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CN113646424A - 具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的制造方法及其应用 - Google Patents

具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的制造方法及其应用 Download PDF

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CN113646424A
CN113646424A CN202080025956.0A CN202080025956A CN113646424A CN 113646424 A CN113646424 A CN 113646424A CN 202080025956 A CN202080025956 A CN 202080025956A CN 113646424 A CN113646424 A CN 113646424A
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pluripotent stem
cell
ability
gene
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CN202080025956.0A
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村上裕太
长濑雅也
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Original Assignee
Fujifilm Corp
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Abstract

本发明的课题在于提供一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。根据本发明，提供一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。根据本发明，提供一种具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。根据本发明，提供一种分化细胞的制造方法及分化细胞。根据本发明，提供一种用于多能干细胞的品质评价的方法。另外，根据本发明，提供一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。

Description

具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的制造方法及其 应用
技术领域
本发明涉及一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。本发明涉及一种通过上述制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法而获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。本发明涉及一种分化细胞的制造方法。本发明涉及一种通过上述分化细胞的制造方法而获得的分化细胞。并且，本发明涉及一种用于多能干细胞的品质评价的方法。另外，本发明涉及一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。
背景技术
在再生医学领域中，正在进行用于将多能干细胞诱导分化成特定细胞来获得各种分化细胞的研究。
多能干细胞被定义为兼备能够分化成构成活体的所有细胞的能力(多潜能性(multipotency))和自我复制能力(self-replication)的细胞。但是，实际上已知，在多能干细胞来源的供体之间或已建立的菌株之间分化能力不恒定，存在分化能力高的细胞和低的细胞。
在专利文献1中记载有一种挑选具有向血球的高分化能力的人工多能干(iPS)细胞的方法，其包括以下工序：(i)在作为样品的人工多能干细胞中测定选择包括TRIM58、CTSF、FAM19A5及TCERG1L基因的组中的一个或其以上的基因的表达水平的工序；及(ii)选择与已知具有向血球的高分化能力的iPS细胞或胚胎干(ES)细胞相比，在上述中所测定出的基因的表达水平相等或其以上的人工多能干细胞的工序，和/或，选择与已知具有向血球的低分化能力的iPS细胞或ES细胞相比，在上述中所测定出的基因的表达水平高的人工多能干细胞的工序。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2014/200030号
发明内容
发明要解决的技术课题
分化细胞是通过利用复杂的培养条件使细胞通过比较长期间的培养阶段性地分化而获得的，因此为了以良好的效率制造分化细胞产品，要求在分化诱导之前选择具有高分化能力的多能干细胞，并将其用作细胞材料。然而，专利文献1中所记载的方法为挑选具有向血球的高分化能力的iPS细胞的方法，因此要求用于对向其他多种特定细胞的分化能力进行评价的方法。
本发明要解决的课题在于提供一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。本发明要解决的课题在于提供一种通过上述制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法而获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。本发明要解决的课题在于提供一种分化细胞的制造方法。本发明要解决的课题在于提供一种通过上述分化细胞的制造方法而获得的分化细胞。并且，本发明要解决的课题在于提供一种用于多能干细胞的品质评价的方法。
用于解决技术课题的手段
在上述课题下，本发明人等进行了详细的研究，其结果，明确了多能干细胞能够分类为使原始内胚层细胞表达的基因低表达的菌株和高表达的菌株，高表达菌株向特定细胞的分化效率低。根据该结果，本发明人等发现了能够以原始内胚层细胞表达的基因的表达水平为指标，挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。本发明是根据上述见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下发明。
(1)一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括：
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择与已知具有向上述特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞，来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序。
(2)根据(1)所述的方法，其中，上述原始内胚层细胞表达的基因为选自包括CER1、LEFTY1、LEFTY2、NODAL及CXCR4的组中的至少一种基因。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，上述特定细胞为源自中胚层或外胚层的分化细胞。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其中，上述特定细胞为心肌细胞或神经细胞。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中，上述多能干细胞为人源细胞。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中，作为上述样品的多能干细胞通过对多能干细胞进行克隆培养使其增殖而获得。
(7)一种具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，其通过(1)至(6)中任一项所记载的方法而获得。
(8)一种分化细胞的制造方法，其包括：
通过(1)至(6)中任一项所述的方法获得具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序；及
对在上述工序中所获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导的工序。
(9)根据(8)所述的方法，其中，上述分化细胞为源自中胚层或外胚层的细胞。
(10)一种分化细胞，其通过(8)或(9)所述的方法而获得。
(11)一种用于多能干细胞的品质评价的方法，其包括：
(a)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；
(b)将所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平进行比较的工序；及
(c)将上述基因的表达水平相等或低的多能干细胞判断为优良的工序。
(12)一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括以下工序：
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择与已知具有向上述特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞的工序。
发明效果
根据本发明，能够提供一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。根据本发明，能够提供一种具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。根据本发明，能够提供一种分化细胞的制造方法。根据本发明，能够提供一种分化细胞。根据本发明，能够提供一种用于多能干细胞的品质评价的方法。另外，根据本发明，能够提供一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法。
附图说明
图1是基于流式细胞仪的cTnT阳性细胞的分析。
图2是高产克隆组相对于低产克隆组的火山图(Volcano Plot)。
图3是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了NANOG的表达量的图表。
图4是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了NODAL的表达量的图表。*表示P-值(P-value)＜0.01。
图5是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了LEFTY1的表达量的图表。*表示P-值(P-value)＜0.01。
图6是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了LEFTY2的表达量的图表。*表示P-值(P-value)＜0.01。
图7是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了CER1的表达量的图表。*表示P-值(P-value)＜0.01。
图8是以高产克隆组相对于低产克隆组比较了CXCR4的表达量的图表。*表示P-值(P-value)＜0.01。
图9是表示外胚层分化诱导前的NODAL的表达量的图表。
图10是表示外胚层分化诱导后的PAX6的表达量的图表。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
本说明书中的缩写具有以下含义。
bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)：碱性成纤维细胞生长因子
BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4)：骨形态发生蛋白4
CER1(Cerberus 1)：地狱犬1
cTnT(cardiac Troponin T)：心肌肌钙蛋白T
CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)：C-X-C趋化因子受体4型DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)：达尔伯克改良伊格尔培养基
DMEM/F12(DMEM Ham’s F-12)：达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12Ham
D-PBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)：达尔伯克磷酸缓冲生理盐水
EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸
Erk(Extracellular Signal-regulated Kinase)：细胞外信号调节激酶
ESG(Embryonal stem cell-specific gene)：胚胎干细胞特异性基因
FGF(Fibroblast growth factor)：成纤维细胞生长因子
GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)：3-磷酸甘油醛脱氢酶
GSK(Glycogen Synthase Kinase)：糖原合成酶激酶
Klf(Kruppel-like factor)：Kruppel样因子
LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)：包含富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5
LIF(Leukemia inhibitory factor)：白血病抑制因子
Oct(octamer-binding transcription factor)：八聚体结合转录因子
PAX6(paired box 6)：配对盒6
PCR(polymerase chain reaction)：聚合酶链反应
ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase)：Rho相关卷曲螺旋形成激酶
RT-PCR(Reverse Transcription polymerase chain reaction)：逆转录聚合酶链反应
SCF(Stem cell factor)：干细胞因子
Sox：SRY(sex determining region Y)-box：SRY(Y染色体性别决定区)框
Stat3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)：信号转导和转录激活因子3
VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)：血管内皮生长因子
[1]多能干细胞的制造方法及多能干细胞
本发明涉及一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括以下工序。
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择与上述已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞，来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序。
根据本发明，能够以原始内胚层细胞表达的至少一种基因的表达量为指标，选择具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。通过排除不具有分化成特定细胞的能力的细胞或该能力低的细胞，能够降低生产成本，并使生产稳定化。
“多能干细胞”是指兼备能够分化成构成活体的所有细胞的能力(多潜能性)和经过细胞分裂产生具有与自身相同的分化能力的子细胞的能力(自我复制能力)的细胞。多潜能性能够通过将评价对象的细胞移植到裸鼠中并试验有无形成包含三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)各自的细胞的畸胎瘤来评价。自我复制能力能够通过传代培养细胞，根据细胞增殖及增殖后的细胞所具有的特质是否因传代培养而变化来评价。
作为多能干细胞，能够举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等，只要是兼备多潜能性及自我复制能力的细胞，则并不限定于此。优选使用ES细胞或iPS细胞，更优选使用iPS细胞。多能干细胞优选为源自哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的细胞，更优选为人源细胞。在本发明的最优选的方式中，使用人源iPS细胞作为多能干细胞。
ES细胞例如能够通过培养植入前的早期胚胎、构成该早期胚胎的内细胞团、单个卵裂球等来建立(Manipulating the Mouse Embryo ALaboratory Manual,SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Thomson,J.A.et al.,Science,282，1145-1147(1998))。作为早期胚胎，可以使用通过核移植体细胞核而制作出的早期胚胎(Wilmut et al.(Nature，385，810(1997))、Cibelli et al.(Science,280,1256(1998))、入谷明等人(Tanpakushitsu Kakusan Koso,44,892(1999))、Baguisi et al.(Nature Biotechnology，17，456(1999))、Wakayama et al.(Nature,394,369(1998)；Nature Genetics，22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，14984(1999))、RideoutIII et al.(Nature Genetics,24，109(2000))、Tachibana et al.(Human EmbryonicStem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Tran sfer,Cell(2013)in press))。作为早期胚胎，也可以使用孤雌发育胚(Kim et al.(Science,315,482-486(2007))、Nakajima et al.(Stem Cells，25，983-985(2007))、Kim et al.(Cell Stem Cell,1，346-352(2007))、Revazova et al.(Cloning Stem Cells,9,432-449(2007))、Revazova etal.(Cloning Stem Cells,10,11-24(2008))。除了上述掲示的论文以外，关于ES细胞的制作，可参考Strelchenko N.,et al.Reprod Biomed Online.9:623-629,2004；KlimanskayaI.,et al.Nature 444:481-485,2006；Chung Y.,et al.Cell Stem Cell 2:113-117，2008；Zhang X.,et al.Stem Cells 24:2669-2676,2006；Wassarman，P.M.et al.Methodsin Enzymology,Vol.365,2003等。另外，通过ES细胞与体细胞的细胞融合而获得的融合ES细胞也包含于本发明的方法中所使用的胚胎干细胞中。
ES细胞中也有能够从保存机构获得的细胞或市售的细胞。例如，关于人ES细胞，能够从京都大学再生医科学研究所(例如，KhES-1、KhES-2及KhES-3)、WiCell ResearchInstitute、ESI BIO等获得。
EG细胞能够通过在LIF、bFGF、SCF的存在下培养原始生殖细胞等来建立(Matsuiet al.,Cell,70,841-847(1992)、Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(23),13726-13731(1998)、Turnpenny et al.,Stem Cells,21(5),598-609,(2003))。
“人工多能干细胞(iPS细胞)”是指通过初始化因子的导入等重编程体细胞来制作的具有多能性(多分化能力)和增殖能力的细胞。人工多能干细胞显示出与ES细胞接近的性质。iPS细胞的制作中所使用的体细胞并不受特别限定，可以为分化的体细胞，也可以为未分化的干细胞。并且，其来源也不受特别限定，但优选使用哺乳动物(例如，人或黑猩猩等灵长类、小鼠或大鼠等啮齿类)的体细胞，更优选使用人的体细胞。iPS细胞能够通过至今为止报道的各种方法来制作。并且，当然也可设想适用今后开发的iPS细胞制作法。
iPS细胞制作法的最基本的方法为利用病毒将作为转录因子的Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc这4种因子导入细胞中的方法(Takahashi K,Yamanaka S:Cell 126(4)，663-676，2006；Takahashi,K,et al.:Cell 131(5),861-72,2007)。关于人iPS细胞，有通过导入Oct4、Sox2、Lin28及Nanog这4种因子来建立的报道(Yu J,et al.:Science 318(5858),1917-1920,2007)。还报道有通过导入除c-Myc以外的3种因子(Nakagawa M,et al.:Nat.Biotechnol.26(1),101-106，2008)、导入Oct3/4及Klf4这2种因子(Kim J B,et al.:Nature 454(7204),646-650,2008)或仅导入Oct3/4(Kim J B,et al.:Cell 136(3),411-419,2009)来建立iPS细胞。并且，还报道有将作为基因的表达产物的蛋白质导入细胞中的方法(Zhou H,Wu S,Joo JY,et al.:Cell Stem Cell 4,381-384,2009；Kim D,Kim CH,Moon JI,et al.:Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，还报道有通过使用对组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294或组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等，能够提高制作效率或减少所导入的因子等(Huangfu D,et al.:Nat.Biotechnol.26(7),795-797,2008；Huangfu D,et al.:Nat.Biotechnol.26(11),1269-1275,2008；SilvaJ,et al.:PLoS.Biol.6(10),e 253,2008)。关于基因导入法也进行了研究，除了将逆转录病毒利用于基因导入的技术以外，还开发出将慢病毒(Yu J,et al.:Science 318(5858),1917-1920，2007)、腺病毒(Stadtfeld M,et al.:Science 322(5903),945-949,2008)、质粒(Okita K,et al.:Science 322(5903),949-953,2008)、转座子载体(Woltjen K,Michael IP,Mohseni P,et al.:Nature 458,766-770,2009；Kaji K,Norrby K,Pac a A,et al.:Nature 458，771-775,2009；Yusa K,Rad R,Takeda J,et al.:Nat Methods 6,363-369,2009)或附加体型载体(Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,Tian S,et al.:Science 324,797-801,2009)利用于基因导入的技术。
发生了向iPS细胞的转化即初始化(重编程)的细胞能够以Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及Cript等多能干细胞标志物(未分化标志物)的表达等作为指标来选择。将所选择的细胞作为iPS细胞而回收。
例如，也能够从国立大学法人京都大学或独立行政法人理化学研究所生物资源中心提供iPS细胞。
多能干细胞中，已知有原始态(naive)型多能干细胞及始发态(prime)型多能干细胞这两种不同状态的细胞。原始态型多能干细胞及始发态型多能干细胞能够根据分子特征及细胞特征来区分。
原始态型多能干细胞典型地具有如下特征：表达高水平的多能因子Oct4、Nanog、Sox2、Klf2及Klf4，对Lif/Stat3或2i(ERKi/GSKi)中的任一个产生响应而自我更新，对Fgf/Erk产生响应而分化，并呈现XaXa的X染色体状态。始发态型多能干细胞典型地具有如下特征：表达高水平的多能性因子Oct 4、Sox2及Nanog，不响应于Lif/Stat3，但响应于Fgf/Erk而自我再生，并呈现XaXi的X染色体激活状态(Nichols et al.,(2009)Cell Stem Cell 4(6):487-492)。另外，Xa表示活性X染色体，Xi表示失活X染色体。
在本说明书中，特定细胞为源自外胚层、内胚层或中胚层的任意的分化细胞。作为源自外胚层的分化细胞，并不受特别限定，可以举出神经系统细胞(神经细胞、神经胶质细胞等)、感觉器官细胞(晶体、视网膜、内耳等)、皮肤表皮细胞、毛囊等。
作为源自内胚层的分化细胞，并不受特别限定，例如可以举出消化器官系统细胞(肝细胞、胆管细胞、胰腺内分泌细胞、腺胞细胞、导管细胞、吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞、肠上皮细胞样细胞等)、肺、甲状腺等组织的细胞。
作为源自中胚层的分化细胞，并不受特别限定，可以举出血球·淋巴细胞系统细胞(造血干细胞、红血球、血小板、巨噬细胞、粒细胞、辅助T细胞、杀伤性T细胞、B淋巴细胞等)、血管系统细胞(血管内皮细胞等)、心肌细胞(例如，心房肌细胞、心室肌细胞等)、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞等。
本发明的制造多能干细胞的方法中的工序(i)为在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序。
在“作为样品的多能干细胞“这一记载中，“作为样品的”是指能够成为用于制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的材料，通过后述的工序(ii)从“作为样品的多能干细胞”中获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。
原始内胚层细胞为在面向囊胚的内细胞团的囊胚腔的表层分化的细胞。原始内胚层细胞表达的基因可以为原始内胚层细胞特异性表达的基因。原始内胚层细胞特异性表达的基因是指虽然检测到在囊胚的原始内胚层中的表达，但未检测到在胚盘上层中的表达的基因。在本发明的优选方式中，作为原始内胚层细胞表达的基因，使用选自包括CER1、LEFTY1、LEFTY2、NODAL及CXCR4的组中的至少一种基因。
在专利文献1中，挑选与已知显示出向造血干细胞和/或造血前体细胞的高分化效率的iPS细胞等中的GATA4、GATA6等基因的表达水平相等或其以上的对象iPS细胞来作为显示出向造血干细胞和/或造血前体细胞的高分化效率的iPS细胞。另一方面，在本发明的制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法中，如以下详细记载那样，选择与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比相等或低的多能干细胞来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，在这点上与专利文献1的记载不同。
基因的表达水平是指基因的表达量，通常能够根据与基因对应的转录产物的产生量或其翻译产物的产生量、活性等来分析。表达水平的测定能够通过作为基因的转录产物的mRNA或作为基因的翻译产物的蛋白质的测定来进行，但优选通过作为mRNA或其逆转录产物的cDNA的测定来进行。
在表1中示出各基因的NCBI登录号(accession Number)。
[表1]
Figure BDA0003285916150000111
根据上述NCBI登录号(accession Number)获取各基因的序列信息，从而能够测定基因的表达水平。
原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的测定方法并不受特别限定，例如能够通过定量RT-PCR来进行测定。RT-PCR为将成为测定对象的mRNA作为模板而合成cDNA，并将该cDNA作为模板而通过PCR扩增的方法。作为定量RT-PCR，例如能够举出如下方法(实时PCR)等：使用结合有淬灭荧光染料和报告荧光染料的引物进行PCR而在各循环中定量扩增产物量，并根据所检测的荧光强度急剧增大的循环数测定试样中的模板DNA量。定量RT-PCR的方法在本技术领域中是周知的，并且也能够使用市售的试剂盒来实施。根据定量RT-PCR，能够将基因的表达量或拷贝数测定为相对于成为对照的管家基因(例如，GAPDH基因)的表达量或拷贝数的相对值。另外，基因的mRNA的测定也能够通过如下来进行：对通过通常的RT-PCR等进行mRNA的扩增而获得的扩增产物施加凝胶电泳，并进行染色之后，测定带(band)强度。或者，也能够使用DNA芯片检测或定量基因的mRNA或cDNA。原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的测定也能够使用下一代定序器来进行。另外，成为测定对象的细胞能够通过从培养工序中提取一部分来获得。
作为表示表达水平的数值，例如当通过实时PCR测定表达量时，能够使用Ct(Cyclethreshold：循环阈值)值。Ct值是PCR扩增产物达到一定量时的循环数。在横轴上标绘扩增的循环数，在纵轴上标绘PCR产物量来制作扩增曲线，在对PCR产物量的值设定了阈值(Threshold)时，阈值与扩增曲线相交的点的循环数成为Ct值。当使用荧光标记的探针测定表达量时，也能够使用荧光强度。
在本发明的制造多能干细胞的方法中，首先能够进行多能干细胞的扩增培养。“作为样品的多能干细胞”优选在涂布有饲养细胞的板或涂布有基质胶(Matrigel)(注册商标)等支架的板上在适当的培养基中扩增培养。作为饲养细胞，并不受特别限定，可以举出小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)、小鼠胚成纤维细胞(STO细胞)。在扩增培养中，优选维持细胞的未分化性。
作为扩增培养时的培养基，能够使用mTeSR(注册商标)1(Stemcell Technologies公司)或StemFlex(注册商标)等市售的培养基。可替代地，例如作为基础培养基，可以举出DMEM、DMEM与F12的混合培养基(DMEM/F12＝1:1)、KnockoutTM D-MEM(Invitrogen公司)等，并且可以举出任意地组合血清替代物(KSR；KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen公司))、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、抗生物质(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素、丝裂霉素、庆大霉素)、bFGF等添加成分并将其添加到上述任一基础培养基中而制备出的培养基。
扩增培养的培养条件优选在37℃、5％CO2、10％O2条件下等，但并不限定于此。
通过扩增培养，能够将细胞培养至培养液中的细胞浓度成为1×104cells/mL至1×1010cells/mL。
在扩增培养的中途可以进行传代。例如，在成为汇合或亚汇合时，能够采集细胞的一部分，将其移到另一培养容器中继续培养。为了促进分化，优选将细胞密度设定为较低。例如，能够以1×104个/cm2～1×106个/cm2左右的细胞密度接种细胞。
作为样品的多能干细胞也可以通过扩增培养对多能干细胞进行克隆培养使其增殖而获得。克隆培养是指通过培养而获得一个细胞分裂增殖而成的细胞群，将通过克隆培养而获得的细胞群称为克隆群或简称为克隆。
原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的测定，能够对原始态型多能干细胞或始发态型多能干细胞进行，但优选对始发态型多能干细胞进行。这是因为，为了检测多能干细胞中的原始内胚层细胞表达的基因的表达，始发态型多能干细胞是合适的。
本发明的制造多能干细胞的方法中的工序(ii)为选择与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，在工序(i)中所测定出的原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞，来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序。并且，在工序(ii)中，不选择在工序(i)中所测定出的原始内胚层细胞表达的基因的表达水平比已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平高的细胞。
“已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”是指通过在文献等刊物中报道而已明确向特定细胞的分化能力相对高，或者，通过预先进行的向特定细胞的分化能力的评价实验而已明确向特定细胞的分化能力相对高的多能干细胞。
作为“已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”，例如能够举出CellularDynamics International公司的01434菌株(McNamara et al.,2018,Cell Systems 7,359-370)。
“已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”的选择例如能够通过确定向特定细胞的分化诱导后的特定细胞的细胞数相对于开始分化诱导时的多能干细胞的细胞数的比率(特定细胞的生产率)，并选择特定细胞的生产率相对高的细胞来进行。特定细胞的生产率可能根据特定细胞的种类或分化诱导方法而发生变化，因此能够对特定细胞的每一种类或每种分化诱导方法设定成为“具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”的选择基准的特定细胞的生产率的值。若为本领域技术人员，则能够适当设定用于对“具有向特定细胞的高分化能力”的细胞和向特定细胞的分化能力不高的细胞进行划分的特定细胞的生产率。
“已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”例如能够通过评价源自中胚层、内胚层或外胚层的分化细胞或其前体细胞(优选源自中胚层或外胚层的分化细胞或其前体细胞)的生产率来选择。更具体而言，多能干细胞向特定细胞的分化能力例如能够通过进行向心肌细胞、血球、骨骼肌细胞、神经细胞、肝实质细胞、胰腺β细胞、肠上皮细胞或它们的前体细胞的分化诱导来评价。这是因为，在向它们的分化细胞或它们的前体细胞的分化诱导中存在已建立的实验系统。
作为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞的一例，能够举出已知具有向心肌细胞的高分化能力的多能干细胞。作为已知具有向心肌细胞的高分化能力的多能干细胞，优选能够举出心肌细胞的生产率为50％以上的多能干细胞，更优选能够举出心肌细胞的生产率为60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、110％以上、120％以上或130％以上的多能干细胞。并且，也可以使用心肌细胞的生产率为140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上或200％以上的多能干细胞。
心肌细胞的生产率(％)是指(分化诱导后的总心肌细胞数÷开始分化诱导时的多能干细胞数)×100。
如后述，向心肌细胞的分化诱导能够通过如下操作来实施：第1天，将细胞在添加有ROCK抑制剂及bFGF的mTeSR(注册商标)1中培养，第2天，在包含ROCK抑制剂、bFGF、激活素(Activin)A及牛胎血清的×0.5mTeSR(注册商标)1及×0.5DMEM低糖(low-glucose)培养基中培养，第3天～第8天，在包含bFGF、激活素(Activin)A、BMP4及牛胎血清的DMEM低糖(low-glucose)培养基中培养，第9天，在包含Wnt抑制剂及牛胎血清的该培养基中培养，第10天～第14天，在去除了Wnt抑制剂的该培养基中培养。
心肌细胞能够通过例如使用以荧光染料标志的抗cTnT抗体等检测表达作为心肌细胞标志物的cTnT的细胞来鉴定。心肌细胞的细胞数能够通过使用抗cTnT抗体等，经由基于荧光染料的标记，利用流式细胞法测定表达cTnT的细胞的比例(cTnT阳性细胞率)来计算。cTnT阳性细胞率能够通过遵照实施例2中所记载的方法，利用流式细胞法来测定。
作为已知具有向心肌细胞的高分化能力的多能干细胞，优选能够举出分化诱导后的cTnT阳性细胞率为25％以上的多能干细胞，更优选能够举出cTnT阳性细胞率为30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上或60％以上的多能干细胞。
在本发明中，选择将原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平进行比较时，表达水平相等或低的多能干细胞。
“相等”是指原始内胚层细胞表达的基因的表达水平为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平的1倍以上且小于2倍，优选为1.9倍以下、1.8倍以下、1.7倍以下、1.6倍以下、1.5倍以下、1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下或1.1倍以下。
“低”是指原始内胚层细胞表达的基因的表达水平小于已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的表达水平的1倍，优选为0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
当原始内胚层细胞表达的基因为NODAL基因时，所选择的多能干细胞中的NODAL基因的表达水平优选为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的NODAL基因的表达水平的1.9倍以下，也可以为1.8倍以下、1.7倍以下、1.6倍以下、1.5倍以下、1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下、1.1倍以下、1.0倍以下、0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
当原始内胚层细胞表达的基因为LEFTY1基因时，所选择的多能干细胞中的LEFTY1基因的表达水平优选为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的LEFTY1基因的表达水平的1.9倍以下，也可以为1.8倍以下、1.7倍以下、1.6倍以下、1.5倍以下、1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下、1.1倍以下、1.0倍以下、0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
当原始内胚层细胞表达的基因为LEFTY2基因时，所选择的多能干细胞中的LEFTY2基因的表达水平优选为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的LEFTY2基因的表达水平的1.5倍以下，也可以为1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下、1.1倍以下、1.0倍以下、0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
当原始内胚层细胞表达的基因为CER1基因时，所选择的多能干细胞中的CER1基因的表达水平优选为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的CER1基因的表达水平的1.7倍以下，也可以为1.6倍以下、1.5倍以下、1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下、1.1倍以下、1.0倍以下、0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
当原始内胚层细胞表达的基因为CXCR4基因时，所选择的多能干细胞中的CXCR4基因的表达水平优选为已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的CXCR4基因的表达水平的1.9倍以下，也可以为1.8倍以下、1.7倍以下、1.6倍以下、1.5倍以下、1.4倍以下、1.3倍以下、1.2倍以下、1.1倍以下、1.0倍以下、0.9倍以下、0.8倍以下、0.7倍以下或0.6倍以下。
若为本领域技术人员，则能够根据已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的各基因的表达水平来适当设定用于选择具有向特定细胞的分化能力的多能干细胞的基准值。例如，也能够将作为“已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞”而选择的两个以上的克隆中的原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的值的平均值设定为基准值，将与该基准值相比，上述基因的表达水平相等或低的多能干细胞选择为具有向特定细胞的分化能力的多能干细胞。能够对每个基因设定基准值。
在选择具有向特定细胞的分化能力的多能干细胞时，测定作为样品的原始内胚层细胞表达的两种以上的基因的表达水平，通过适用判别分析来进行评分，从而能够确定作为样品的原始内胚层细胞是否为具有向特定细胞的分化能力的多能干细胞。作为判别分析，例如可以举出卡尔费休的线性判别、基于马哈拉诺比斯距离的判别、基于欧几里德距离的判别、多组判别、变量选择及典型判别等。这些判别分析能够通过使用各种统计分析软件来实施。
本发明中还包括通过上述制造方法而获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞。通过对利用上述制造方法而获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导，能够高效地制造分化细胞。
本发明的另一方面涉及一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括：
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择与已知具有向上述特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞，来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序。
本发明的又一方面涉及一种用于多能干细胞的品质评价的方法，其包括：
(a)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；
(b)将所测定出的上述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平进行比较的工序；及
(c)将所述基因的表达水平相等或低的多能干细胞判断为优良的工序。
本发明的品质评价是指关于作为样品的多能干细胞是否具有向特定细胞的高分化能力，在分化诱导前进行预测。能够以原始内胚层细胞表达的至少一种基因的表达水平为指标，将预测为具有向特定细胞的高分化能力的作为样品的多能干细胞评价为优良菌株，将预测为不具有向特定细胞的高分化能力的作为样品的多能干细胞评价为不良菌株。
根据用于本发明的品质评价的方法，通过品质评价来排除不良菌株，由此能够降低生产成本，且能够使生产稳定化。并且，也能够在克隆培养过程的多个时点，将一部分细胞采样，通过监控原始内胚层细胞表达的基因的表达量的变化来检测克隆培养过程中的细胞品质的恶化，并将其反馈到生产工艺。在iPS细胞的建立、扩增、分化的各工序中，作为iPS细胞的新的品质基准，能够测定并监控原始内胚层基因的表达量。
本发明中的工序(a)能够与上述[1]制造方法中所记载的工序(i)相同地实施。本发明中的工序(b)能够与上述[1]制造方法中所记载的工序(ii)相同地实施。在工序(b)中，能够将与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的上述基因的表达水平相比，在工序(a)中所测定出的原始内胚层细胞表达的基因的表达水平相等或低的多能干细胞评价为具有分化成特定细胞的能力。评价为具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞优选作为分化诱导的对象。这是因为，由此能够高效地生产分化细胞产品。
[2]分化细胞的制造方法及分化细胞
本发明涉及一种分化细胞的制造方法，其包括以下工序。
通过上述制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法获得具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序；及
对在上述工序中所获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导的工序。
通过对利用本发明的制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法而获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导，能够高效地制造分化细胞。
通过上述制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法而获得具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序能够根据上述[1]制造方法的记载来实施。
“分化诱导”是指促使按照特定的细胞谱系分化。对具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导的方法并不受特别限定。例如，能够使用市售的StemDiff(注册商标)Trilineage Differentiation Kit(Stemcell Technologies公司)分别诱导分化成内胚层、中胚层及外胚层。
在向内胚层细胞的分化诱导中，例如能够使用STEMdiff(注册商标)Tril ineageEndoderm Medium(Stem Cell Technologies公司)，按照操作指南将细胞诱导分化成内胚层细胞。
在向中胚层细胞的分化诱导中，例如能够使用STEMdiff(注册商标)Tril ineageMesoderm Medium(Stem Cell Technologies公司)，按照操作指南将细胞诱导分化成中胚层细胞。
向外胚层细胞的分化诱导例如能够通过在后述的实施例5中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，例如能够使用STEMdiff(注册商标)Trilinea ge Ectoderm Medium(Stem Cell Technologies公司)，按照操作指南将细胞诱导分化成外胚层细胞。
关于向内胚层细胞、中胚层细胞及外胚层细胞的分化诱导的确认，能够通过各胚层特异性基因的表达来确认。各胚层特异性基因的表达的测定方法并不受特别限定，例如能够通过定量RT-PCR法来进行测定。
作为内胚层特异性基因，并不受特别限定，能够举出SOX17及FOXA2等。作为中胚层特异性基因，并不受特别限定，能够举出T及PDGFRA等。作为外胚层特异性基因，并不受特别限定，能够举出PAX6及MAP2等。
向心肌细胞的分化诱导例如能够通过在后述的实施例1中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够通过如下操作诱导分化成心肌细胞：第1天，将细胞在添加有ROCK抑制剂及bFGF的mTeSR(注册商标)1中培养，第2天，在包含ROCK抑制剂、bFGF、激活素(Activin)A及牛胎血清的×0.5mTeSR(注册商标)1及×0.5DMEM低糖(low-glucose)培养基中培养，第3天～第8天，在包含bFGF、激活素(Activin)A、BMP4及牛胎血清的DMEM低糖(low-glucose)培养基中培养，第9天，在包含Wnt抑制剂及牛胎血清的该培养基中培养，第10天～第14天，在去除了Wnt抑制剂的该培养基中培养。作为ROCK抑制剂，例如能够使用H1152、Y27634等。作为Wnt抑制剂，例如能够使用XAV939。或者，也能够使用PSC CardiomyocyteDifferentia tion Kit(Thermo Fisher Scientific)，按照操作指南将细胞诱导分化成心肌细胞。向心肌细胞的分化诱导能够通过用流式细胞仪测定作为心肌细胞标志物的cTnT的表达来确认。
并且，向血液细胞的分化诱导能够通过在WO2019/151386中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够通过如下操作诱导分化成血液细胞：第1天，在包含BMP4及Y27634(ROCK抑制剂)的培养基中培养，第2天，添加bFGF及BMP4，第3天，确认细胞形成了球状的集落并在包含SB431542(TGF-β受体抑制剂)、CHIR99021(GSK3抑制剂)、bFGF及BMP4中培养基中培养(第3天及第4天)，第5天～第6天，在包含VEGF及bFGF的培养基中培养，第7天～第10天，在包含VEGF、bFGF、IL-6、IGF-1、IL-11及SCF的培养基中培养。另外，向血液细胞的分化诱导能够通过利用流式细胞仪分析作为血液细胞的标志物的CD34和KDR的表达来确认。
向神经干细胞的分化诱导例如能够通过在WO2019/151386中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够使用PSC Neural Induction Medium(Thermo FisherScientific)，按照操作指南将细胞诱导分化成神经干细胞。向神经干细胞的分化诱导例如能够通过对作为神经干细胞的标志物的SOX1蛋白进行免疫染色来确认。
向肠干细胞样细胞的分化诱导例如能够通过在WO2019/156200中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够将细胞在包含FGF2或GSK-3β抑制剂的DMEM/F12中培养来诱导分化成肠干细胞样细胞。向肠干细胞样细胞的分化诱导例如能够通过对作为肠干细胞标志物的LGR5进行免疫染色来确认。
向肠上皮细胞样细胞的分化诱导例如能够通过在WO2019/156200中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够将细胞在包含EGF及毛喉素的Advanced DMEM/F-12中培养来诱导分化成肠上皮细胞样细胞。向肠上皮细胞样细胞的分化诱导例如能够以肠上皮细胞标志物的表达或肽的吸入或经由维生素D受体的药物代谢酶的表达诱导为指标来判定或评价。
通过本发明的分化细胞的制造方法，在上述以外的中胚层系细胞分化条件下培养具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，由此能够分化成源自中胚层的细胞。作为源自中胚层的分化细胞，并不受特别限定，可以举出血球·淋巴细胞系统细胞(造血干细胞、红血球、血小板、巨噬细胞、粒细胞、辅助T细胞、杀伤性T细胞、B淋巴细胞等)、血管系统细胞(血管内皮细胞等)、心肌细胞(例如，心房肌细胞、心室肌细胞等)、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞等。
通过本发明的分化细胞的制造方法，在上述以外的外胚层系细胞分化条件下培养具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，由此能够分化成源自外胚层的细胞。作为源自外胚层的分化细胞，并不受特别限定，可以举出神经系统细胞(神经细胞、神经胶质细胞等)、感觉器官细胞(晶体、视网膜、内耳等)、皮肤表皮细胞、毛囊等。
通过本发明的分化细胞的制造方法，在内胚层系细胞分化条件下培养具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，由此能够分化成源自内胚层的细胞。作为源自内胚层的分化细胞，并不受特别限定，例如可以举出消化器官系统细胞(肝细胞、胆管细胞、胰腺内分泌细胞、腺胞细胞、导管细胞、吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞、肠上皮细胞等)、肺、甲状腺等组织的细胞。
本发明中还包括通过上述分化细胞的制造方法获得的分化细胞。通过本发明的分化细胞的制造方法进行了分化诱导的细胞能够用于各种疾病的治疗用医药品候选化合物的筛选。例如，能够通过将医药品候选化合物单独或与其他药剂组合而添加到分化诱导的细胞中来检测细胞的形态或功能变化、各种因子的增减、基因表达谱等来进行评价。
使用通过本发明的分化细胞的制造方法进行了分化诱导的细胞，由进行了分化诱导的细胞制作组织，能够将其用于再生医学领域中。作为将所制作出的组织移植到患者的方法，若为本领域技术人员，则是显而易见的。
利用以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例
＜实施例1＞
向心肌细胞的分化诱导
遵照日本专利5984217号中所记载的方法，由包含不同的供体来源的外周血单个核细胞制作出iPS细胞克隆A～N。在iPS细胞的培养中，使用mTeSR(注册商标)1(Stem CellTechnologies公司)及Matrigel(注册商标)(Corning公司)，利用0.5mmol/L的EDTA溶液(Invitrogen公司)处理7分钟，由此回收细胞并传代培养。在上述条件下将iPS细胞扩增培养至两个T225烧瓶的量。由此获得的iPS细胞为始发态型。
在上述条件下使iPS细胞增殖至汇合度成为80％左右之后，在TrypLE(注册商标)Select(Thermo Fisher公司)中对细胞进行单细胞剥离而进行回收，并在添加有终浓度1μmol/L的H1152(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)、25μg/mL的庆大霉素(Thermo Fisher公司)及100ng/mL的bFGF(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)的mTeSR(注册商标)1中将细胞调整为3.0×106cells/mL。将该细胞的悬浮液15mL添加到30mL一次性生物反应器(ABLE公司)中，并以转速40rpm搅拌培养。从培养开始起2～4小时之后，在同一个培养基中定容(mass up)为使最终液量成为30mL、细胞数成为4.5×107cells，并且以该状态继续搅拌培养。
搅拌培养开始后1天之后，置换为由终浓度1μmol/L的H1152、25μg/mL的庆大霉素、100ng/mL bFGF、24ng/mL的激活素(Activin)A(R&D System公司)、5％牛胎血清(GEHealthcare公司)、×0.5mTeSR(注册商标)1及×0.5DMEM低糖(low-glucose)(ThermoFisher公司)构成的培养基，并且继续搅拌培养。
搅拌培养开始后2天之后，采样一部分培养液并测量细胞数，在由终浓度25μg/mL的庆大霉素、100ng/mL的bFGF、24ng/mL的激活素(Activin)A、40ng/mL的BMP4(R&D System公司)、10％牛胎血清及DMEM低糖(low-g lucose)构成的培养基中调整为1.0×106cells/mL，并且继续搅拌培养。搅拌培养开始后第3天～第7天，用该培养基每天更换培养基，并且继续搅拌培养。
搅拌培养开始后8天之后，采样一部分培养液并测量细胞数，在由终浓度25μg/mL的庆大霉素(Gentamycin)、16.25μg/mL的XAV939(Sigma Aldrich公司)、10％牛胎血清及DMEM低糖(low-glucose)构成的培养基中调整为1.0×106cells/mL，并且继续搅拌培养。搅拌培养后第9天～第13天，用去除了XAV939的该培养基每隔2天更换培养基，并且继续搅拌培养。
搅拌培养开始后14天之后，确认到源自克隆A、B、D、E、F、G、I、J、K、L、M及N的细胞团的一部分自主跳动。另一方面，源自克隆C及H的细胞团未观察到跳动。采样一部分培养液并测量了细胞数。将最终获得的细胞数示于表2。
[表2]
Figure BDA0003285916150000221
＜实施例2＞
源自iPS细胞的心肌细胞团利用流式细胞仪的分析
将搅拌培养开始后14天的细胞团用TrypLE(注册商标)Select分离至单一细胞，并且使用Live/Dead(注册商标)Fixable Green Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher公司)对死细胞进行了染色。用D-PBS(Thermo Fisher公司)清洗之后，用终浓度4％的甲醛(SigmaAldrich公司)进行处理而固定了细胞。对于所获得的固定细胞0.5×106cells，将抗-cTnT抗体(Abcam公司的ab8295)稀释为1/250后添加到包含终浓度0.1％的Saponin(MerckMillipore公司)、2％牛胎血清的D-PBS中，并且在室温下处置了1小时。同时，作为Isotype对照，使将IgG1 isotype Control Murine Myeloma(Sigma Aldrich公司的M5284)稀释为1/25后添加的样品并置。接着，将Alexa Fluor(注册商标)647标记Goat anti-mouse IgG1抗体(Thermo Fisher公司的A21240)稀释为1/500后进行添加，并且在室温下处置了30分钟。使用流式细胞仪(Thermo Fisher公司的Attune Nxt)对所获得的标记细胞进行了分析。对前向光散射、侧向光散射及活细胞进行调控(gating)之后，根据与Isotype样品的比较计算出cTnT阳性细胞率。将在克隆A中获得的流式细胞仪及调控例示于图1。将心肌细胞诱导后的各克隆的cTnT阳性细胞率及根据分化诱导后的总细胞数和cTnT阳性细胞率计算出的总心肌细胞数(cTnT阳性细胞数)、以及以开始分化诱导时的多能干细胞数为基准的心肌细胞的生产率(％)((分化诱导后的总心肌细胞数÷开始分化诱导的多能干细胞数)×100)示于表3。
[表3]
Figure BDA0003285916150000231
＜实施例3＞
iPS细胞的基因表达分析
在实施例1的iPS细胞扩增培养时点，采样一部分细胞，并使用RNeasy Plus MiniKit(QIAGEN N.V.)提取了RNA。使用微阵列分析Clariom S，Hu man Assay(Affymetrix，Inc.)分析该RNA，获得了各iPS细胞克隆的基因表达量矩阵。按照Transcriptome AnalysisConsole(Thermo Fisher公司)实施了数据分析。
＜实施例4＞
iPS细胞的基因表达与心肌细胞生产率的相关性分析
为了比较按照实施例2获得的源自各iPS细胞克隆的心肌细胞生产率及按照实施例3获得的基因表达量，将克隆A、B、E、F、G、I、J、K、L、M定义为心肌细胞高产克隆组，将克隆C、D、H、N定义为低产克隆组，制作出火山图(Volcano Plot)(组合t-检验与倍数(fold)分析的两组间比较)。将结果示于图2。在图2中，在纵轴上示出t-检验的显著性水平P-值(P-value)(-log 10)，在横轴上示出平均值之比的倍数变化(Fold Change)。
并且，提取心肌细胞高产克隆组与低产克隆组之间表达量差绝对值为2倍以上、表达显著性差异(P-value)小于0.01的基因并将其编成列表(未公开列表)。根据所获得的基因列表可知，低产克隆组的iPS细胞具有被认为在原始内胚层中表达的基因组例如NODAL、CER1、CXCR4等的表达显著性地高的倾向。并且，确认了被认为在原始内胚层中表达的基因组中LEFTY1及LEFTY2的表达量，其结果还可知，低产克隆组的iPS细胞中的表达量具有高于高产克隆组的iPS细胞中的表达量的倾向。将NODAL、CER1、CXCR4、LEFTY1及LEFTY2的倍数变化(Fold Change)(Low Avg/High Avg)及P-值(P-value)示于表4。
[表4]
Figure BDA0003285916150000241
为了更详细地确认上述内容，在iPS细胞扩增培养时点采样，将从一部分细胞获得的RNA的一部分使用High capacity RNA-to-cDNAKit(Thermo Fisher公司)逆转录为cDNA，并使用TaqMan(注册商标)Gene Expression Assay(Thermo Fisher公司)，以源自克隆A的cDNA为基准，通过ΔΔCT法对各基因表达量进行了定量。将所使用的TaqMan(注册商标)Probe的ID示于表5，将在基于TaqMan(注册商标)Probe的各基因表达量评价中获得的结果示于表6。将基于TaqMan(注册商标)Probe的各基因表达量评价的结果分为高产克隆组、低产克隆组，结果总结为箱线图(box plot)并示于图3～8。作为多能性标志物的NANOG在两组的表达量之间无很大的差异，另一方面，被认为在原始内胚层中表达的基因(NODAL、LEFTY1、LEFTY2、CER1、CXCR4)确认到在低产克隆中表达显著性地高(图中*表示P-值(P-value)＜0.01)。
根据以上示出，心肌细胞的生产性相对低的iPS细胞克隆均具有原始内胚层基因(原始内胚层表达的基因)系列的表达量高的倾向。
[表5]
基因名称 TaqMan(注册商标)Gene Expression Assay ID
NANOG Hs02387400_g1
NODAL Hs00415443_m1
leftY1 Hs00764128_s1
leftY2 Hs00745761_s1
CER1 Hs00193796_m1
CXCR4 Hs00607978_s1
[表6]
Figure BDA0003285916150000261
＜实施例5＞
向外胚层细胞的分化诱导
在iPS细胞克隆14株中，选择克隆B、H、I、N，利用与实施例1相同的方法扩增培养。使iPS细胞增殖至汇合度成为80％左右之后，在TrypLE(注册商标)Select中对细胞进行单细胞剥离并回收，在包含终浓度10μmol/L的Y-27632(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)的STEMdiff(注册商标)Trilineage Ectoderm Medium(Stem CellTechnologies公司)中调整为1×106cells/mL，并且接种于涂布了Matrigel(注册商标)的6孔板(well plate)上。次日以后，每天更换为STEMdiff(注册商标)Trilineage EctodermMedium，接种后培养了7天。
＜实施例6＞
iPS细胞的基因表达与外胚层细胞分化率的相关性分析
按照实施例5中所记载的方法接种后，培养7天细胞之后，使用RNeasy Plus MiniKit回收了RNA。利用与实施例4相同的方法逆转录为cDNA，并使用TaqMan(注册商标)GeneExpression Assay(ID：Hs01088114_m1)分析了作为外胚层标志物基因的PAX6的基因表达量。并且，各iPS克隆的扩增培养后(接种后第0天)的RNA也同样回收，并测定了作为原始内胚层基因的NODAL的表达量(ID：Hs00415443_m1)。表达量以克隆B为基准，通过ΔΔCT法进行了定量。将结果示于表7及图9、10。原始内胚层基因的表达高的iPS克隆(克隆H、N)均显示出外胚层诱导后的PAX6表达量相对低，即外胚层分化效率低。
[表7]
Figure BDA0003285916150000271

Claims (12)

1.一种制造具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括下述工序：
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择所测定出的所述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向所述特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的所述基因的表达水平相比为相等或低的多能干细胞，来获取具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述原始内胚层细胞表达的基因为选自由CER1、LEFTY1、LEFTY2、NODAL及CXCR4组成的组中的至少一种基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述特定细胞为源自中胚层或外胚层的分化细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
所述特定细胞为心肌细胞或神经细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
所述多能干细胞为人源细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
作为所述样品的多能干细胞通过对多能干细胞进行克隆培养使其增殖而获得。
7.一种具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞，其通过权利要求1至6中任一项所述的方法而获得。
8.一种分化细胞的制造方法，其包括下述工序：
通过权利要求1至6中任一项所述的方法获得具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的工序；及
对在所述工序中所获得的具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞进行分化诱导的工序。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，
所述分化细胞为源自中胚层或外胚层的细胞。
10.一种分化细胞，其通过权利要求8或9所述的方法而获得。
11.一种用于多能干细胞的品质评价的方法，其包括下述工序：
(a)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；
(b)将所测定出的所述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的所述基因的表达水平进行比较的工序；及
(c)将所述基因的表达水平相等或低的多能干细胞判断为优良的工序。
12.一种挑选具有分化成特定细胞的能力的多能干细胞的方法，其包括以下工序：
(i)在作为样品的多能干细胞中测定原始内胚层细胞表达的基因的表达水平的工序；及
(ii)选择所测定出的所述原始内胚层细胞表达的基因的表达水平与已知具有向所述特定细胞的高分化能力的多能干细胞中的所述基因的表达水平相比为相等或低的多能干细胞的工序。
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