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CN113666914B - 二氢嘧啶类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

二氢嘧啶类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN113666914B CN202111137288.3A CN202111137288A CN113666914B CN 113666914 B CN113666914 B CN 113666914B CN 202111137288 A CN202111137288 A CN 202111137288A CN 113666914 B CN113666914 B CN 113666914B
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Abstract

本发明公开了二氢嘧啶类化合物及其制备方法和用途，属于药物化学技术领域。本发明提供的二氢嘧啶类化合物的结构如式I所示。本发明还公开了该二氢嘧啶类化合物的制备方法。本发明提供了式I所示化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药在制备治疗或预防P2X3和/或/P2X2/3受体相关疾病的药物中的应用。本发明化合物的止咳作用时间较对比例1化合物明显延长；对P2X3的抑制活性优于对比例1化合物及阳性对照药gefapixant，在10mg/kg静脉给药下对小鼠的味觉几乎没有影响，与阳性对照药gefapixant有显著性的统计性差异。

Description

二氢嘧啶类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及二氢嘧啶类化合物或其盐、溶剂化 物、异体构、代谢物、氮氧化物及前药、其制备方法、以及在制备治疗和预防与 P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病药物中的用途，尤其在制备治疗和预防呼吸系 统疾病的药物中的用途。
背景技术
据估计，持续时间＞8周的慢性咳嗽，占呼吸科门诊1/3以上，发病率在 2-10％。慢性咳嗽患者对在健康受试者中通常不会引起咳嗽的各种诱因更为敏感， 如日常活动(说话和大笑)、气温变化、接触气溶胶或食物气味。慢性咳嗽不仅 影响患者的生存质量，还会产生严重的心理负担。现有技术中，对于慢性咳嗽的 治疗手段有限。临床上常用的药物包括：糖皮质激素、β2受体激动药、抗组胺 药、抗反流药、抗生素类等，目前尚无专门针对慢性咳嗽的批准用药。
P2X3受体是嘌呤类受体家族中的一员，是非选择性的配体门控离子通道， 在伤害性信息的产生、传递中起着重要的作用。近年来的研究发现，P2X3受体 的过度活化与感觉神经元的超敏化(hyper-sensitization)有关。损伤或感染引发 的气道和肺部神经元超敏反应可引起过度、持续和频繁地咳嗽。因此，现有技术 中，可抑制神经元超敏反应的P2X3受体拮抗剂被用于治疗慢性咳嗽。
gefapixant(MK-7264)是一种口服、选择性P2X3受体拮抗剂，用于治疗成 人患者难性慢性咳嗽(RCC)或不明原因慢性咳嗽(UCC)。Gefapixant由默沙 东公司(Merck&Co)研发，目前已向FDA新药申请(NDA)。该药的两项临 床III期试验表明，与安慰剂组相比，每天2次45mg剂量gefapixant治疗组在第 12周(COUGH-1研究)和第24周(COUGH-2研究)的24小时咳嗽频率(采 用24小时录音客观地测量每小时的咳嗽次数)有统计学意义的显著降低。2项研究中，每天2次15mg剂量gefapixant治疗组没有达到主要疗效终点。45mg 组虽然达到临床终点，但45mg因不良事件而停药的频率更高、味觉相关不良事 件发生率更高。因此临床需要更安全，更有效的P2X3受体拮抗剂。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种结构如式I所示的二氢嘧啶类化合物，该 化合物对P2X3受体的亲和力好，拮抗作用强，安全性好。
本发明的目的之二在于，提供该化合物的制备方法。
本发明的目的之三在于，提供该化合物的用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的结构如式I所示的化合物，或其盐、溶剂化物、异体构、代谢 物、氮氧化物及前药，
Figure BDA0003282524750000021
其中，R1选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取 代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的C1-C12烷胺基、取代或未取 代的环C4-C8烷胺基；
R2、R3独立地选自氢、氘、取代或未取代的C1-12烷基；或者R2、R3连接形 成取代或未取代的3元至15元环烷基基团；
R4选自取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基；
R5选自1～5个氢、氘、取代与未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取 代或未取代的烷硫基、取代或未取代的氨基或卤素。
本发明的部分实施方案中，R2、R3独立地选自氢、氘、取代或未取代甲基、 取代或未取代乙基、取代或未取代丙基、取代或未取代环丙基；其中，R2或R3的取代基独立地选自一个或多个的氘、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基、环丙基、 叔丁基、甲氧基、乙氧基、环丙氧基、叔丁氧基、甲硫基、乙硫基、环丙硫基、 叔丁硫基、胺基、甲胺基、乙胺基、环丙胺基、叔丁胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、 环丙酰胺基、叔丁酰胺基、NO2、CN、CF3；
或R2、R3连接形成取代或未取代环丙基，其中，取代环丙基的取代基独立 地选自一个或多个的氘、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基、环丙基、叔丁基、甲 氧基、乙氧基、环丙氧基、叔丁氧基、甲硫基、乙硫基、环丙硫基、叔丁硫基、 胺基、甲胺基、乙胺基、环丙胺基、叔丁胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、环丙酰胺 基、叔丁酰胺基、NO2、CN、CF3；
或/和R1选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代 的C1-C12烷胺基、取代或未取代的环C4-C8烷胺基；其中，R1的取代基选自一个 或多个的氘、卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷胺基、烷硫基、酰胺 基、NO2、CN、CF3；
或/和R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代 的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的苯 并噻唑基、取代或未取代的苯并异恶唑基、取代或未取代的咪唑并哒嗪基，其中 R4的取代基选自1～5个氘、氨基、氰基、甲基、甲氧基、卤素、三氟甲氧基或 二氟甲氧基；
或/和R5选自1～5个氢、氘、氨基、甲基、卤素、三氟甲基、二氟甲基。
本发明的部分实施方案中，R2、R3独立地选自氢、氘、甲基、乙基、丙基 或环丙基；
或R2、R3连接形成环丙基；
或/和R1选自羟基、C1-C16烷基或C1-C12环烷基、取代或未取代的C1-C6烷胺 基；
或/和R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代 的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基、取代或未取代的苯 并噻唑基、取代或未取代的苯并异恶唑基、取代或未取代的咪唑并哒嗪基，其中 R4的取代基选自1～5个氘、氨基、氰基、甲基、甲氧基、卤素、三氟甲氧基、 二氟甲氧基；
或/和R5选自1～5个氢、氘、氨基、甲基、卤素、三氟甲基、二氟甲基。
本发明的部分实施方案中，选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
表1
Figure BDA0003282524750000031
Figure BDA0003282524750000041
Figure BDA0003282524750000051
Figure BDA0003282524750000061
本发明的部分实施方案中，所述化合物中的氢被一个或多个氘所取代。
本发明提供的式I化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及 前药的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：化合物a及化合物k在碱的催化下进行取代反应，生成化合物b；
步骤2：化合物c与化合物d在碱性条件下发生取代反应得到e；
步骤3：化合物e与化合物f发生光延反应得到化合物g；
步骤4：化合物g与化合物b在催化剂存在下，发生偶联反应生成化合物h；
步骤5：体化合物h在无机碱催化或者酸催化发生水解反应得到化合物j；
步骤6：化合物j与化合物i发生缩合或酯化反应得到式I化合物；
Figure BDA0003282524750000071
本发明提供的一种药物制剂，包括上述的化合物以及药学上可接受的载体。
本发明提供的式I化合物或其盐、溶剂化物、异体构、代谢物、氮氧化物及 前药在制备治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的用途。
本发明的部分实施方案中，在制备治疗或预防呼吸系统疾病药物中的用途。
本发明的部分实施方案中，在制备治疗或预防咳嗽、哮喘、疼痛、睡眠呼吸 暂停药物中的用途。
本发明中，所述“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、 辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或 其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相 应的其它问题或并发症。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的式I所示的二氢嘧啶类化合物对P2X3受体的亲和力好，拮抗 作用强，安全性好。试验表明，本发明化合物的止咳作用时间较对比例1化合物 明显延长；对P2X3的抑制活性优于对比例1化合物及阳性对照药gefapixant， 在10mg/kg静脉给药下对小鼠的味觉几乎没有影响，与阳性对照药gefapixant有 显著性的统计性差异。
本发明提供的式I化合物的制备方法原料易得，操作简便，易于工业化。
具体实施方式
以下将结合实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述，本发明的实施例 和实验例仅用于说明本发明的技术方案，并非对本发明的限制，凡依照本发明公 开的内容所作的任何本领域的等同置换，均属于本发明的保护范围。
化合物的结构是核磁共振(1H NMR)或液质联用(LC-MS)来确定的。
液质联用仪(LC-MS)为安捷伦G6120B(与液相Agilent 1260配用)；核磁共振仪(1HNMR)为Bruker AVANCE-400或Bruker AVANCE-800，核磁共振(1HNMR)位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出，测定溶剂为DMSO，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
本发明的术语“室温”是指温度为10～25℃。
实施例1：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧杂-4-(4-(吡嗪-2-基硫基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(甲磺基)丙酰胺(化合物1)的制备：
Figure RE-GDA0003609915470000011
步骤1：4-(吡嗪-2-硫基)苯胺(化合物b-1)的制备
将2-氟吡嗪(51.0g，0.52mol)和对氨基苯硫酚(61.3g，0.49mol)溶解入二甲亚砜(360ml)中，加入碳酸铯(320g，0.98mol)得到反应混合物，并用机械搅拌匀速搅拌反应混合物。随后升温反应体系内温到80℃反应2h。薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后，将反应 混合物加入三倍体积(约1L)水中，并保持搅拌。之后用乙酸乙酯三次萃取产物，合并干燥 乙酸乙酯后浓缩得到粗品，粗品以500ml水打浆1h后过滤，鼓风干燥箱干燥得到4-(吡 嗪-2-氧基)苯胺(95.6g，褐色颗粒状固体)，收率96.0％。
ESI-MS:m/z＝204.1(M+H)+。
步骤2：6-氯-1-(4-氯苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物e-1)的制备
将6-氯尿嘧啶(36.6g，0.25mol)和4-氯苄溴(53.4g，0.26mol)混合后用 300mlDMF溶解后滴加DIPEA(96.9g，0.75mol)后保持30℃反应3h，薄层色谱 跟踪反应进程，反应完全后，将反应混合物加入3倍体积的水中，洗出固体过滤， 干燥后将滤饼用300ml乙酸乙酯打浆，过滤得到固体，鼓风干燥机干燥后得到 6-氯-1-(4-氯苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮化合物(52.25g，白色固体)，收率 77.1％，纯度为99.28％。
ESI-MS:m/z＝271.0(M+H)+。
步骤3：甲基(S)-3-(4-氯-3-(4-氯苄基)-2,6-二氧基-3,6-二氢嘧啶-1(2H) -基)-2-甲基丙酸酯(化合物g-1)的制备
将化合物e-1(27.1g，0.1mol)，(S)-(+)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯(11.8g，0.1mol)以及三苯基膦(52.4g，0.2mol)，用300ml无水四氢呋喃溶解澄清，用氩气置换 反应体系内空气后，冰水浴冷却反应体系，保持搅拌下缓慢匀速滴加偶氮二甲酸 二异丙酯(40.4g，0.2mol)，30min内滴加完毕后，保持室温反应，2小时后薄层 色谱跟踪反应进程，反应完全后，反应液用500ml水淬灭后，用30ml乙酸乙酯 萃取三次，有机溶液干燥后浓缩的到油状物粗品。用100ml乙酸乙酯和500ml 石油醚的混合溶剂分散油状物粗品，析出大量三苯基氧膦固体，过滤除去三苯基 氧膦，母液浓缩后这层析提纯得到甲基(S)-3-(4-氯-3-(4-氯苄基)-2,6-二氧 基-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(32.1g，白色固体)，收率86.5％， 纯度98.71％。
ESI-MS:m/z＝371.1(M+H)+。
步骤4：甲基(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-硫基)苯基)氨 基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(化合物h-1)的制备
将化合物g-1(3.71g，0.01mol)，化合物b-1(2.03g，0.01mol)，xant-phos (868mg，1.5mmol)，醋酸钯(337mg，1.5mmol)，磷酸钾(4.24g，0.02mol) 混合后用30ml二氧六环溶解，氩气置换反应瓶内空气，并且氩气保护反应，反 应混合物在油浴中升温到80℃反应1h，薄层色谱检测反应至化合物g-1消耗完 全，反应混合物减压蒸馏除去二氧六环后用100ml乙酸乙酯和100ml水分液萃 取三次，乙酸乙酯相干燥浓缩后柱层析提纯得到甲基(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6- 二氧-4-(4-(吡嗪-2-硫基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸酯(4.58g， 黄褐色泡沫状固体)，收率85.1％，纯度98.89％。
ESI-MS:m/z＝538.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),δ8.17(s,1H),7.55–7.48(m, 1H),7.46–7.37(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.21(s,4H),7.14–7.11(m,1H),7.04 (d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.61(s,1H),3.88(m,2H),3.46(s,3H),2.76(m, 1H),0.99(m,3H)。
步骤5，S-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(吡嗪-2-硫基)苯基)氨基)-3,6-二氢 嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基丙酸(化合物j-1)的制备
将化合物h-1(538mg，1.0mmol)溶于甲醇(3ml)和四氢呋喃(3ml)的混 合溶剂中，保持温度在10℃左右，加入氢氧化锂(168mg，4mmol)的水(3ml) 溶液，以得到反应混合物，使所述反应混合物在室温下反应过夜。薄层色谱跟踪 反应进程，反应完全后，经柱层析纯化得到化合物j-1(397mg，类白色固体)， 收率：75.8％，纯度为99.35％。
ESI-MS:m/z＝524.1(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.11(s,1H)，δ8.85(s,1H)，δ8.18(s,1H), 7.56–7.49(m,1H),7.48–7.39(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.16(s,4H),7.14– 7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.62(s,1H),4.06–3.79(m,2H), 2.75(m,1H),0.98(m,3H)。
步骤6，(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧杂-4-(4-(吡嗪-2-基硫基)苯基)氨基)-3,6- 二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(甲磺基)丙酰胺(化合物1)的制备
将化合物j-1(299mg，0.57mmol)，DIPEA(183mg,1.42mmol)以及 EDCI(130.8mg，0.68mmol)，用二氯甲烷(5ml)溶解，搅拌15min后，加入甲 基磺酰胺(64.7mg，0.68mmol)以及DMAP(83mg，0.68mmol)后室温下反应2-3 小时，薄层色谱跟踪反应进程，反应完全后水洗反应混合物，二氯甲烷萃取三次 后，合并干燥浓缩后经柱层析提纯得到化合物1(215.5mg)，收率62.9％，纯度 99.39％。
ESI-MS:m/z＝601.1(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H)，δ8.83(s,1H)，δ8.79(s,1H), 7.96–7.86(m,1H),7.48–7.39(m,1H),7.35–7.26(m,2H),7.20(m,4H),7.14– 7.11(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.42–5.15(s,2H),4.62(s,1H),3.88(m,2H), 3.01(s,3H),2.69(m,1H),0.99(m,3H)。
实施例2：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧杂-4-(4-(吡啶-2-基硫基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(甲磺基)丙酰胺(化合物2)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 2-氟吡啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物2，收率：76.0％，纯度 为99.05％。
ESI-MS:m/z＝600.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.70(s,1H),8.80(s,1H),8.31(dd,J＝5.0, 2.0Hz,1H),7.99–7.89(m,1H),7.45–7.37(m,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.25 (m,4H),7.14–7.09(m,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),5.42–5.15(m,2H),4.62(s, 1H),3.88(m,2H),3.01(s,3H),2.69(m,1H),0.98(m,3H)。
实施例3：1-(2,6-二氧-4-(4-(吡啶-2-硫代苯基)氨基)-3-(4-(三氟甲基)苄基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)基甲基)-N-(甲磺酰基)环丙烷-1-羧酰胺(化合物3)的制 备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟-吡嗪替换为等摩尔的 2-氟吡啶，并将步骤3中(S)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯替换为等摩尔的1-(羟甲基) 环丙烷-1-羧酸甲酯，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物3，收率：76.1％， 纯度为99.05％。
ESI-MS:m/z＝646.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.40(s,1H),8.89(s,1H),8.35(dd,J＝5.2, 2.0Hz,1H),7.85(m,1H),7.46–7.38(m,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.23–7.15 (m,4H),7.15–7.09(m,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),5.28(s,2H),4.65(s,1H),4.13 (s,2H),3.12(s,3H),1.07–0.92(m,4H).
实施例4：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧代-4-(4-(嘧啶-2-基硫代)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基-N-(甲磺酰基)丙酰胺(化合物4)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 2，6-二氟吡啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物4，收率：79.1％， 纯度为98.98％。
ESI-MS:m/z＝634.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.30(s,1H),8.79(s,1H),8.33(q,J＝8.2Hz, 1H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.36(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(s,4H),6.95(dd,J＝8.0, 1.7Hz,1H),6.90(dd,J＝7.9,2.5Hz,1H),5.31(s,2H),4.66(s,1H),4.08–3.80(m, 2H),3.01(s,3H),2.73(m,1H),0.98(m,3H).
实施例5：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(5-((5-三氟甲氧基)吡啶-2-基)硫 基)苯基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基-N-(磺酰基)丙酰胺(化合物5)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 2-氟-5-三氟甲氧基吡啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物5，收率： 80.1％，纯度为99.50％。
ESI-MS:m/z＝684.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.70(s,1H),8.89(s,1H),8.36(s,1H),7.90– 7.79(m,1H),7.45–7.37(m,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(m,4H),7.14–7.09 (m,1H),5.42–5.15(m,2H),4.62(s,1H),3.86(m,2H),3.01(s,3H),2.68(m,1H), 0.98(m,3H)。
实施例6：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧代-4-(4-(嘧啶-2-基硫代)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基-N-(甲磺酰基)丙酰胺(化合物6)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 2-氟嘧啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物6，收率：78.9％，纯度 为99.61％。
ESI-MS:m/z＝599.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.69(s,1H),8.80(s,1H),8.38(dd,J＝5.0, 2.0Hz,2H),7.45–7.37(m,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(m,4H),7.08–7.01 (m,1H),5.42–5.15(m,2H),4.62(s,1H),3.88(m,2H),3.01(s,3H),2.69(m,1H), 0.99(m,3H)。
实施例7：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(2-氰基嘧啶-5-基硫代)苯基)-氨基)-2,6-二 氧-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基-N-(甲磺酰基)丙酰胺(化合物7)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 5-氟2-氰基嘧啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物7，收率：79.1％， 纯度为98.99％。
ESI-MS:m/z＝626.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.68(s,1H),8.79(s,1H),8.38(s,1H),7.90– 7.79(m,1H),7.46–7.38(m,2H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(s,4H),7.14–7.09 (m,1H),5.42–5.15(m,2H),3.86(m,2H),3.01(s,3H),2.68(m,1H),0.98(m,3H)。
实施例8：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(6-甲氧基哒嗪-3-基)硫代)苯基)-2,6-二氧 -3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-甲基-N-(甲磺酰基)丙酰胺(化合物8)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 3-氟-6-甲氧基哒嗪，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物8，收率：77.8％， 纯度为98.96％。
ESI-MS:m/z＝631.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.70(s,1H),8.69(s,1H),8.34(s,1H),7.90– 7.79(m,1H),7.46–7.38(m,2H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(s,4H),7.14–7.09 (m,1H),5.42–5.15(m,2H),4.06(m,2H),3.76(s,3H),3.01(s,3H),2.68(m,1H), 0.98(m,3H)。
实施例9：3-(3-(4-氯苄基)-2,6-二氧-4-(4-(苯硫基)苯基)氨基)-3,6-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2,2-二甲基-N-(甲磺基)丙酰胺(化合物9)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 氟苯，同时将步骤3中(S)-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯替换为等摩尔的3-羟基-2,2-二 甲基丙酸甲酯，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物9，收率：75.1％， 纯度为99.26％。
ESI-MS:m/z＝613.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),9.16(s,1H),8.60(s,1H),8.03 (m,1H),7.61–7.53(m,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(m,4H),7.24–7.19(m, 2H),7.03(d,J＝8.3Hz,2H),5.42–5.15(s,2H),4.06(m,2H),3.88(m,3H),0.99 (s,6H)。
实施例10：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(6-氟吡啶-2-基硫代)苯基)-2,6-二氧-3,6- 二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基-N-(甲磺酰基)丙酰胺(化合物10)的制备
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中2-氟吡嗪替换为等摩尔的 2，6-二氟吡啶，其余条件均相同，得到白色固体状的化合物10，收率：75.1％， 纯度为99.11％。
ESI-MS:m/z＝618.2(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.60(s,1H),8.95(s,1H),8.43(q,J＝8.2Hz, 1H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(s,4H),6.95(dd,J＝8.0, 1.7Hz,1H),6.90(dd,J＝7.9,2.5Hz,1H),5.31(s,2H),4.66(s,1H),4.08–3.80(m, 2H),3.01(s,3H),2.73(m,1H),0.99(m,3H).
对比例1：(S)-3-(3-(4-氯苄基)-4-(4-(3-氟吡啶-2-氧基)苯基)氨基)-2,6-二氧杂 -3,6-二氢嘧啶-1(2H)基)-2-甲基丙酸的制备
Figure BDA0003282524750000151
本实施例的制备方法与实施例1相比，将步骤1中的对氨基苯硫酚替换为等 摩尔的对氨基苯酚，并将步骤1中的2-氟吡嗪替换为等摩尔的2，3-二氟吡啶， 其余的步骤2-5的条件均相同，无步骤6的缩合反应，得到白色固体状的对比例 1化合物，收率：81.6％，纯度为99.21％。
ESI-MS:m/z＝525.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),8.65(s,1H),8.03(q,J＝8.2Hz, 1H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(brs,4H),6.95(dd,J＝ 8.0,1.7Hz,1H),6.90(dd,J＝7.9,2.5Hz,1H),5.31(s,2H),4.66(s,1H),4.08–3.80 (m,2H),2.77(m,1H),0.99(m,3H)。
试验例1：小鼠咳嗽试验
1试验材料
1.1供试品基本信息
实施例1-10化合物(本发明人实验室合成)、阳性对照药(gefapixant，批号：01030-210326-2-1，掌心医药购买获得)、对比例1化合物(本发明人实验室合成)。
1.2试验试剂：生理盐水，氨水。
2实验动物：健康成年KM小鼠，雌雄各半，每组6只，体重28-30g左右。
3试验方法
3.1剂量设计及供试品使用量
目前文献报道的动物咳嗽模型多采用机械、化学和电刺激等方法刺激动物的 神经和感受器，引发咳嗽。根据候选化合物的特点和已有相似靶点化合物为参考， 初步选择浓氨水诱导的方法建立小鼠咳嗽造模试验。
3.2供试品的配制方法
50％氨水溶液的配制方法：量取2.5ml氨水溶于5ml的0.9％的氯化钠注射液 中，充分混匀即可。
对比例1溶液配制方法：称取9mg对比例1溶于3ml 0.5％CMC-Na溶液， 充分混匀，配置成3mg/ml的溶液。
实施例溶液配制方法：称取9mg实施例溶于3ml 0.5％CMC-Na溶液，充分 混匀，配置成3mg/ml的溶液。
3.3实验操作方法
分组：分为阳性对照组、对比例1组、实施例1组～实施例10组和模型组。每 组取6只KM小鼠，灌胃给药；其中，对比例1组给予对比例1化合物；阳性对照 组给予阳性对照药(gefapixant，购买获得)、实施例组给予相应实施例制备所得 化合物；每个组别对应三个剂量：30mg/kg、10ml/kg；模型组给予等体积的 0.5％CMC-Na溶液。给药60min或120min后，分别将小鼠置于500ml烧杯，烧杯中 放入1枚棉球(重量为100±5mg)，棉球内含有50％氨水0.3ml。观察小鼠3min内出 现典型咳嗽的次数(典型咳嗽动作：腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，伴有咳声)。
4结果与讨论
4.1结果判断标准
①咳嗽判定标准：
咳嗽的表现为：腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，伴有咳声。
②用秒表计时，记录小鼠3min内咳嗽次数(次)，用软件进行统计学分析， 各组数据采用均数±标准差统计描述，进行多组间单因素方差分析，P<0.05为差 异有统计学意义。
4.2结果讨论
试验样品给药60、120min后咳嗽次数如下表所示：
表2
Figure BDA0003282524750000171
备注：与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05。与对比例1组比较：△P<0.05。
如表所示，30mg/kg试验用药时，阳性对照组、对比例1组与模型组比较， 给药60min后小鼠咳嗽次数均明显减少，且均具有统计学差异(P<0.01)；给药 120min后，对比例1组与模型组比较，小鼠咳嗽次数减少，但不具有统计学意 义，说明对比例1化合物120min时不具备明显的止咳作用。
而本发明的多个实施例化合物给药60min和120min后，与模型组相比较咳 嗽次数仍然明显减少，且具有统计学差异(P<0.01)；此外，给药120min后，与 对比例1化合物具有统计学差异(P<0.05)。说明本发明实施例化合物的止咳作 用时间比对比例1化合物长。
试验例2：体外生物活性评价
1.试剂、耗材和仪器：本试验例所用试剂、耗材和仪器均来自于市售。
2.细胞系：使用稳定转染人源P2X3受体的HEK 293细胞系。
3.细胞培养
生长培养基：DMEM high glucose；10％FBS；1％PenStrep。
4.细胞培养过程：
a)复苏细胞
1)将细胞冻存管浸入37℃水浴中，并持续晃动使其尽快溶解；
2)用1mL移液枪上下缓慢地吹打细胞使其至悬浮，滴加到含有10mL新 鲜预温生长培养基的15mL离心管中，然后以1000rpm/min，离心5分钟；
3)弃去上清液，用5mL新鲜生长培养基重悬细胞。将细胞悬液转移到培 养皿中，放于5％CO2的培养箱中37℃静置培养；
4)24小时后，缓慢去除培养基(注意不要破坏细胞单层)，用新鲜生长培 养基培养。
b)传代培养
细胞系通常以1：3到1：4的比例稀释传代，每周传代两次(1：3的传代 比例更常用)，传代后的细胞需要2-3天才能生长达到85％的汇合度；
1)当细胞在10cm培养皿中达到>85％饱和后，用0.25％Trypsin-EDTA溶 液消化约1min，将培养皿中的细胞吸出；
2)根据稀释比将细胞转移到含有完全生长培养液的培养皿中。注意：为保 持细胞的对数生长，应该维持细胞单层培养；
3)根据细胞系细胞倍增时间(HEK293-P2X3：24小时)，使用0.25％胰蛋 白酶溶液对细胞进行传代。
c)冻存细胞
1)将培养皿从培养箱中取出，置于超净工作台中，用0.25％Trypsin-EDTA 溶液消化约1min，收集细胞并计数，再以1000rpm/min，离心5min；
2)吸出上清液，将细胞重新悬浮于冻存液(90％FBS和10％DMSO)中， 密度为2×106cells/mL，每支冻存管中加入1mL细胞悬液；
3)将细胞冻存管放入冻存盒中，然后将其转移到-80℃过夜；
4)把冻存管转移到液氮罐中(-196℃)。
5.实验过程
步骤1：细胞实验板的准备
1)当15cm培养皿中的细胞长至80％融合时，去除上清液，加入5mL DPBS 清洗细胞并吸出，再加入2.5mL 0.25％Trypsin-EDTA溶液至培养皿中，将培养 皿放入培养箱1-3分钟，或直到细胞消化下来，再加入3mL完全培养基终止消 化，用细胞计数仪检测细胞密度；
2)1000rpm/min离心5min后，用生长培养基重悬细胞并调节悬浮液体积， 使细胞密度达到4×105cells/mL(1×104cells/25μL)；
3)黑色微孔板中加入10μL 5×Matrigel，将微孔板置于培养箱中15分钟后， 取出微孔板，倒置300g/min离心30s，除去5×Matrigel。然后将配好的细胞悬 浮液加入384黑色微孔板中，每孔25μL；
4)将微孔板放入5％CO2的培养箱中37℃培养过夜，直到第二天细胞生长 至融合状态。
步骤2：化合物的准备
拮抗剂模式
1)测试化合物母液浓度：20mM；
2)384-LDV板上的化合物运用Bravo进行12点稀释，化合物起始浓度10μM， 稀释倍数为3倍稀释；
3)HPE(高效药效对照)：阳性对照化合物单剂量；FAC(终效浓度)：40μM； ZPE(零效对照)：100％DMSO；
4)使用ECHO将384-LDV板上的化合物及HPE、ZPE转移至384孔板(PE 6008590)作为化合物板；
5)将化合物板保存在-20℃。
步骤3：进行筛选试验
1)将生长至融合状态的细胞板从培养箱中取出；
2)准备检测缓冲液：30mL缓冲液含0.3mL 250mM probenecid、0.6mL 1M HEPES和29.1mL HBSS，实际的检测缓冲液量将根据细胞板数而定；
3)准备C6 dye，C6 dye原液为10×，用缓冲液将C6 dye稀释至1×；
4)使用Bluewasher的gentle spin模式进行倒置离心弃去培养基。
5)用移液排枪在细胞板上加入C6 dye，20μL/孔；
6)将细胞板300rpm/min离心30s后，在培养箱中孵育1.5h；
7)在预先准备好的化合物板上使用Dragonfly自动加样仪在每孔加入20μL 的实验缓冲液，根据实验板布局用Bravo将10μL的化合物转移到细胞板中，测 试化合物最终检测浓度最高剂量FAC：10μM，3倍稀释，12个浓度点。
8)细胞板300rpm/min离心30s，放入培养箱中孵育30min；
9)在激动剂板(PE 6008590)上准备25μL 4×BZATP(终浓度3.5uM)激 动剂作用于P2X3细胞。
10)将细胞板、FLIPR枪头和激动剂板置于室温15min；
11)用FLIPR转移10μL的BZATP激动剂到细胞板中并读数。
步骤4：用Excel和Xlfit进行数据分析
6.实验结果与分析
实施例化合物对P2X3受体的抑制作用IC50如下表所示，其中A表示小于 10nM，B表示10.1～50nM，C表示50.1～100nM。
表3
试验样品 P2X3 IC<sub>50</sub>(nM)
阳性对照药 C
对比例1 B
化合物1 A
化合物2 A
化合物3 B
化合物4 B
化合物5 A
化合物6 C
化合物7 A
化合物8 B
化合物9 C
化合物10 A
由表3可知，实施例1、2、5、7、10的化合物对P2X3有抑制活性，且优 于对比例1及阳性对照药。
试验例3：味觉障碍试验
1试验材料
1.1供试品基本信息
实施例1、2、10化合物(本发明人实验室合成)、阳性对照药(gefapixant， 批号：01030-210326-2-1，掌心医药购买获得)。
1.2试验试剂
0.9％氯化钠注射液、盐酸奎宁(Quinie，批号：C12476271)
2实验动物：健康成年SD大鼠，全雄，体重280-300g左右。
3试验方法
3.1供试品的配制方法
0.3mM的奎宁溶液配制方法：称取119.20mg盐酸奎宁溶于1000ml的自来 水中，充分混匀即可。
试验样品溶液配制方法：称取40mg试验样品先加入适量DMSO溶解后再 加入HS-15溶液，充分混匀，加入16ml生理盐水，配置成2.5mg/ml的溶液。
3.2实验操作方法
动物及分组：160-180g/只左右的雄性SD大鼠，每组10只，各组平均体重 相近，单笼饲养。
饮水习惯训练：各组动物每天上午8:30和下午16:30分别给正常饮水30分 钟，其余时间禁水，持续5天，每天更换两瓶水左右摆放位置。
给药：实验前一天晚上禁水，次日上午试验组按以下剂量尾静脉注射给予4 mL/kg(10mg/kg)的试验样品，模型组静脉注射给予4mL/kg(10mg/kg)的 0.5％HS-15。
4结果与讨论
4.1结果判断标准
①饮水量测量：注射后将动物放回原来的笼子，各组的测量时间分别在各种 药物Tmax区间(测量时间为给药后0min-15min)，每个笼子同时放入一瓶正常 饮用水，一瓶含有0.3mM盐酸奎宁(Quinie)的饮水，所有动物饲养笼中两瓶 水放置的左右位置一致。让动物自由饮水15min，分别测量两瓶水的饮水量，精 确到0.1ml。
②数据统计分析：分别统计奎宁苦味水、自来水的饮用量，以及奎宁水占自 来水量的百分比，用方差分析比较各组之间的差异有无显著性。
4.2结果讨论
表4
试验样品 奎宁/自来水(％)
溶媒组 38.16％
阳性对照组 79.01％**
实施例1组(化合物1) 40.34％<sup>△</sup>
实施例2组(化合物2) 41.54％<sup>△</sup>
实施例10组(化合物10) 39.43％<sup>△</sup>
备注：与溶媒组比较：**P<0.01；与阳性对照组比较：△P<0.01。
由上表可知，阳性对照组相对于溶媒组，小鼠饮用奎宁/自来水的比例具有 统计学差异(P<0.01)，表明阳性对照组化合物对小鼠的味觉有显著的影响。而 实施例1组、2组和10组与溶媒组相比，小鼠饮用奎宁/自来水的比例不具备统 计学意义，因此以上化合物1、化合物2和化合物10在10mg/kg静脉给药下对 小鼠的味觉几乎没有影响，且与阳性对照组有显著性的统计性差异。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护 范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色， 其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种结构如式I所示的化合物或其盐，
Figure FDA0003612516020000011
其中，R1为C1-C16烷基；
R2、R3独立地选自氢、甲基、乙基或丙基；或者R2、R3连接形成未取代环丙烷；
R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基；R4的取代基选自卤素、甲氧基、氰基、三氟甲氧基或二氟甲氧基；
R5选自卤素、三氟甲基或二氟甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，所述式I中：
R1为甲基；
R2、R3独立地选自氢、甲基、乙基或丙基；或者R2、R3连接形成未取代环丙烷；
R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基；R4的取代基选自卤素、甲氧基、氰基、三氟甲氧基或二氟甲氧基；
R5选自卤素、三氟甲基或二氟甲基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，所述式I中：
R1为甲基；
R2、R3独立地选自氢或甲基；或者R2、R3连接形成未取代环丙烷；
R4选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的嘧啶基、取代或未取代的吡嗪基、取代或未取代的哒嗪基；R4的取代基选自氟、甲氧基、氰基或三氟甲氧基；
R5选自氯、三氟甲基或二氟甲基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003612516020000021
5.根据权利要求1-4任意一项所述的化合物或其盐，其特征在于，所述化合物中的氢被一个或多个氘所取代。
6.根据权利要求4所述的化合物或其盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：化合物a及化合物k在碱的催化下进行取代反应，生成化合物b；
步骤2：化合物c与化合物d在碱性条件下发生取代反应得到e；
步骤3：化合物e与化合物f发生光延反应得到化合物g；
步骤4：化合物g与化合物b在催化剂存在下，发生偶联反应生成化合物h；
步骤5：体化合物h在无机碱催化或者酸催化发生水解反应得到化合物j；
步骤6：化合物j与化合物i发生缩合或酯化反应得到式I化合物；
Figure FDA0003612516020000031
；
其中，R1、R2、R3、R4、R5的定义同权利要求4。
7.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
8.权利要求1-4任意一项所述的化合物或其盐在制备治疗或预防P2X3和/或P2X2/3受体相关疾病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途为在制备治疗或预防呼吸系统疾病药物中的用途。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途为在制备治疗或预防咳嗽、哮喘、疼痛或睡眠呼吸暂停药物中的用途。
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