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CN113655026A - 椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜 - Google Patents

椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜 Download PDF

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CN113655026A
CN113655026A CN202110897601.7A CN202110897601A CN113655026A CN 113655026 A CN113655026 A CN 113655026A CN 202110897601 A CN202110897601 A CN 202110897601A CN 113655026 A CN113655026 A CN 113655026A
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王艳
刘勤颖
陈月岩
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Abstract

本发明公开了一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列。本发明通过反射式物镜的设计来实现椭圆曲面大视野，能将平面矩形的激光扫描场转换成椭圆半球面的激光扫描场；通过采用多路激光并行扫描和多路荧光并行的探测方式能实现高通量扫描，利用四色原理，将不相邻区域划分为一组，利用区域间隙和合并式半波片最大化多次偏振合束的能量效率；不组激光之间引入延时，通过同时点的区域不相邻、相邻的区域不同时的方案，在时间和空间上能有效区分荧光信号的来源区域，极大程度地避免荧光散射带来的信号串扰。

Description

椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜
技术领域
本发明涉及显微成像仪器领域，特别涉及一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜。
背景技术
双光子显微镜因为其深的生物组织成像深度和高的空间分辨力，目前在动物脑皮层的神经组织功能结构成像中得到了很好的应用，推动了神经科学(脑科学)的发展。
科学家希望能同时观察记录更大范围内更多的神经元的功能信号，对双光子成像技术提出了新的需求。首先需要达到神经元的分辨率，要求光学分辨率在1～2微米，对应到数值孔径为0.3～0.5；其次图像刷新速度需要至少5帧每秒，才能有效捕捉神经元的钙功能信号；在满足空间和时间分辨率的前提下，成像更大的视野范围，从而单次记录到的神经元数目更多。
目前国际上双光子成像的最大视野直径约为5mm，但全视野的成像速度小于1帧每秒，达不到功能信号探测的要求。在实时成像和单细胞分辨率条件下，双光子成像的视野面积仅为1mm×1mm，对于小鼠来说也仅仅覆盖单个脑功能区。而小鼠全脑皮层面积约200mm2，而且脑表面是不平的，接近于一个椭圆半球，这对光学显微成像来说是一个极大的挑战。
动物在体脑皮层单神经元分辨动态大视野成像，需要解决两方面问题，一是在实现大成像视野面积的同时，令视野弯曲，与脑皮层曲率匹配，这与常规的平场物镜视野设计理念差异巨大；二是大视野高分辨图像要求像素数极多，同时保证时间分辨率，因此需要的成像数据通量是巨大的，因此需要让激光扫描和荧光探测通量呈数量级的提升。
并行扫描和探测是提高激光扫描和荧光探测通量常用手段，将大面积视野划分为若干块区域，多个激光焦点分别进行独立扫描，以及结合多通道探测器或面阵探测器探测各个区域的荧光信号，可以显著提升成像通量。但是目前的并行扫描方案在多次合束拼接视野时激光能量损耗大，每经过一次消偏振合束棱镜，激光能量就减少一半；多通道并行探测存在由荧光散射带来的信号串扰，具体为荧光散射面积较大，荧光同时落在相邻的几个区域，造成通道间的信号串扰。
所以，现在需要一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列；
所述近红外飞秒脉冲激光器联组发出的激光依次经过所述分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块后透射所述二向色片，然后经过所述椭球曲面大视野反射式物镜照射到样品上，样品被激发产生的荧光经过所述椭球曲面大视野反射式物镜收集后，被所述二向色片反射至所述光电倍增管探测阵列；
所述椭球曲面大视野反射式物镜包括沿光路依次设置的主镜、次镜和三镜，所述主镜的光学面为双曲面，所述次镜的光学面为扁椭圆面，所述三镜的光学面为扁椭圆面，进入所述椭球曲面大视野反射式物镜的激光经过所述主镜、次镜、三镜依次反射后照射到样品上；
所述近红外飞秒脉冲激光器联组包括4个近红外飞秒脉冲激光器；
所述分束延时模块联组包括4个分束延时模块，所述分束延时模块包括延时光路和分束光路；
所述扫描单元联组包括4个扫描单元，每个扫描单元包括4个独立的扫描模块，每个扫描模块独立实现1个矩形的子扫描区域的二维扫描；
每个所述近红外飞秒脉冲激光器对应1个所述分束延时模块，每个所述分束延时模块对应1个所述扫描单元；
4个所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光经过所述延时光路后形成依次具有T/4的时间间隔的4路延时激光，每路延时激光再经过所述分束光路后等分为4路子激光，来源于同一路延时激光的4路子激光进入同一个扫描单元，且每路子激光对应1个扫描模块用于实现1个子扫描区域的扫描，从而通过16路子激光与16个扫描模块一一对应，实现16个子扫描区域的扫描；其中，T为近红外飞秒脉冲激光器发出的激光的脉冲周期，进一步优选的实施例中，T＝12.5ns，则时间相邻的两组之间的延时相隔3.125ns；同一个扫描单元中的每个扫描模块扫描得到的子扫描区域处于同一时间位点，不同的扫描单元中的扫描模块扫描得到的子扫描区域位于不同的时间位点；
所述合束拼接模块用于实现16个扫描模块出射的16路子激光的合束拼接，通过将16个子扫描区域合束拼接，形成4×4阵列分布的矩形扫描场，而且使得位于同一时间位点的4个子扫描区域边界不相邻，而边界相邻的任意4个区域在时间上位于不同的时间位点。
优选的是，所述主镜的光学面为八阶双曲面，所述次镜的光学面为二次扁椭圆面，所述三镜的光学面为六阶扁椭圆面。
进一步优选的，所述椭球曲面大视野反射式物镜的数值孔径范围为0.3～0.5。该反射式物镜的成像视野为椭球曲面，长轴曲率半径9～12mm，短轴曲率半径6～9mm，视野的平面投影尺寸为6mm×6mm。
优选的是，所述延时光路包括第一反射镜和第二反射镜，所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光依次经过所述第一反射镜和第二反射镜反射后形成延时激光输出，通过调整所述第一反射镜和第二反射镜之间的距离使得输出的延时激光产生不同的延时量；
所述分束光路包括第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件，所述第二反射镜输出的延时激光进所述第一分光元件后均分为两路，一路透射所述第一分光元件后到达所述第二分光元件，并被所述第二分光元件均分为两路，另一路被所述第一分光元件反射后到达所述第三分光元件，并被所述第三分光元件均分为两路，从而将延时激光均分为4路。
优选的是，所述第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件均为消偏振分光棱镜或者为50/50分光片。
优选的是，所述扫描模块包括快轴共振扫描镜和慢轴检流计振镜。
优选的是，所述合束拼接模块包括4个一级合束拼接模块和1个二级合束拼接模块，每个一级合束拼接模块分别对应1个所述扫描单元，以将1个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光进行合束拼接；
所述二级合束拼接模块用于将4个所述一级合束拼接模块出射的4组激光再次进行合束拼接，然后输入到所述二向色片。
优选的是，所述一级合束拼接模块包括2个一级合束拼接子光路、一级偏振合束棱镜、第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜，2个一级合束拼接子光路出射的激光经过所述一级偏振合束棱镜合束后再依次经过所述第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜后输出，所述一级合并式半波片包括4个不同的半波片；
2个所述一级合束拼接子光路结构相同，均包括第一一级子半波片、第二一级子半波片、一级子偏振合束棱镜、第一一级子透镜、一级子合并式半波片和第二一级子透镜，所述一级子合并式半波片包括两个不同的半波片，2个所述一级合束拼接子光路分别记为第一一级合束拼接子光路和第二一级合束拼接子光路；
同一个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光分别记为：第一路子激光、第二路子激光、第三路子激光、第四路子激光，
第一路子激光和第二路子激光经第一一级合束拼接子光路合束后透射所述一级偏振合束棱镜，具体为：
第一路子激光经过所述第一一级子半波片后透射所述一级子偏振合束棱镜，第二路子激光经过所述第二一级子半波片后被所述一级子偏振合束棱镜反射，然后与透射所述一级子偏振合束棱镜的第一路子激光合束，然后一同经过所述第一一级子透镜，在所述第一一级子透镜的后焦面上的一级子合并式半波片的两个不同的半波片上形成2个子扫描区域，且2个子扫描区域之间间隔一个子扫描区域的距离；合束后的两路子激光再经过所述第二一级子透镜后变回准直激光，再透射所述一级偏振合束棱镜，其中，经过一级子合并式半波片后的2路激光偏振态相同；
第三路子激光和第四路子激光经第二一级合束拼接子光路合束后被所述一级偏振合束棱镜反射，然后与透射所述一级偏振合束棱镜的合束激光合束；然后一同经过所述第一一级透镜，在所述第一一级透镜的后焦面上的一级合并式半波片的四片不同的半波片上形成4个子扫描区域，且4个子扫描区域相互之间间隔一个子扫描区域的距离，最后再经过所述第二一级透镜后变回准直激光，输出到所述二级合束拼接模块，其中，经过一级合并式半波片后的4路激光偏振态相同。
优选的是，所述二级合束拼接模块包括2路二级合束拼接子光路、二级偏振合束棱镜和二级透镜，2个二级合束拼接子光路出射的激光经过所述二级偏振合束棱镜合束后再经过所述二级透镜，然后入射到所述二向色片上；
2个所述二级合束拼接子光路结构相同，均包括二级子偏振合束棱镜、第一二级子透镜和第二二级子透镜，2个所述二级合束拼接子光路分别记为第一二级合束拼接子光路和第二二级合束拼接子光路；
4个所述一级合束拼接模块出射的4路子激光的合束激光分别记为：第一路子合束激光、第二路子合束激光、第三路子合束激光、第四路子合束激光；
第一路子合束激光和第二路子合束激光经所述第一二级合束拼接子光路合束后透射所述二级偏振合束棱镜，具体为：
第一路子合束激光透射所述二级子偏振合束棱镜后，与被所述二级子偏振合束棱镜反射的第二路子合束激光合束，然后一同经过所述第一二级子透镜，在所述第一二级子透镜的后焦面上形成8个子扫描区域，8个子扫描区域是由第一路子合束激光和第二路子合束激光各自的4个子扫描区域拼接而形成的均分的两行扫描区域，且每行扫描区域中的4个子扫描区域依次相邻，而两行扫描区域之间则间隔一行扫描区域的距离；
第三路子合束激光和第四路子合束激光经所述第二二级合束拼接子光路合束后被所述二级偏振合束棱镜反射，然后与透射所述二级偏振合束棱镜的合束激光合束，最后一同经过所述二级透镜，在所述二级透镜的后焦面上形成完整的由16个子扫描区域形成的4×4阵列分布的矩形扫描场。
优选的是，所述光电倍增管探测阵列为由4×4个光电倍增管组成的阵列，每个光电倍增管对应1个扫描模块的成像视野的荧光探测。
本发明通过反射式的物镜设计来实现椭圆曲面大视野，能将平面矩形的激光扫描场转换成椭圆半球面的激光扫描场，从而适配动物脑皮层弯曲的形状。
本发明采用多路激光并行扫描和多路荧光通道并行探测方式能实现高通量扫描，在多个子视野区域的拼接合束的过程中，利用四色原理，将16路4X4阵列的子视野区域划分为4组，同一组的4个子区域的边界不相邻。先进行同一组的4个子区域的合束拼接，利用它们边界不相邻的特点，扫描视野能落在不同晶向的半波片上，将偏振合束后的偏振态调整到一致，而且是下一次偏振合束的最佳偏振方向。这种方法实现了多次偏振合束的能量透过率最大化，每次合束的效率优于90％，而不是传统方法中每经过一次消偏振合束棱镜，激光能量就减少一半。不同组之间的合束拼接采用传统的合束方式。
每一次合束过程中，通过调整入射到偏振分光棱镜或消偏振分光棱镜的角度，控制扫描子视野之间的相对位置，从而达到所设计的拼接后的位置分布效果。
通过延时模块，同一组的4个子区域对应的激光束在时间上是同一时点的，不同组的激光束在时间上存在差异，时间相邻的两组之间的延时相隔3.125ns，相当于将12.5ns的脉冲周期等分为4份，每组激光在其中一个时间位点。
光电倍增管探测阵列为由4×4个光电倍增管组成的阵列，每个阵元光电倍增管对应1个扫描单元的成像视野的荧光探测。由于荧光存在散射，激光扫描到视野交界时，产生的荧光除了进入本探测阵元，也会有一定概率落入相邻的探测阵元。由于相邻区域的扫描激光存在延时差异，导致产生的荧光也存在同样的时间差异，因此可以在时间上区分荧光的来源区域，从而减少荧光散射带来的信号串扰。
总的来说，本发明通过使得扫描区域同时点的区域不相邻、相邻的区域不同时的思路，在时间和空间上能有效区分荧光信号的来源区域，极大程度地避免了区域间的信号串扰。
本发明的有益效果是：
本发明提供的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，通过反射式物镜的设计来实现椭圆曲面大视野，能将平面矩形的激光扫描场转换成椭圆半球面的激光扫描场，从而能适配动物脑皮层弯曲的形状；
本发明采用多路激光并行扫描和多路荧光并行的探测方式能实现高通量扫描，在多个子视野区域的拼接合束的过程中，利用四色原理，将不相邻区域划分为一组，利用区域间隙和合并式半波片最大化多次偏振合束的能量效率；且不组激光之间引入延时，通过同时点的区域不相邻、相邻的区域不同时的方案，在时间和空间上能有效区分荧光信号的来源区域，从而能极大程度地避免荧光散射带来的区域间的信号串扰。
附图说明
图1为本发明的实施例中的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜的总体原理结构示意图。
图2为分束延时模块的光路图。
图3为各路激光经过延时光路后在时间轴上的时间分布示意图。
图4为各路激光经扫描和合束拼接后的扫描视野区域分布示意图。
图5为一级合束拼接模块的光路图。
图6为二级合束拼接模块的光路图。
图7为椭球曲面大视野反射式物镜的原理示意图。
图8为各路激光激发的荧光在光电倍增管探测阵列处的分布示意图。
附图标记说明：
1—近红外飞秒脉冲激光器联组；1.1～1.4—近红外飞秒脉冲激光器；
2—分束延时模块联组；2.1～2.4—分束延时模块；2.11—第一反射镜；2.12—第二反射镜；2.13—第一分光元件；2.14—第二分光元件；2.15—第三分光元件；
3—扫描单元联组；3.11～3.14—扫描模块；
4—合束拼接模块；4.1～4.4—一级合束拼接模块；4.5—二级合束拼接模块；4.1.01—第一一级合束拼接子光路4.1.01；4.1.02—第二一级合束拼接子光路；4.1.1、4.1.7—第一一级子半波片；4.1.2、4.1.8—第二一级子半波片；4.1.3、4.1.9—一级子偏振合束棱镜；4.1.4、4.1.10—第一一级子透镜；4.1.5、4.1.11—一级子合并式半波片；4.1.6、4.1.12—第二一级子透镜；4.1.13—一级偏振合束棱镜；4.1.14—第一一级透镜；4.1.15—一级合并式半波片；4.1.16—第二一级透镜；
4.5.01—第一二级合束拼接子光路4.5.01；4.5.02—第二二级合束拼接子光路4.5.02；4.5.1、4.5.4—二级子偏振合束棱镜；4.5.2、4.5.5—第一二级子透镜；4.5.3、4.5.6—第二二级子透镜；4.5.7—二级偏振合束棱镜；挡板—4.5.8；4.5.9—二级透镜；
5—椭球曲面大视野反射式物镜；5.1—主镜；5.2—次镜；5.3—三镜；
6—二向色片；
7—光电倍增管探测阵列；
A、B、C、D—激光；A1—第一路子激光；A2—第二路子激光；A3—第三路子激光；A4—第四路子激光。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
参照图1，本实施例的一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组1、分束延时模块联组2、扫描单元联组3、合束拼接模块4、椭球曲面大视野反射式物镜5、二向色片6和光电倍增管探测阵列7；
近红外飞秒脉冲激光器联组1发出的激光依次经过分束延时模块联组2、扫描单元联组3、合束拼接模块4后透射二向色片6，然后经过椭球曲面大视野反射式物镜5照射到样品上，样品被激发产生的荧光经过椭球曲面大视野反射式物镜5收集后，被二向色片6反射至光电倍增管探测阵列7。
本实施例中，近红外飞秒脉冲激光器联组1包括4个近红外飞秒脉冲激光器；
分束延时模块联组2包括4个分束延时模块，分束延时模块包括延时光路和分束光路；
扫描单元联组3包括4个扫描单元，每个扫描单元包括4个独立的扫描模块，每个扫描模块独立实现1个矩形的子扫描区域的二维扫描；
每个近红外飞秒脉冲激光器对应1个分束延时模块，每个分束延时模块对应1个扫描单元；
4个近红外飞秒脉冲激光器发出的激光经过延时光路后形成依次具有T/4的时间间隔的4路延时激光，每路延时激光再经过分束光路后等分为4路子激光，来源于同一路延时激光的4路子激光进入同一个扫描单元，且每路子激光对应1个扫描模块用于实现1个子扫描区域的扫描，从而通过16路子激光与16个扫描模块一一对应，实现16个子扫描区域的扫描；其中，T为近红外飞秒脉冲激光器发出的激光的脉冲周期；同一个扫描单元中的每个扫描模块扫描得到的子扫描区域处于同一时间位点，不同的扫描单元中的扫描模块扫描得到的子扫描区域位于不同的时间位点；
合束拼接模块4用于实现16个扫描模块出射的16路子激光的合束拼接，通过将16个子扫描区域合束拼接，形成4×4阵列分布的矩形扫描场，而且使得位于同一时间位点的4个子扫描区域边界不相邻，而边界相邻的任意4个区域在时间上位于不同的时间位点。
以上为本发明的总体构思，以下在其基础上结合更为具体的实施例和附图对本发明做进一步说明。
参照图2-8，本实施例中，近红外飞秒脉冲激光器联组11包含四个近红外飞秒脉冲激光器1.1、1.2、1.3和1.4，它们型号一致，分别发射飞秒激光A、B、C、D进入各自的分束延时模块2.1～2.4。
本实施例中，分束延时模块联组2包括4个分束延时模块2.1～2.4，分束延时模块包括延时光路和分束光路，如图2所示(仅展示2.1，2.2～2.4相同)；延时光路包括第一反射镜2.11和第二反射镜2.12，近红外飞秒脉冲激光器发出的激光A依次经过第一反射镜2.11和第二反射镜2.12反射后形成延时激光输出，通过调整第一反射镜2.11和第二反射镜2.12之间的距离L使得输出的延时激光产生不同的延时量L/c，其中c为光速；
分束光路包括第一分光元件2.13、第二分光元件2.14和第三分光元件2.15，第二反射镜2.12输出的延时激光进第一分光元件2.13后均分为两路，一路透射第一分光元件2.13后到达第二分光元件2.14，并被第二分光元件2.14均分为两路，另一路被第一分光元件2.13反射后到达第三分光元件2.15，并被第三分光元件2.15均分为两路，从而将延时激光均分为4路。在优选的实施例中，第一分光元件2.13、第二分光元件2.14和第三分光元件2.15均为消偏振分光棱镜或者为50/50分光片。
在优选的实施例中，飞秒激光脉冲的重复频率一般为80MHz，即周期为12.5ns。通过调整分束延时模块2.1～2.4的各自的延时量，使得A～D四组激光脉冲在时间上分离，时间相邻的两路之间的延时相隔3.125ns，如图3所示，相当于将12.5ns的脉冲周期等分为4份，每组激光在其中一个时间位点。
每个激光器的激光被等分为4路，因此共分出16路激光。各路激光进一步地进入并行扫描单元联组33，入射到相应的扫描单元。A1～A4激光对应扫描单元3.11～3.14，B1～B4激光对应扫描单元3.21～3.24，C1～C4激光对应扫描单元3.31～3.34，D1～D4激光对应扫描单元3.41～3.44。
每个扫描模块3.11～3.14包括快轴8kHz共振扫描镜和慢轴检流计振镜，实现每个单独子区域的二维快速扫描，每个子区域扫描视野面为矩形。
16个子区域扫描视野面需要通过合束拼接模块4进行合束拼接，在进入物镜5之前形成完整的扫描场，如图4所示，是一个4×4扫描视野阵列。各路激光扫描形成的子区域的排布特点为：同组激光的子区域的边界不相邻，如A1～A4是不相邻的；边界相邻的子区域来源于不同组激光，如A1、B1、C1、D1相邻，来自四组激光；以下进行详细说明。
合束拼接模块4包括4个一级合束拼接模块4.1～4.4和1个二级合束拼接模块4.5，每个一级合束拼接模块分别对应1个扫描单元，以将1个扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光进行合束拼接；
二级合束拼接模块4.5用于将4个一级合束拼接模块出射的4组激光再次进行合束拼接，然后输入到二向色片6。
16路扫描支路通过合束拼接模块44进行合束和视野拼接，最终形成如图4所示的扫描场。同组激光的四路扫描支路先通过一级合束拼接模块进行合束拼接，如A1～A4通过一级合束拼接模块4.1进行合束拼接，而B、C、D组分别通过4.2、4.3、4.4进行合束拼接。
下面以一级合束拼接模块4.1为例描述如何进行合束拼接，4.2～4.4与之相同。
参照图5，一级合束拼接模块包括2个一级合束拼接子光路4.1.01和4.1.02、一级偏振合束棱镜4.1.13、第一一级透镜4.1.14、一级合并式半波片4.1.15和第二一级透镜4.1.16，2个一级合束拼接子光路4.10出射的激光经过一级偏振合束棱镜4.1.13合束后再依次经过第一一级透镜4.1.14、一级合并式半波片4.1.15和第二一级透镜4.1.16后输出，一级合并式半波片4.1.15包括4个不同的半波片；
2个一级合束拼接子光路4.1.01和4.1.02结构相同，均包括第一一级子半波片4.1.1、第二一级子半波片4.1.2、一级子偏振合束棱镜4.1.3、第一一级子透镜4.1.4、一级子合并式半波片4.1.5和第二一级子透镜4.1.6，一级子合并式半波片4.1.5包括两个不同的半波片，2个一级合束拼接子光路分别记为第一一级合束拼接子光路4.1.01和第二一级合束拼接子光路4.1.02；
同一个扫描单元中的4个扫描模块3.11～3.14出射的4路子激光分别记为：第一路子激光A1、第二路子激光A2、第三路子激光A3、第四路子激光A4，
第一路子激光A1和第二路子激光A2经第一一级合束拼接子光路4.1.01合束后透射一级偏振合束棱镜4.1.13，具体为：
第一路子激光A1经过第一一级子半波片4.1.1后透射一级子偏振合束棱镜4.1.3，第二路子激光A2经过第二一级子半波片4.1.2后被一级子偏振合束棱镜4.1.3反射，然后与透射一级子偏振合束棱镜4.1.3的第一路子激光A1合束，然后一同经过第一一级子透镜4.1.4，在第一一级子透镜4.1.4的后焦面上的一级子合并式半波片4.1.5的两个不同的半波片上形成2个子扫描区域，且2个子扫描区域之间间隔一个子扫描区域的距离；调整第一一级子半波片4.1.1和第二一级子半波片4.1.2使激光的合束效率最大，调整激光入射到一级子偏振合束棱镜4.1.3的角度使得两个子扫描区域处于合适的位置，即2个子扫描区域之间间隔一个子扫描区域的距离，由于A1、A2形成的扫描场不相邻存在缝隙，因此它们能进一步完全落入两个不同半波片上，两个半波片采用胶合方式组成一级子合并式半波片4.1.5；
合束后的两路子激光再经过第二一级子透镜4.1.6后变回准直激光，再透射一级偏振合束棱镜4.1.13，其中，经过一级子合并式半波片4.1.5后的2路激光偏振态相同；
A1、A2经过偏振合束后的偏振态是不同的，正好相互垂直的，后续再通过偏振合束，它们将再次分离，失去合束效果。通过一级子合并式半波片4.1.5中胶合的两片半波片的晶向选择合适的不同方向，使得A1、A2区域的激光偏振态在通过4.1.5后变为一致，并正好调整到下一次偏振合束所需的最佳偏振态上。
同理，第三路子激光A3和第四路子激光A4经第二一级合束拼接子光路4.1.02合束，然后被一级偏振合束棱镜4.1.13反射，使得A3、A4与透射一级偏振合束棱镜4.1.13的合束激光A1、A2合束，然后一同经过第一一级透镜4.1.14，在第一一级透镜4.1.14的后焦面上的一级合并式半波片4.1.15的四片不同的半波片上形成4个子扫描区域，且4个子扫描区域相互之间间隔一个子扫描区域的距离，最后再经过第二一级透镜4.1.16后变回准直激光，输出到二级合束拼接模块4.5，其中，经过一级合并式半波片4.1.15后的4路激光偏振态相同。
通过一级子合并式半波片4.1.5、4.1.11将合束效率最大化，通过调整入射到4.1.13的角度，使得四个扫描子区域的扫描视野在第一一级透镜4.1.14的后焦面上的相互位置为所设计的合适的位置。这四个子视野区域依然是边界不相邻的，因此也能完全落入四片不同的半波片上。四片半波片通过胶合方式形成一级合并式半波片4.1.15。通过控制选择各半波片的晶向，四个子视野通过4.1.15后的偏振态相同，并为下次偏振合束所需的最佳偏振态。然后经过第二一级透镜4.1.16使激光变回准直激光。
至此，A1～A4通过一级合束拼接模块完成了合束和视野拼接，B、C、D组的合束方式相同，不再叙述。
参照图6，以下通过二级合束拼接模块4.5对A、B、C、D四组激光进行合束拼接。
二级合束拼接模块4.5包括2路二级合束拼接子光路4.5.01和4.5.02、二级偏振合束棱镜4.5.7和二级透镜4.5.9，2个二级合束拼接子光路4.5.0出射的激光经过二级偏振合束棱镜4.5.7合束后再经过二级透镜4.5.9，然后入射到二向色片6上；
2个二级合束拼接子光路4.5.01和4.5.02结构相同，均包括二级子偏振合束棱镜4.5.1、第一二级子透镜4.5.2和第二二级子透镜4.5.3，2个二级合束拼接子光路4.5.0分别记为第一二级合束拼接子光路4.5.01和第二二级合束拼接子光路4.5.02；
4个一级合束拼接模块4.1～4.4出射的4路子激光的合束激光分别记为：第一路子合束激光A、第二路子合束激光B、第三路子合束激光C、第四路子合束激光D；
第一路子合束激光A和第二路子合束激光B经第一二级合束拼接子光路4.5.01合束后透射二级偏振合束棱镜4.5.7，具体为：
第一路子合束激光A透射二级子偏振合束棱镜4.5.1后，与被二级子偏振合束棱镜4.5.1反射的第二路子合束激光B合束，然后一同经过第一二级子透镜4.5.2，在第一二级子透镜4.5.2的后焦面上形成8个子扫描区域，8个子扫描区域是由第一路子合束激光A和第二路子合束激光B各自的4个子扫描区域拼接而形成的均分的两行扫描区域，且每行扫描区域中的4个子扫描区域依次相邻，而两行扫描区域之间则间隔一行扫描区域的距离；
第三路子合束激光C和第四路子合束激光D经第二二级合束拼接子光路4.5.02合束后被二级偏振合束棱镜4.5.7反射，然后与透射二级偏振合束棱镜4.5.7的合束激光合束，最后一同经过二级透镜4.5.9，在二级透镜4.5.9的后焦面上形成完整的由16个子扫描区域形成的4×4阵列分布的矩形扫描场，如图4。
A组、B组激光通过二级偏振合束棱镜4.5.7进行合束，由于在各自的一级合束拼接模块中，通过合并式的半波片将各自偏振态已调整到最佳，保障了此处的合束效率。调整入射到二级偏振合束棱镜4.5.7的角度使得在第一二级子透镜4.5.2的后焦面上形成的两组8个子区域的各扫描场处于设计的合适的位置。C组、D组激光的合束拼接同理。
继续参照图6，在一种优选的实施例中，二级合束拼接模块4.5还包括挡板4.5.8，用挡板4.5.8挡掉消偏振合束所损失的一半激光。在进一步优选的实施例中，挡板4.5.8也可换为一个相机，该相机用于实时监测各视野的目前拼接情况，若某个子区域视野位置发生偏移，维护人员能及时发现并进行调整。
在一种优选的实施例中，二级偏振合束棱镜4.5.7也可以用50/50分光平片替代。
二向色片6能高效率地透过激光波段，而可见荧光波段将反射，反射率高。扫描视野合束后的激光将通过二向色片6后到达反射式物镜，在样品内形成激发扫描场，样品内被激发的荧光经过反射物镜达到二向色片6，被反射到光电倍增管探测阵列，进行光电信号转换。
参照图7，通过椭球曲面大视野反射式物镜55，将多个扫描子区域拼接后的平面扫描场(图4)转换成椭圆半球面的曲面扫描视野。
本实施例中，椭球曲面大视野反射式物镜5包括沿光路依次设置的主镜5.1、次镜5.2和三镜5.3，主镜5.1的光学面为八阶双曲面，次镜5.2的光学面为二次扁椭圆面，三镜5.3的光学面为六阶扁椭圆面，进入椭球曲面大视野反射式物镜5的激光经过主镜5.1、次镜5.2、三镜5.3依次反射后照射到样品上。椭球曲面大视野反射式物镜5的数值孔径范围为0.3～0.5。该反射式物镜的成像视野为椭球曲面，长轴曲率半径9～12mm，短轴曲率半径6～9mm，视野的平面投影尺寸为6mm×6mm。
16路扫描激光束将激发样品，产生相应的荧光。AA1～AA4分别为A1～A4激光激发的荧光，BB1～BB4分别为B1～B4激光激发的荧光，CC1～CC4分别为C1～C4激光激发的荧光，DD1～DD4分别为D1～D4激光激发的荧光。
光电倍增管探测阵列7，为由4×4个光电倍增管组成的阵列，每个阵元光电倍增管对应1个扫描单元的成像视野的荧光探测，如图8所示。来自曲面视野的荧光经过反射物镜5的扫描场转换后，在探测阵列7又变回平面矩阵的分布。
由于荧光存在散射，激光扫描到视野交界时，产生的荧光除了进入本探测阵元，也会有一定概率落入相邻的探测阵元。由于相邻区域的扫描激光存在延时差异，导致产生的荧光也存在同样的时间差异，因此可以在时间上区分荧光的来源区域，从而减少荧光散射带来的信号串扰。
总的来说，本发明通过同时点的区域不相邻，相邻的区域不同时的思路，在时间和空间上能有效区分荧光信号的来源区域，极大程度地避免了区域间的信号串扰。
本发明的实施方式描述了16路4×4阵列的扫描和探测方法，而根据四色原理，对平面分布的任意个区域，总能使这些区域划分为四类而同一类的区域是不相邻的，进而通过本发明提供的独特合束拼接方式来提高合束的能量透过率，通过本发明提供时空区分法来减少荧光信号串扰，因此本发明的实施方式能推广到任意数量的并行扫描和探测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，包括：近红外飞秒脉冲激光器联组、分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块、椭球曲面大视野反射式物镜、二向色片和光电倍增管探测阵列；
所述近红外飞秒脉冲激光器联组发出的激光依次经过所述分束延时模块联组、扫描单元联组、合束拼接模块后透射所述二向色片，然后经过所述椭球曲面大视野反射式物镜照射到样品上，样品被激发产生的荧光经过所述椭球曲面大视野反射式物镜收集后，被所述二向色片反射至所述光电倍增管探测阵列；
所述椭球曲面大视野反射式物镜包括沿光路依次设置的主镜、次镜和三镜，所述主镜的光学面为双曲面，所述次镜的光学面为扁椭圆面，所述三镜的光学面为扁椭圆面，进入所述椭球曲面大视野反射式物镜的激光经过所述主镜、次镜、三镜依次反射后照射到样品上；
所述近红外飞秒脉冲激光器联组包括4个近红外飞秒脉冲激光器；
所述分束延时模块联组包括4个分束延时模块，所述分束延时模块包括延时光路和分束光路；
所述扫描单元联组包括4个扫描单元，每个扫描单元包括4个独立的扫描模块，每个扫描模块独立实现1个矩形的子扫描区域的二维扫描；
每个所述近红外飞秒脉冲激光器对应1个所述分束延时模块，每个所述分束延时模块对应1个所述扫描单元；
4个所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光经过所述延时光路后形成依次具有T/4的时间间隔的4路延时激光，每路延时激光再经过所述分束光路后等分为4路子激光，来源于同一路延时激光的4路子激光进入同一个扫描单元，且每路子激光对应1个扫描模块用于实现1个子扫描区域的扫描，从而通过16路子激光与16个扫描模块一一对应，实现16个子扫描区域的扫描；其中，T为近红外飞秒脉冲激光器发出的激光的脉冲周期；同一个扫描单元中的每个扫描模块扫描得到的子扫描区域处于同一时间位点，不同的扫描单元中的扫描模块扫描得到的子扫描区域位于不同的时间位点；
所述合束拼接模块用于实现16个扫描模块出射的16路子激光的合束拼接，通过将16个子扫描区域合束拼接，形成4×4阵列分布的矩形扫描场，而且使得位于同一时间位点的4个子扫描区域边界不相邻，而边界相邻的任意4个区域在时间上位于不同的时间位点。
2.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述主镜的光学面为八阶双曲面，所述次镜的光学面为二次扁椭圆面，所述三镜的光学面为六阶扁椭圆面。
3.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述延时光路包括第一反射镜和第二反射镜，所述近红外飞秒脉冲激光器发出的激光依次经过所述第一反射镜和第二反射镜反射后形成延时激光输出，通过调整所述第一反射镜和第二反射镜之间的距离使得输出的延时激光产生不同的延时量；
所述分束光路包括第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件，所述第二反射镜输出的延时激光进所述第一分光元件后均分为两路，一路透射所述第一分光元件后到达所述第二分光元件，并被所述第二分光元件均分为两路，另一路被所述第一分光元件反射后到达所述第三分光元件，并被所述第三分光元件均分为两路，从而将延时激光均分为4路。
4.根据权利要求3所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述第一分光元件、第二分光元件和第三分光元件均为消偏振分光棱镜或者为50/50分光片。
5.根据权利要求1所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述扫描模块包括快轴共振扫描镜和慢轴检流计振镜。
6.根据权利要求3所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述合束拼接模块包括4个一级合束拼接模块和1个二级合束拼接模块，每个一级合束拼接模块分别对应1个所述扫描单元，以将1个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光进行合束拼接；
所述二级合束拼接模块用于将4个所述一级合束拼接模块出射的4组激光再次进行合束拼接，然后输入到所述二向色片。
7.根据权利要求6所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述一级合束拼接模块包括2个一级合束拼接子光路、一级偏振合束棱镜、第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜，2个一级合束拼接子光路出射的激光经过所述一级偏振合束棱镜合束后再依次经过所述第一一级透镜、一级合并式半波片和第二一级透镜后输出，所述一级合并式半波片包括4个不同的半波片；
2个所述一级合束拼接子光路结构相同，均包括第一一级子半波片、第二一级子半波片、一级子偏振合束棱镜、第一一级子透镜、一级子合并式半波片和第二一级子透镜，所述一级子合并式半波片包括两个不同的半波片，2个所述一级合束拼接子光路分别记为第一一级合束拼接子光路和第二一级合束拼接子光路；
同一个所述扫描单元中的4个扫描模块出射的4路子激光分别记为：第一路子激光、第二路子激光、第三路子激光、第四路子激光，
第一路子激光和第二路子激光经第一一级合束拼接子光路合束后透射所述一级偏振合束棱镜，具体为：
第一路子激光经过所述第一一级子半波片后透射所述一级子偏振合束棱镜，第二路子激光经过所述第二一级子半波片后被所述一级子偏振合束棱镜反射，然后与透射所述一级子偏振合束棱镜的第一路子激光合束，然后一同经过所述第一一级子透镜，在所述第一一级子透镜的后焦面上的一级子合并式半波片的两个不同的半波片上形成2个子扫描区域，且2个子扫描区域之间间隔一个子扫描区域的距离；合束后的两路子激光再经过所述第二一级子透镜后变回准直激光，再透射所述一级偏振合束棱镜，其中，经过一级子合并式半波片后的2路激光偏振态相同；
第三路子激光和第四路子激光经第二一级合束拼接子光路合束后被所述一级偏振合束棱镜反射，然后与透射所述一级偏振合束棱镜的合束激光合束；然后一同经过所述第一一级透镜，在所述第一一级透镜的后焦面上的一级合并式半波片的四片不同的半波片上形成4个子扫描区域，且4个子扫描区域相互之间间隔一个子扫描区域的距离，最后再经过所述第二一级透镜后变回准直激光，输出到所述二级合束拼接模块，其中，经过一级合并式半波片后的4路激光偏振态相同。
8.根据权利要求7所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述二级合束拼接模块包括2路二级合束拼接子光路、二级偏振合束棱镜和二级透镜，2个二级合束拼接子光路出射的激光经过所述二级偏振合束棱镜合束后再经过所述二级透镜，然后入射到所述二向色片上；
2个所述二级合束拼接子光路结构相同，均包括二级子偏振合束棱镜、第一二级子透镜和第二二级子透镜，2个所述二级合束拼接子光路分别记为第一二级合束拼接子光路和第二二级合束拼接子光路；
4个所述一级合束拼接模块出射的4路子激光的合束激光分别记为：第一路子合束激光、第二路子合束激光、第三路子合束激光、第四路子合束激光；
第一路子合束激光和第二路子合束激光经所述第一二级合束拼接子光路合束后透射所述二级偏振合束棱镜，具体为：
第一路子合束激光透射所述二级子偏振合束棱镜后，与被所述二级子偏振合束棱镜反射的第二路子合束激光合束，然后一同经过所述第一二级子透镜，在所述第一二级子透镜的后焦面上形成8个子扫描区域，8个子扫描区域是由第一路子合束激光和第二路子合束激光各自的4个子扫描区域拼接而形成的均分的两行扫描区域，且每行扫描区域中的4个子扫描区域依次相邻，而两行扫描区域之间则间隔一行扫描区域的距离；
第三路子合束激光和第四路子合束激光经所述第二二级合束拼接子光路合束后被所述二级偏振合束棱镜反射，然后与透射所述二级偏振合束棱镜的合束激光合束，最后一同经过所述二级透镜，在所述二级透镜的后焦面上形成完整的由16个子扫描区域形成的4×4阵列分布的矩形扫描场。
9.根据权利要求8所述的椭半球曲面大视野高通量双光子显微镜，其特征在于，所述光电倍增管探测阵列为由4×4个光电倍增管组成的阵列，每个光电倍增管对应1个扫描模块的成像视野的荧光探测。
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