CN113663063A

CN113663063A - 登革病毒的修饰性mRNA疫苗

Info

Publication number: CN113663063A
Application number: CN202010415324.7A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2021-11-19

Abstract

本发明提供了登革病毒的修饰性mRNA疫苗。具体地，本发明提供了一种登革病毒的mRNA疫苗组合物，它含有：(a)用于表达登革病毒的免疫原的mRNA，所述的登革病毒的免疫原选自下组：E80蛋白(即包膜蛋白E的膜外部分)、prME蛋白、NS1、或其组合；和(b)药学上可接受的载体。实验表明，本发明的mRNA疫苗一方面能够诱导超强水平的中和抗体，比其它疫苗在小鼠中能诱导出的抗体水平高10‑50倍，另一方面能够诱导针对登革病毒的强的T细胞反应，从而同时为经免疫的动物提供完全保护。

Description

登革病毒的修饰性mRNA疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地涉及登革病毒的修饰性mRNA疫苗。

背景技术

登革病毒(Dengue virus)属于黄病毒科、黄病毒属。通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等传播，可引起登革热和登革出血热等严重症状，在全球热带和亚热带地区广泛地传播，每年约有3.9亿人感染登革病毒。登革病毒感染者多数无明显症状，发病者呈现头痛、发热、肌痛和关节炎痛等症状，重则可能危及生命。登革热患者若被不同血清型的登革病毒二次感染，则会增大出现重症登革热的可能性。

登革病毒属于有包膜的单链RNA病毒，含有四个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)，其编码三种病毒结构蛋白(C、prM、E)以及七种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。包膜蛋白E蛋白是跨膜蛋白，其膜外部分占总蛋白的80％(E80)、由三个结构域EDI、EDII、EDIII组成。

目前登革病毒的亚单位重组疫苗主要包括亚单位蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗以及DNA疫苗。

有效疫苗应该是可以同时预防四个血清型的登革病毒。目前唯一市的登革病毒疫苗是法国赛诺菲巴斯德公司研制开发的四价嵌合减毒疫苗(Dengvaxia)，但是在2018年初，接种该疫苗的17名儿童死于登革病毒感染，部分人群出现皮疹。赛诺菲称，该疫苗对于已经接触过蚊媒病毒感染的人可以发挥保护作用，但对以前未接触过的人，有可能会造成感染恶化。

因此，本领域迫切需要开发新的更有效地诱导针对登革病毒的中和抗体并提供更有效保护的登革病毒疫苗。

发明内容

本发明的目的就是提供新的更有效地诱导针对登革病毒的中和抗体并提供更有效保护的登革病毒疫苗。

在本发明的第一方面，提供了一种登革病毒的mRNA疫苗组合物，所述的疫苗组合物含有：

(a)用于表达登革病毒的免疫原的mRNA，所述的登革病毒的免疫原选自下组：E80蛋白(即包膜蛋白E的膜外部分)、prME蛋白、NS1、或其组合；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的登革病毒选自下组：血清型DENV-1、血清型DENV-2、血清型DENV-3、DENV-4或其组合。

在另一优选例中，所述的登革病毒为血清型DENV-2。

在另一优选例中，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1为无或5'加帽元件；

Z2为5'-UTR元件；

Z3为信号肽编码序列，优选地Z3为IgE信号肽编码序列；

Z4为登革病毒免疫原编码序列，其中登革病毒免疫原选自下组：E80蛋白、prME蛋白、和NS1；

Z5为3-UTR元件；

Z6为polyA尾部元件。

在另一优选例中，所述的5'加帽元件选自下组：cap0(m7G5'ppp5'Np)、cap1(m7G5'ppp5'NmpNp)和cap2(m7G5'ppp5'NmpNmpNp)；优选为cap1。

在另一优选例中，所述的mRNA被包裹在脂质体中，从而构成脂质体纳米颗粒。

在另一优选例中，所述的脂质体纳米颗粒的平均粒径为10-500nm，较佳地20-250nm，更佳地50-100nm。

在另一优选例中，所述的脂质体纳米颗粒包括位于外部的脂质体层以及位于内部的所述的mRNA。

在另一优选例中，所述的脂质体层的成分选自下组：PEG修饰的脂质(如DMG-PEG2000)、中性脂质(如DSPC)、阳离子脂质(如D-Lin-MC3-DMA)、胆固醇(cholesterol)、或其组合。

在另一优选例中，纳米颗粒的脂质体层包括PEG修饰的脂质(DMG-PEG 2000)、中性脂质(DSPC)、阳离子脂质(D-Lin-MC3-DMA)和胆固醇(cholesterol)。

在另一优选例中，所述的PEG修饰的脂质选自下组：DMG-PEG 2000、C14-PEG2000、C16-PEG2000、或其组合。

在另一优选例中，所述的阳离子脂质选自下组：DODAP、D-Lin-MC3-DMA，DODMA、或其组合。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物中包括用于表达E80蛋白的mRNA和用于表达NS1蛋白的mRNA。

在另一优选例中，用于表达E80蛋白的mRNA和用于表达NS1蛋白的mRNA的摩尔比为1:99至99:1,较佳地1:10至10:1。

在另一优选例中，所述登革病毒的免疫原包括II型登革病毒的E80、prME和NS1。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物中mRNA本身还可以充当佐剂。

在本发明的第二方面，提供了一种mRNA，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6的定义如上所述。

在另一优选例中，所述的mRNA以脂质体纳米颗粒形式存在。

在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的登革病毒的mRNA疫苗组合物或第二方面所述的mRNA的用途，其被用于制备一药物，所述药物用于(a)预防登革病毒；(b)在哺乳动物中诱导产生针对登革病毒的特异性抗体；和/或(c)在哺乳动物中诱导产生针对登革病毒的T细胞反应。

在本发明的第四方面，提供了一种制备包裹有mRNA的脂质体纳米颗粒的方法，包括步骤:

(S1)提供mRNA，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6的定义如上所述；和

(S2)将所述mRNA与脂质体纳米颗粒进行混合并孵育，从而形成包裹有mRNA的脂质体纳米颗粒。

在另一优选例中，在步骤(S2),在35℃－42℃进行混合和孵育。

在另一优选例中，所述的孵育时间为0.1-3小时，较佳地0.5-1.5小时。

在另一优选例中，所述的mRNA是用以下步骤制备的：

(i)通过PCR获得一线性化产物，所述的线性化产物含有登革病毒的免疫原的编码序列；

(ii)以所述线性化产物为模板，通过体外转录，获得初始mRNA序列；

(iii)在所述mRNA序列的5'端添加5'cap1(N7mGpppGm),以及在3'端添加poly(A)尾巴，获得具有翻译功能的所述mRNA。

在另一优选例中，将所述mRNA与空载的脂质体纳米颗粒进行混合。

在另一优选例中，所述的空载的脂质体纳米颗粒是用以下步骤制备的(W1)将四种脂质用乙醇溶解，这四种脂质分别为Avanti Polar Lipids公司的PEG修饰的脂质(DMG-PEG2000)和中性脂质(DSPC)，Medchemexpress公司的阳离子脂质(D-Lin-MC3-DMA)，以及Sigma公司的胆固醇(cholesterol)；

(W2)将四种脂质按预定的摩尔比例进行混合，通过脂质体挤出器进行均质化，从而获得空载的脂质体纳米颗粒。

在另一优选例中，所述的摩尔比例为DLin-MC3-DMA(MC3):DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000＝(50±10):(10±2):(38.5±7.7):(1.5±0.3)，更佳地为50:10:38.5:1.5。

在本发明的第五方面，提供了一种预防登革病毒感染的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的登革病毒的mRNA疫苗组合物、或第二方面所述的mRNA、或含有所述mRNA的脂质体纳米颗粒。

在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物(如啮齿动物，例如小鼠和大鼠)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了DENV2的E80、prME和NS1的mRNA在HEK-293T细胞中表达水平以及脂质体纳米颗粒(Lipid nanoparticle，LNP)的形态观察。(a)本发明所使用的的mRNA疫苗结构示意图。5'cap1、5'UTR、信号肽、抗原(DENV2的E80、prME和NS1)、3'UTR以及poly(A)尾巴。(b)mRNA转染HEK-293T细胞表达目的蛋白的情况，分别用抗登革病毒的E蛋白的抗体和抗NS1蛋白的抗体进行流式分析。(c)LNP的结构示意图。(d)冷冻电镜观察制备的LNP形态和大小。

图2显示了DENV2的E80-mRNA疫苗在小鼠中的免疫效果。(a)Balb/c小鼠免疫mRNA疫苗示意图，总共有三次免疫，每次间隔两周，在第六周时候开始取脾和取血进行免疫原性检测。(b,c,d)免疫血清的抗体反应检测，用果蝇细胞(C6/36)来源的DENV2(16681)、E80蛋白以及NS1蛋白作为包被抗原进行ELISA实验来检测DENV2特异性抗体反应，将免疫6周后的血清进行梯度稀释用于检测。(e)免疫血清的中和抗体滴度检测，免疫血清对DENV2 16681毒株的中和能力。(f)通过Elispot实验检测抗原特异性T细胞反应，取免疫后6周小鼠脾脏淋巴细胞，分别进行特异性刺激和阴性对照，分析IFN-γ产生情况。利用覆盖整个E80蛋白的4个肽库(P1,P2,P3,P4)、NS1单肽P_265-273和PBS分别对脾脏淋巴细胞进行特异性刺激，PBS作为阴性对照。在图2b至2e中，每个符号代表一只小鼠。横线代表该组的平均值。

图3显示了对DENV2的E80-mRNA和NS1-mRNA的剂量探究结果。分别使用20μg E80、10μg E80、5μg E80以及20μg NS1、10μg NS1、5μg NS1的LNP-mRNA疫苗对小鼠进行三次免疫。(a,b,c)用果蝇细胞(C6/36)来源的DENV2(16681)、E80蛋白以及NS1蛋白作为包被抗原进行ELISA实验来检测DENV2特异性抗体反应，将免疫6周后的血清进行梯度稀释。(d)免疫血清的中和抗体滴度检测，免疫血清对DENV2 16681毒株的中和能力。(e)通过Elispot实验检测抗原特异性T细胞反应，取免疫后6周小鼠脾脏淋巴细胞，分别进行特异性刺激和阴性对照，分析IFN-γ产生情况。利用E80的2个肽库(P2和P4)、NS1单肽P_265-273和PBS分别对脾脏淋巴细胞进行特异性刺激，PBS作为阴性对照。在图3a至3d中，每个符号代表一只小鼠。横线代表该组的平均值。

图4显示了DENV2疫苗对小鼠的保护效果。其中，分别使用10μg E80、10μgNS1、10μgE80+NS1 LNP mRNA疫苗以及Empty-LNP mRNA疫苗对小鼠进行三次免疫。三次免疫后两周开始对小鼠进行攻毒，并且取攻毒后第二天，第三天和第四天的血液以及第四天的脾检测小鼠体内病毒载量。(a,b,c)用果蝇细胞(C6/36)来源的DENV2(16681)、E80蛋白以及NS1蛋白作为包被抗原进行ELISA实验来检测DENV2特异性抗体反应，将免疫6周后的血清进行梯度稀释。(d)免疫血清的中和抗体滴度检测，免疫血清对DENV2 16681毒株以及DENV2LP的中和能力。(e)通过Elispot实验检测抗原特异性T细胞反应，取免疫后6周小鼠脾脏淋巴细胞，分别进行特异性刺激和阴性对照试验，分析IFN-γ产生情况。利用E80的2个肽库(P2和P4)、NS1单肽P_265-273和PBS分别对脾脏淋巴细胞进行特异性刺激，PBS作为阴性对照。(f)利用qRT-PCR方法检测攻毒后第二天、第三天和第四天小鼠血液中病毒载量以及第四天小鼠脾中病毒载量。图4的a、b、c、d、f和g中，每个符号代表一只小鼠。横线代表该组的平均值。

图5显示了DENV2的抗体依赖性增强反应。(a)取上述10μg E80、E80+NS1LNP mRNA疫苗以及Empty-LNP mRNA疫苗免疫后的血清，进行DENV2的抗体依赖性增强反应(Antibodydependent enhancement response,ADE)检测，将血清进行梯度稀释并与病毒在37℃下孵育1h，之后感染K562细胞。48小时之后对这些细胞进行抗体染色，并且进行流式分析。(b)取上述10μg E80、E80+NS1以及Empty-LNP mRNA疫苗免疫后的血清进行抗体分型实验。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种新颖的脂质体纳米颗粒包裹的mRNA疫苗，即针对II型登革病毒的由脂质体纳米颗粒包裹的修饰性mRNA疫苗。出乎意料的是，本发明的mRNA疫苗不仅增强了特异性T细胞反应，而且可以能够诱导超强水平的中和抗体，比其它疫苗在小鼠中能诱导出的抗体水平高10-50倍。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人应用脂质体纳米颗粒包裹mRNA疫苗的技术成功制备了三种II型登革病毒的mRNA疫苗，分别以病毒prME蛋白、包膜蛋白E基因膜外区(E80)、及NS1蛋白为三种抗原靶标。实验结果表明，体外制备的三种mRNA均可在胞内表达特异性蛋白；制备的LNP结构和形态稳固，包裹mRNA的效率高；LNP包裹的mRNA在小鼠体内可以有效表达蛋白；三种mRNA疫苗(E80-mRNA、prME-mRNA以及NS1-mRNA)均可诱导出特异性抗体反应和T细胞反应；E80-mRNA和E80+NS1-mRNA疫苗为小鼠提高完全保护。

术语

如本文所用，术语“本发明的mRNA”、“本发明的用于预防登革病毒的mRNA”、“本发明的mRNA分子”、“本发明的mRNA序列”可互换使用，指具有式I结构的mRNA寡核苷酸。

登革病毒

登革病毒属于有包膜的单链RNA病毒，分为四个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)，其编码三种病毒结构蛋白(C、prM、E)以及七种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)¹。E80蛋白是包膜蛋白的胞外域(占E蛋白N端的80％)，NS1蛋白属于非结构蛋白。

登革病毒感染引起类似流感症状，四个型别的登革病毒感染会加剧症状，增加了其预防的困难性。

mRNA疫苗

本发明还提供了用于预防登革病毒的mRNA疫苗及其制备方法。本发明的登革病毒mRNA疫苗具备表达时间相对长、免疫原性强、保护性好等优势。

典型地，本发明方法包括：首先通过PCR方法获得抗原蛋白的表达基因(或编码序列)，之后利用体外转录技术获得相应的mRNA，最后利用脂质体纳米颗粒包裹mRNA，从而获得高效的mRNA疫苗。

mRNA疫苗是一种体外制备的具有表达活性的mRNA，其主要结构包括5'和3'UTR以及含有表达抗原的开放读码框。相比于DNA疫苗，它不需要任何核定位信号，并且无整合到基因组上的风险。通过脂质体纳米颗粒包裹的mRNA疫苗不需要其他的任何佐剂进行辅助，本身的脂质体纳米颗粒以及RNA可充当佐剂作用，并且其可以同时激活MHCI以及MHCII两种递呈途径，从而在很大程度上提高了疫苗的免疫原性。

为了提高mRNA疫苗的表达量，在本发明中，选取了一系列促进mRNA表达的核酸元件。所述的元件包括(但并不限于)：5'UTR、信号肽、抗原序列以及3'UTR。

在本发明中，优选的登革病毒的蛋白是E80和NS1蛋白。在本发明的mRNA疫苗中，分别是编码这些登革病毒的蛋白的mRNA。

在本发明中，SEQ ID No:1为II型登革病毒prME DNA序列；SEQ ID No:3为II型登革病毒E80 DNA序列；SEQ ID No:5为II型登革病毒NS1 DNA序列。mRNA的序列与SEQ IDNo.:1、3或5分别对应。

此外，SEQ ID No:2、4和6中分别给出了II型登革病毒prME、E80和NS1的氨基酸序列。

在优选例中，本发明的mRNA疫苗包括了针对四个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)中1－4种血清型的登革病毒E80和NS1的mRNA。

脂质体纳米颗粒

本发明还提供了一种脂质体纳米颗粒，所述的脂质体纳米颗粒用于包裹体外制备的mRNA疫苗，协助mRNA疫苗进入动物体内并且表达蛋白。

在另一优选例中，所述脂质体纳米颗粒包括四种组分，分别为：DLin-MC3-DMA(MC3)、DSPC、cholesterol和DMG-PEG 2000。这四种脂质可以在体外形成稳固的脂质体纳米颗粒，保护mRNA免受外界核酸酶的降解，有利于mRNA进入动物体内并发挥作用。

在另一优选例中，所述的脂质体纳米颗粒大小比较均一，大概为80nm左右，可在动物体内有效运输。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它包括本发明的脂质体纳米颗粒和本发明的mRNA疫苗。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(针对一种登革病毒血清型)，也可以是多价的(针对四种登革病毒血清型)；同时，即可以仅含有一种核苷酸(E80 or NS1)，也可以含有多种核苷酸(E80加NS1)。

本发明的药物组合物或者疫苗组合物可制备成各种剂型，其中包括(单不限于)：注射剂、悬浮剂、喷雾剂等。

本发明的主要优点包括：

(1)首次研发了由脂质体纳米颗粒包裹的修饰性的II登革病毒mRNA疫苗；

(2)本发明的E80-mRNA疫苗能够在小鼠体内产生高滴度的中和抗体；

(3)本发明的E80-mRNA和NS1-mRNA疫苗能够在小鼠体内产生特异性的T细胞反应；

(4)本发明的E80-mRNA疫苗能够提高小鼠完全保护，清除病毒血症。

(5)本发明的NS1-mRNA基本上能够清除病毒血症。

(6)NS1-mRNA和E80-mRNA疫苗联合免疫显示出协同作用，具体表现为：a)同样100％完全保护小鼠免受病毒感染(图4g,h)；b)提高E蛋白特异性的T细胞反应强度(图4f)；c)降低了对DENV2的ADE副作用(图5a)；d)改变了IgG亚类的分布(图5b)，提高Th1型T细胞反应并降低Th2型T细胞反应。

(7)本发明的mRNA疫苗的制法方便快捷、速度优于其他现有的疫苗技术。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明,均可从市售渠道获得。

序列信息

SEQ ID No:1和2为II型登革病毒prME DNA序列和氨基酸序列；

SEQ ID No:3和4为II型登革病毒E80 DNA序列和氨基酸序列；

SEQ ID No:5和6为II型登革病毒NS1 DNA序列和氨基酸序列；

SEQ ID No:7为5'UTR元件；

SEQ ID No:8为信号肽编码序列；

SEQ ID No:9为3'UTR元件。

材料和方法

1.细胞、病毒

C6/36细胞和Vero细胞(购自中国科学院细胞库)均用10％牛血清的DMEM培养基进行培养。本发明中的用到的DENV2毒株为16681株系。

2.抗体

抗登革病毒的抗体(购自Genetex)；抗登革病毒NS1蛋白的抗体(购自Sigma)

3.mRNA制备

从捷瑞公司合成三个质粒(5'UTR-IgE-E80-3'UTR-puc57；5'UTR-IgE-prME-3'UTR-puc57；5'UTR-IgE-NS1-3'UTR-puc57)，利用PCR技术从这三个质粒上扩增目的片段，并以纯化的PCR产物为模板进行体外转录，之后利用NEB公司的加帽(mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase试剂盒)和加尾(E.coli Poly(A)Polymerase)试剂盒制备相应的mRNA，最后通过琼脂糖电泳观察mRNA的完整性以及大小。

4.转染HEK-293T细胞表达蛋白

制备好的mRNA通过商业化转染试剂盒Lipsome2000转染HEK-293T细胞，10％FBSDMEM培养基培养细胞，转染36小时后开始收取细胞，之后进行目的蛋白检测，未转染的细胞作为阴性对照(Mock组)。

5.FACS检测蛋白表达

利用4％PFA和破膜液对收集到的细胞进行固定和破膜处理，使用抗DENV2的特异性抗体(4G2)进行染色，使用FITC标记的抗鼠抗体进行染色，最后利用流式分析目的蛋白的表达水平。

6.脂质体纳米颗粒包裹mRNA

分别用乙醇将这四种脂质(D-Lin-MC3-DMA、DSPC、cholesterol和DMG-PEG2000)溶解，并以一定的摩尔比例进行混合(D-Lin-MC3-DMA:DSPC:cholesterol:DMG-PEG 2000＝50:10:38.5:1.5)，将脂质体混合物加入到脂质体挤出器(Avestin LF1)中，通过80nm的滤膜，之后将制备好的脂质体纳米颗粒和mRNA孵育一定时间，最终得到脂质体包裹的mRNA疫苗。

7.小鼠免疫

动物实验经过了上海市巴斯德研究所动物委员会的批准。本实验中所使用的Balb/c小鼠均是购买自维通利华公司。

用Empty-LNP、E80-mRNA、prME-mRNA以及NS1-mRNA分别对小鼠进行免疫，其中，空的LNP(Empty-LNP，没有包裹mRNA的LNP)作为阴性对照。免疫分为三次，在0周、2周、4周对小鼠进行肌肉注射，每只小鼠40μl的剂量，第六周杀鼠取脾取血，用于Elispot实验、ELISA实验和中和滴度检测。

8.特异性T细胞检测实验

将小鼠的脾脏取出，在无菌培养皿中加入1ml 1640培养基，于40μm细胞筛中研磨，将收集的脾内免疫细胞用红细胞裂解液裂解，之后开始计数。在已包被抗IFN-γ的Elispot96孔板中，每孔加入1.65×10⁶脾细胞，加入不同的刺激物：DENV2的E804个肽库(P1,P2,P3,P4)、DENV2的NS1单肽P_265-273、PBS，其中PBS作为阴性对照。48小时后洗掉细胞，用IFN-γ特异性抗体染色，然后加入链亲和素(Streptavidin)-HRP室温孵育1h，并用BCP/NCIP底物显色，最后用CTL仪器进行斑点计数。

9.抗体滴度检测实验

ELISA实验：ELISA板分别包被C6/36细胞来源的DENV2病毒、Vero来源的病毒培养上清(含有大量分泌性NS1蛋白)，用5％牛奶封闭后，2倍梯度稀释的8种浓度血清，每孔加入100μl于37℃孵育1h，然后加入IgG-HRP二抗，最后用TMB显色液显色，1M HCL终止反应，于酶标仪(microplate reader)上进行OD450读数。

PRNT实验：血清样本在56℃下孵育30min，用于灭活补体。48孔板中提前一天铺70000个Vero细胞，第二天将血清梯度稀释，每孔50μl的血清和100PFU登革病毒16681在37℃下孵育1小时，之后加入铺好细胞的48孔板中进行感染，最后去除病毒和血清复合物，加入700μl 1.5％CMC培养四天。第四天收取细胞板，用4％PFA固定病毒感染的细胞，之后用抗登革病毒的抗体染色3h，再加入二抗(鼠抗)于37度下孵育2h，最后用BCP/NCIP试剂盒进行显色，观察并计数。血清样本中中和滴度为EC50，表示能抑制50％病毒感染细胞的血清稀释度。

10.统计

所有的统计分析均使用GraghPadPrism5来进行。DENV2和NS1的特异性的IgG抗体反应和中和滴度均是利用双尾Student氏t检验(two-tailed student's t-test)的方法来分析。

实施例1 II登革病毒mRNA疫苗

1.1 mRNA疫苗

在本实施例中，构建的mRNA疫苗包括prME、E80和NS1，结构示意图如图1a所示。mRNA-prME、mRNA-E80、mRNA-NS1分别表达prME蛋白、E80蛋白和NS1蛋白。

将上述三种mRNA分别转染HEK-293T细胞，并用未转染mRNA的细胞作为阴性对照(Mock组)。利用流式技术对表达的蛋白进行鉴定，收集转染后36h的细胞，使用登革病毒E蛋白(4G2)和NS1蛋白特异性抗体进行染色，之后使用FITC标记的二抗进行染色，最后通过流式仪器检测特异性蛋白的表达。

如图1b所示，结果表明，这三种mRNA均可以在胞内表达相应的蛋白，即prME蛋白、E80蛋白和NS1蛋白。

1.2 脂质体纳米颗粒(LNP)

本发明人利用四种脂质成分组建脂质体纳米颗粒，使用无水乙醇将脂质进行溶解，并按照一定比例混合四种脂质，通过装有80nm滤膜的脂质体挤出器使脂质体纳米颗粒均质化，其结构示意图如图1c所示。

为了验证脂质体纳米颗粒(LNP)是否制备成功，利用冷冻电镜对LNP进行观察。

结果表明，如图1d所示，大部分LNP的粒径在80nm左右。

实施例2 DENV2的E80-mRNA、prME-mRNA和NS1-mRNA疫苗诱导出T细胞反应和抗体反应

在本实施例中，通过抗体反应和T细胞反应，评价修饰性核苷酸(1mψ)的E80-mRNA、prME-mRNA和NS1-mRNA疫苗免疫效果。

2.1 抗体反应

BALB/cA(每组4只)小鼠在第0周、第2周和第4周分别免疫20μg E80-mRNA、prME-mRNAP、NS1-mRNA、Empty-LNP mRNA疫苗，其中Empty-LNP为阴性对照，血清和脾在第六周收集。用昆虫细胞来源的DENV2(16681)病毒、E80蛋白和NS1蛋白作为包被抗原进行ELISA实验，检测特异性抗体反应。

如图2b，c和d所示，E80 mRNA疫苗产生了很强的针对DENV2和E80蛋白的特异性抗体；prME-mRNA疫苗产生了DENV2的特异性抗体，但是对于E80没有产生明显的抗体反应。NS1-mRNA疫苗产生了强烈的NS1蛋白的特异性抗体。

如图2e所示，E80-mRNA疫苗免疫血清对病毒有很强的中和效果。

2.2 T细胞反应

对于ELISPOT实验，用DENV2 E80的4个肽库、NS1单肽P_265-273和PBS分别对脾脏淋巴细胞进行特异性刺激，PBS作为阴性对照，用于检测DENV2特异性的T细胞反应。

如图2f所示，结果表明：E80-mRNA、prME-mRNAP和NS1-mRNA三组疫苗均产生了强的T细胞反应。

实施例3 不同剂量的E80和NS1 mRNA疫苗均可产生强的T细胞反应和特异性抗体水平

在本实施例中，评价不同剂量的E80-mRNA-LNP和NS1-mRNA-LNP疫苗的免疫效果。

3.1 特异性抗体反应

七组BALB/cA(每组3只)小鼠在第0周，第2周和第4周分别免疫E80-mRNA(20μg)、E80-mRNA(10μg)、E80-mRNA(5μg)、NS1-mRNA(20μg)、NS1-mRNA(10μg)、NS1-mRNA(5μg)和未包裹核苷酸的LNP(Empty-LNP)，其中Empty-LNP为阴性对照。血清和脾在第六周收集。用昆虫细胞来源的DENV2(16681)、E80蛋白和NS1蛋白作为包被抗原进行ELISA实验，检测DENV2特异性抗体反应。

如图3a，3b和3c所示，结果表明，E80-mRNA和NS1-mRNA疫苗均产生明显的抗体反应，在不同剂量间无显著性差异。

另外，如图3d所示，三组E80-mRNA疫苗免疫血清对标准株DENV2(16681)产生很强的中和效果，这三组间中和滴度无显著性差异。

3.1 T细胞反应

对于ELISPOT实验，用DENV2 E80的2个肽库P2和P4、NS1单肽P_265-273和PBS分别对脾脏淋巴细胞进行特异性刺激，PBS作为阴性对照，用于检测DENV2特异性的T细胞反应。

如图3e所示，结果表明，E80-mRNA、NS1-mRNA六组疫苗均产生了强的T细胞反应。

综合上述结果表明，不同剂量的本发明的E80和NS1 mRNA疫苗均可产生强的T细胞反应和特异性抗体水平。

在后续实验中，选取代表性的10μg的E80和10μg NS1 mRNA疫苗用于免疫保护实验。

实施例4 DENV2 mRNA疫苗可以保护小鼠抵抗DENV2病毒

在本实施例中，进一步评价mRNA疫苗的保护效果。方法如下：设置四组免疫组，BALB/cA(每组10只)小鼠在第0周，第2周和第4周分别免疫10μg E80-mRNA、NS1-mRNA、E80+NS1 mRNA和未包裹核苷酸的LNP(Empty-LNP)，其中Empty-LNP为阴性对照。第6周，通过腹腔注射的方式注射anti-IFNRα/β抗体，第二天开始进行皮下攻毒DNEV2-LP。取攻毒后第二天、第三天和第四天的血液以及第四天的脾进行病毒载量检测。

结果

如图4a,4b,和4c所示，E80-mRNA、NS1-mRNA、E80+NS1-mRNA三组免疫血清均产生了特异性的抗体反应。

图4d表明，上述E80-mRNA和E80+NS1-mRNA疫苗对标准株DENV2(16681)和本实验室攻毒用的DENV2-LP均产生很强的中和效果。

图4e表明，上述三组免疫血清均产生了强烈的T细胞反应。

如图4f和4g所示，在第四天小鼠血液中，Empty-LNP组中的血液病毒载量与E80-mRNA、NS1-mRNA以及E80+NS1 mRNA有极显著的差异性，并且E80-mRNA、NS1-mRNA以及E80+NS1mRNA三组血液中病毒载量在第四天被完全清除；在第四天脾中，NS1-mRNA免疫组中检测到少量病毒，E80-mRNA和E80+NS1-mRNA免疫组中无病毒被检测到。

以上结果表明，mRNA-E80和mRNA-E80-NS1疫苗可完全保护BALB/cA小鼠抵抗DENV2病毒，mRNA-NS1疫苗可以清除病毒血症，但是在脾中会有少量残存。

实施例5 DENV2的抗体依赖性增强反应和抗体分型

5.1 抗体依赖性增强反应(ADE)检测

取E80-mRNA、E80+NS1-mRNA以及Empty-LNP mRNA疫苗免疫后的血清进行DENV2(16681)的抗体依赖性增强反应(ADE)检测。

结果如图5a所示，E80-mRNA免疫组血清在稀释度为25600左右时，病毒的感染率达到最大，大约10％。E80+NS1-mRNA免疫组血清在稀释度25600-102400之间时，病毒感染率达到了最大(约7％)，说明E80+NS1联用时，NS1抗体可以降低E80-mRNA疫苗的ADE反应，起到协同保护作用，这有利于提高疫苗保护作用，降低或减少副作用。

5.2 抗体分型

取上述三种疫苗免疫后的血清进行抗体分型实验。

结果如图5b所示，E80-NS1-mRNA免疫血清中IgG1比例相对于E80-mRNA免疫血清中IgG1比例要高一些，说明其Th2细胞反应更强；而E80-mRNA免疫血清血清中IgG2a比例要比E80-NS1-mRNA略高，说明其Th1细胞反应更强。

讨论

目前，登革病毒无特异性治疗药物，研发有良好预防效果的疫苗十分迫切。

登革病毒有几个方面值得注意，主要是抗体依赖性增强反应(Antibodydependent enhancement，ADE)和NS1蛋白造成的血管渗漏²。ADE反应主要指在机体初次感染某一型别的登革病毒后，机体会产生这一型别的终身免疫；当机体再次被异型病毒感染后，机体中一些弱中和或者非中和抗体会结合病毒形成抗原抗体复合物，这些抗体依赖本身的Fcγ端结合巨噬细胞的Fcγ受体促进聚集的病毒感染巨噬细胞，从而加剧病情发展^3-5。NS1蛋白是病毒复制复合体中的一部分，释放到胞质外的NS1六聚体可能会通过炎症依赖或者非依赖的途径破坏内皮糖原，从而引起抗原血症和促炎反应，增加血管渗漏发生的风险^6,7。在登革病毒疫苗研究中，E蛋白由于具有多个中和位点而成为主要的靶抗原，NS1蛋白无中和位点通常容易被忽略。

mRNA疫苗相较于传统的亚单位疫苗操作简便，周期短以及效价高等优势；mRNA疫苗和DNA疫苗同属于核酸疫苗，但是mRNA疫苗不需要任何核定位信号以及无整合到基因组中的可能性等优点。

目前，该技术尚未应用到登革病毒领域，本发明首次制备由脂质体纳米颗粒包裹的登革病毒的mRNA疫苗，致力于降低疫苗的制备成本以及实现对四种血清型病毒的均衡保护。

本发明的实验结果表明，制备的脂质体纳米颗粒(LNP)可以有效包裹mRNA疫苗，形成具有强免疫原性的mRNA疫苗，不需要其他佐剂辅助。在体外细胞实验中，三种mRNA疫苗prME、E80和NS1均可在胞内表达出特异性蛋白质。

在体内的动物免疫实验中，三种mRNA疫苗均可产生较强的T细胞反应和抗体水平，其中E80诱导出的中和抗体滴度最高。随后的体内保护实验也证实了E80-mRNA疫苗、NS1-mRNA以及E80+NS1-mRNA均起到了很好的保护效果。

出乎意料的是，E80-mRNA疫苗可以诱导超强水平的中和抗体(图4e)，比其它疫苗在小鼠中能诱导出的抗体水平高10-50倍；同时为小鼠提供完全保护(100％完全保护)，即在血液和脾脏中检测不到登革病毒(图4g,h)。

另外，NS1-mRNA单独免疫可以为小鼠提供部分保护，使其免受病毒血症的侵害(图4g，第4天)。

另外，NS1-mRNA和E80-mRNA疫苗联合免疫时，显示协同作用。这具体表现为：a)同样100％完全保护小鼠免受病毒感染(图4g,h)；b)提高E蛋白特异性的T细胞反应强度(图4f)；c)降低了对DENV2的ADE副作用(图5a)；和)改变了IgG亚类的分布(图5b)，这表明提高了Th1型T细胞反应，并降低了Th2型T细胞反应。

由于E80-mRNA疫苗已具有极佳的保护效果(100％完全保护)，因此NS1-mRNA+E80-mRNA疫苗在联合免疫时的保护效果仍为100％。然而，提高E蛋白特异性的T细胞反应强度、降低了对DENV2的ADE副作用和改变了IgG亚类的分布均提示了协同促进作用。例如，降低了对DENV2的ADE副作用，这更有利于提供保护，可进一步降低了动物被感染和感染后发生重症的风险。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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2.Guzman,MG,Halstead,SB,Artsob,H,Buchy,P,Farrar,J,Gubler,DJ,et al.(2010).Dengue:a continuing global threat.Nature reviews Microbiology8:S7-16.

3.Halstead,SB,Nimmannitya,S,and Cohen,SN(1970).Observations relatedto pathogenesis of dengue hemorrhagic fever.IV.Relation of disease severityto antibody response and virus recovered.The Yale journal of biology andmedicine42:311-328.

4.Beatty,PR,Puerta-Guardo,H,Killingbeck,SS,Glasner,DR,Hopkins,K,andHarris,E(2015).Dengue virus NS1 triggers endothelial permeability andvascular leak that is prevented by NS1 vaccination.Science translationalmedicine7:304ra141.

5.Wilder-Smith A,OE,Horstick O,Wills B.(2019).Dengue.Lancet 393:350.

6.Mackenzie,JM,Jones,MK,and Young,PR(1996).Immunolocalization of thedengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNAreplication.Virology220:232-240.

7.Hafirassou,ML,Meertens,L,Umana-Diaz,C,Labeau,A,Dejarnac,O,Bonnet-Madin,L,et al.(2018).A Global Interactome Map of the Dengue Virus NS1Identifies Virus Restriction and Dependency Host Factors.Cell reports22:1364.

序列表

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 登革病毒的修饰性mRNA疫苗

<130> P2020-0391

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1950

<212> DNA

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 1

atgattgtgt ctaggcagga gaagggaaag tccctcctgt tcaagacaga ggacggagtg 60

aacatgtgca cactcatggc tatggacctc ggcgagctat gcgaggacac aattacatac 120

aagtgcccac tgctgcggca gaacgagccc gaggacatcg actgctggtg caactctaca 180

tctacctggg tgacatacgg aacatgcaca actatggggg agcacagacg cgagaagcgg 240

tccgtggctc tcgtgcccca cgtgggaatg ggcctggaga cccggacaga gacctggatg 300

tcttctgagg gcgcttggaa gcacgtgcag cgcattgaga cctggattct ccgccaccct 360

ggcttcacca tgatggccgc tattctcgct tacacaattg gcacaaccca cttccagcgc 420

gctctcattt tcattctgct caccgccgtg accccatcta tgaccatgag atgcatcggc 480

atgtccaacc gcgacttcgt ggagggcgtg tccggcggat cttgggtgga cattgtgctt 540

gagcacgggt cttgcgtgac cacaatggct aagaacaagc ctacactcga cttcgagctg 600

attaagaccg aggctaagca gcccgctaca ctgcgcaagt actgcattga ggctaagctc 660

acaaacacca caacagagtc ccggtgccct acccagggcg agccatctct caacgaggag 720

caggacaagc ggttcgtgtg caagcactct atggtggacc gcggatgggg aaacggatgc 780

gggctgttcg gaaagggcgg aattgtgaca tgcgctatgt tcagatgcaa gaagaacatg 840

gagggaaagg tggtgcagcc tgagaacctt gaatacacca ttgtgattac ccctcactcc 900

ggggaggagc acgccgtggg aaacgacaca ggcaagcacg gaaaggagat taagattacc 960

cctcagtcta gcatcacaga ggccgaattg accggatacg gcacagtgac aatggagtgc 1020

tctcctagaa caggcctcga cttcaacgag atggtgctgc tccagatgga gaacaaggct 1080

tggctcgtgc accgccagtg gttcctcgac ctgccactgc cttggctgcc gggagccgac 1140

acccagggat ctaactggat acagaaggag acactcgtga ccttcaagaa cccccacgct 1200

aagaagcagg acgtggtggt gctgggttca caggagggcg ccatgcacac cgctctgaca 1260

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cgcctccgca tggacaagct ccagctgaag ggaatgtcct actctatgtg caccggaaag 1380

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tacgagggcg acggcagccc ttgcaagatc cctttcgaga tcatggacct cgaaaagcgc 1500

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cagctgaagc tcaactggtt caagaagggg tcttccattg gccagatgtt cgagacaaca 1680

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<210> 2

<211> 650

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 2

Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr

1 5 10 15

Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu

20 25 30

Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn

35 40 45

Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val

50 55 60

Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg

65 70 75 80

Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr

85 90 95

Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val Gln Arg Ile

100 105 110

Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met Ala Ala Ile

115 120 125

Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala Leu Ile Phe

130 135 140

Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Ile Gly

145 150 155 160

Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val

165 170 175

Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn

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Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro

195 200 205

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225 230 235 240

Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp

245 250 255

Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala

260 265 270

Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val Gln Pro Glu

275 280 285

Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His

290 295 300

Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Ile Thr

305 310 315 320

Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val

325 330 335

Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val

340 345 350

Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe

355 360 365

Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser

370 375 380

Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala

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Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His

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<211> 1182

<212> DNA

<213> 登革病毒(Dengue virus)

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<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 4

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Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr

165 170 175

Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp

180 185 190

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Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe

225 230 235 240

Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly

290 295 300

Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile

305 310 315 320

Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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<212> DNA

<213> 登革病毒(Dengue virus)

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accaccgcct cgggcaagct cattacagag tggtgctgta ggtcttgcac actgcctcct 960

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<210> 6

<211> 355

<212> PRT

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<400> 6

Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe

145 150 155 160

Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Lys Glu Lys Gln Asp

165 170 175

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Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp

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210 215 220

Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu

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Met Ile Ile Pro Lys Asn Leu Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser

290 295 300

Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro

305 310 315 320

Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg

325 330 335

Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala

340 345 350

Gly His Gly

355

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc cacc 44

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggactgga cctggattct gttcctcgtg gccgccgcta ctcgtgtgca ctct 54

<210> 9

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgataatagg ctggagcctc ggtggccatg cttcttgccc cttgggcctc cccccagccc 60

ctcctcccct tcctgcaccc gtacccccgt ggtctttgaa taaagtctga 110

Claims

1.一种登革病毒的mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有：

(b)药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的登革病毒选自下组：血清型DENV-1、血清型DENV-2、血清型DENV-3、DENV-4或其组合。

3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的登革病毒为血清型DENV-2。

4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1为无或5'加帽元件；

Z2为5'-UTR元件；

Z3为信号肽编码序列，优选地Z3为IgE信号肽编码序列；

Z5为3-UTR元件；

Z6为polyA尾部元件。

5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的mRNA被包裹在脂质体中，从而构成脂质体纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的脂质体纳米颗粒的平均粒径为10-500nm，较佳地20-250nm，更佳地50-100nm。

7.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物中包括用于表达E80蛋白的mRNA和用于表达NS1蛋白的mRNA。

8.一种mRNA，其特征在于，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1为无或5'加帽元件；

Z2为5'-UTR元件；

Z3为信号肽编码序列，优选地Z3为IgE信号肽编码序列；

Z5为3-UTR元件；

Z6为polyA尾部元件。

9.一种如权利要求1所述的登革病毒的mRNA疫苗组合物或权利要求8所述的mRNA的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于(a)预防登革病毒；(b)在哺乳动物中诱导产生针对登革病毒的特异性抗体；和/或(c)在哺乳动物中诱导产生针对登革病毒的T细胞反应。

10.一种制备包裹有mRNA的脂质体纳米颗粒的方法，其特征在于，包括步骤:

(S1)提供mRNA，所述的mRNA具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (I)

式中，

Z1为无或5'加帽元件；

Z2为5'-UTR元件；

Z3为信号肽编码序列，优选地Z3为IgE信号肽编码序列；

Z5为3-UTR元件；

Z6为polyA尾部元件；和