多核苷酸，当其转移至生物(例如，植物)中时赋予该生物所希望的特征，如昆虫抗性、疾病抗性、除草剂耐受性、抗生素抗性、改进的营养价值、工业过程中改进的性能、商业上有价值的酶或代谢物的生产、或者改变的繁殖能力。
“启动子”是编码区的不被翻译的DNA序列上游，其包含RNA聚合酶结合位点并且起始DNA的转录。启动子区还可以包括充当基因表达的调节物的其他元件。
如在此使用的，术语“重组”是指核酸分子(例如，DNA或RNA)或蛋白质或生物的如下形式，该形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。如在此使用的，“重组核酸分子”是包括多核苷酸组合的核酸分子，这些多核苷酸不会天然地一起存在并且是人类干预的结果，例如，由至少两种彼此异源的多核苷酸的组合组成的核酸分子，或人工合成的(例如，使用组装的核苷酸序列合成的多核苷酸)并且包含偏离通常存在于自然界中的多核苷酸的多核苷酸的核酸分子，或包含人工掺入至宿主细胞的基因组DNA中和该宿主细胞基因组相关侧翼DNA中的转基因的核酸分子。重组核酸分子的另一个实例是由将转基因插入至植物的基因组DNA中产生的DNA分子，其可以最终导致该生物中的重组RNA/或蛋白质分子的表达。如在此使用的，“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且含有掺入至其基因组中的转基因和/或异源核酸分子。由于此类基因组改变，该重组植物明显不同于相关的野生型植物。
“调节元件”是指参与控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子以及终止信号。它们还典型地涵盖适当翻译该核苷酸序列所需的序列。
“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。在具体实施例中，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物的基因组(核或质体)中。
“转化的/转基因的/重组的”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物例如细菌或植物。核酸分子可以稳定整合到宿主基因组中，或者，核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含该异源的核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。
本发明提供了用于控制有害的植物有害生物的组合物以及方法。特别地，本发明涉及新颖嵌合杀昆虫蛋白，其至少对鞘翅目昆虫具有活性，例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)(北方玉米根虫；NCR)和/或黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)和/或马铃薯甲虫(Leptinotarsadecimlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado Potato Beetle)；CPB)。在一些实施例中，本发明的新颖嵌合杀昆虫蛋白可能对其他昆虫有害生物具有活性，包括鳞翅目昆虫有害生物，包括但不限于小地老虎(黑色地老虎)、小蔗螟(甘蔗蛀虫；SCB)和/或西南玉米螟虫(西南玉米螟；SWCB))。本发明还涉及核酸(它们的表达产生了本发明的嵌合杀昆虫蛋白)，以及涉及制造和使用这些嵌合杀昆虫蛋白以控制昆虫有害生物的方法。在实施例中，这些核酸的表达产生嵌合杀昆虫蛋白，其可用于至少控制鞘翅目昆虫有害生物(如西方玉米根虫、北方玉米根虫和/或南方玉米根虫)，特别是当表达于转基因植物(如转基因玉米植物)中时。
本发明进一步涵盖了核酸分子，该核酸分子包含编码本发明的嵌合杀昆虫蛋白的核苷酸序列。可优化核苷酸序列用于在细菌(如大肠杆菌)中表达或用于在植物(如玉米(玉蜀黍))中表达。为在异源生物中表达而优化的核苷酸序列不是天然存在的，所述异源生物是诸如不同于该序列起源的细菌或植物的物种。在该实施例的一个方面中，核酸分子包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:11-16、20、21和/或23中任一个的核苷酸序列。制造编码本发明的嵌合杀昆虫蛋白的核酸分子的方法的具体示例性教导可以在本申请的实例中找到。本领域的技术人员应当认识到可以对由本发明所涵盖的制造嵌合杀昆虫蛋白的示范性方法进行修饰。
技术人员将认识到，用于商业用途的转基因，如包含SEQ ID NO:11-16、20、21和/或23中的任一个的核酸分子，可能需要对核酸序列的相对较小的修饰以符合政府法规标准。此类修饰将不会影响产生的分子的功能，该分子将与SEQ ID NO:11-16、20、21和/或23是基本上相同的。技术人员将认识到修饰的核酸分子将与起始分子是基本上相同的，并且涵盖于本发明中。
在一些实施例中，本发明涵盖对昆虫有害生物有毒的嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白以N末端至C末端方向包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)N末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与以下的氨基酸1到氨基酸338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352对应的氨基酸序列：(i)SEQID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iv)SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列，融合至(b)C末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与以下的氨基酸339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352或353到氨基酸488、489或490对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白的N末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)与SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(b)与SEQ IDNO:2的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(c)与SEQID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(d)与SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列。
在其他实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白的N末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488；或(b)SEQ ID NO:2的氨基酸1至氨基酸345，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQID NO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(c)SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(d)SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488。
在其他实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(b)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖对昆虫有害生物有毒的嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白以N末端至C末端方向包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)N末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:17的氨基酸1至约氨基酸363对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性的氨基酸序列，融合至(b)C末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(i)与SEQ ID NO:1约氨基酸位置347至约氨基酸位置489对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:2约氨基酸位置346至约氨基酸位置488对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白的N末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)与SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸347至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(b)与SEQ IDNO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且C末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列。
在其他实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少80％同一性至至少99％同一性的氨基酸序列；或(b)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
本发明的嵌合杀昆虫蛋白在生物测定中对昆虫有害生物进行测试时或在昆虫有害生物取食的转基因生物中表达时具有昆虫控制活性。在一些实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白至少对鞘翅目昆虫有害生物具有活性。鞘翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何鞘翅目昆虫，包括原鞘亚目、粘食亚目、肉食亚目和多食亚目、及其任何组合中的那些。
在其他实施例中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白对根萤叶甲属物种具有活性。根萤叶甲属是鞘翅目的一种甲虫属，通常被称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。示例性根萤叶甲属物种包括但不限于：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲指名亚种(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spotted cucumber beetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leaf beetle))、南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)；及其任何组合。
根据本发明的鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括瘦跗叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)，如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲虫属物种(Chrysomelaspp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leaf beetle))；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳
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(tobacco fleabeetle))和黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato flea beetle))：条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如十字花科跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(cruciferflea beetle))和西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(western black fleabeetle))；花象属物种(Anthonomus spp.)，如胡椒花象(A.eugenii，pepper weevil)；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫(wireworms))；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如甘蓝荚象甲(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbageseedpod weevil))；条跳甲属物种，如十字花科跳甲(十字花科植物跳甲)；Aeolus属物种(Aeolus spp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheatwireworm))；砂铁线属物种(Horistonotus spp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern corn billbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanese beetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如菜豆莹叶甲(C.trifurcate)(豆叶甲(Bean leaf beetle))；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(listerbeetles))；以及前述的任何组合。
本发明的嵌合杀昆虫蛋白也可对鳞翅目昆虫有害生物具有活性。鳞翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何被分类为鳞翅目的昆虫，包括在轭翅亚目、有喙亚目和异石蛾亚目及其任何组合内的那些昆虫物种。示例性鳞翅目昆虫包括但不限于：玉米螟属物种，如欧洲玉米螟(O.nubilalis，European corn borer)；菜蛾属物种，如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth)；灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋夜蛾(fall armyworm))、黄条粘虫(S.ornithogalli，yellowstripedarmyworm)、西部黄条粘虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm)、南部粘虫(S.eridania，southern armyworm)和甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)；地老虎属物种，如小地老虎(A.ipsilon)(黑色地老虎)、普通地老虎(A.segetum，common cutworm)、泥背地老虎(A.gladiaria，claybacked cutworm)和西部灰地老虎(A.orthogonia，palewestern cutworm)；切根虫属物种(Striacosta spp.)，如豆白缘切根虫(S.albicosta)(西部豆切根虫(western bean cutworm))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)，如玉米穗虫(H.zea)(玉米穗蛾(corn earworm))、茶色铃夜蛾(H.punctigera)(原生夜蛾(nativebudworm))、海灰翅夜蛾(S.littoralis)(埃及棉树叶虫(Egyptian cotton leafworm))和棉铃虫(H.armigera，cotton bollworm)；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)，如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟夜蛾(tobacco budworm))；蔗螟属物种(Diatraea spp.)，如西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)和小蔗螟(D.saccharalis)(甘蔗蛀虫))；粉纹夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)，如粉纹夜蛾(T.ni，cabbage looper)；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)，如地中海玉米螟(S.nonagroides，Mediterranean corn borer)；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)，如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm)；纹卷蛾属物种(Cochylis spp.)，如向日葵细卷叶蛾(C.hospes，banded sunflower moth)；天蛾属物种(Manduca spp.)，如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)，如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；尺夜蛾属物种(Pseudoplusia spp.)，如大豆尺蠖(P.includens)(大豆夜蛾)；干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)，如黎豆夜蛾(A.gemmatalis)(绒毛豆毛虫(velvetbeancaterpillar))；绿夜蛾属物种(Plathypena spp)，如苜蓿绿夜蛾(P.scabra，greencloverworm)；马醉木属物种(Pieris spp.)，如大菜粉蝶(P.brassicae)(纹白蝶(cabbagebutterfly))；夜蛾属物种(Papaipema spp.)，如蛀茎夜蛾(P.nebris，stalk borer)；黏虫属物种(Pseudaletia spp.)，如一星黏虫(P.unipuncta)(普通黏虫)；疆夜蛾属物种(Peridroma spp.)，如杂色地老虎(P.saucia，variegated cutworm)；茄茎麦蛾属物种(Keiferia spp.)，如番茄蠹蛾(K.lycopersicella，tomato pinworm)；菜粉蝶属物种(Artogeia spp.)，如菜粉蝶(A.rapae，imported cabbageworm)；茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)，如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm)；透翅缓夜蛾属物种(Crymodes spp.)，如C.devastator，glassy cutworm；脏切叶蛾属物种(Feltiaspp.)，如脏切夜蛾(F.ducens，dingy cutworm)；以及前述的任何组合。在该实施例的一个方面中，本发明的嵌合杀昆虫蛋白针对黑色地老虎、甘蔗蛀虫和/或西南玉米螟具有活性。
本发明的嵌合杀昆虫蛋白还可以针对半翅类、双翅类、草盲蝽属物种和/或其他刺吸式昆虫(例如直翅目或缨翅目的刺吸式昆虫)具有活性。双翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何双翅目昆虫，包括但不限于斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)，如三叶斑潜蝇(L.trifolii)(潜叶虫(leafminer))和美洲斑潜蝇(L.sativae)(蔬菜潜叶虫(vegetable leafminer))；Scrobipalpula属物种，如番茄潜叶虫(S.absoluta，tomatoleafminer)；地种蝇属物种(Delia spp.)，如玉米蝇蛆(D.platura)(玉米种蝇(seedcornmaggot))、甘蓝种蝇蛆(D.brassicae)(甘蓝种蝇(cabbage maggot))和甘蓝根花蝇(D.radicum，cabbage root fly)；锈蝇属物种(Psilia spp.)，如胡萝卜锈蝇(P.rosae，carrot rust fly)；根斑蝇属物种(Tetanops spp.)，如甜菜根蛆(T.myopaeformis)(甜菜根斑蝇(sugarbeet root maggot))；以及前述的任何组合。
直翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何直翅目昆虫，包括但不限于黑蝗属物种(Melanoplus spp.)，如异黑蝗(M.differentialis)(长额负蝗(Differential grasshopper))、赤胫黑蝗(M.femurrubrum，Redlegged grasshopper))、双带黑蝗(M.bivittatus，Twostriped grasshopper))；及其任何组合。
缨翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何缨翅目昆虫，包括但不限于花蓟马属物种(Frankliniella spp.)，如西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))和烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))；和蓟马属物种(Thrips spp.)，如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips))、瓜蓟马(T.palmi，melon thrips)；以及前述的任何组合。
本发明的嵌合杀昆虫蛋白还可以针对线虫具有活性。如本文使用的术语“线虫”涵盖目前已知的或之后鉴定的任何被分类为动物界线虫门的生物，包括但不限于有腺纲(包括例如：嘴刺目、等咽目、单齿目、矛线目、毛首目、索虫目、姆斯帕目、薄咽目、色矛目、带线虫目、链环目和单宫目)和/或胞管肾纲(包括例如：小杆目、圆线虫目、蛔虫目、旋尾目、驼形目、双胃目、垫刃目和滑刃目)中的线虫。
线虫包括但不限于寄生线虫，如根结线虫、胞囊线虫和/或腐线虫。根据本发明的线虫的示例性属包括但不限于：根结线虫属(根结线虫)、异皮线虫属(胞囊线虫)、球异皮线虫属(Globodera)(胞囊线虫)、穿孔线虫属(穿孔线虫)、肾状线虫属(肾形肾状线虫)、短体线虫属(腐线虫)、滑刃线虫属(叶面线虫)、螺旋线虫属(螺旋线虫)、纽带线虫属(矛线虫)、拟毛刺属(短粗根线虫)、长针线虫属、珍珠线虫属(假根结线虫)、亚粒线虫属(Subanguina)、刺线虫属(刺线虫)、小环线虫属(小环线虫)、环线虫属(环线虫)、茎线虫属(茎线虫)、锥线虫属(锥线虫)、半轮线虫属(半轮线虫)、鞘线虫属(鞘线虫)、潜根线虫属(潜根线虫)、根结线虫属(Hypsoperine)、大茎线虫属(大茎线虫)、Melinius属、刻点胞囊属(Punctodera)、五沟线虫属(Quinisulcius)、盾线虫属(盾线虫)、剑线虫属(匕首线虫)、矮化线虫属(矮化线虫)、穿刺线虫属(穿刺线虫)、伞滑刃属(蛔虫)、及其任何组合。
根据本发明的示例性植物寄生线虫包括但不限于：细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，pine wood nematode)、龙胆轮线虫属(Criconemoides ornata)、马玲薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor，potato rot nematode)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci，stem and bulb nematode)、马铃薯胞囊线虫(Globodera pallida，potato cystnematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(金黄线虫(golden nematode))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii，sugar beet cyst nematode)；玉米胞囊线虫(Heterodera zeae，corn cystnematode)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、Heterodera trifolii(三叶异皮线虫)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、Hoplolaimusmagnistylus、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、北方根节线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)、异常珍珠线虫(Nacobbusaberrans)、Naccobus dorsalis、Paratrichodorus christiei、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、Pratylenchus hexincisus、落选短体线虫(Pratylenchusneglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Pratylenchus projectus、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、Pratylenchus tenuicaudatus、Pratylenchusthornei、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、Punctodera chaccoensis、Quinisulciusacutus、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、顺逆矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius)、柑桔半穿刺线虫(Tylenchulussemipenetrans)、美洲剑线虫(Siphinema americanum)、X.Mediterraneum、以及前述的任何组合。
本发明的嵌合杀昆虫蛋白可以与其他杀有害生物剂(例如Bt Cry蛋白)组合使用以增加有害生物的靶范围。此外，本发明的嵌合杀昆虫蛋白与杀昆虫剂(其具有不同的作用方式或靶向昆虫肠中不同的受体)相组合进行使用对于预防和/或管理昆虫抗性而言具有特定的功用。
第二杀有害生物剂可以是源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫蛋白。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白可以是许多杀昆虫蛋白中的任一种，包括但不限于：Cry1蛋白、Cry3蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry11蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry34蛋白连同Cry35蛋白、二元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、二元嵌合杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、二元杀昆虫蛋白PS149B1、营养期杀昆虫蛋白(VIP)(例如披露于美国专利5,849,870和5,877,012中，通过引用并入本文)、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、修饰的Cry3A蛋白、或由前述杀昆虫蛋白中的任一个制成的杂合蛋白或嵌合蛋白。在其他实施例中，苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白选自下组，该组由以下组成：Cry3Bb1、Cry34Ab1连同Cry35Ab1一起、mCry3A(美国专利号7276583，通过引用并入本文)、eCry3.1Ab(美国专利号8309516，通过引用并入本文)、和Vip3A蛋白(包括Vip3Aa(美国专利号6137033，通过引用并入本文))。
在一些实施例中，本发明涵盖核酸分子，所述核酸分子包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)编码嵌合杀昆虫蛋白的核苷酸序列，所述嵌合杀昆虫蛋白包含与SEQID NO:5-10、18、19或22中的任一个具有至少80％到至少99％同一性的氨基酸序列；或者(b)(a)的经密码子优化用于在转基因生物中表达的核苷酸序列。
在其他实施例中，本发明的核酸分子是密码子优化的，以便在转基因细菌和/或转基因植物中表达。在这些实施例的一些方面，细菌在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。在其他方面，本发明的核酸分子是密码子优化的，以便在转基因大肠杆菌细菌中表达。在仍其他的方面，植物是双子叶植物或单子叶植物。在仍其他的方面，双子叶植物选自由以下组成的组：大豆、向日葵、番茄、芸苔属作物、棉花、甜菜和烟草；或者单子叶植物选自由以下组成的组：大麦、玉米、燕麦、稻、高粱、甘蔗和小麦。在另外的方面中，核酸分子是密码子优化的，以便在转基因玉米植物中表达。在另外的方面，密码子优化用于在转基因生物中表达的本发明的核酸分子包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:11-16、20、21或23中任一个的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖包含可操作地连接于本发明的核酸分子的异源启动子的嵌合基因。在这些实施例的一些方面，异源启动子是植物可表达型启动子。在其他方面，所述植物可表达型启动子选自下组启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因9 5'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
在这些实施例的其他方面，所述核酸分子编码本发明的嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白对至少鞘翅目昆虫有害生物具有活性。在其他方面，鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。在仍其他方面中，根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)和玉蜀黍根萤叶甲(Diabrotica zeae)(墨西哥玉米根虫)。
本发明还涵盖重组载体或重组构建体，这些重组载体或构建体也可被称为载体或构建体，其包含本发明的表达盒和/或核酸分子。在此类载体中，这些核酸优选地处于表达盒中，这些表达盒包含用于在能够表达核酸分子的宿主细胞中表达核苷酸分子的调节元件。此类调节元件通常包含启动子和终止信号并且优选地还包含元件，这些元件允许由本发明的核酸所编码的多肽的有效的翻译。包含核酸的载体能够在特定的宿主细胞中复制(优选是作为染色体外分子)并因此可用来在这些宿主细胞中扩增本发明的核酸。本发明还涵盖宿主细胞，该宿主细胞含有本发明的表达盒或核酸分子。在一些实施例中，用于此类载体的宿主细胞是微生物(如细菌，特别是苏云金芽孢杆菌或大肠杆菌)，或真菌(如酵母)。在其他实施例中，用于此类重组载体的宿主细胞是内生菌或附生菌。在又其他实施例中，此类载体是病毒载体并被用于在特定的宿主细胞(例如昆虫细胞或植物细胞)中复制核苷酸序列。重组载体也用于将本发明的核酸分子转化到宿主细胞中，由此这些核酸分子被稳定整合到转基因宿主的DNA中。在一些实施例中，该转基因宿主是植物，例如单子叶植物，如玉米植物。在其他实施例中，转基因宿主植物是双子叶植物，如大豆植物或棉花植物。
在其他实施例中，将本发明的核酸分子中的至少一个插入到适当的表达盒(包含启动子以及终止信号)中。核酸的表达可以是组成型的，或者可以使用响应于各种类型的刺激以起始转录的诱导型启动子。在其他实施例中，其中表达了本发明的嵌合杀昆虫蛋白的细胞是微生物，如病毒、细菌或真菌。在其他实施例中，病毒(如杆状病毒)在其基因组中含有本发明的核酸分子并且在感染了适当的真核细胞(适合于病毒复制以及该核酸的表达)之后表达了大量相应的嵌合杀昆虫蛋白。将由此产生的嵌合杀昆虫蛋白用作杀昆虫剂。可替代地，被工程化以包括该核酸的杆状病毒被用来体内感染昆虫并通过该杀昆虫毒素的表达或通过病毒感染与该杀昆虫毒素的表达的组合而将其杀死。在一个另外的实施例中，本发明还涵盖了用于产生具有杀昆虫活性的嵌合蛋白的方法，该方法包括在编码本发明的嵌合蛋白的核酸分子被表达的条件下培养宿主细胞。
在其他实施例中，本发明还涵盖包含本发明重组载体的转基因宿主细胞。在这些实施例的一些方面，转基因宿主细胞是转基因细菌细胞或转基因植物细胞。
在其他方面，转基因细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。在其他方面，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌(所谓的内生菌)，或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱杆菌属、固氮螺菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生的真菌(如木霉属以及胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的核酸的可能的宿主。在仍其他方面中，转基因细菌细胞是大肠杆菌细胞。在其他方面，芽孢杆菌属细胞是转基因苏云金芽孢杆菌细胞。这些基因操作技术对于不同的可供使用的宿主而言是特异性的并且在本领域中是已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中(在转录或翻译融合中)在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达编码多个ORF的操纵子，最简单的方法是在转录融合中将该操纵子插入载体(如pKK223-3)中，允许对该异源基因的同源核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性物种(如芽孢杆菌属)中的过表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本发明的上下文中使用(Quax等人,在:Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中，编辑Baltz等人,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993))。用于过表达的替代性系统依赖于例如酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属、以及克鲁维酵母属的使用(Sreekrishna,在:Industrial microorganisms:basic and applied moleculargenetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中,Baltz,Hegeman,和Skatrud编辑,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993)；Dequin和Barre,Biotechnology[生物科技]L2:173-177(1994)；van den Berg等人,Biotechnology[生物科技]8:135-139(1990))。
在这些实施例的仍其他方面中，转基因植物细胞是转基因双子叶植物细胞或转基因单子叶植物细胞。在一些实施例中，转基因双子叶植物细胞选自由以下组成的组：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞；或者转基因单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉米细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。
在一些实施例中，本发明涵盖包含本发明的核酸分子、嵌合基因、表达盒或重组载体的转基因植物或植物部分。在其他实施例中，转基因植物或植物部分表达由本发明的核酸分子、嵌合基因、表达盒或重组载体编码的嵌合杀昆虫蛋白。在仍其他的实施例中，转基因植物或植物部分包含SEQ ID NO:5-10、18、19或22中的任一个。在其他实施例中，转基因植物或植物部分是转基因玉米植物或玉米植物部分。
在一些实施例中，在转基因植物中表达本发明的核酸分子，因此引起相应的嵌合杀昆虫蛋白在该转基因植物中的生物合成。以这种方式，产生了针对昆虫(例如玉米根虫)具有增强的抗性的转基因植物。为了其在转基因植物中的表达，可对本发明的这些核酸分子任选地进行修饰和优化。尽管在许多情况中来自微生物有机体的基因可以在没有修饰的情况下在植物中以高水平表达，但在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中不优选的密码子的微生物核酸所造成的。在本领域中已知的是，所有生物针对密码子使用具有特定偏好，并且可以对本发明中所描述的核酸的密码子进行改变以符合植物的偏好，同时保持由此所编码的氨基酸。此外，在植物中高表达最好是由以下编码序列实现的，这些编码序列具有至少大约35％、优选大于约45％、更优选大于约50％、并且最优选大于约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核酸可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可使信息不稳定的ATTTA基序，以及可能引起不适当的聚腺苷酸化作用的AATAAA基序。在一些实施例中，可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]17:477-498(1989))。此外，针对可能引起信息缩短的不合理剪接位点的存在对这些核酸筛选。可以使用熟知的位点定向诱变、PCR、以及合成基因的构建，例如，使用公开的专利申请EP 0 385962、EP 0 359 472、以及WO 93/07278中所述的方法，对在这些核酸之内所有需要做出的变化(如以上所描述的那些变化)进行改变。
在本发明的一些实施例中，根据在美国专利5,625,136(通过引用并入本文)中所披露的程序来制造本发明的嵌合杀昆虫蛋白的编码序列。在这个程序中，使用了玉蜀黍优选的密码子，即最频繁地编码玉蜀黍中的氨基酸的单个密码子。针对特定的氨基酸的玉蜀黍优选的密码子可源自(例如)来自玉蜀黍的已知基因序列。针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于Murray等人,Nucleic Acids Research[核酸序列]17:477-498(1989)中，其披露内容通过引用并入本文。
以这种方式，这些核苷酸序列可以进行优化用于在任何植物中表达。认识到的是该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。
为了更加有效的翻译起始，可修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的适当的共有序列(NAR 15:6643-6653(1987))，并且Clonetech提出了另一种共有翻译起始子(1993/1994目录，第210页)。这些共有序列适合与本发明的核酸一起使用。在实施例中，将这些序列并入包含核酸的构建体中，达到并且包括ATG(而未对第二个氨基酸进行修饰)，或者可替代地达到并且包括在ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二氨基酸的可能性)。
本发明的核酸分子在转基因植物中的表达是由在植物中起作用的启动子驱动的。启动子的选择将根据表达的时间和空间需要而变化，并且还根据靶物种而变化。因此，本发明的核酸在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等等)、根、和/或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。不过，对于所选的启动子的起源没有限制；只要它们可有效驱动核酸在所希望的细胞中表达就足够了。
在一些实施例中，使用了以组成型表达的启动子，包括肌动蛋白或泛素或cmp启动子，或CaMV 35S和19S启动子。本发明的核酸也可以在用化学方法进行调节的启动子的调节下表达。用于基因表达的化学诱导的优选的技术详述于公开申请EP 0 332 104(汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))以及美国专利5,614,395中。用于化学诱导的优选的启动子是烟草PR-1a启动子。
在其他实施例中，可使用一类伤口诱导型启动子。已经描述了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位表达的启动子。理想的是，这种启动子应该仅在感染的部位有局部活性，并且以这种方式，本发明的嵌合杀昆虫蛋白仅在需要合成这些蛋白的细胞中累积以杀死入侵的昆虫有害生物。这类优选的启动子包括由以下文献所描述的那些：Stanford等人Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]215:200-208(1989)，Xu等人PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)，Logemann等人Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)，Firek等人Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)，以及Warner等人Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)。
用于在植物(特别是玉米)中表达对本发明的嵌合杀昆虫蛋白进行编码的基因的组织特异性的或组织优选的启动子是那些直接在根、髓、叶或花粉(特别是根)中表达的启动子。此类启动子，例如从PEPC或trpA中分离的那些披露于美国专利号5,625,136中，或从MTL中分离的那些披露于美国专利号5,466,785中。这两篇美国专利以其全文通过引用并入本文。
此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在本发明的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节物来调节本发明的核苷酸序列的表达。本发明的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本发明的多肽仅当用诱导的化学物处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学品诱导本发明的核苷酸序列的表达时，该启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品抑制本发明的核苷酸序列表达时该启动子可以是化学阻抑型启动子。
化学诱导型启动子在本领域是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a启动子(其由水杨酸激活)(例如，PR1a系统)、类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA 88,10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.[植物杂志]14,247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型启动子和四环素-阻抑型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]227,229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)、Lac阻遏物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(Aoyama等人(1997)Plant J.[植物杂志]11:605-612)以及蜕皮激素诱导型系统启动子。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA诱导型和细胞膨胀诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等人(1993)Plant J.[植物杂志]4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等人(1988)Genetics[遗传]119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等人(1994)Plant J.[植物杂志]6:141-150)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Kohler等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29:1293-1298；Martinez等人(1989)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]208:551-565；和Quigley等人(1989)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于以下文献中的诱导型启动子中的任一种：Gatz(1996)Current Opinion Biotechnol.[生物技术新见]7:168-172和Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.[植物生理学与植物分子生物学年度综述]48:89-108。适用于指导本发明的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中，该专利通过引用以其全文并入本文。基因表达的化学诱导还详述于公开申请EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))和美国专利5,614,395中。在一些实施例中，用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。
在另外的方面中，本发明的核苷酸序列可以与启动子可操作地相关联，该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如，昆虫或线虫植物有害生物)进行的诱导型。已经描述了在创伤部位和/或在有害生物攻击(例如，昆虫/线虫摄食)或植物病原菌侵染的部位处表达的数量众多的启动子。理想的是，这种启动子应仅在攻击部位处或邻近该部位具有局部活性，并且以这种方式，本发明的核苷酸序列的表达将集中在所侵入或摄食的细胞中。此类启动子包括但不限于由以下描述的那些启动子：Stanford等人,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]215:200-208(1989)；Xu等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)；Logemann等人,Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)；Rohrmeier和Lehle，Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)；Firek等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)；Warner等人,PlantJ.[植物杂志]3:191-201(1993)；美国专利号5,750,386；美国专利号5,955,646；美国专利号6,262,344；美国专利号6,395,963；美国专利号6,703,541；美国专利号7,078,589；美国专利号7,196,247；美国专利号7,223,901；以及美国专利申请公开2010043102。
在本发明的一些实施例中，使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白，以允许转录起始和延伸。在一些实施例中，最小启动子被构建成仅包含来自转录因子的结合和目的核苷酸序列的转录所必需的选定启动子的核苷酸/核苷酸序列的启动子，这一目的核苷酸序列可操作地与包括但不限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中，最小启动子缺少募集并结合转录因子的cis序列，这些转录因子调节(例如，增强、阻抑、赋予组织特异性，赋予诱导性或阻抑性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即，5’)。因此，可以选择来自与本发明一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作最小启动子。
可以将许多其他序列掺入本发明所描述的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、和AMV)。
本发明的核酸在植物中针对不同的细胞定位的靶向表达可能是更优选的。在一些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。使用本领域内熟知的技术进行编码酶类的转基因的亚细胞定位。典型地，对编码来自已知细胞器靶向的基因产物的靶肽的DNA进行操作并将其融合在该核酸的上游。针对叶绿体的许多此类靶序列是已知的并且已经证明了它们在异源构建体中的功能。还将本发明的核酸的表达靶向至宿主细胞的内质网或液泡。实现其的技术在本领域中是熟知的。
适合于植物转化的载体描述于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一种T-DNA边界序列的载体是合适的，而对于直接基因转移，任何载体都是合适的，并且仅含有目的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这两者，转化通常(但不是必需的)用选择性标记进行，这种选择性标记可以提供针对抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或除草剂(basta)的抗性。包含本发明的核酸分子的植物转化载体还可包含以下基因(例如磷酸甘露糖异构酶；PMI)，这些基因提供转基因植物的阳性选择，如美国专利5,767,378和5,994,629(通过引用并入本文)中所披露的。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。
在一些实施例中，核酸可以转化到核基因组中。在其他实施例中，本发明的核酸被直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的密码子优化，而且质体能够在单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人,(1994),Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同目的基因一起引入合适的靶组织中。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体(plastome)的特定区域。最初，将叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变(赋予对壮观霉素和/或链霉素抗性)用作用于转化的选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,和Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530；Staub,J.M.,和Maliga,P.(1992)Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。转化频率的实质性增加是通过用显性选择性标记(细菌aadA基因，其编码了壮观霉素-解毒酶氨基糖苷-3'-腺苷酰转移酶)置换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因来获得的(Svab,Z.,和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被涵盖在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个优选的实施例中，将本发明的核酸插入到质体靶向的载体中并且转化到所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了对于包含本发明的核酸的质体基因组同型的植物，并且这些植物能够优先地高表达该核酸。
在一些实施例中，本发明的转基因植物可包含至少一种非蛋白质的第二杀有害生物剂。在这些实施例的一些方面，该第二杀有害生物剂是干扰RNA分子。干扰RNA分子典型地包含针对靶基因的至少一种RNA片段、间隔序列、和与第一RNA片段互补的第二RNA片段，从而可以形成双链RNA结构。当生物识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所得的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被称为小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于该复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶杂交，此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制(参见例如，公开物WO 2013/192256，其通过引用并入本文)。设计用于昆虫控制的干扰RNA产生非天然存在的双链RNA，其利用昆虫中的天然RNAi途径来触发靶基因的下调，这可能导致停止摄食和/或生长并可能导致昆虫有害生物死亡。干扰RNA分子可赋予针对与本发明的蛋白质相同的靶有害生物的昆虫抗性，或可靶向不同的有害生物。靶昆虫植物有害生物可以通过咀嚼、吸吮或刺穿来摄食。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制。在其他实施例中，干扰RNA可赋予针对非昆虫植物有害生物(如线虫有害生物或病毒有害生物)的抗性。
多于一种的杀有害生物剂在相同转基因植物中的共表达可以通过制造单一的重组载体(在一种所谓的分子堆积(molecular stack)中包含多于一种的杀有害生物剂的编码序列)并对植物进行遗传工程化以便在该转基因植物中含有并表达所有的杀有害生物剂而实现。此类分子堆积还可以通过使用微型染色体进行制造，如在(例如)美国专利7,235,716中所说明。可替代地，包含对第一杀有害生物剂进行编码的核酸的转基因植物可以用对第二有害生物剂等进行编码的不同的核酸进行再转化。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于本发明的基因的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二杀有害生物剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。
包括本发明的嵌合杀昆虫蛋白的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用并入本文)中所述的。在本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子有效对抗同一靶昆虫(例如鞘翅目有害生物或根萤叶甲属靶有害生物)的情况下，该组合(i)在一种用于进一步增强本发明的组合物对抗该靶昆虫的活性的方法中以及(ii)在一种用于通过提供对抗该靶昆虫的又另一种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强对根萤叶甲属昆虫种群控制的方法，该方法包括提供一种本发明的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。
即使在杀昆虫种子包衣针对不同昆虫具有活性的情况下，该杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将针对鳞翅目昆虫具有活性的杀昆虫种子包衣添加到本发明的转基因种子(在一些实施例中针对鞘翅目和一些鳞翅目具有活性)中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目有害生物两者。
此类杀昆虫剂和/或杀昆虫种子包衣的实例包括但不限于，氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣选自下组，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合。包含此类杀昆虫剂和杀昆虫种子包衣的商业产品包括但不限于以下：
Figure BDA0003032612060000431
(克百威)、
Figure BDA0003032612060000432
(灭多虫、灭多威、纳乃得)、
Figure BDA0003032612060000433
(胺甲萘)、
Figure BDA0003032612060000434
(联苯菊酯)、
Figure BDA0003032612060000435
(七氟菊酯)、
Figure BDA0003032612060000436
(氯氰菊酯)、
Figure BDA0003032612060000437
(氯氰菊酯)、Delta
Figure BDA0003032612060000438
(溴氰菊酯)、
Figure BDA0003032612060000439
(λ-氯氟氰菊酯)、
Figure BDA00030326120600004310
(氯菊酯)、
Figure BDA00030326120600004311
(氯菊酯)、
Figure BDA0003032612060000441
(联苯菊酯)、
Figure BDA0003032612060000442
(联苯菊酯)、
Figure BDA0003032612060000443
(七氟菊酯))、
Figure BDA0003032612060000444
(λ氯氟氰菊酯)、
Figure BDA0003032612060000445
(毒死蜱)、
Figure BDA0003032612060000446
(氯氧磷)、
Figure BDA0003032612060000447
(灭克磷)、
Figure BDA0003032612060000448
(甲拌磷)、
Figure BDA0003032612060000449
(甲拌磷、氟氰戊菊酯(flucythinate))、
Figure BDA00030326120600004410
(甲拌磷)、
Figure BDA00030326120600004411
(特丁磷)、
Figure BDA00030326120600004412
(乐果)、异氯磷、
Figure BDA00030326120600004413
(氟虫腈))、
Figure BDA00030326120600004414
(噻虫嗪)、
Figure BDA00030326120600004415
(吡虫啉)、
Figure BDA00030326120600004416
(吡虫啉)、
Figure BDA00030326120600004417
(噻虫胺)和
Figure BDA00030326120600004418
(氟氯氰菊酯、嘧丙磷)。
本发明还涵盖一种杀昆虫组合物，其包含控制昆虫有效量的本发明嵌合杀昆虫蛋白。在进一步的实施例中，杀昆虫组合物包含合适的农业载剂和本发明的嵌合杀昆虫蛋白。该农业载剂可包括有益于活性成分(如本发明的嵌合杀昆虫蛋白，包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的嵌合杀昆虫蛋白：与SEQ ID NO:5-10、18、19和/或22中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列)施用的佐剂、混合剂、增强剂等。合适的载剂不应对有价值的作物具有植物毒性(特别是在作物的存在下施用组合物时所用的浓度)，并且不应与本文的活性成分的化合物(即本发明的多肽或其他组合物成分)进行化学反应。此类混合物可以设计用于直接施用于作物，或者可以是浓缩物或配制品，其通常在施用前用另外的载剂和佐剂进行稀释。它们可以包括惰性或活性组分，并且可以是固体(如例如尘剂、粉剂、颗粒剂、水分散性颗粒剂或可湿性粉剂)或液体(如例如可乳化浓缩物、溶液、乳剂或悬浮液)。合适的农业载剂可包括液体载剂，例如水、甲苯、二甲苯、石脑油、作物油、丙酮、甲基乙基酮、环己酮、三氯乙烯、全氯乙烯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸丁酯、丙二醇单甲醚和二乙二醇甲醚、甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、甘油等。水通常是用以稀释浓缩物的选用载剂。合适的固体载剂可包括滑石、叶腊石粘土、硅石、凹凸棒石粘土、砂藻土(kieselguhr)、白垩、硅藻土(diatomaxeous earth)、石灰、碳酸钙、膨润土、漂白土、棉子壳、小麦粉、大豆粉、浮石、木粉、核桃壳粉、木质素等。在另一个实施例中，本发明的多肽可以包封在合成基质(如聚合物)中，并施用于宿主(如植物)的表面。昆虫摄取宿主细胞允许将昆虫控制剂递送至昆虫并导致对昆虫有害生物的毒性作用。
在另外的实施例中，本发明的杀昆虫组合物可以是粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体或溶液。本发明的杀昆虫组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞(例如苏云金芽孢杆菌细胞)的培养物来制备。本发明的组合物可包含按重量计至少1％，约5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的本发明的嵌合杀昆虫蛋白。本发明的杀昆虫组合物可包含至少第二杀有害生物剂(其可以是杀昆虫的、杀线虫的、杀真菌的、杀细菌的)。至少第二杀有害生物剂可以针对与本发明的嵌合杀昆虫蛋白相同的昆虫或不同的昆虫具有杀昆虫作用。第二杀有害生物剂可以是蛋白质。杀有害生物剂可以是干扰RNA。第二杀有害生物剂可以是微生物(如细菌)，其包含编码杀有害生物剂的核酸分子和/或包含杀有害生物剂(如蛋白质或干扰RNA)。可对该微生物进行减毒、热灭活或冷冻干燥。微生物可能死亡或无法繁殖。第二杀有害生物剂可以是杀昆虫剂、例如克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合，或含有如上所述的杀虫剂和杀虫种子包衣的商业产品。
本发明的杀昆虫组合物，例如包含本发明的嵌合杀昆虫蛋白和农业上可接受的载剂的组合物，可用于常规农业方法中。农业上可接受的载剂是可用于将包含本发明的多肽的组合物施用至植物或种子的配制品。例如，本发明的组合物可以与水和/或肥料混合，并且可以通过任何手段在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所，如飞机喷雾桶、灌溉设备、直接注射喷雾设备、背负式喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如，喷管式喷雾器、手动喷雾器)等。所希望的场所可以是土壤、植物等。
本发明的杀昆虫组合物可以在以下时间施用至处于任何生理状态下的种子或植物繁殖体：在种子收获和播种之间的任何时间；或在播种期间或播种后；和/或发芽后。优选种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态，使得在处理过程期间不会造成损害或造成最小的损害，包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的包衣技术以及机器(如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器)施用至种子或植物繁殖体上。
在一些实施例中，本发明涵盖产生本发明嵌合杀昆虫蛋白的方法，所述方法包括在本发明的宿主细胞产生所述嵌合杀昆虫蛋白的条件下培养所述宿主细胞或包含所述宿主细胞的生物。
在一些实施例中，本发明还涵盖了产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括：(a)将包含编码本发明的嵌合杀昆虫蛋白的核酸分子的嵌合基因或表达盒或重组载体引入植物或植物部分，其中所述嵌合杀昆虫蛋白在所述植物或植物部分中表达，从而产生具有增强的抗昆虫的植物或植物部分。在一些方面，嵌合基因可编码嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:5-10、18、19和/或22中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或相似的氨基酸序列。“增强的”昆虫抗性可以用转基因植物对以转基因植物为食的昆虫有害生物的任何毒性作用来衡量。增强的昆虫抗性与对照植物相比可高出0％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、或至少1000％的杀昆虫活性。可通过植物转化、植物组织培养或育种的方法产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。可通过有性或无性繁殖的方法来产生植物或植物部分。可以使用任何合适的对照植物或植物部分，例如在相同环境下生长的、具有相同或相似遗传背景的植物。在实施例中，对照植物或植物部分与所描述的植物具有相同的遗传背景并在相同的环境中生长，但其不包含本发明的分子，而所描述的植物包含本发明的核酸分子。
在一些实施例中，本发明涵盖一种控制昆虫有害生物的方法，所述方法包括将有效量的本发明的嵌合杀昆虫蛋白递送至所述昆虫有害生物或其环境。在其他实施例中，嵌合蛋白通过转基因植物或通过局部施用包含嵌合杀昆虫蛋白的杀昆虫组合物递送。在其他实施例中，嵌合蛋白包含SEQ ID NO:5-10、18、19或22中任一个的氨基酸序列。
在控制昆虫有害生物的方法的其他方面，转基因植物或杀昆虫组合物包含不同于嵌合杀昆虫蛋白的第二杀昆虫剂。在仍其他方面中，第二杀昆虫剂是蛋白质、dsRNA或化学品。在另外的方面中，蛋白质选自由以下组成的组：Cry蛋白、Vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；或者化学品是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或者化学品包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
在控制昆虫有害生物的方法的其他方面，所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。在其他方面，鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属物种。在仍其他方面中，根萤叶甲属物种选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)和玉蜀黍根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
在一些实施例中，本发明涵盖降低根萤叶甲属昆虫群体对本发明的嵌合杀昆虫蛋白的抗性发展的方法，所述方法包括在由根萤叶甲属昆虫群体摄食的转基因植物中表达嵌合杀昆虫蛋白和干扰RNA分子(所述干扰RNA分子抑制幼虫和/或成虫根萤叶甲属昆虫中靶基因的表达)和/或对根萤叶甲属昆虫有害生物有毒的Cry蛋白，从而使所述根萤叶甲属昆虫群体中的抗性发展与仅暴露于所述嵌合杀昆虫蛋白的根萤叶甲属昆虫群体相比降低。
在一些实施例中，本发明涵盖向玉米种植者提供控制玉米作物中根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，所述方法包括(a)向所述种植者出售或提供包含本发明核酸分子的转基因玉米种子；和(b)向所述种植者宣传所述转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。
在一些实施例中，本发明涵盖制备嵌合杀昆虫蛋白的方法，所述嵌合杀昆虫蛋白包含以N末端至C末端方向融合N末端区域，所述N末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与以下的氨基酸1至氨基酸338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iv)SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列，融合至(b)C末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与以下的氨基酸339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352或353到氨基酸488、489或490对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ IDNO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:3。
在其他实施例中，本发明涵盖制备嵌合杀昆虫蛋白的方法，所述嵌合杀昆虫蛋白包含以N末端至C末端方向融合N末端区域，所述N末端区域包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:17氨基酸1至约氨基酸363对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列，融合至(a)C末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1的约氨基酸347至约氨基酸489对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(b)C末端区域，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:2的约氨基酸346至约氨基酸488对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列。
在其他实施例中，本发明提供了一种制备包含SEQ ID NO:5-10、18、19或22的氨基酸序列的嵌合蛋白的方法。
实例
本发明的实施例可以通过参考以下实例而被更好地理解。前述的和以下的本发明的实施例以及各种实施例的描述不是旨在限制权利要求书，而是对其具有说明性。因此，应理解的是权利要求书不旨在受限于这些实例的具体细节。本领域技术人员应理解的是本发明的其他实施例可以在不偏离本披露的精神和范围的情况下进行实践，本披露的范围是由所附权利要求书限定的。本领域公认的重组DNA和分子克隆技术可以在以下中找到，例如J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约]:Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2001)；T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments withGene Fusions[基因融合实验],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],ColdSpring Harbor[冷泉港],NY[纽约](1984)和Ausubel,F.M.等人,Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学实验手册],New York[纽约],John Wiley and Sons Inc.[约翰威利父子出版公司],(1988),Reiter等人,Methods in Arabidopsis Research[拟南芥属研究方法],World Scientific Press[世界科学出版社](1992)，以及Schultz等人,Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册],Kluwer Academic Publishers[克鲁沃学术出版社](1998)。
实例1.SproCRW和SplyCRW嵌合体的杀昆虫活性。
为了确定SproCRW和SplyCRW是否具有对玉米根虫杀昆虫活性关键的结构域，制备了相互嵌合体。所述第一嵌合蛋白被命名为SproCRW/SplyCRW，其以氨基至羧基末端方向包含SproCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-346)连接至SplyCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:2的氨基酸346-488)。SproCRW/SplyCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:5表示(SproCRW结构域为氨基酸1-346和SplyCRW结构域为氨基酸347-489)。所述第二嵌合蛋白被命名为SplyCRW/SproCRW，其以氨基至羧基末端方向包含SplyCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-345)连接至SproCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:1的氨基酸346-489)。SproCRW/SplyCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:5表示(SplyCRW结构域为氨基酸1-345和SproCRW结构域为氨基酸346-488)。SproCRW/SplyCRW杂合毒素的比对如表1所示。
表1.SproCRW/SplyCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000511
SproCRW/SplyCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对如表2所示。
表2.SplyCRW/SproCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000521
SproCRW和SplyCRW蛋白的N末端区域(氨基酸1-346)具有83％的同一性。C末端区域(氨基酸347-489(SproCRW)和氨基酸347-488(SplyCRW)具有79％同一性。SproCRW/SplyCRW杂合蛋白(SEQ ID NO:5)在其全长上与SproCRW序列(SEQ ID NO:1)具有94％序列同一性，与SplyCRW蛋白(SEQ ID NO:2)具有88％同一性。SplyCRW/SproCRW杂合蛋白(SEQID NO:6)在其全长上与SplyCRW蛋白(SEQ ID NO:2)具有94％序列同一性，与SproCRW蛋白(SEQ ID NO:1)具有88％同一性。SproCRW/SplyCRW杂合毒素与SplyCRW/SproCRW杂合毒素具有82％同一性。
在如上所述的饲料掺入测定中，对这两种嵌合蛋白进行了针对西方玉米根虫的试验。SproCRW和SplyCRW作为阳性对照。结果表明，两种嵌合蛋白相比于彼此以及相比于野生型的SproCRW和SplyCRW蛋白针对WCR具有相同的活性。
实例2.SproCRW、SplyCRW和WoodsCRW嵌合体的杀昆虫活性。
本实例描述了通过将SproCRW和SplyCRW的部分与另一种称为WoodsCRW的新颖杀昆虫蛋白的部分组合而制备的新嵌合蛋白，所述WoodsCRW描述于2018年7月19日公开的国际申请公开号WO 2018132325中，并通过引用将其全部并入本文。
为了确定SproCRW和SplyCRW是否具有可与WoodsCRW蛋白的结构域组合以产生具有针对WCR的活性的嵌合杀昆虫蛋白的结构域，在SproCRW和WoodsCRW以及SplyCRW和WoodsCRW之间产生了相互嵌合体。WoodsCRW与SproCRW和SplyCRW在其全长序列上分别具有34％和35％序列同一性。构建第一嵌合蛋白，被命名为SproCRW/WoodsCRW，其以氨基至羧基末端方向包含SproCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-345)连接至WoodsCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:4的氨基酸346-489)。SproCRW/WoodsCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:7表示(SproCRW结构域为氨基酸1-345和WoodsCRW结构域为氨基酸346-489)。第二嵌合蛋白(被命名为WoodsCRW/SproCRW)以氨基至羧基末端方向包含WoodsCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-346)连接至SproCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:1的氨基酸346-489)。WoodsCRW/SproCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:8表示(WoodsCRW结构域为氨基酸1-346和SproCRW结构域为氨基酸347-490)。第三嵌合蛋白(被命名为SplyCRW/WoodsCRW)以氨基至羧基末端方向包含SplyCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-344)连接至WoodsCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:4的氨基酸345-489)。SproCRW/WoodsCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:9表示(SplyCRW结构域为氨基酸1-344和WoodsCRW结构域为氨基酸345-489)。第四嵌合蛋白(被命名为WoodsCRW/SplyCRW)以氨基至羧基末端方向包含WoodsCRW蛋白的N末端区域(其包含SEQ ID NO:4的氨基酸1-346)连接至SplyCRW蛋白的C末端区域(其包含SEQ ID NO:2的氨基酸347-490)。WoodsCRW/SproCRW杂合毒素的氨基酸序列由SEQ ID NO:10表示(WoodsCRW结构域为氨基酸1-346和SplyCRW结构域为氨基酸347-490)。WoodsCRW/SproCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对如表3所示。
表3.WoodsCRW/SproCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000551
WoodsCRW/SplyCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对如表4所示。
表4.WoodsCRW/SplyCRW杂合毒素与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000561
SproCRW/WoodsCRW嵌合蛋白(SEQ ID NO：7)在其全长上与SproCRW序列(SEQ IDNO:1)具有94％序列同一性，与SplyCRW蛋白(SEQ ID NO:2)具有88％同一性。SplyCRW/SproCRW杂合蛋白(SEQ ID NO:23)在其全长上与SplyCRW蛋白(SEQ ID NO:2)具有94％序列同一性，与SproCRW蛋白(SEQ ID NO:1)具有88％同一性。
如上所述，制备所有四种嵌合蛋白用于针对WCR的测试。SproCRW/WoodsCRW嵌合蛋白和SplyCRW/WoodsCRW蛋白是完全不溶的。在如上所述的饲料掺入测定中，对WoodsCRW/SproCRW(SEQ ID NO:8)和WoodsCRW/SplyCRW(SEQ ID NO:10)嵌合蛋白进行针对西方玉米根虫的测试。SproCRW和SplyCRW作为阳性对照。结果在表5中显示。获取侵染后3天和6天的死亡率百分数和生长抑制百分数，其中s＝小型幼虫，m＝中型幼虫，l＝大型幼虫。结果表明，两种嵌合蛋白相比于彼此以及相比于野生型的SproCRW和SplyCRW蛋白针对WCR具有相同的活性。
表5.嵌合蛋白针对WCR的杀昆虫活性。
Figure BDA0003032612060000571
实例3.Plu1415CRW/SproCRW和SplyCRW嵌合体的杀昆虫活性。
本实例描述了通过将SproCRW和SplyCRW的部分与称为Plu1415(SEQ ID NO:17)的非杀昆虫蛋白的部分组合而制备的嵌合蛋白，所述Plu1415描述于2018年7月19日公开的国际申请公开号WO 2018132325中，通过引用将其全部并入本文。Plu1415是一种来源于细菌发光杆菌的蛋白质，对根萤叶甲属昆虫有害生物没有任何活性。Plu1415的晶体结构由Rosado等人，2007(Science[科学],317:1548-1551)描述。如Plu1415一样，SporCRW和SplyCRW由N末端MACPF结构域和C末端β棱柱结构域构成。Plu1415的β棱柱结构域来自SEQID NO:17的约氨基酸位置364至约氨基酸位置510。SproCRW的β棱柱结构域来自SEQ ID NO:1的约氨基酸位置347至约氨基酸位置489，并且对于SplyCRW来自SEQ ID NO:2的约氨基酸位置346至约氨基酸位置488。Plu1415与SproCRW和Plu1415与SplyCRW的总体百分比同一性分别为25％和26％。Plu1415与SproCRW和SplyCRW的β棱柱结构域的同一性甚至更低，分别为21％和23％。
制备了两种嵌合蛋白，以确定SproCRW或SplyCRW的β棱柱结构域是否能赋予非杀昆虫蛋白(即Plu1415)杀昆虫活性。Plu1415-SproCRW嵌合体(SEQ ID NO:18)包含Plu1415的N末端MACPF结构域(SEQ ID NO:17的氨基酸1-363)和SproCRW的β棱柱结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸347-489)。类似地，Plu1415-SplyCRW嵌合体(SEQ ID NO:19)包含Plu1415的N末端MACPF结构域(SEQ ID NO:17的氨基酸1-363)和SplyCRW的β棱柱结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸346-488)。Plu1415/SproCRW嵌合蛋白和Plu1415/SplyCRW嵌合蛋白与它们各自的亲本蛋白的比对显示在表6和表7中，其中氨基酸位置下面的“.”表示相同的氨基酸。
表6.Plu1415/SproCRW杂合蛋白与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000591
表7.Plu1415/SplyCRW杂合蛋白与亲本蛋白的比对。
Figure BDA0003032612060000601
制备第三嵌合蛋白作为对照，其中Plu1415的β棱柱结构域被HmassCRW蛋白(其描述于2018年5月3日公开的国际申请公开号WO 2018081194)的β棱柱结构域替代。用上述饲料掺入测定测试了三个嵌合体对西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性。
表8所示的WCR测定结果表明，通过将非杀昆虫蛋白的β棱柱结构域(即从SEQ IDNO:17的约氨基酸位置364-510)替换为SplyCRWβ棱柱结构域(从SEQ ID NO:2的约氨基酸位置346-488)，SplyCRWβ棱柱结构域可以赋予非杀昆虫蛋白(Plu1415)杀昆虫活性。
表8.嵌合蛋白的杀昆虫活性。
Figure BDA0003032612060000611
实例4.用杂合蛋白转化玉蜀黍。
编码本发明嵌合杀昆虫蛋白的玉蜀黍优化的核苷酸序列(例如SproCRW/SplyCRW(SEQ ID NO:5))如美国专利号6,051,760(在此通过引用并入)所述产生。
构建了两个植物表达盒，以将SproCRW/SplyCRW编码序列引入玉蜀黍。第一盒包含可操作地连接到SproCRW/SplyCRW编码序列的玉蜀黍泛素1(Ubi1)启动子，所述SproCRW/SplyCRW编码序列可操作地连接到玉蜀黍Ubi361终止子。第二盒包含可操作地连接到编码选择性标记磷酸甘露糖异构酶(PMI)的pmi编码序列的玉蜀黍Ubi1启动子，所述pmi编码序列可操作地连接到玉蜀黍Ubi1终止子。生成包含所述两个表达盒的重组植物转化二元载体，用于玉蜀黍转化实验。
使用标准分子生物学技术将所述二元载体转化到根癌农杆菌中。为了制备用于转化的农杆菌，将细胞在28℃和220rpm下在液体YPC培养基中培养过夜。
基本上如在Negrotto等人,2000(Plant Cell Reports[植物细胞通讯]19:798-803)中所说明进行未成熟玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这个实例，所有的培养基组分基本上如在以上Negrotto等人所说明。然而，本领域内已知的各种培养基组分可以被代替。
简言之，使包含二元载体植物转化载体的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在28℃下在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上生长2-4天。将大约0.8X109个农杆菌悬浮于补充有100μM As的LS-inf培养基中(Negrotto等人，同上)。在这个培养基中对细菌预诱导30至60分钟。
将来自适合的基因型的未成熟胚从8-12天大的穗中切除到液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基漂洗这些胚。然后添加农杆菌溶液，并且将这些胚涡旋30秒并且允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在暗处培养两到三天。随后，将每皮氏板(petri plate)20与25个之间的胚转移到补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在28℃在黑暗中培养10天。
将产生胚性愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基中。在这种培养基上对培养物进行持续大约6周的选择，具有大约3周的传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移至补充有甘露糖的Reg1培养基中。在光照中(16小时光照/8小时黑暗方案)培养之后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基中并且孵育约1-2周。将这些小植株转移至含有Reg3培养基的Magenta GA-7盒(马真塔公司(Magenta Corp)，芝加哥，伊利诺伊州)中并使其在光照中生长。
在转化、选择和再生后，使用
Figure BDA0003032612060000621
分析来测定植物中是否存在pmi基因和SproCRW/SplyCRW玉蜀黍密码子优化的编码序列。还测试了植物中是否存在载体骨架。将对载体骨架阴性并且包含来自二元载体的转基因的一个拷贝的转基因玉蜀黍植物转移到温室中，并测试其针对WCR的杀昆虫活性。
实例5：与第二杀昆虫剂组合的嵌合杀昆虫蛋白。
将SproCRW/SplyCRW蛋白与针对必需靶并且已知具有杀昆虫活性的双链RNA(dsRNA)组合制备。在非限制性实例中，dsRNA可靶向编码液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、跨膜四蛋白、网格蛋白重链、γ-外被体、β-外被体和/或保幼激素环氧化物水解酶的基因(PCT专利申请号PCT/US 17/044825；PCT/US 17/044831；PCT/US 17/044832；美国专利号7,812,219；各自通过引用并入本文)。在基本上如实例1所述进行的膳食掺入测定中测试dsRNA和纯化的蛋白质针对WCR的功效。实例6.在植物细胞中原位编辑基因组以生成经修饰的嵌合蛋白。
以下实例说明了利用植物细胞基因组的原位基因组编辑以掺入突变，使本文描述的嵌合蛋白(包括但不限于实例1和2中描述的嵌合蛋白)进入野生型沙雷氏菌属杀昆虫蛋白或Woods杀昆虫蛋白(包括SproCRW(SEQ ID NO:1)、SplyCRW(SEQ ID NO:2)和/或SquiCRW(SEQ ID NO:3))的编码序列，或进入已经修饰的SproCRW、SplyCRW和/或SquiCRW蛋白的编码序列。
定向基因组修饰(也称为基因组编辑)可用于在特定DNA序列中引入突变。这些基因组编辑技术，其包括锌指核酸酶(ZNF)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)，已成功施用至包括作物植物在内的50多种不同生物。参见例如，Belhaj,K.等人,Plant Methods[植物方法]9,39(2013)；Jiang,W.等人,Nucleic Acids Res[核酸研究]41,e188(2013))。用于基因组编辑的CRISPR/Cas系统基于Cas9核酸酶和指定靶多核苷酸序列的工程化的单引导RNA(sgRNA)的瞬时表达。
Cas9是一种大的单体DNA核酸酶，其借助两个20-核苷酸(nt)非编码RNA的复合物被引导至DNA靶序列：CRIPSR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，其功能上可作为单合成RNA嵌合体获得。Cas9蛋白含有两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链，因此，在靶DNA中引入钝切(bluntcut)。
当Cas9和sgRNA在活的玉蜀黍细胞中瞬时表达时，在转基因玉蜀黍细胞中产生特异性靶DNA中的双链断裂(DSB)。通过非同源末端连接和同源定向DNA修复途径引入断裂位点处的突变。
通过使用在转基因玉蜀黍中表达Cas9核酸酶和sgRNA靶(针对SproCRW或经修饰的SproCRW序列进行了玉蜀黍密码子优化)的重组质粒，将特定突变引入天然SproCRW杀昆虫蛋白(SEQ ID NO:1)或经修饰的SproCRW蛋白的编码序列。该方法的实施是通过根癌农杆菌的农杆菌浸润方法，该根癌农杆菌携带含有指定的目的靶序列的二元质粒。sgRNA与靶SproCRW或经修饰的SproCRW编码序列结合后，Cas9核酸酶对编码序列进行特异性切割，并在DNA修复过程中引入所需的一个或多个突变，例如引入SplyCRW蛋白的C末端部分。因此，现在突变的SproCRW编码序列将编码SproCRW/SplyCRW嵌合蛋白。
通过PCR和测序筛选包含基因组编辑的SproCRW/SplyCRW编码序列的植物细胞。诱导具有基因组编辑的SproCRW/SplyCRW或经修饰的SproCRW/SplyCRW编码序列的愈伤组织，以再生植物进行表型评估，评估表达的SproCRW/SplyCRW嵌合蛋白对以下的杀昆虫活性：WCRW，北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)。
应当理解的是，本文所述的实例和实施例仅是出于说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。
在本说明书中提到的所有公开物和专利申请显示了本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有这些公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而被并入。
序列表
<110> 先正达基团（Syngenta Participations AG）
REYNOLDS, Clarence Michael
<120> 杀昆虫蛋白
<130> 81716-WO-REG-ORG-P-1
<150> 62/752,500
<151> 2018-10-30
<160> 23
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> 变形斑沙雷氏菌
<400> 1
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<213> 普利茅斯沙雷氏菌
<400> 2
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<213> 奎沃斯沙雷氏菌
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<210> 6
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sply-Spro 杂合杀昆虫蛋白.
<400> 6
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<210> 7
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SproCRW-WoodsCRW 杂合蛋白.
<400> 7
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Ala Val Trp Leu Ser Asn Gln Ser Tyr Ala Ser Val Thr Gly Lys Ser
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Tyr Val Ser Asp Asp Phe Ile Lys Leu Ile Asn Ala Ile Asn Pro Glu
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Ser Lys Asp Ser Ile Ala Thr Val Phe Asn Val Tyr Gly Ser His Val
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Leu Met Ser Gly Val Met Gly Gly Lys Ala His Val Ser Ala Ser Ala
195 200 205
Asn Lys Leu Thr Leu Thr Gln Lys Phe Glu Met Ser Thr Ile Val Gln
210 215 220
Ala Lys Tyr Glu Gln Leu Thr Ser Gln Leu Ser Val Glu Asp Lys Leu
225 230 235 240
Lys Tyr Ser Glu Ala Phe Asp Ser Phe Ser Glu Ser Gly Ser Tyr Thr
245 250 255
Tyr Asp Ile Leu Gly Gly Ser Pro Ser Leu Gly Ala Leu Val Phe Lys
260 265 270
Asn Asn Ser Gln Gly Ser Ser Asp Asp Asn Leu Lys Asn Trp Ile Gln
275 280 285
Ser Ile Ser Ser Met Pro Val Leu Thr Lys Phe Ile Asp Gln Thr Ser
290 295 300
Leu Met Pro Val Trp Leu Leu Cys Glu Asp Lys Thr Lys Ala Asp Ala
305 310 315 320
Leu Lys Lys Tyr Tyr Asp Asn Thr Trp Ser Lys Ser Gln Met Ala Val
325 330 335
Ala Ser Leu Arg Ala Asn Tyr Ile Asp Ala Val Glu Val Ile Gln Ser
340 345 350
Asn Ser Ser Gly Val Arg Pro Pro Ser Gly Tyr Thr Lys Ile Asp Tyr
355 360 365
Asp Leu Asn Lys Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Leu Cys Tyr His
370 375 380
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Leu Ile Ile Ile Lys Gly Asn Gly Ala Arg Ala Pro Ser Gly Tyr Thr
405 410 415
Lys Ile Asp Val Asp Leu Asn Glu Asp Ala Gly Gly Lys Tyr Leu Tyr
420 425 430
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435 440 445
Leu Ala Val Val Gly Gly Asp Asn Ser His Thr Pro Ala Pro Tyr Gly
450 455 460
Tyr Arg Arg Ile Asp Thr Asp Val Asn Glu Gly Ala Gly Gly Glu Tyr
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<210> 8
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WoodsCRW-SproCRW 杂合蛋白.
<400> 8
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65 70 75 80
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
Gln Asn Ser Asp Ile His Lys Ile Val Val Gly Gly Asp Gly Val Ala
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275 280 285
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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<213> 人工序列
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<223> SplyCRW-WoodsCRW 杂合蛋白.
<400> 9
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<213> 人工序列
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<223> WoodsCRW-SplyCRW 杂合蛋白.
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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485 490
<210> 11
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SplyNtSproCt 大肠杆菌优化序列
<400> 11
atgaagttcg aaagccttaa ggtggagaac ctgttttcga gttcactgac ccggatcaat 60
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ccttttctgg cctatgcgga ctcatctgct gtcttacatc ctgtgttgga ctggtcaaag 180
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gccgtgtggt taagtaacca aacttactca tcggtctctg gaaaaagtct gcaaagttat 300
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tatataagtg acgattttaa gaagcttatt tcttcgatag atcccaacaa ccagcaaaca 540
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ggaggttcac ccagtctggg agcattggtc ttcaaggtta acaaccagga ttctgacgat 840
aatttacgga agtggatcga ttcgatctcc accatgcctg tgttgacgaa atttatcgat 900
cagaccagtt tattgcctgt ctggacgctt tgcgaagatc aggtgaaagc cgacgccctg 960
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tgctatcacg aagcccagtt taccccggtg aacggcaaac agcccatcgt ggatattcag 1200
gttctgtacg gttctcagat gcctgcgccg gggtatatta agattgatgt agatctgaac 1260
agcggggccg gtggtgaatt tgtgtacctg tcctataaaa aaggggagcc gacatcgtcc 1320
gatgttatta acaaaatcac cgcggtttat ggaaagaatg aatatgtacc gaccccgtat 1380
ggctataaac agatcagcgg cgacctcaac gctggggcgg ggggtgactt cgtttatttg 1440
tgtacttatc aaggggggac cgaataa 1467
<210> 12
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SproNtSplyCt 大肠杆菌优化序列
<400> 12
atgaaaattg agagcagcaa ggtcgaaggc cttttctcct ctagcttcac acgggtgaat 60
gctgtgccgc ttccgagtga caccctgccg ggtgtaggta tcattggttg cggttataat 120
ccgtttctgg cgtatgccga cgctagcgcc gttctgcacc cgattctcga ttggtcaaag 180
tcacaattta atgaaattac catgaatggc cagcagtacc aacttcctga tgtccttcaa 240
gcagtgtggt taagcaacca gtcgtacgcc tctgtgacag gcaaatcgct ccagtcatac 300
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gccacgaacg aatttagcga ctcgtcactg cgcaaatcag aaaacgaatt ttcacgctgc 420
cagcaaagtt ttgatttatg gtctatttcg atccctgctg atattgcccg cctccagaac 480
tacgtgtcgg atgactttat taaactcatc aatgcaatta atccagagtc caaagattct 540
atcgccaccg tgtttaacgt ctacgggtcc catgttttaa tgtctggtgt aatggggggg 600
aaagcgcacg ttagcgcctc ggctaataag cttaccctga cccagaaatt tgaaatgtcc 660
accattgtac aagctaaata cgaacagctt accagtcagc tgagcgtaga agacaagctg 720
aaatatagtg aagcgttcga ttcgttttcg gagtctggct cgtataccta cgatatcctg 780
ggcggttcgc cgtccttagg ggctttagtt ttcaaaaaca atagtcaggg ctcgtctgac 840
gataacctta agaactggat ccaatctatt agctcgatgc cagtacttac caaattcatc 900
gaccagacaa gcctgatgcc cgtttggctg ttgtgcgagg ataaaaccaa agccgatgcg 960
ctgaaaaaat attacgataa cacctggtcc aagagccaaa tggccgtcgc aagcctgcgc 1020
gcgaactaca ttgacgaggt aacgtttgtt cttggcgata actctgacat ccctgcgcca 1080
gcagggtata ctaaggtacc agtggacctg aattctgggg caggtggtaa attcatttat 1140
ctttgctatc atgaagcgca gtttactccc gtgaactcta agcaagccat agttggcttg 1200
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ttttgtactt atcagggagg aactgaataa 1470
<210> 13
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SproNt-WoodsCt 大肠杆菌优化序列
<400> 13
atgaaaattg agagcagcaa ggtcgaaggc cttttctcct ctagcttcac acgggtgaat 60
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tcacaattta atgaaattac catgaatggc cagcagtacc aacttcctga tgtccttcaa 240
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<210> 14
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WoodsNt-SproCt 大肠杆菌优化序列:
<400> 14
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<210> 15
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SplyNt-WoodsCt 大肠杆菌优化序列:
<400> 15
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ccttttctgg cctatgcgga ctcatctgct gtcttacatc ctgtgttgga ctggtcaaag 180
agtcaatttc atacggttac tatgaacgga caaacatatc aattgccgga aatccttaat 240
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cagcagtctt tcgacttatg gtctataagc gcccctgcag atatagcacg cctgcagaat 480
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ttggctacaa tattcaacgt gtatggatct catatactga tgagcggcgt catgggcgga 600
aaagcccacg tctcggcgag tgcgaataag cttaccttaa ctcagaaatt tgagatgtcc 660
acgattgttc aggcaaaata cgagcagctt acatcacaac tgtcggccga agacaagtta 720
aagtacagcg aggcgttcga atcattctcc gagtccggtt cctacaccta tgatatctta 780
ggaggttcac ccagtctggg agcattggtc ttcaaggtta acaaccagga ttctgacgat 840
aatttacgga agtggatcga ttcgatctcc accatgcctg tgttgacgaa atttatcgat 900
cagaccagtt tattgcctgt ctggacgctt tgcgaagatc aggtgaaagc cgacgccctg 960
aagaactact ataacaacac atggtcgcag ttgcagatgg ccgttgctag attacgggcc 1020
aactacattg acgcagtcga agtgatccag agtaattctt cgggggttcg ccctcccagt 1080
ggatatacga aaattgatta cgacctcaat aaaggcgccg gtggggatta tatctacctg 1140
tgttatcata aagcccgtta tagcgcttac tcagaaaaca aagattgcgt ttctgattta 1200
attattatta agggaaacgg agcacgcgcc ccgagcggtt atacgaaaat tgatgtggat 1260
ttgaatgagg atgcaggtgg aaaatacctg tatttatgct acaagaagca aagttacgac 1320
aatgtggaag caatcaaggg gctggcggta gttggtggtg acaattcgca tacccctgct 1380
ccgtacggtt accgtcggat tgacaccgat gttaacgagg gggccggagg tgagtacatt 1440
tatatctgtt actccaaagg ggcttaa 1467
<210> 16
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WoodsNt-SplyCt 大肠杆菌优化序列:
<400> 16
atgaaaagct tggatcacgt tgctcatcag aacttactga atgaaccgac tcaccataaa 60
agcaatacca aggcggcgct gatgcgtcat caggaaaacc tggttgaacg ctatctgccg 120
ggtgtggagg tgattggggc aggttacaac cctttcggcg tatacgcgtc cactgactca 180
gttactgtgc aactttttga ttggcaaagc gcgccatcag aaccggtcat ttttaacccc 240
gattacattg ctccgaaagc tgtgtcagta caacaaaatg atgaagcccg gtatacgaac 300
gttagcggca aaacaatcaa cacgtttcaa aaaaacttct ccctgaaagt tactgtcgcg 360
ggatcctata acttatttag cggtagcgtc agcaatgaat tcagcagcag cgaaactcgc 420
aatgcagaaa acgaatttag ccgcatccaa cagagcatcc gcgtctggtc tctgcgcctc 480
gcgtacacgg attccctgcg tgaatattta aaagcggacg ttcgcgatta tatcgatagc 540
attcaatcag atgcgcagat tgaaattctg tttgatcgtt acgggtcaca tttccttacc 600
ggcgtggtga tgggtggcgc agcaatcatg gcgtcttcga ccaataaagt acaggtggac 660
cacacatacg agaatgaaac cattgccaag gccagctacg aagccttaac tgggcagatc 720
tctgctgaga ctgcggctaa atatcgccaa agcatgtcgt cgttctccca gaactccgat 780
attcacaaaa ttgtggtcgg cggagacgga gtcgcgggcg cgaaagtgta tagcggtgac 840
aaggcggatt tcgatgcttg ggctgacacc gtggggacgt ctccagattt tgtggacttt 900
gttagcagcg ttcctatgtt gggaatttgg gaactgtgca aagatgacgc gcaggcgaaa 960
aagatggaag attactataa taatacgtgg gccccgcgga aaagcaaaga ggctcaaatt 1020
tatgctgatt atatcgacga ggtaacgttt gttcttggcg ataactctga catccctgcg 1080
ccagcagggt atactaaggt accagtggac ctgaattctg gggcaggtgg taaattcatt 1140
tatctttgct atcatgaagc gcagtttact cccgtgaact ctaagcaagc catagttggc 1200
ttgcaggtct tgtacgggaa acaagaacca gcacctgatt attcacgtat taacatagat 1260
ctgaattctg gagcaaacgg ggatgatgtc tacctttctt ataaaaaggg ggacgccact 1320
tcgaaagaag tcatcaacaa aatcactgcg gtgtacggga aggatcagta cgttcccaca 1380
ccgtatggct acaagcaaat tccgggggac ctgaattcag gtgcgggtgg cgactttgtc 1440
tatttttgta cttatcaggg aggaactgaa taa 1473
<210> 17
<211> 510
<212> PRT
<213> 发光杆菌
<400> 17
Met Ser Asn Asp Lys Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gln Glu Asn Ser Glu
1 5 10 15
Arg Asp Val Glu Ile Arg Asp Arg Asn Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Phe Asp Asp Thr Val Ile Ala Gly Ala Glu Met Ile Gly Thr Ser Tyr
35 40 45
Asp Val Phe Gly Lys Tyr Cys Asn Val Gly Ser Cys Met Asn Ser Leu
50 55 60
Phe Asp Glu Arg Lys Ile Asn Ala Ser Glu Asp Asn Phe Lys Lys Val
65 70 75 80
Thr Ile Leu Gly Lys Thr Leu Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asp Cys Tyr
85 90 95
Ser Val Gly Asp Leu Lys Tyr Thr Asn Ala Ser Gly Glu Ser Ile Glu
100 105 110
Ser Tyr Gln Ser Asn Ile Ser Ser Lys Ser Arg Ile Lys Gly Asn Tyr
115 120 125
Leu Phe Phe Ser Ala Ser Leu Lys Val Asp Phe Asp Thr Asp Ser Leu
130 135 140
Thr Asp Phe Glu Asn Ala Phe Ser Arg Ile Gln Tyr Thr Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Ile Leu Lys Ser Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Ser Val Lys Thr Ala Leu Asp Lys Ala Asp Thr Glu Glu Asp Met Asn
180 185 190
Asp Leu Phe Asn Thr Trp Gly Ser His Phe Leu Ser Gly Val Val Met
195 200 205
Gly Gly Cys Ala Gln Tyr Ser Ser Ser Thr Asn Lys Tyr Thr Ser Asn
210 215 220
Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Val Ala Ala Ala Ser Phe Ala Gly Phe
225 230 235 240
Ile Gly Leu Ser Ala Arg Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Asp Ile Lys
245 250 255
Lys Phe Arg Ser Ala Ser Asn Ile Lys Thr His Ala Ile Gly Gly Asp
260 265 270
Leu Ser Arg Phe Asp Pro Phe Gly Gly Ala Thr Ser Ala Asp Gln Pro
275 280 285
Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ala Phe Glu Asp Trp Lys
290 295 300
Ala Ser Val Pro Asn Ala Pro Glu Leu Val Asn Phe Ala Asp Ser Asn
305 310 315 320
Pro Leu Thr Gly Ile Trp Glu Leu Cys Ser Asp Arg Thr Gln Lys Ala
325 330 335
Lys Leu Lys Lys His Phe Glu Thr Val Trp Ala Pro Ala Glu Ser Ala
340 345 350
Lys Arg Arg Val His Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Ile Ile Ile Gly Ile
355 360 365
Asn Asn Thr Asn Thr Pro Pro Glu Gly Tyr Ile Gly Leu Lys Ser Thr
370 375 380
Lys Asp Glu Asn Leu Asn Ser Lys Gly Asn Ile Cys Leu Phe Met His
385 390 395 400
Lys Ala Lys Tyr Asp Pro Asn Ile Asp Asn Lys Asp Cys Ile Thr Glu
405 410 415
Leu Lys Phe Ile Thr Val Arg Asp Lys Ser Pro Glu Gly Asp Trp Val
420 425 430
Lys Ile Pro Gln Asp Ile Tyr Ile Ser Pro Asn Gln Tyr Leu Tyr Leu
435 440 445
Cys Tyr Leu Pro Ala Lys Tyr Ser Ala Glu Lys Ala Ile Lys Asp Ile
450 455 460
Gln Leu Leu Cys Ser Ser Cys Gly Ser Ser Met Ile Leu Pro Tyr Gly
465 470 475 480
Tyr Asn Asp Val Leu Asp Glu Arg Gly Glu Arg Ala Asn Ala Thr Glu
485 490 495
Asp Asp Asn Val His Tyr Leu Ile Tyr Ser Ala Gly Trp Lys
500 505 510
<210> 18
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/SproCRW.
<400> 18
Met Ser Asn Asp Lys Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gln Glu Asn Ser Glu
1 5 10 15
Arg Asp Val Glu Ile Arg Asp Arg Asn Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Phe Asp Asp Thr Val Ile Ala Gly Ala Glu Met Ile Gly Thr Ser Tyr
35 40 45
Asp Val Phe Gly Lys Tyr Cys Asn Val Gly Ser Cys Met Asn Ser Leu
50 55 60
Phe Asp Glu Arg Lys Ile Asn Ala Ser Glu Asp Asn Phe Lys Lys Val
65 70 75 80
Thr Ile Leu Gly Lys Thr Leu Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asp Cys Tyr
85 90 95
Ser Val Gly Asp Leu Lys Tyr Thr Asn Ala Ser Gly Glu Ser Ile Glu
100 105 110
Ser Tyr Gln Ser Asn Ile Ser Ser Lys Ser Arg Ile Lys Gly Asn Tyr
115 120 125
Leu Phe Phe Ser Ala Ser Leu Lys Val Asp Phe Asp Thr Asp Ser Leu
130 135 140
Thr Asp Phe Glu Asn Ala Phe Ser Arg Ile Gln Tyr Thr Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Ile Leu Lys Ser Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Ser Val Lys Thr Ala Leu Asp Lys Ala Asp Thr Glu Glu Asp Met Asn
180 185 190
Asp Leu Phe Asn Thr Trp Gly Ser His Phe Leu Ser Gly Val Val Met
195 200 205
Gly Gly Cys Ala Gln Tyr Ser Ser Ser Thr Asn Lys Tyr Thr Ser Asn
210 215 220
Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Val Ala Ala Ala Ser Phe Ala Gly Phe
225 230 235 240
Ile Gly Leu Ser Ala Arg Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Asp Ile Lys
245 250 255
Lys Phe Arg Ser Ala Ser Asn Ile Lys Thr His Ala Ile Gly Gly Asp
260 265 270
Leu Ser Arg Phe Asp Pro Phe Gly Gly Ala Thr Ser Ala Asp Gln Pro
275 280 285
Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ala Phe Glu Asp Trp Lys
290 295 300
Ala Ser Val Pro Asn Ala Pro Glu Leu Val Asn Phe Ala Asp Ser Asn
305 310 315 320
Pro Leu Thr Gly Ile Trp Glu Leu Cys Ser Asp Arg Thr Gln Lys Ala
325 330 335
Lys Leu Lys Lys His Phe Glu Thr Val Trp Ala Pro Ala Glu Ser Ala
340 345 350
Lys Arg Arg Val His Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Leu Thr Phe Val Leu
355 360 365
Gly Asp Asn Ser Asp Ile Pro Ala Pro Val Gly Tyr Thr Lys Val Pro
370 375 380
Ile Asp Leu Asn Ser Asp Ala Gly Gly Lys Tyr Val Tyr Leu Cys Tyr
385 390 395 400
His Glu Ala Gln Phe Thr Pro Val Asn Gly Lys Gln Pro Ile Val Asp
405 410 415
Ile Gln Val Leu Tyr Gly Ser Gln Met Pro Ala Pro Gly Tyr Ile Lys
420 425 430
Ile Asp Val Asp Leu Asn Ser Gly Ala Gly Gly Glu Phe Val Tyr Leu
435 440 445
Ser Tyr Lys Lys Gly Glu Pro Thr Ser Ser Asp Val Ile Asn Lys Ile
450 455 460
Thr Ala Val Tyr Gly Lys Asn Glu Tyr Val Pro Thr Pro Tyr Gly Tyr
465 470 475 480
Lys Gln Ile Ser Gly Asp Leu Asn Ala Gly Ala Gly Gly Asp Phe Val
485 490 495
Tyr Leu Cys Thr Tyr Gln Gly Gly Thr Glu
500 505
<210> 19
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/SplyCRW.
<400> 19
Met Ser Asn Asp Lys Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gln Glu Asn Ser Glu
1 5 10 15
Arg Asp Val Glu Ile Arg Asp Arg Asn Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Phe Asp Asp Thr Val Ile Ala Gly Ala Glu Met Ile Gly Thr Ser Tyr
35 40 45
Asp Val Phe Gly Lys Tyr Cys Asn Val Gly Ser Cys Met Asn Ser Leu
50 55 60
Phe Asp Glu Arg Lys Ile Asn Ala Ser Glu Asp Asn Phe Lys Lys Val
65 70 75 80
Thr Ile Leu Gly Lys Thr Leu Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asp Cys Tyr
85 90 95
Ser Val Gly Asp Leu Lys Tyr Thr Asn Ala Ser Gly Glu Ser Ile Glu
100 105 110
Ser Tyr Gln Ser Asn Ile Ser Ser Lys Ser Arg Ile Lys Gly Asn Tyr
115 120 125
Leu Phe Phe Ser Ala Ser Leu Lys Val Asp Phe Asp Thr Asp Ser Leu
130 135 140
Thr Asp Phe Glu Asn Ala Phe Ser Arg Ile Gln Tyr Thr Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Ile Leu Lys Ser Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Ser Val Lys Thr Ala Leu Asp Lys Ala Asp Thr Glu Glu Asp Met Asn
180 185 190
Asp Leu Phe Asn Thr Trp Gly Ser His Phe Leu Ser Gly Val Val Met
195 200 205
Gly Gly Cys Ala Gln Tyr Ser Ser Ser Thr Asn Lys Tyr Thr Ser Asn
210 215 220
Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Val Ala Ala Ala Ser Phe Ala Gly Phe
225 230 235 240
Ile Gly Leu Ser Ala Arg Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Asp Ile Lys
245 250 255
Lys Phe Arg Ser Ala Ser Asn Ile Lys Thr His Ala Ile Gly Gly Asp
260 265 270
Leu Ser Arg Phe Asp Pro Phe Gly Gly Ala Thr Ser Ala Asp Gln Pro
275 280 285
Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ala Phe Glu Asp Trp Lys
290 295 300
Ala Ser Val Pro Asn Ala Pro Glu Leu Val Asn Phe Ala Asp Ser Asn
305 310 315 320
Pro Leu Thr Gly Ile Trp Glu Leu Cys Ser Asp Arg Thr Gln Lys Ala
325 330 335
Lys Leu Lys Lys His Phe Glu Thr Val Trp Ala Pro Ala Glu Ser Ala
340 345 350
Lys Arg Arg Val His Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Val Thr Phe Val Leu
355 360 365
Gly Asp Asn Ser Asp Ile Pro Ala Pro Ala Gly Tyr Thr Lys Val Pro
370 375 380
Val Asp Leu Asn Ser Gly Ala Gly Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Cys Tyr
385 390 395 400
His Glu Ala Gln Phe Thr Pro Val Asn Ser Lys Gln Ala Ile Val Gly
405 410 415
Leu Gln Val Leu Tyr Gly Lys Gln Glu Pro Ala Pro Asp Tyr Ser Arg
420 425 430
Ile Asn Ile Asp Leu Asn Ser Gly Ala Asn Gly Asp Asp Val Tyr Leu
435 440 445
Ser Tyr Lys Lys Gly Asp Ala Thr Ser Lys Glu Val Ile Asn Lys Ile
450 455 460
Thr Ala Val Tyr Gly Lys Asp Gln Tyr Val Pro Thr Pro Tyr Gly Tyr
465 470 475 480
Lys Gln Ile Pro Gly Asp Leu Asn Ser Gly Ala Gly Gly Asp Phe Val
485 490 495
Tyr Phe Cys Thr Tyr Gln Gly Gly Thr Glu
500 505
<210> 20
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/SproCRW CDS.
<400> 20
atgtcaaacg ataaaacggg aaaaagtctg gaacaggaaa atagcgagcg cgacgttgaa 60
attcgcgatc gcaactactt tcgcaaattg agcttgtttg acgatactgt tatcgccggt 120
gcggagatga tcggtactag ctacgatgtg tttggcaagt actgcaatgt aggaagctgc 180
atgaacagcc tcttcgatga acgtaaaatc aacgcgagtg aagacaactt taaaaaagtt 240
accattttag gcaaaacgct caaggtaccg tattatatcg attgttattc tgtcggtgat 300
cttaaataca cgaacgcatc aggcgaatct atcgagagtt atcagtctaa catttcttct 360
aaaagtcgta tcaaaggtaa ctatctgttt ttttctgcct cactcaaggt cgatttcgat 420
acggatagcc tgacggattt cgagaatgcc ttctctcgta tccagtacac gtatgatttg 480
tatattttaa aatcatccgc ggaagccctc aaggaatttc tgaaagagtc agtcaaaacg 540
gcgttggaca aggcggatac cgaagaagac atgaacgacc tgtttaatac ttggggcagt 600
catttcctgt caggcgtagt gatgggtggt tgcgcgcaat acagttcgag tacgaataag 660
tatacctcaa atctgaccaa tagctttgac gttgttgcag cggcatcttt cgctggtttt 720
attggtctgt ccgcccgtac aggcaactca tttatggaag atattaaaaa atttcgctcc 780
gcatctaata ttaagaccca cgcgatcggt ggggatctca gccgcttcga tccgttcggc 840
ggcgccacct ccgccgatca accgtctgcc gaagagatcg cggcggccaa gaaggccttt 900
gaagattgga aagccagcgt accaaacgca ccggaattag tgaacttcgc ggattctaat 960
ccgctgaccg gcatttggga gctgtgctcg gatcgtacgc agaaagcgaa actgaaaaaa 1020
cacttcgaga cggtgtgggc cccggcagaa agcgcgaagc gtcgggtaca tgcggattat 1080
atcgacgaac tgaccttcgt cctcggtgat aattctgaca ttcctgcgcc ggtaggttat 1140
acgaaagtcc cgatcgatct taattcggat gccggcggta aatacgttta tctgtgctat 1200
cacgaagccc agtttacccc ggtgaacggc aaacagccca tcgtggatat tcaggttctg 1260
tacggttctc agatgcctgc gccggggtat attaagattg atgtagatct gaacagcggg 1320
gccggtggtg aatttgtgta cctgtcctat aaaaaagggg agccgacatc gtccgatgtt 1380
attaacaaaa tcaccgctgt ttatggaaag aatgaatatg taccgacccc gtatggctat 1440
aaacagatca gcggcgacct caacgctggg gcggggggtg acttcgttta tttgtgtact 1500
tatcaagggg ggaccgaata a 1521
<210> 21
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/SplyCRW CDS.
<400> 21
atgtcaaacg ataaaacggg aaaaagtctg gaacaggaaa atagcgagcg cgacgttgaa 60
attcgcgatc gcaactactt tcgcaaattg agcttgtttg acgatactgt tatcgccggt 120
gcggagatga tcggtactag ctacgatgtg tttggcaagt actgcaatgt aggaagctgc 180
atgaacagcc tcttcgatga acgtaaaatc aacgcgagtg aagacaactt taaaaaagtt 240
accattttag gcaaaacgct caaggtaccg tattatatcg attgttattc tgtcggtgat 300
cttaaataca cgaacgcatc aggcgaatct atcgagagtt atcagtctaa catttcttct 360
aaaagtcgta tcaaaggtaa ctatctgttt ttttctgcct cactcaaggt cgatttcgat 420
acggatagcc tgacggattt cgagaatgcc ttctctcgta tccagtacac gtatgatttg 480
tatattttaa aatcatccgc ggaagccctc aaggaatttc tgaaagagtc agtcaaaacg 540
gcgttggaca aggcggatac cgaagaagac atgaacgacc tgtttaatac ttggggcagt 600
catttcctgt caggcgtagt gatgggtggt tgcgcgcaat acagttcgag tacgaataag 660
tatacctcaa atctgaccaa tagctttgac gttgttgcag cggcatcttt cgctggtttt 720
attggtctgt ccgcccgtac aggcaactca tttatggaag atattaaaaa atttcgctcc 780
gcatctaata ttaagaccca cgcgatcggt ggggatctca gccgcttcga tccgttcggc 840
ggcgccacct ccgccgatca accgtctgcc gaagagatcg cggcggccaa gaaggccttt 900
gaagattgga aagccagcgt accaaacgca ccggaattag tgaacttcgc ggattctaat 960
ccgctgaccg gcatttggga gctgtgctcg gatcgtacgc agaaagcgaa actgaaaaaa 1020
cacttcgaga cggtgtgggc cccggcagaa agcgcgaagc gtcgggtaca tgcggattat 1080
atcgacgagg taacgtttgt tcttggcgat aactctgaca tccctgcgcc agcagggtat 1140
actaaggtac cagtggacct gaattctggg gcaggtggta aattcattta tctttgctat 1200
catgaagcgc agtttactcc cgtgaactct aagcaagcca tagttggctt gcaggtcttg 1260
tacgggaaac aagaaccagc acctgattat tcacgtatta acatagatct gaattctgga 1320
gcaaacgggg atgatgtcta cctttcttat aaaaaggggg acgccacttc gaaagaagtc 1380
atcaacaaaa tcactgcggt gtacgggaag gatcagtacg ttcccacacc gtatggctac 1440
aagcaaattc cgggggacct gaattcaggt gcgggtggcg actttgtcta tttttgtact 1500
tatcagggag gaactgaata a 1521
<210> 22
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/Hmass 蛋白.
<400> 22
Met Ser Asn Asp Lys Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gln Glu Asn Ser Glu
1 5 10 15
Arg Asp Val Glu Ile Arg Asp Arg Asn Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Phe Asp Asp Thr Val Ile Ala Gly Ala Glu Met Ile Gly Thr Ser Tyr
35 40 45
Asp Val Phe Gly Lys Tyr Cys Asn Val Gly Ser Cys Met Asn Ser Leu
50 55 60
Phe Asp Glu Arg Lys Ile Asn Ala Ser Glu Asp Asn Phe Lys Lys Val
65 70 75 80
Thr Ile Leu Gly Lys Thr Leu Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asp Cys Tyr
85 90 95
Ser Val Gly Asp Leu Lys Tyr Thr Asn Ala Ser Gly Glu Ser Ile Glu
100 105 110
Ser Tyr Gln Ser Asn Ile Ser Ser Lys Ser Arg Ile Lys Gly Asn Tyr
115 120 125
Leu Phe Phe Ser Ala Ser Leu Lys Val Asp Phe Asp Thr Asp Ser Leu
130 135 140
Thr Asp Phe Glu Asn Ala Phe Ser Arg Ile Gln Tyr Thr Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Ile Leu Lys Ser Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Phe Leu Lys Glu
165 170 175
Ser Val Lys Thr Ala Leu Asp Lys Ala Asp Thr Glu Glu Asp Met Asn
180 185 190
Asp Leu Phe Asn Thr Trp Gly Ser His Phe Leu Ser Gly Val Val Met
195 200 205
Gly Gly Cys Ala Gln Tyr Ser Ser Ser Thr Asn Lys Tyr Thr Ser Asn
210 215 220
Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Val Ala Ala Ala Ser Phe Ala Gly Phe
225 230 235 240
Ile Gly Leu Ser Ala Arg Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Asp Ile Lys
245 250 255
Lys Phe Arg Ser Ala Ser Asn Ile Lys Thr His Ala Ile Gly Gly Asp
260 265 270
Leu Ser Arg Phe Asp Pro Phe Gly Gly Ala Thr Ser Ala Asp Gln Pro
275 280 285
Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ala Phe Glu Asp Trp Lys
290 295 300
Ala Ser Val Pro Asn Ala Pro Glu Leu Val Asn Phe Ala Asp Ser Asn
305 310 315 320
Pro Leu Thr Gly Ile Trp Glu Leu Cys Ser Asp Arg Thr Gln Lys Ala
325 330 335
Lys Leu Lys Lys His Phe Glu Thr Val Trp Ala Pro Ala Glu Ser Ala
340 345 350
Lys Arg Arg Val His Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Ile Phe Val Gly Tyr
355 360 365
Gly Asp Thr Pro Asp Ala Ala Arg Ala Asp Val Tyr Ala Gln Met Ala
370 375 380
Ala Tyr Asp Pro Lys Ala Pro Glu Phe Ile Val Phe Lys Asp Leu Asn
385 390 395 400
Cys Ser Ala Arg Gly Lys Tyr Glu Tyr Leu Gly Tyr Thr Val Thr Thr
405 410 415
Asp Leu Lys Glu Ala Ile Arg Gly Met Arg Gly Ala Thr Asp Pro Asn
420 425 430
Asp Arg Cys Ser Asp Thr Tyr Asn Val Gly Gly Cys Thr Tyr His Arg
435 440 445
Leu Arg Arg Asp Leu Asn His Gly Ala Gly Gly His Tyr Val Tyr Leu
450 455 460
Tyr Trp Thr Lys Asp Ala Ala Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ala Ala Asp
465 470 475 480
Val Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Phe Asp His Tyr Gly Gln Pro Gly Trp
485 490 495
Ser Arg Val Arg Leu Ile Asn Asn Asp Gly Asp Leu Asn Thr Asn Arg
500 505 510
Gly Thr Gly Ser Arg Thr Tyr Asp Ile Phe Val Trp Val Ser Lys Glu
515 520 525
Leu
<210> 23
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Plu1415/HmassCRW CDS.
<400> 23
atgtcaaacg ataaaacggg aaaaagtctg gaacaggaaa atagcgagcg cgacgttgaa 60
attcgcgatc gcaactactt tcgcaaattg agcttgtttg acgatactgt tatcgccggt 120
gcggagatga tcggtactag ctacgatgtg tttggcaagt actgcaatgt aggaagctgc 180
atgaacagcc tcttcgatga acgtaaaatc aacgcgagtg aagacaactt taaaaaagtt 240
accattttag gcaaaacgct caaggtaccg tattatatcg attgttattc tgtcggtgat 300
cttaaataca cgaacgcatc aggcgaatct atcgagagtt atcagtctaa catttcttct 360
aaaagtcgta tcaaaggtaa ctatctgttt ttttctgcct cactcaaggt cgatttcgat 420
acggatagcc tgacggattt cgagaatgcc ttctctcgta tccagtacac gtatgatttg 480
tatattttaa aatcatccgc ggaagccctc aaggaatttc tgaaagagtc agtcaaaacg 540
gcgttggaca aggcggatac cgaagaagac atgaacgacc tgtttaatac ttggggcagt 600
catttcctgt caggcgtagt gatgggtggt tgcgcgcaat acagttcgag tacgaataag 660
tatacctcaa atctgaccaa tagctttgac gttgttgcag cggcatcttt cgctggtttt 720
attggtctgt ccgcccgtac aggcaactca tttatggaag atattaaaaa atttcgctcc 780
gcatctaata ttaagaccca cgcgatcggt ggggatctca gccgcttcga tccgttcggc 840
ggcgccacct ccgccgatca accgtctgcc gaagagatcg cggcggccaa gaaggccttt 900
gaagattgga aagccagcgt accaaacgca ccggaattag tgaacttcgc ggattctaat 960
ccgctgaccg gcatttggga gctgtgctcg gatcgtacgc agaaagcgaa actgaaaaaa 1020
cacttcgaga cggtgtgggc cccggcagaa agcgcgaagc gtcgggtaca tgcggattat 1080
atcgacgaga ttttcgtagg ctatggggat acgccggacg cggcacgcgc agacgtatat 1140
gcacagatgg cggcatacga tccgaaggcc ccggagttta ttgtttttaa agatctgaat 1200
tgttcagctc gcggtaaata tgaatatctg ggatacactg tgacgaccga cctcaaagag 1260
gcgatccgcg gcatgcgcgg cgcaaccgac ccgaatgatc gctgttccga tacctataat 1320
gtgggtgggt gtacttacca ccggctgcgt cgggacctga accacggagc gggtgggcat 1380
tacgtgtatc tgtattggac caaagacgct gcggcgggca agccattgct tgccgcggat 1440
gtcgagatta attattcagg cttcgatcat tatgggcagc ccgggtggtc tcgtgttcgt 1500
ttgattaata atgatgggga cctcaatacg aatcgtggga cgggctcccg cacctatgac 1560
attttcgtat gggtttcaaa agaattgtaa 1590

Claims (53)

1.一种对昆虫有害生物有毒的嵌合杀昆虫蛋白，所述嵌合杀昆虫蛋白以N末端至C末端方向包含(a)N末端区域，其包含与以下的氨基酸1至氨基酸338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ IDNO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列；或(iv)SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列，融合至(b)C末端区域，其包含与以下的氨基酸339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352或353到氨基酸488、489或490对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列，或包含SEQ IDNO:3；或(c)N末端区域，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至约氨基酸363对应的氨基酸序列，融合至(i)C末端区域，其包含与SEQ ID NO:1的约氨基酸347至约氨基酸489对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)C末端区域，其包含与SEQ ID NO:2的约氨基酸346至约氨基酸488对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中(a)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(b)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(c)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(d)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(e)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸347至氨基酸489对应的氨基酸序列，或(f)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述嵌合杀昆虫蛋白包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中(a)所述N末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488；或(b)所述N末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至氨基酸345，并且所述C末端区域包含SEQ IDNO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(c)所述N末端区域包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(d)所述N末端区域包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488；或(e)所述N末端区域包含SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸347至氨基酸489，或(f)所述N末端区域包含SEQ IDNO:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488。
5.如权利要求4所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述嵌合杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19或SEQ ID NO:22。
6.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
7.如权利要求6所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
8.如权利要求7所述的嵌合杀昆虫蛋白，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctatahowardi)和玉蜀黍根萤叶甲(Diabrotica zeae)。
9.一种核酸分子，所述核酸分子包含(a)编码如权利要求1至8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白的核酸序列；或者(b)(a)的经密码子优化用于在转基因生物中表达的核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述转基因生物是细菌或植物。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述细菌在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。
12.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述植物是双子叶植物或单子叶植物。
13.如权利要求12所述的核酸分子，其中(a)所述双子叶植物选自由以下组成的组：大豆、向日葵、番茄、芸苔属作物、棉花、甜菜以及烟草；或者(b)所述单子叶植物选自由以下组成的组：大麦、玉蜀黍、燕麦、稻、高粱、甘蔗和小麦。
14.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:11-16、20或21中的任何一个。
15.一种嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接至如权利要求9-14中任一项所述的核酸分子的异源启动子。
16.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。
17.如权利要求16所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自下组启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因9 5'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
18.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
19.如权利要求18所述的嵌合基因，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
20.如权利要求19所述的嵌合基因，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
21.如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌或植物。
22.一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求15所述的嵌合基因。
23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求22所述的重组载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。
24.如权利要求23所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。
25.如权利要求24所述的转基因芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞是苏云金芽孢杆菌细胞。
26.如权利要求23所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。
27.如权利要求26所述的转基因植物细胞，其中(a)所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞；或(b)所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。
28.一种转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含如权利要求27所述的转基因植物细胞。
29.如权利要求28所述的转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分是转基因玉蜀黍植物或植物部分。
30.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求1至8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白以及农业上可接受的载剂。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述农业上可接受的载剂选自由以下组成的组：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌菌株的培养物而制备。
33.如权利要求32所述的组合物，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述杀昆虫蛋白。
34.如权利要求30-33中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二杀有害生物剂。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述第二杀有害生物剂是生物剂或化学剂。
36.如权利要求35所述的组合物，其中(a)所述生物剂是或衍生自苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白；(b)所述生物剂是或衍生自dsRNA、Cry蛋白、Vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(c)所述化学剂是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或者(d)所述化学剂包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
37.一种用于产生杀昆虫蛋白的方法，所述方法包括在如权利要求23所述的宿主细胞产生所述杀昆虫蛋白的条件下培养所述宿主细胞或包含所述宿主细胞的生物。
38.一种产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括：(a)向植物或植物部分中引入如权利要求15所述的嵌合基因，其中所述杀昆虫蛋白在所述植物或植物部分中表达，从而产生具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述引入步骤通过以下实现：(a)转化所述植物或植物部分；或者(b)使包含所述嵌合基因的第一植物与不同的第二植物杂交。
40.一种控制昆虫有害生物的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1-8中任一项所述的嵌合杀昆虫蛋白递送至所述昆虫有害生物或其环境。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述杀昆虫蛋白通过转基因植物或通过局部施用包含所述杀昆虫蛋白的杀昆虫组合物递送。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因植物或所述杀昆虫组合物包含不同于所述杀昆虫蛋白的第二杀昆虫剂。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述第二杀昆虫剂是蛋白质、dsRNA或化学品。
44.如权利要求43所述的方法，其中(a)所述蛋白质选自由以下组成的组：Cry蛋白、Vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(b)所述化学品是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或(c)所述化学品包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
45.如权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属物种。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述根萤叶甲属物种选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
48.一种降低根萤叶甲属昆虫群体对如权利要求15所述的杀昆虫蛋白的抗性发展的方法，所述方法包括在由所述根萤叶甲属昆虫群体摄食的转基因植物中表达所述杀昆虫蛋白和干扰RNA分子，所述干扰RNA分子抑制幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中靶基因的表达，从而使所述根萤叶甲属昆虫群体中的抗性发展与仅暴露于所述杀昆虫蛋白的根萤叶甲属昆虫群体相比降低。
49.一种向玉米种植者提供控制玉米作物中根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，所述方法包括(a)向所述种植者出售或提供包含如权利要求8所述的核酸分子的转基因玉米种子；和(b)向所述种植者宣传所述转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。
50.一种制备嵌合杀昆虫蛋白的方法，所述嵌合杀昆虫蛋白包括以N末端至C末端方向融合(a)N末端区域，其包含与以下的氨基酸1至氨基酸338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351或352对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ IDNO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQID NO:3具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iv)SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列，融合至(b)C末端区域，其包含与以下的氨基酸339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352或353到氨基酸488、489或490对应的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或c)N末端区域，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至约氨基酸363对应的氨基酸序列，融合至(i)C末端区域，其包含与SEQ IDNO:1的约氨基酸347至约氨基酸489对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列；或(ii)C末端区域，其包含与SEQ ID NO:2的约氨基酸346至约氨基酸488对应的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性到至少99％同一性的氨基酸序列。
51.如权利要求50所述的方法，其中(a)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(b)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至氨基酸345对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(c)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489对应的氨基酸序列；或(d)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列；或(e)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸347至氨基酸489对应的氨基酸序列，或(f)所述N末端区域包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363对应的氨基酸序列，并且所述C末端区域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488对应的氨基酸序列。
52.如权利要求51所述的方法，其中(a)所述N末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至氨基酸345，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488；或(b)所述N末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至氨基酸345，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(c)所述N末端区域包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸346至氨基酸489；或(d)所述N末端区域包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至氨基酸346，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488；或(e)所述N末端区域包含SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸347至氨基酸489，或(f)所述N末端区域包含SEQ ID NO:17的氨基酸1至氨基酸363，并且所述C末端区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸346至氨基酸488。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述嵌合杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22。
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