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CN113648418A - Apelin-APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用 - Google Patents

Apelin-APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用 Download PDF

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CN113648418A CN202110498293.0A CN202110498293A CN113648418A CN 113648418 A CN113648418 A CN 113648418A CN 202110498293 A CN202110498293 A CN 202110498293A CN 113648418 A CN113648418 A CN 113648418A
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Abstract

本发明公开了Apelin‑APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用。本发明发明人发现，使用Apelin‑APJ抑制剂能够有效促进细胞血睾屏障相关基因表达，保证血睾屏障完整性，提高小鼠卵胞浆内单精子注射囊胚率以及降低合子胚胎阻滞，从而可以用于慢性疾病引发的生殖系统损伤等相关问题，具有极高的应用价值和临床意义。而且，本发明中的Apelin‑APJ抑制剂在0.1～100μM使用剂量内无明显毒副作用，可以安全的用于药物制备等相关用途。

Description

Apelin-APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及Apelin-APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用。
背景技术
糖尿病(DM)是一种胰岛素分泌缺陷、胰岛素抵抗或两者兼而有之的代谢障碍性疾病，其中，二型糖尿病是人类最常见的慢性疾病之一。糖尿病的患病人群广，危害性大。二型糖尿病可以导致身体大部分系统功能受损，对于人体健康存在巨大的威胁。
相关技术中，大对数研究只要集中在糖尿病对肾脏和视网膜等重要器官损伤的发病机制，但对于糖尿病对人类生殖系统的影响研究甚少。而随着有研究发现二型糖尿病的首次诊断年龄在不断降低，而且还发现糖尿病的其中一个重要并发症是男性生殖系统紊乱后，人们对于糖尿病导致的精子发生障碍开始不断深入探究，但其潜在的致病机制及治疗方案确仍未有实质的进展。
Apelin(APLN，或称爱帕琳肽)是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体。Apelin在心力衰竭的晚期阶段是一种具有良好特征的心脏保护肽，因此，外用Apelin可以增加心脏衰竭患者的心输出量和收缩力，从而改善心脏性能。目前已经发现靶向Apelin-APJ的小分子极少，但是却意义重大。在临床中发现，与健康人相比，二型糖尿病患者体内的Apelin水平会显著增加。同样，一型糖尿病患者体内的Apelin水平也会相对提高，这种非正常的提高显然会给人体健康带来不可预估的风险。
因此，开发一种能在不影响糖尿病的正常治疗的情况下，有效控制糖尿病对人体生殖系统损伤的药物或治疗方法对于糖尿病的治疗具有极高的临床意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种 Apelin-APJ抑制剂在制备糖尿病引起的生殖系统损伤治疗药物中的应用，发明人发现，Apelin-APJ抑制剂能够有效促进细胞血睾屏障相关基因表达，保障血睾屏障完整性，恢复血睾屏障功能，从而能够防止糖尿病对人体生殖系统的损伤。
本发明的第一个方面，提供Apelin-APJ抑制剂在制备生殖系统损伤治疗药物中的应用。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述生殖系统损伤为慢性疾病引发的生殖系统损伤。
在本发明的一些优选实施方式中，所述慢性疾病包括糖尿病。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述慢性疾病为糖尿病。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂包括 ML221、F13A。F13A是Apelin13的同源突变体，其氨基酸序列为QRPRLSHKGPMPA(SEQ IDNO.1)，作为Apelin-APJ的抑制剂在实验中应用。
在本发明的一些优选实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂为ML221、F13A。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂的使用剂量为0.1～100μM。
发明人发现，糖尿病致生殖系统损伤的机理主要是糖尿病患者血液中过高的Apelin会抑制睾丸支持细胞表达组成血睾屏障相关基因的表达，破坏血睾屏障完整性，导致血睾屏障功能受损，进而影响精子发生。
本发明的第二个方面，提供Apelin-APJ抑制剂在制备血睾屏障损伤治疗药物中的应用。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述血睾屏障损伤是由糖尿病引起的血睾屏障损伤。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂包括 ML221、F13A。
在本发明的一些优选实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂为ML221、F13A。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂的使用剂量为0.1～100μM。
发明人发现，Apelin-APJ抑制剂可以有效促进细胞血睾屏障相关基因的表达，从而保证血睾屏障完整性。
本发明的第三个方面，提供Apelin-APJ抑制剂在制备促进血睾屏障连接蛋白表达制剂中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂包括 ML221、F13A。
在本发明的一些优选实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂为ML221、F13A。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述血睾屏障连接蛋白包括缝隙连接蛋白、紧密连接蛋白和闭合蛋白。
闭合蛋白是生精上皮中支持细胞间形成紧密连接结构的基础，其程序性的开启与关闭保证了精子发生正常进行，若异常开放则会影响精子发生的正常进程。发明人发现，干扰睾丸支持细胞内闭合蛋白的功能状态，会导致不育。在本发明中，发明人发现，Apelin-APJ抑制剂能够有效恢复高Apelin抑制降低的闭合蛋白的表达，有效提高血睾屏障紧密性。
在本发明的一些优选实施方式中，所述缝隙连接蛋白为缝隙连接蛋白43。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂的使用剂量为0.1～100μM。
缝隙连接蛋白43(Cx43)连接蛋白作为缝隙连接最重要的组成部分，目前为止发现的连接蛋白至少有20余种，其中表达最普遍和研究最多的是缝隙连接蛋白43。其已被发现存在于几十种组织和细胞当中，作为小鼠、大鼠、豚鼠、犬和人中一种重要的缝隙连接，与机体的许多系统疾病病理生理过程都及其相关。Cx43的表达及分布异常，在泌尿系统多种疾病的发生、发展过程中起重要作用，在本发明中，发明人发现，Apelin-APJ抑制剂能够有效促进缝隙连接蛋白43的表达，提高血睾屏障的密闭性，恢复精子的正常发生。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述紧密连接蛋白为紧密连接蛋白1。
紧密连接蛋白1是1986年发现的与紧密连接相关的蛋白，近年来发现其于维持和调节上皮和屏障功能有关，还参与调节细胞物质转运，维持上皮极性，细胞增殖分化，肿瘤细胞转移等重要过程，由于紧密连接蛋白1结构和功能于紧密连接的其他成员密切相关，多数情况下只要紧密连接蛋白1受到破坏，紧密连接的功能多随之改变，故紧密连接蛋白1常被用来作为观察各种组织紧密连接屏障功能和通透性的指标。在本发明中，发明人发现，Apelin-APJ 抑制剂能够有效促进紧密连接蛋白1的表达，恢复血睾屏障紧密连接的正常功能，提高睾丸连接的紧密性，维持精子的正常发生。
本发明的第四个方面，提供Apelin-APJ抑制剂在制备改善雄性生殖细胞质量制剂中的应用。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述改善雄性生殖细胞质量制剂针对于糖尿病引发的精子质量下降。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂包括 ML221、F13A。
在本发明的一些优选实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂为ML221。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Apelin-APJ抑制剂的使用剂量为0.1～100μM。
发明人发现，Apelin-APJ抑制剂能够显著提高雄性小鼠的精子质量，包括提高糖尿病模型小鼠卵胞浆内单精子注射囊胚率以及降低合子胚胎阻滞。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的Apelin-APJ抑制剂能够有效促进细胞血睾屏障相关基因表达，保证血睾屏障完整性，从而能够防止糖尿病对人体生殖系统的损伤。
2.本发明中的Apelin-APJ抑制剂还能提高糖尿病模型小鼠卵胞浆内单精子注射囊胚率以及降低合子胚胎阻滞，从而说明Apelin-APJ抑制剂可以显著提高雄性小鼠的精子质量。
3.本发明中的Apelin-APJ抑制剂在10mg/kg使用剂量内无明显毒副作用，而且对生殖系统损伤的保护作用强，能有效用于慢性疾病，如糖尿病引发的生殖系统相关问题，具有极高的应用价值和临床意义。
附图说明
图1为本发明实施例中的Apelin-APJ抑制剂(ML221)的作用机理示意图；
图2为使用不同浓度Apelin-APJ抑制剂处理后的TM4细胞光镜图(A)及其数量统计结果(B)；
图3为使用不同浓度Apelin-APJ抑制剂处理后的TM4细胞流式图(A)及其凋亡情况统计结果(B)；
图4为Apelin-APJ抑制剂对细胞血睾屏障相关基因表达的蛋白的免疫荧光染色成像图，其中，A为闭合蛋白的细胞成像，B为缝隙连接蛋白43的细胞成像，C为紧密连接蛋白1的细胞成像；
图5为Apelin-APJ抑制剂对细胞血睾屏障相关基因表达的蛋白的荧光强度分析图，其中， A为闭合蛋白，B为缝隙连接蛋白43，C为紧密连接蛋白1；
图6为Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型睾丸血睾屏障完整性的保护效果，其中，A 为免疫荧光成像，B为生物素阳性统计图；
图7为糖尿病小鼠血睾屏障中紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白的细胞成像图，其中，A为紧密连接蛋白1，B为缝隙连接蛋白43；
图8为Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型精子质量的实验步骤示意图；
图9为本发明实施例中的糖尿病小鼠模型睾丸实物对比图；
图10为本发明实施例中的糖尿病小鼠模型卵胞浆内单精子注射情况，其中，A为卵胞浆内单精子注射情况实物图，B为卵胞浆内单精子注射囊胚率统计图，C为卵胞浆内单精子注射降低合子胚胎阻滞情况。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验材料
下述实施例中的Apelin-APJ抑制剂均选择为ML221。
ML221，化学名为5-[(4-硝基苯甲酰基)氧基]-2-[(2-嘧啶硫基)甲基]-4H-吡喃-4-酮，CAS 号为877636-42-5，结构式如式I所示。
Figure BDA0003055352750000051
当然，下述实施例仅以ML221作为代表，并不表示可使用的Apelin-APJ抑制剂仅限于 ML221，本领域技术人员应理解的是，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他Apelin-APJ抑制剂。
糖尿病致生殖系统损伤的机理探究
糖尿病对患者生殖系统的损伤备受关注，包括：生殖器官结构、生殖激素合成和分泌、生殖细胞发生和功能、性功能及子代健康等，尤其是其损伤的病理机制，其中涉及激素水平、细胞和分子水平的调节障碍。
Apelin-APJ抑制剂(ML221)的作用机理示意图如图1所示。
结果发现，在糖尿病小鼠睾丸间质中加入过量Apelin会导致血睾屏障功能受损，进而影响精子的发生，从而可以进一步分析得到结论，糖尿病带来的Apelin水平过高可能是导致糖尿病患者生殖系统损伤的主要原因之一。临床上无论是一型还是二型糖尿病病人血液中的 Apelin含量都有一个明显的升高，在小鼠中，在睾丸中过量注射Apelin后，相比对对照组，其血睾屏障损伤显著上升，而血睾屏障是维持正常精子发生重要屏障。在细胞实验中，发明人发现过量的Apelin，会直接导致血睾屏障相关基因，例如紧密连接蛋白1，缝隙连接蛋白43等蛋白的表达下调，破坏组成血睾屏障的基础。所以结合小鼠体内以及体外细胞实验的结果来看，Apelin在糖尿病病人血液中的异常升高就是导致其血睾屏障功能受损的重要原因之一。
Apelin-APJ抑制剂的细胞毒性检测
本实施例选取ML221作为Apelin-APJ抑制剂示例，以展示Apelin-APJ抑制剂对细胞血睾屏障相关基因表达的促进效果。应理解的是，实施例仅以ML221作为代表，并不表示可使用的Apelin-APJ抑制剂仅限于ML221，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他Apelin-APJ抑制剂。
具体实验步骤为：
(1)培养小鼠睾丸支持细胞：
以正常小鼠睾丸Sertoli细胞TM4(属于小鼠睾丸支持细胞系)作为模拟体内的睾丸支持细胞的体外研究对象，在37℃，5％CO2培养48小时，培养基采用改良Eagle培养基(DMEM) +10％的胎牛血清(FBS)。
(2)取传代后的TM4细胞，分为四组，分别加入10nM、1μM、100μM的ML221以及DMSO(空白对照)，在37℃，5％CO2培养24小时。
(3)对培养后的TM4细胞进行细胞数量统计以及Annexin V-FITC/PI染色，通过流式检测凋亡，分析分析高浓度ML221对细胞的增殖和凋亡是否存在影响。
结果如图2～3所示。
根据图2和图3所示，可以发现，使用浓度为10nM到100μM之间的ML221处理TM4 细胞，并不会造成TM4细胞的大量凋亡，细胞数量稳定，与空白对照无显著差异，在流式图中也未表现出任何实质性差异，说明浓度为10nM到100μM之间的ML221对TM4细胞的增殖和凋亡无影响，对细胞无毒性。
Apelin-APJ抑制剂对细胞血睾屏障相关基因表达的促进效果
本实施例选取ML221作为Apelin-APJ抑制剂示例，以展示Apelin-APJ抑制剂对细胞血睾屏障相关基因表达的促进效果。应理解的是，实施例仅以ML221作为代表，并不表示可使用的Apelin-APJ抑制剂仅限于ML221，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他Apelin-APJ抑制剂。
具体实验步骤为：
(1)培养小鼠睾丸支持细胞：
以正常小鼠睾丸Sertoli细胞TM4(属于小鼠睾丸支持细胞系)作为模拟体内的睾丸支持细胞的体外研究对象，在37℃，5％CO2培养48小时，培养基采用改良Eagle培养基(DMEM) +10％的胎牛血清(FBS)。
(2)取传代后的TM4细胞，分为三组，分别加入2μg APLN蛋白(模型)、2μg Apelin+终浓度20μM的ML221(实验组)、以及DMSO(空白对照)，在37℃，5％CO2培养48小时。
(3)对培养后的TM4细胞进行基因检测，分析细胞血睾屏障相关基因水平：
为了确保检测结果以及实验结论的准确，发明人分别采用了两种方式检测细胞血睾屏障相关基因水平(闭合蛋白、缝隙连接蛋白43和紧密连接蛋白1)。
第一种细胞血睾屏障相关基因水平检测方法为：
将各组的细胞接种于圆形玻片上，待细胞生长至完全贴壁后，用4％多聚甲醛固定，对细胞玻片进行免疫荧光染色。其中，一抗为anti-ZO1和anti-CX43，4℃孵育过夜后添加二抗 (anti-Rb-594)，一抗和二抗的稀释比为1：1000(稀释溶液为DMEM)，置于室温下静置1小时。然后用Hoechst 33342染核(稀释比l：1000，稀释溶液为DMEM)，室温染10分钟。拍片观察及统计。
第二种细胞血睾屏障相关基因水平检测方法为：
收集各组的细胞，3000rpm离心5分钟，弃去上清，使用蛋白提取液重悬细胞，冰上裂解10分钟。然后在各组中加入等体积的蛋白上样缓冲液，在98℃金属浴中裂解10分钟。通过免疫蛋白印迹检测血睾屏障相关基因的表达。
结果如图4～5所示。
通过在正常小鼠睾丸Sertoli细胞TM4上实验说明，在培养体系中加入过量的Apelin会导致血睾屏障相关基因水平(闭合蛋白、缝隙连接蛋白43和紧密连接蛋白1)的明显降低，通过Apelin-APJ受体抑制剂ML221的加入，可以接触高Apelin的抑制作用，恢复相关蛋白的表达水平。
Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型睾丸血睾屏障完整性的保护效果
本实施例选取ML221作为Apelin-APJ抑制剂示例，以展示Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型睾丸血睾屏障完整性的保护效果。应理解的是，实施例仅以ML221作为代表，并不表示可使用的Apelin-APJ抑制剂仅限于ML221，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他Apelin-APJ抑制剂。
具体实验步骤为：
(1)构建糖尿病小鼠模型：
本实施例中选择8周龄的db/db全雄小鼠作为试验对象，小鼠购买于常州卡文斯实验动物有限公司。
(2)将试验小鼠麻醉后固定在操作台上，使用手术剪刀剪开下腹部，使用镊子轻轻扯出两侧睾丸；用毛细管吸取2μL浓度为20mM的ML221，沿输出总管刺入睾丸间质内，轻轻吹入ML221。设置空白对照和加重表型组(+APLN)，其中，对照组将ML221替换为等量的 DMSO。将注射完成的睾丸轻轻放回小鼠腹部，缝合伤口，待小鼠清醒后，正常环境培养7 天。
(3)7天后再次麻醉小鼠，向睾丸间质内注射30μL的生物素，0.5小时后对睾丸进行4％多聚甲醛固定，检测睾丸血睾屏障完整性。具体操作为：用4％多聚甲醛固定睾丸样本，进行石蜡包埋切片，对组织切片进行免疫荧光染色。其中，一抗为生物素，4℃孵育过夜后添加二抗(anti-bio-cy3)，一抗和二抗的稀释比为1：1000(稀释溶液为5％牛血清白蛋白)，置于室温下静置1小时。然后用Hoechst 33342染核(稀释比l：1000，稀释溶液为 PBS)，室温染10分钟。拍片观察及统计。
结果如图6所示。
db/db小鼠由于本身长期处于高血糖以及高Apelin的状态，对照组中也存在一定生物素阳性的管腔，当在睾丸间质内注射过量的Apelin后，其生物素阳性管腔比例显著上升，同时，注射Apelin-APJ抑制剂ML221的实验组，其管腔阳性比例相比对照组显著降低。因此，可以发现，在注射ML221之后，糖尿病小鼠睾丸血睾屏障完整性有明显的提高。
Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠体内紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白的表达水平的影响
本实施例选取ML221作为Apelin-APJ抑制剂示例，以展示Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白的表达水平的影响。应理解的是，实施例仅以ML221 作为代表，并不表示可使用的Apelin-APJ抑制剂仅限于ML221，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他Apelin-APJ抑制剂。
采用与上述实施例相同的方法，利用8周龄的db/db全雄小鼠作为试验对象进行实验，其区别在于，仅针对于紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白进行检测。
针对于该区别，在免疫荧光染色时，一抗为紧密连接蛋白1和缝隙连接蛋白43，二抗为山羊抗兔带荧光488标记二抗，一抗和二抗的稀释比为1：500(稀释溶液为5％牛血清白蛋白)，置于室温下静置1小时。然后用Hoechst 33342染核(稀释比l：1000，稀释溶液为PBS)，室温染10分钟。拍片观察及统计。
结果如图7所示。
如图7所示，在睾丸间质中注射过量的Apelin会抑制睾丸支持细胞中紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白的表达水平，而加入Apelin-APJ抑制剂ML221可以部分恢复这些蛋白的表达水平。因此，可以说明Apelin-APJ抑制剂能够显著恢复糖尿病模型小鼠睾丸血睾屏障中紧密连接蛋白与缝隙连接蛋白的表达水平，从而实现保护睾丸血睾屏障完整性的作用效果。
Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型精子质量的影响
本实施例选取ML221作为Apelin-APJ抑制剂示例，以展示Apelin-APJ抑制剂对糖尿病小鼠模型精子质量的影响。应理解的是，实施例仅以ML221作为代表，并不表示可使用的 Apelin-APJ抑制剂仅限于ML221，本领域技术人员可以根据实际使用需求合理的选择其他 Apelin-APJ抑制剂。
具体实验步骤为：
(1)挑选发情间期的8-12周龄C57BL6/N雌鼠或B2D6F1雌鼠，体重大约18-25g，按照体重计算注射激素的单位，每20g体重的注射量为8U。当日晚上7点半左右腹腔注射8U 孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)，并在PMSG注射后46-48小时后再注射8U人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)以诱导超数排卵。
(2)HCG注射13.5小时后进行取卵。取卵前，提前将取卵液M2与透明质酸酶溶液混合并预热到37℃，在无菌培养皿中放入100μL取卵液M2，盖盖备用。对小鼠进行颈椎脱位安乐死，腹面朝上，75％酒精消毒后沿腹中下部剪开皮肤，向头和尾部撕开，移去消化道，暴露子宫卵巢输卵管。超排成功的小鼠输卵管可肉眼见到膨大部，呈透明囊泡状，用眼科镊夹住输卵管与子宫连接处，在贴近卵巢处用眼科剪剪断卵巢和输卵管的连接处，然后再剪断输卵管与子宫连接处，迅速将输卵管转至预热好的M2取卵液中。
(3)体式镜下用1mL注射器针头划开输卵管壶腹部，分离卵母细胞复合物(COCs)。具体操作为：将输卵管在提前预热好的37℃体式镜热台上，用200μL含1mg/mL透明质酸酶的M2取卵液中消化约1分钟，用200μL微量移液枪辅助吹吸(不要吹出气泡)，1分钟后可见卵母细胞周围的颗粒细胞大部分脱离。然后在镜下用口吸管快速挑选卵母细胞，在三个新的100μL M2液滴里分别清洗三次，每次将卵母细胞在液体上部画圈吹开，由于卵母细胞与颗粒细胞的沉降速率不同，在卵母细胞沉降而颗粒细胞漂浮时，快速挑选卵母细胞，以尽快中和、去除透明质酸酶并去除颗粒细胞。将边缘折光明显，胞质均质透亮，极体明显，透明带宽度适宜的优质M II期卵子全部转移到提前一天平衡好的M16培养液中短暂培养，以用于后续显微注射。
(4)在显微注射前5分钟，将步骤(3)得到的M II期卵母细胞放入含有细胞松弛素B(Cytorelaxin B，CB)的M2培养液中，改善胞膜韧性。同时，将断尾的成熟精子放入含有细胞松弛素B的M2培养液中，用压电破膜仪(piezo)大脉冲破透明带，吸入单个精子头，然后再次用压电破膜仪(piezo)的小脉冲破卵母细胞胞膜，将精子头注射入M II期卵母细胞胞质后，退出并吸少量胞质，将卵母细胞破口封起来，每次注射20-30个，时间控制在20分钟左右。注射完成后，放回KSOM培养液，并清洗三次，以去除细胞松弛素B，培养箱培养并观察胚胎发育情况。
步骤示意图如图8所示。
结果如图9～10所示。
如图9所示，腹腔注射ML221对睾丸大小无影响。如图10所示，注射ML221后，db/db小鼠囊胚率上升，胚胎阻滞率降低。因此，ML221可以显著提高精子质量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> Apelin-APJ抑制剂在治疗血睾屏障损伤中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> F13A
<400> 1
Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Ala
1 5 10

Claims (10)

1.Apelin-APJ抑制剂在制备生殖系统损伤治疗药物中的应用；
所述生殖系统损伤为慢性疾病引发的生殖系统损伤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性疾病包括糖尿病。
3.Apelin-APJ抑制剂在制备血睾屏障损伤治疗药物中的应用。
4.Apelin-APJ抑制剂在制备促进血睾屏障连接蛋白表达制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述血睾屏障连接蛋白包括缝隙连接蛋白、紧密连接蛋白和闭合蛋白。
6.Apelin-APJ抑制剂在制备改善雄性生殖细胞质量制剂中的应用。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述Apelin-APJ抑制剂包括ML221、F13A。
8.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述Apelin-APJ抑制剂的使用剂量为0.1～100μM。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述血睾屏障损伤是由糖尿病引起的血睾屏障损伤。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述改善雄性生殖细胞质量制剂针对于糖尿病引发的精子质量下降，并提高临床辅助生殖成功率。
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